CN101036876B - 超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质的制备方法，属于生物分离工程领域中的纤维素凝胶介质的制备技术。该方法过程包括：将碳酸钙微粒分散于纤维素粘胶液中，制成复合水相，然后将该粘胶液加入变压器油中，并加入复合乳化剂油酸钾和Span60，搅拌乳化反应后，加热固化形成微球，再加入乙二醇二缩水甘油醚和环氧氯丙烷，在碱性条件下进行双交联反应，用稀盐酸除去碳酸钙微粒后，用硼氢化钠还原，制备成超大孔纤维素微球介质。该介质在保持原有纤维素凝胶介质优点的同时，增加了许多超大孔，使得介质的耐压性能、传质速率、动态吸附容量等都有明显的提高，因而这种新型超大孔纤维素微球型蛋白质吸附剂具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质的制备方法，属于生物分离工程领域中的纤维素凝胶介质的制备技术。
背景技术
液相层析技术由于具有分离精度高，条件温和而广泛应用于蛋白质等生物物质的制备分离和纯化，在生物产品下游加工过程中具有举足轻重的作用，其核心技术新型层析介质的开发也一直是层析领域的研究热点之一。理想的层析介质不仅应具有较高的吸附容量，而且应当满足在高流速下保持高分辨率的要求。但是，目前大多数的商业化层析介质的孔径仅为10-200nm，与生物大分子的尺寸接近，从而严重地影响了生物大分子在层析介质内的传质。故此，强化介质内的传质是实现生物大分子的高效层析分离所面临的主要挑战之一。
在层析介质制备过程中通过特定致孔剂(如环己烷、己烷等)的引入在形成常规纳米级扩散孔的同时获得一定量微米级的大孔。溶质在大孔中以对流的形式输送，而在扩散孔中则以扩散方式传递。由此，生物大分子在介质内的传质得以强化，其对实现大分子溶质的快速分离具有重要作用。1991年，Afeyan等人公布了利用苯乙烯和二乙烯基苯制备大孔的灌注层析介质的专利(US5,019，270)。利用该技术制备的介质在操作流速1500cm/h下仍保持较高的分离效率。但上述的双孔介质为有机高分子合成介质，这类介质较高的非特异性吸附和复杂的制备工艺在一定程度上制约了它的应用。自此以后，越来越多的研究者关注于这方面的研究，特别是从亲水材料出发合成大孔型介质。Gustavsson和Larsson在1996年报道了以油相(环己烷)为液体致孔剂，采用双乳化法制备超大孔琼脂糖凝胶介质的方法(P.E.Gustavsson and P.O.Larsson.Superporous agarose，a new material for chromatography，Journal of Chromatography A，1996，743，231-240)。这类超大孔介质在保持琼脂糖凝胶介质原有的网状结构的同时，又具备了流通孔的特性，操作流速得到了提高。但是由于采用了液体致孔剂，上述大孔介质中流通孔的孔径很难控制(如美国专利US5，723，601中所报道的琼脂糖凝胶介质流通孔的孔径分布在0.5～1000μm)，并且制备过程比较复杂。孙彦在其公布的超大孔琼脂糖凝胶介质的制备专利中(ZL031 30027.8)，提出了一种采用固体致孔剂制备大孔的新思路，通过控制固体致孔剂的粒径来调控超大孔的孔径，制备的琼脂糖层析介质最高操作流速可达1000cm/h以上。
纤维素曾以其良好的亲水性和生物相容性成为了最为经典的层析介质材料。但是商品化纤维素吸附剂的耐压性能差、吸附量低等缺陷限制了其在层析分离过程中的应用。通过制备方法的改进虽然在一定程度上可以改善这种状况，如刘明华利用喷射法制备的球形纤维素珠体的平均孔径可达20-300nm(CN 1456593A)，但其在生物大分子的快速分离中的应用仍然受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质的制备方法。以该方法制备的分离介质具有可控的超大孔孔径和介质的孔隙率，并高流速下具有较高的耐压性能、吸附容量和传质速率。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。采用生物相容性的固体碳酸钙微粒为致孔剂，以纤维素黄原酸钠为水相，以25#变压器油为油相，制备超大孔型蛋白质吸附剂的方法。该方法主要包括悬浮液的制备、分散乳化、凝胶固化和凝胶交联和固体致孔剂去除过程。其特征在于，将粒径为0.86μm-3.96μm(10％-90％)、密度为1.6g/mL-2.6g/mL碳酸钙微粒均匀分散在质量含量为4％-12％、体积量为碳酸钙体积的5-40倍的纤维素黄原酸钠中；再将此悬浮水溶液分散于体积量为水相体积5-14倍、含油酸钾和司班60复合乳化剂的变压器油中，复合乳化剂中油酸钾和Span60质量比为1∶1-1∶7，复合乳化剂的质量为油相质量的0.02％-2％，搅拌至液滴分散均匀后，维持搅拌速度不变并将逐步升温至90℃，固化形成微球，向经去离子水洗净的微球中加入体积比为0.5-5倍的乙二醇二缩水甘油醚，平衡1小时后加入1.0-4.0mol/L氢氧化钠在30-75℃下交联2.5小时，经乙二醇二缩水甘油醚交联后的微球采用环氧氯丙烷二次交联，环氧氯丙烷与微球的体积比为0.5-5，所得到微球加入0.001mol/L的稀盐酸除去微球中包裹的碳酸钙微粒，并在1-4mol/L氢氧化钠条件下用2-7g/L硼氢化钠还原，制成粒径为15μm～123μm的超大孔纤维素微球。
