CN1256356C - 双乳化制备两类孔型刚性高分子介质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双乳化制备两类孔型刚性高分子介质的方法。该方法包括聚合物单体溶液和致孔剂的选择、乳化液形成、聚合反应、清洗步骤，其特征在于：将单体甲基丙烯酸缩水甘油脂、光引发剂安息香乙醚、乳化剂司班80和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯形成均匀的混合液，再将甘油水溶液致孔剂分散于混合溶液中形成乳化液；此乳化液在吐温80水溶液中形成二次乳化；整个体系在一定转速下通过紫外光引发悬浮聚合反应；反应后体系经水和无水乙醇反复清洗获得具有超大孔和扩散孔两类孔型结构的色谱分离介质。该方法制备的分离介质具有超大孔，比表面积大，介质内部传质快，适于高速下操作，洗脱条件温和，在大规模分离生物大分子具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及以双乳化技术通过紫外光引发悬浮聚合制备两类孔型高分子刚性微球分离介质的方法，属于用于生物大分子分离纯化的色谱介质制备技术。
背景技术
现代生物大分子分离纯化技术的发展，促进了生命科学、医学及医药工业的发展，液相色谱仪是生物分子分离纯化的重要工具，而其中分离介质尤为重要。因而获得优良性能的两类孔型介质是生物分离方向的重要研究课题。
为了更快更好地分离效果，人们一直尝试着找到好的色谱介质。在研究作为催化剂载体的膜和大孔聚合物时，研究人员发现当膜的孔径达到0.5μm时，只要有微小的压力差就可以引发孔内的对流传质，研究人员设想如果在色谱填料上有这种横穿介质的特大孔对流传质时，溶质便会随流动相一道进入介质的内孔表面，而不是靠浓度差进行扩散传质，从而加快传质过程。基于这一原理，Afeyan等人于1989年申请了一种多孔型高分子微球聚合物色谱介质的美国专利(US Pat 5019270)，并把这种分离过程称为灌注色谱(Perfusion Chromatography)。在灌柱色谱中，分子容易进入颗粒的内部，固定相粒子有两种孔：一类是穿透孔(6000～8000)贯穿于固定相的颗粒中，流体以对流形式通过；另一类是扩散孔(800～1500)，其与穿透孔相连组成一个网络，流体以扩散的形式通过。利用该技术制备的大孔介质的操作流速可达1500cm/h。该类介质是由苯乙烯-二乙烯基苯为骨架的。
Gustavsson和Larsson在《Journal of Chromatography A》第734卷中报道了以油相(环己烷)为液体致孔剂，采用油/水/油的两次乳化法制备超大孔琼脂糖软凝胶介质的方法(P.E.Gustavsson and P.O.Larsson.Superporous agarose，a new material for chromatography，Journal of Chromatography A，1996，743，231-240)。这类超大孔介质既保持琼脂糖软凝胶介质原有的网状结构，同时具备流通孔的特性。在此基础上，Larsson公开了采用双乳化法获得超大孔软凝胶介质的专利技术(US5,723,601)。
Minglian Zhang等人在2001年《Journal of Chromatography A》第922卷中发表的论文以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，二乙烯基苯和三聚异氰尿酸三烯丙酯为交联剂，有机致孔剂为环己醇和月桂醇，通过原位聚合反应制备了具有两类孔型聚甲基丙烯酸缩水甘油酸分离介质。实验结果表明其分离介质可以使柱内传质性能大大改善，但是由于其微粒介质形状不规则，在高流速下容易发生破碎，限制了其应用。
