EA028623B1 - Способ очистки аденовирусных частиц - Google Patents

Способ очистки аденовирусных частиц Download PDF

Info

Publication number
EA028623B1
EA028623B1 EA201290200A EA201290200A EA028623B1 EA 028623 B1 EA028623 B1 EA 028623B1 EA 201290200 A EA201290200 A EA 201290200A EA 201290200 A EA201290200 A EA 201290200A EA 028623 B1 EA028623 B1 EA 028623B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
cell
adenovirus
dna
purification
Prior art date
Application number
EA201290200A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290200A1 (ru
Inventor
Марсел Лео Де Вохт
Вохт Марсел Лео Де
Марлус Венстра
Original Assignee
Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В.
Янссен Вэксинс Превеншн Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В., Янссен Вэксинс Превеншн Б.В. filed Critical Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В.
Publication of EA201290200A1 publication Critical patent/EA201290200A1/ru
Publication of EA028623B1 publication Critical patent/EA028623B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу очистки аденовирусных частиц из суспензии клеток-продуцентов, включающему лизирование клеток, отделение их ДНК от аденовирусных частиц путем селективного преципитирования ДНК бромидом домифена и очистку путем центрифугирования и/или глубинной фильтрации указанной суспензии, содержащей указанные аденовирусные частицы.

Description

Изобретение относится к области получения вирусов. Более конкретно, оно касается улучшенных способов очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии.
Область техники, к которой относится изобретение
Последние исследования в области получения вакцин показали необходимость широкомасштабного производства. Надежные и высокопродуктивные способы необходимы для поддержания в мире достаточных количеств (рекомбинантных) вакцин для борьбы с инфекционными заболеваниями.
Вакцины против инфекционных заболеваний могут иметь в основе рекомбинантные аденовирусные частицы. По этой причине огромные усилия прилагают для оптимизации процессов, основанных на клетках, для получения аденовирусов. Клетки культивируют в условиях повышающейся плотности и в дальнейшем заражают с целью получения более высокой общей вирусной продукции. Такие процессы с высокой плотностью клеток раскрыты, например, в АО 2010/060719 Сгисе11 Но11аиб ВУ и у Уик и соавт. (2004). В них описан способ получения больших концентраций рекомбинантного аденовируса. Этот оптимизированный способ основан на возможности инфицировать культуры при высокой плотности клеток (например, при более высокой чем 5х106 кл/мл) с сохранением высокой вирусной продуктивности на клетку. При этом предложен способ получения собранного вирусного раствора с высокой концентрацией вируса в одном биореакторе. Типичный выход вирусных частиц (ВЧ, УР) в указанных способах составляет приблизительно 1,5-2,5х1012 вч/мл.
Способы, в которых клетки культивируют при высоких плотностях, склонны к аккумулированию больших количеств клеточного детрита и ДНК клетки-хозяина. Эти примеси должны быть удалены в ходе дальнейшего процесса очистки, который является трудоемкой процедурой. Способ удаления ДНК клетки-хозяина из полученной клеточной культуры был раскрыт ранее в И8 7326555. Способ включает селективную преципитацию ДНК клетки-хозяина из клеточной культуры. Селективное преципитирующее средство может специфически связываться с ДНК клетки-хозяина и оставлять аденовирусные частицы непреципитированными. Способ в этой ссылке, тем не менее, описан только для клеточных культур с низкой плотностью клеток, где клеточный детрит и ДНК клетки-хозяина присутствуют в небольших количествах. До настоящего времени не было известно, можно ли использовать указанный способ в культурах, содержащих высокие плотности клеток. Напротив, в известном уровне техники можно было принять убедительное предположение, что преципитирующее средство, как применяется в указанном способе, не будет селективно преципитировать ДНК клетки-хозяина из культуры, и будет преципитировать вирусные частицы при применении в высоких концентрациях (Ооегке и соавт. 2004).
Поскольку способы культивирования клеток увеличиваются, и клетки культивируют при повышенных плотностях, в производстве существует необходимость в дальнейшем технологическом прогрессе, который позволит обрабатывать суспензии с высокой плотностью клеток. Это относится в частности к области продукции аденовируса.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способам очистки аденовирусных частиц из лизата клеток из суспензии с высокой плотностью клеток. В нем было обнаружено, что ДНК клетки-хозяина в суспензиях с высокой плотностью клеток можно селективно преципитировать из лизированной клеточной суспензии, оставив вирусные частицы непреципитированными. Селективная преципитация ДНК клетокхозяина производится при помощи катионных детергентов.
Селективная преципитация в суспензиях с низкой плотностью клеток была ранее описана, например, в И8 7326555. Достижение селективной преципитации в суспензии с высокой плотностью клеток, тем не менее, было беспрецедентным и очень ожидаемым. На самом деле, в известном уровне техники было продемонстрировано, например в ϋ8 7326555, что в суспензиях с низкой плотностью клеток (вплоть до 1х106 клеток/мл), аденовирусные частицы преципитируют при повышении концентрации катионного детергента. Это предполагает, основываясь на экстраполяции, что повышение концентрации катионного детергента в значительной степени (например, на коэффициент 2) приведет к преципитации всего объема аденовирусных частиц, имеющихся в суспензии.