上述的优化条件：纤维素黄原酸钠粘胶的质量浓度为6％-10％，水相中纤维素与碳酸钙颗粒的体积比为6-12倍，变压器油体积为水相体积的7-12倍，复合乳化剂油酸钾和Span60的质量比为1∶2-1∶6，加入量为油相质量的0.1％-1.2％；采用乙二醇二缩水甘油醚和环氧氯丙烷为交联剂，在2-3.5mol/L氢氧化钠溶液和在35-60℃下交联，乙二醇二缩水甘油醚体积为微球体积为0.5-2倍，环氧氯丙烷体积为微球体积为0.5-2倍，以硼氢化钠为还原剂，其浓度在3-5g/L。
本发明制备的超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质同现有的层析分离介质相比，其明显的优点是，成本低廉，制备过程简便经济；固体碳酸钙微粒无毒；介质在保存原有纤维素类介质优点的同时，兼有超大孔介质的特点；耐压性能好，传质速率高，吸附容量大，流通孔孔径可控；介质内超大孔的存在有利于实现蛋白质的高效快速分离，层析流速可达1800cm/h；纤维素凝胶上活性基团多，通过修饰不同配基，例如离子交换配基、亲和配基等，能满足多种吸附分离要求，应用于多种色谱分离模式。相对微孔介质而言，具有更温和的吸附和洗脱条件，为蛋白质保持活性提供了良好的环境；介质清洗、除菌简便，易再生，生物相容性好，亲水性好，在酶的固定化、细胞分离、质粒DNA和蛋白质的纯化等方面具有广泛的应用前景。
下面对本发明进行详细说明。
本发明的关键技术有六点：一是碳酸钙微粒的选择。平均粒径为2.34μm，无毒、重质非活性的碳酸钙微粒可以用做固体致孔剂。关键技术之二是配制复合水相。将碳酸钙加入到粘胶稀释液中(6％NaOH)，超声分散1小时后，加入到粘胶液中混合均匀。碳酸钙的含量直接关系到孔隙率，影响传质速率。关键技术之三采用油相悬浮热再生法制备超大孔纤维素微球。在油水两相中进行反应，获得的含有碳酸钙微粒的微球，碳酸钙微粒在介质内分布均匀，纤维素粘胶在加热条件下固化成球。关键技术之四是分散剂的选择。选用油酸钾和Span60复合分散剂，控制分散液滴的稳定及大小。关键技术之五是在制备过程中搅拌速度的控制。在反应过程中要维持转速的稳定，同时，调控转速也是获得不同粒径方法之一。关键技术之六是采用的适宜的交联处理步骤。选择长链和短链两种交联剂共同交联的方法，有效的提高了超大孔介质的稳定性和耐压性能，同时又能不影响纤维素凝胶自身特有的网络结构。
附图说明
图1为光学显微镜下本发明制备的含有碳酸钙微粒的超大孔纤维素微球(放大倍数为100)
图2为光学显微镜下本发明制备的超大孔纤维素微球的照片(碳酸钙已除去，放大倍数为100)
图3为扫描电镜下本发明制备的超大孔纤维素微球的照片(碳酸钙已除去，放大倍数为1000)
图4描述了超大孔和微孔纤维素微球流速和背压的关系，其中(△)对应于微孔纤维素微球，(□)对应于大孔纤维素微球。
图5描述了标准层析柱(HR5/10，Amersham Biosciences)中超大孔介质、微孔介质动态吸附量与静态吸附量之比(q10/qm)随流速的变化曲线，其中流动相为10mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.6)，牛血清白蛋白料液浓度为2mg/mL。图中(△)对应于DEAE-MC，(□)对应于DEAE-SC。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例1
5g脱脂棉在19％的NaOH溶液中碱化2小时后，挤干碱液并置于25℃水浴摇床中老化48小时；老化的脱脂棉经2.5mL二硫化碳(CS2)磺化10小时后，加入6％NaOH溶液稀释为8％的粘胶液，加入6gCaCO3，将此粘胶液加入到含复合乳化剂的600mL变压器油中，在搅拌转速为500rpm下持续搅拌至分散成均匀的液滴，油相中复合乳化剂的含量为0.4％，其中油酸钾和Span60的质量比为1∶2.5，分散后的体系置于超级恒温水浴中，升温到90℃，继续保温2.5小时；料液冷却后将反应混合物全部倾出，静置片刻，离心将上层油相液体倒掉，用蒸馏水反复洗涤介质，直至将介质上黏附的油全部洗净。