Yang Shi等在2003年的《Chromatographia》第57卷中发表的论文以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，二乙烯基苯和三聚异氰尿酸三烯丙酯为交联剂悬浮聚合生成两类孔型的PGDH分离介质，并已经申请了专利(CN01134656.6)。其致孔剂为固体碳酸钙和有机溶剂，制得的分离介质的在高的流速下(1535cm/h)有好的机械强度和高的动态吸附容量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生物大分子分离的两类孔型刚性微球介质的制备方法。以该方法制备的分离介质具备高机械强度、高吸附容量和高传质速率的特点，且介质的孔径、孔隙率和粒径是可控的。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。采用双乳化法光引发悬浮聚合制备两类孔型刚性介质微球。包括悬浮液的预处理与制备、双乳化反应、固化和交联过程、固体微粒中致孔剂的去除过程，其特征在于，先将单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)按照0.3～3的体积比混合制成聚合物单体溶液；再将乳化剂司班80(Span 80)、光聚合引发剂安息香乙醚溶解在上述的聚合物单体溶液中，司班80的浓度为10～100g/L单体溶液，光聚合引发剂安息香乙醚加入量相当于聚合单体体积的0.1～5％；上述溶液混合均匀后，分别加入聚合物单体体积10～100％的有机致孔剂甲苯与正庚烷，混合均匀；然后加入浓度为1～40％的甘油水溶液，甘油水溶液的加入量为聚合单体体积的10～150％；上述溶液在2000～10000rpm搅拌速度下形成的乳化液加入到浓度为10～200g/L的吐温80(Tween 80)水溶液中，在500～5000rpm搅拌速度下再次搅拌形成二次乳化，吐温80水溶液体积与聚合单体体积之比为1∶1～1∶20；上述乳化液在100～4000rpm转速下采用0.5～4kW紫外光引发悬浮聚合反应成聚合物微球，反应时间为5～30分钟；微球用无水乙醇进行抽提除去液体致孔剂和乳化剂，再经干燥即可得到两类孔型甲基丙烯酸缩水甘油脂-二甲基丙烯酸乙二醇酯(P-GMA-EDMA-DE)刚性高分子分离介质，抽提过程在常温常压下进行。
上述的优化条件：单体甲基丙烯酸缩水甘油酯与交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯体积比为0.5～0.8，司班80的浓度为25～35g/L单体溶液；有机致孔剂甲苯与正庚烷体积分别为聚合物单体溶液体积的20～90％；甘油水溶液的浓度为15～25％，其加入体积为聚合单体体积的80～120％；甘油水溶液在聚合物单体中形成乳化液所需转速为5000～8500rpm，二次乳化的搅拌速度为1000～2000rpm；二次乳化的连续相中吐温80的浓度为25～135g/L水溶液，其水溶液体积与聚合单体体积之比为1∶2～1∶12；聚合反应中紫外光的功率为1～2kW，搅拌速度为200～500rpm，反应时间为15～25分钟。
下面对本发明进行详细说明：
1、本发明采用双乳化技术形成微球。第一次乳化所用的致孔剂是甘油水溶液，选取的乳化剂是司班80，通过调节聚合反应过程中甘油水溶液加入量和乳化过程的转速可以有效地控制介质超大孔(孔径在500nm以上)的数量和大小，从而获得较为理想的传质性能；第二次乳化过程选取的乳化剂是吐温80。
2、致孔剂的选择与添加量。在乳化过程中连续相和分散相的粘度是影响乳化液分散均匀度和稳定性的重要因素。本发明将甘油作为水溶液的粘度调节剂，通过采用一定浓度的甘油水溶液使分散相在聚合物单体溶液中获得较好的稳定性。随着水相致孔剂中甘油浓度的变化，两类孔型介质中超大孔的大小与数量也会发生变化；另外由于甘油是水溶性小分子，在微球介质聚合成型后用乙醇或水多次洗涤即可除去。
