JP5393896B2 - アデノウイルス粒子の精製方法 - Google Patents
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Description
方法の第1工程は、細胞懸濁液中の細胞を溶解する工程を備える。細胞膜を溶解するこの第1工程は、感染した高細胞密度の懸濁液における細胞性(細胞内)および非細胞性(細胞外)の双方のアデノウイルスを採取することを可能とする。宿主細胞を界面活性剤によりウイルスを含む宿主細胞を溶解する好ましい方法は、機械的でない溶解法(例えば酵素処理)および/または機械的なせん断法(例えば中空糸限外濾過)と置き換えることができ、最大量のアデノウイルスを放出する。活性化された細胞溶解物に使用できる方法は、当業者に既知であり、例えば国際公開第98/22588号、p. 28〜35に説明されている。この点に関して実用的な方法は、例えば凍結融解、固体せん断、高張および/または低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、界面活性剤による溶解、これらの組み合わせ等である。本発明の一実施形態において、細胞は少なくとも1種の界面活性剤を使用して溶解される。溶解用界面活性剤の使用は、それが簡便な方法であり、容易に計量可能であるという利点がある。
溶解後、DNAに濃縮した選択的な沈殿剤(SPA)溶液を添加し、選択的に沈殿させ、同時に、アデノウイルス粒子を液相に残存させる。この工程は、選択的に宿主細胞DNAを沈殿除去し、下流の安定性を改良することも可能とする。本明細書に例示するように、この初期段階の沈殿工程によって、清澄化後、(宿主細胞の)核酸の少なくとも約80%が減少する。
前述の工程から得られたSPA処理した細胞溶解物は、その後、清澄化し、沈殿した不純物および細胞残屑を除去する。前記清澄化は、深層濾過によって実施することができる。仕上げの深層濾過を伴う、または伴わない遠心工程も適している。従って、沈殿した溶解物の清澄化は、遠心のみ、または、米国特許第7326555号明細書に記載されたような、深層濾過等の仕上げの清澄化工程と遠心とを連携させて達成できる。
ある実施形態において、採取したウイルス粒子はさらに精製される。さらなるウイルスの精製は、例えば本明細書に参考として援用した国際公開第2005080556号に記載されたような濃縮、限外濾過、透析濾過またはクロマトグラフィーでの分離を備えるいくつかの工程において実施できる。他の工程、例えば陰イオン交換膜クロマトグラフィー、除菌、逆相吸着、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーも使用できる。これらの工程は、例えば本明細書に参考として完全に援用した米国特許第7326555号に開示されている。当業者は、各々の精製工程の最適な条件を知っている。また、本明細書に参考として完全に援用した国際公開第98/22588号には、ウイルス粒子の生産および精製方法に関しても記載されている。
本発明の方法は、大容量化が可能である。本発明に使用した細胞培養物は、小規模培養物(例えば1〜10リットルで行う)から中規模培養物(例えば20〜1000Lで行う)、市販の大規模の調製、例えば1000〜50000Lの生産の実施までの範囲である。初期工程(溶解、深層濾過、限外濾過)は、培養容量に合わせた容量とし、一方で、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびその後の工程は、導入されるアデノウイルス粒子量に応じた容量とする。従って、後の工程の容量は、バイオリアクター生産率の推定量(1mL当り少なくとも1×1012アデノウイルス粒子(vp/mL))を基準とする。これらの高収率のアデノウイルスは、例えば高細胞密度の培養物を感染させることで得られる(例えば欧州特許第08168181.9号明細書)。これら高濃度のアデノウイルス粒子を含む高密度細胞懸濁液のさらなる精製が、本発明により可能である。多量の細胞残屑および宿主細胞DNAを含む、これらの懸濁液の処理が可能となることで、懸濁液の容量当たり多量のアデノウイルス粒子の精製が可能となる。本発明の利点は、高濃度のアデノウイルス粒子を有する高細胞密度の細胞培養バッチを処理して、処理容量当たりの収率が非常に高い状態でアデノウイルスを回収することが可能な方法を提供できることである。この方法は、大規模な細胞培養物に適用可能であるが、細胞を小規模で培養し、高細胞密度とすることで、効率的に処理可能な高アデノウイルス収率を達成することができる。この方法は、非常に濃縮されたアデノウイルスバッチの処理を可能とすることで、アデノウイルス精製工業の全体にとって、大きな影響を与えるものとなろう。
本発明は、アデノウイルスの精製に関する。本発明のアデノウイルスは、野生型の、修飾された、突然変異型の、アデノウイルスおよび/または組換えアデノウイルスベクターである。遺伝子ワクチン接種および/または遺伝子治療の応用において、「内部のない(gutless)」アデノウイルスベクターを含む、E1の欠失またはさらなる欠失を有する、第1または第2継体の複製不全アデノウイルスの使用が特に注目される。アデノウイルスゲノムは、一般的にヒトに害のない症状に関連する。ゲノムは、それぞれのベクターを構成するのに用いられる方法によっては、操作に影響を受けやすい。複製不全ウイルス、例えば組換えアデノウイルス35(rAd35)または26(rAd26)ベクター(本明細書に例示するもの)は、欠失を補足する生産細胞株を必要とする。
細胞密度最高1×106細胞/mLまでの選択的な宿主細胞DNA沈殿については、従来技術(Goerke et al (2005)、米国特許第7326555号明細書)において実施されている。それには、(低細胞密度で)宿主細胞DNAの少なくとも80%が、細胞懸濁液からのウイルス粒子収率90%>で、沈殿することができることを示す。しかしながら、高細胞密度の細胞懸濁液は多量の宿主細胞DNAおよび細胞残屑を含むため、このような選択的な沈殿が可能かどうかは全く知られていなかった。そのため、従来技術のデータが使用するDNA沈殿剤が高濃度であるとアデノウイルスも沈殿させることを示唆する一方で、より多量のDNA沈殿剤が必要となるものと予測された。
DNA沈殿を0.5L〜20Lの規模で試験した。DNA沈殿に使用したDB濃度は、上記の実験結果に基づくものである(図2)。小規模の試験管モデルとして測定された濃度C*の約80%を用いた。
Claims (3)
- 産生細胞の懸濁液からアデノウイルス粒子を精製する方法であって、
a)前記細胞懸濁液中で細胞を溶解する工程;
b)1.3〜2.2mMの濃度の臭化ドミフェンを添加し、宿主細胞DNAをアデノウイルス粒子から選択的に沈殿する工程;
c)前記アデノウイルス粒子を含む前記懸濁液を浄化し、精製されたアデノウイルスを含む懸濁液を得て、宿主細胞DNA少なくとも80%をアデノウイルスを含む懸濁液から沈殿させる工程を備える方法であって、
前記細胞懸濁液の細胞密度が、1mL当り10×10 6 〜50×10 6 細胞であることを特徴とする方法。 - 細胞密度は、1mL当り約10×106〜30×106細胞であり、臭化ドミフェン(DB)の濃度は、1.3〜2mMである、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、陰イオン交換工程および限外濾過工程をさらに備える、請求項1または2に記載の方法。
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