取5mL洗净的微球与等体积的乙二醇二缩水甘油醚混合，于40℃，170rpm的摇床中混合1小时，后加入二倍体积的3mol/L氢氧化钠溶液继续反应2.5小时，之后用环氧氯丙烷代替乙二醇二缩水甘油醚在同样的条件下对已交联的微球进行二次交联反应。反应完毕后，用蒸馏水反复清洗介质。向清洗后的微球中加入8倍体积的HCl溶液(1mmol/L)放入摇床中反应，一段时间后，再重复上述去除碳酸钙的步骤。将包覆的碳酸钙微粒除尽后，用蒸馏水反复洗涤到中性。向清洗后微球(5mL)中加入2mol/L等体积的氢氧化钠溶液，重新制成悬浮液；然后加入60 mg硼氢化钠，使溶液中硼氢化钠的浓度为6g/L。于30℃，200rpm下，在水浴摇床中反应6小时。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性。就制备成了超大孔介质(如图2、3所示)。
实施例2
5g脱脂棉在19％的NaOH溶液中碱化2小时后，挤干碱液并置于25℃水浴摇床中老化48小时；老化的脱脂棉经2.5mL二硫化碳(CS2)磺化8小时后，加入6％NaOH溶液稀释为6％的粘胶液，加入4gCaCO3，将此粘胶液加入到含复合乳化剂的600mL变压器油中，在搅拌转速为500rpm下持续搅拌分散至粘胶分散成均匀的液滴，油相复合乳化剂中油酸钾和Span60的质量比为1∶2；分散后的体系置于超级恒温水浴中，升温到90℃，继续保温2.5小时；料液冷却后将反应混合物全部倾出，静置片刻，离心将上层油相液体倒掉，用蒸馏水反复洗涤介质，直至将介质上黏附的油全部洗净。
取5g洗净的微球与0.5倍体积的乙二醇二缩水甘油醚混合，于50℃，170rpm的摇床中混合1小时，后加入二倍体积的2mol/L氢氧化钠溶液继续反应2.5小时，之后用环氧氯丙烷代替乙二醇二缩水甘油醚在同样的操作条件下对已交联的微球进行二次交联反应。反应完毕后，用蒸馏水反复清洗介质。向清洗后的微球中加入8倍体积的HCl溶液(1mmol/L)放入摇床中反应；一段时间后，再重复上述去除碳酸钙的步骤。将包覆的碳酸钙微粒除尽后，就制备成了超大孔介质(如图2、3所示)。
实施例3
取5g实施例1制备的超大孔纤维素微球介质(已除去碳酸钙)，移入250mL的锥型瓶I中，加入20mL0.6mol/LDEAE-C1混合，另取一250mL的锥型瓶II加入20mL3.5mol/L NaOH，密封后放入60℃恒温摇床中预热。10min后将锥型瓶II中NaOH加入锥型瓶I，封口。反应1小时后，取出锥型瓶I用水冷却。修饰完的大孔介质在砂芯漏斗中用去离子水冲洗至中性。
实施例4
在标准层析柱(HR5/10，Amersham Biosciences)中分别装填2mL实施例3的超大孔介质和微孔介质，考察在不同流速下层析柱背压随流速的变化规律。超大孔介质内存在许多流通孔，能在介质内产生对流，降低了流动相在色谱介质内部的流动阻力，从而使得超大孔介质可以承受较高的流速(1800cm/h)，流速的上限相对微孔介质的(1200cm/h)提高了0.5倍(如图4所示)。在超大孔介质的穿透实验中，流速的增加对超大孔介质的动态吸附容量的影响很小，其动态吸附容量(在10％穿透点下计算的动态吸附量)与静态吸附容量的比值(q10/qm)保持在0.84左右(如图5所示)。超大孔的引入使得纤维素介质可以在高流速下操作，并同时可以对蛋白质保持较高的吸附容量。
Claims (1)
1.一种超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质的制备方法，该方法包括悬浮液的制备、分散乳化、凝胶固化和凝胶交联和固体微粒去除过程，其特征在于，将粒径为0.86μm-3.96μm、密度为1.6g/cm3-2.6g/cm3碳酸钙微粒均匀分散在质量含量为4％-12％、体积量为碳酸钙体积的5-40倍的纤维素黄原酸钠粘胶液中，制得悬浮水溶液；再将此悬浮水溶液分散于体积量为水相体积5-14倍、含油酸钾和司班60复合乳化剂的25#变压器油中，复合乳化剂中油酸钾和司班60质量比为1∶1-1∶7，复合乳化剂的质量为油相质量的0.02％-2％，搅拌至液滴分散均匀后，维持搅拌速度不变并将逐步升温至90℃，固化形成微球，向经去离子水洗净的微球中加入体积比为0.5-5倍的乙二醇二缩水甘油醚，平衡1小时后加入1.0-4.0mol/L氢氧化钠在30-75℃下交联2.5小时，经乙二醇二缩水甘油醚交联后的微球采用环氧氯丙烷二次交联，环氧氯丙烷与微球的体积比为0.5-5，所得到微球加入0.001mol/L的稀盐酸除去微球中包裹的碳酸钙微粒，并在1-4mol/L氢氧化钠条件下用2-7g/L硼氢化钠还原，制成粒径为15μm～123μm的超大孔纤维素微球。
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