3、有机致孔剂的选择与配比。根据单体与交联剂的类型，选择适宜的有机致孔剂，以便形成的两类孔型介质具有大的比表面积，本发明采用甲苯与正庚烷为有机致孔剂，可以使合成的介质比表面积大，吸附容量大，同时还可以提高微球介质的机械强度。
4、聚合方法的选择。目前分离介质大多采用悬浮热聚合反应，而本发明所用的微球的形成方法是双乳化法，其形成的体系一般状态下很不稳定，要是采用常用的热聚合法几乎不能合成所需的微球，所以本发明利用电磁搅拌下的悬浮光引发聚合生成两类孔型介质微球，反应所用光源为紫外线灯，功率是kW级的，反应器位于紫外灯正下方，反应液面离紫外线灯约30cm距离。光聚合反应比热聚合反应用时大大缩短，可以加快介质微球的制备速度。
5、乳化过程中转速的控制。本发明中微球的形成就是靠两次乳化形成的，第一次乳化的转速影响到两类孔型介质中超孔的大小及数量；第二次乳化的转速影响到微球的粒径分布。本发明的第一次乳化转速为5000～8500rpm，第二次乳化转速为1000～2000rpm。
本发明的优点是以紫外光引发悬浮聚合反应，利用甘油水溶液-油-水双乳化技术制备具有两类孔型(超大孔和扩散孔)的刚性介质。该介质的超大孔大小与介质粒径大小可以通过乳化过程调节，使操作技术更加简化；并且超大孔致孔剂是甘油水溶液，致孔剂去除也更容易，制备得到的分离刚性介质在高的流速下(3000cm/h)有好的机械强度与高的动态吸附容量。
附图说明
图1：两类孔型刚性介质在光学显微镜下的照片(10×10)，可以看到介质都是球形粒子；
图2：两类孔型刚性介质在扫描电子显微镜下的照片(1,500×)，能看到一个完整的球形粒子，并可以清晰的看到超大孔区；
图3：两类孔型刚性介质在扫描电子显微镜下的照片(10,000×)，能在上面清晰的看到超大孔与小孔。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例1
称取0.08克安息香乙醚和1.5克司班80溶解到4.5mL甲基丙烯酸缩水甘油脂(GMA)，3.0mL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)中；再加入3mL甲苯和2mL正庚烷并混合均匀。向混合液中加入8.5mL的20％的甘油溶液，以8000rpm搅拌5分钟，在显微镜下可以清楚的看到其乳化所形成的小液滴，再将搅拌好的乳化液加入到60mL含有1.8克吐温80的水溶液中，以1600rpm搅拌1分钟，然后将整个混合体系转移到带有电磁搅拌的反应器中，在2kW紫外灯下进行悬浮聚合，反应20分钟。反应产物转移到聚四氟纱袋中，用水多次洗涤，在自然条件下风干，再用无水乙醇抽提24小时，除去有机致孔剂与乳化剂，真空干燥后得到上述的两类孔型微球介质3.0克。称取1.0克两类孔型介质与5mL二氧六环和5mL二乙胺进行混合，在60℃水浴摇床200rpm反应6.5小时；待反应结束后用蒸馏水多次洗涤介质，然后向经G3漏斗抽干后的介质中加入60mL0.1mol/L的硼氢化钠溶液，在25℃水浴摇床200rpm反应12小时；用蒸馏水与无水乙醇反复洗涤，充分干燥(＜1Tor，1Tor＝133.332Pa)，得到可以用于生物分离用的阴离子交换两类孔型刚性分离介质。制备好的刚性分离介质的体积平均粒径为42.53μm，比表面积为41.085m2/g干树脂，静态吸附容量为81.7mgBSA/mg湿树脂。利用重力法在标准色谱柱(HR5/10，Amersham Biosciences)中填充制好的分离介质，在300cm/h流速下，动态吸附容量高达32.63mgBSA/mL柱体积(54.83mg BSA/mg湿树脂)，在3000cm/h流速下，动态吸附容量高达21.31mgBSA/mL柱体积(35.52mgBSA/mg湿树脂)。
实施例2
称取0.08克安息香乙醚和1.5克司班80溶解到4.5mL甲基丙烯酸缩水甘油脂(GMA)，3.0mL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)中；再加入3mL甲苯和2mL正庚烷混合均匀。向混合液中加入4.5mL的20％的甘油溶液，以8000rpm搅拌5分钟，在显微镜下可以清楚的看到其乳化的小液滴，再将搅拌好的乳化液加入到含有1.8克吐温80的60mL水中，以1600rpm搅拌1分钟，然后将整个混合体系转移到带有电磁搅拌的反应器中，在紫外灯下进行悬浮聚合，反应20分钟。反应产物转移到聚四氟纱袋中，用水洗涤，在自然条件下风干，再用无水乙醇抽提24小时，除去有机致孔剂与乳化剂，真空干燥后得到上述的两类孔型微球介质3.0克，利用二乙胺修饰分离介质，取1.0克分离介质与5mL二氧六环和5mL二乙胺进行混合，在60℃水浴摇床200rpm反应6.5小时；待反应结束后，用蒸馏水多次洗涤介质，向经G3漏斗抽干后的介质中加入60mL 0.1mol/L的硼氢化钠溶液，在25℃水浴摇床200rpm反应12小时，用蒸馏水与无水乙醇反复洗涤，充分干燥(＜1Tor，1Tor＝133.332Pa)，得到可以用于生物分离用的阴离子交换两类孔型刚性分离介质。制好的分离介质的体积平均粒径为42.0μm，静态吸附容量为80.5mgBSA/mg湿树脂。利用重力法在标准色谱柱(HR5/10，Amersham Biosciences)中填充制好的分离介质，在流速下，动态吸附容量高达27.53mgBSA/mL柱体积(54.83mgBSA/mg湿树脂)，在3000cm/h流速下，动态吸附容量为11.31mgBSA/mL柱体积(18.85mgBSA/mg湿树脂)。
Claims (2)
1.一种双乳化制备两类孔型刚性高分子介质的方法，该方法包括悬浮液的预处理与制备、双乳化反应、固化和交联过程、固体微粒中致孔剂的去除过程，其特征在于：先将单体甲基丙烯酸缩水甘油脂、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯按照0.3～3的体积比混合制成聚合物单体溶液；再将乳化剂司班80、光聚合引发剂安息香乙醚溶解在上述的聚合物单体溶液中，司班80的浓度为10～100g/L单体溶液，光聚合引发剂安息香乙醚加入量相当于聚合单体体积的0.1～5％；上述溶液混合均匀后，分别加入聚合物单体体积10～100％的有机致孔剂甲苯与正庚烷，搅拌均匀；然后加入浓度为1～40％的甘油水溶液，甘油水溶液的加入量为聚合单体体积的10～150％；上述溶液在2000～10000rpm搅拌速度下形成的乳化液加入到浓度为10～200g/L的吐温80水溶液中，在500～5000rpm搅拌速度下再次搅拌形成二次乳化，吐温80水溶液体积与聚合单体体积之比为1∶1～1∶20；上述乳化液在100～4000rpm转速下采用0.5～4kW紫外光引发悬浮聚合反应成聚合物微球，反应时间为5～30分钟；微球用无水乙醇进行抽提除去液体致孔剂和乳化剂，再经干燥即可得到两类孔型甲基丙烯酸缩水甘油脂-二甲基丙烯酸乙二醇酯刚性高分子分离介质。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：单体甲基丙烯酸缩水甘油脂与交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯体积比为0.5～0.8，司班80的浓度为25～35g/L单体溶液；有机致孔剂甲苯与正庚烷体积分别为聚合物单体溶液体积的20～90％；甘油水溶液的浓度为15～25％，其加入体积为聚合单体体积的80～120％；甘油水溶液在聚合物单体中形成乳化液所需转速为5000～8500rpm，二次乳化的搅拌速度为1000～2000rpm；二次乳化的连续相中吐温80的浓度为25～135g/L水溶液，其水溶液体积与聚合单体体积之比为1∶2～1∶12；聚合反应中紫外光的功率为1～2kW，搅拌速度为200～500rpm，反应时间为15～25分钟。
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