В суспензиях с высокой плотностью клеток, где плотность клеток, например, в 10 раз выше и, таким образом, в 10 раз выше концентрация ДНК клетки-хозяина, ожидается, что концентрация детергента, необходимого для достижения преципитации ДНК клетки-хозяина, также будет значительно выше. Следовательно, на основании результатов суспензий с низкой плотностью клеток будет ожидаться, что такая повышенная концентрация детергента обеспечит эффект преципитации в отношении всех вирусных частиц, имеющихся в растворе.
В течение экспериментального тестирования при высоких плотностях клеток (повышенных на коэффициент 10) было обнаружено, что в противоположность любому предположению или ожиданию, основанным на известном уровне техники, повышенная концентрация катионного детергента (которая была повышена на коэффициент 2,5) действительно преципитирует ДНК клетки-хозяина (по меньшей мере 80%), но не преципитирует аденовирусные частицы. На удивление, селективный преципитирующий эффект детергента сохранился. При этом настоящее изобретение относится к способу, который можно использовать для удаления ДНК клетки-хозяина в широкомасштабных способах очистки с использова- 1 028623 нием культур с высокой плотностью клеток.
Изобретение относится к способу очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии, содержащей от 10χ106 до 50х106 клеток/мл, включающему а) лизирование клеток в указанной клеточной суспензии; Ь) отделение ДНК клеток-продуцентов от аденовирусных частиц путем селективного преципитирования ДНК домифен бромидом в концентрации, составляющей от 1,3 до 2,2 мМ; и с) очистку путем центрифугирования и/или глубинной фильтрации указанной суспензии, содержащей указанные аденовирусные частицы, в результате чего по меньшей мере 80% ДНК клеток-продуцентов удаляется из суспензии, содержащей аденовирус.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанный вирус очищают от клеточной суспензии, имеющей плотность клеток, варьирующую от 10х106 до 30х106 клеток/мл.
В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению дополнительно включает анионообменную стадию и стадию ультрафильтрации.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Восстановление аденовирусов и преципитированные ДНК клетки-хозяина, отложенные напротив концентрации домифен бромида в суспензиях с низкой (2,5х106-3,5х106 вч/мл) и высокой (20х 106-30х 106 вч/мл) плотностью клеток.
Фиг. 2. Восстановление аденовирусов и преципитированные ДНК клетки-хозяина, отложенные напротив концентрации домифен бромида в суспензиях с низкой (2,5х106-3,5х106 вч/мл) и высокой (18 χ 106-25χ 106 вч/мл) плотностью клеток.
Подробное описание фигур
Настоящее изобретение относится к способам очистки аденовирусных частиц из клеточного лизата из суспензии с высокой плотностью клеток.
В соответствии с изобретением суспензии с высокой плотностью клеток получают путем культивирования клеток до высокой плотности клеток. Такое культивирование можно проводить (без ограничений) в периодическом режиме, в режиме периодических культур с подпиткой или в режиме перфузии. Способы культивирования клеток до высоких плотностей клеток известны специалистам в данной области техники. Специфические способы получения культур с высокой плотностью клеток раскрыты, например, в АО 2004/099396, АО 2005/095578, АО 2008/006494, АО 2010/060719.
В соответствии с настоящим изобретением плотность клеток в указанной выше суспензии с высокой плотностью клеток варьирует от приблизительно 10χ106 и 50χ106 клеток/мл, например по меньшей мере приблизительно 15χ106 клеток/мл, например по меньшей мере приблизительно 20χ106, например по меньшей мере приблизительно 25χ106, например до приблизительно 30χ106 клеток/мл, например до приблизительно 35χ106 клеток/мл, например до приблизительно 40χ106 клеток/мл, например до приблизительно 45χ106 клеток/мл.
В соответствии с настоящим изобретением культуры с высокой плотностью клеток в дальнейшем инфицируют аденовирусными частицами с целью разрешения репродуцирования указанного аденовируса в клеточной культуре. При этом суспензии с высокой плотностью клеток, которые содержат высокие концентрации аденовируса, получают в одном биореакторе. Способы инфицирования культур с высокой плотностью клеток известны специалистам в данной области техники. Специфические способы получения культур с высокой плотностью клеток с высокой концентрацией аденовируса раскрыты, например, в ЕР 08168181.9, Сойш и соавт. (2004) и Уик и соавт. (2004). Эти ссылки описывают процессы для продукции больших количеств рекомбинантного аденовируса. Эти процессы основаны на возможности инфицировать культуры с высокой плотностью клеток с сохранением высокой аденовирусной продуктивности в клетке. При этом предлагают способ получения суспензии с высокой плотностью клеток с высокой концентрацией аденовируса в одном биореакторе. Типичный результат настоящих процессов, например, для рекомбинантного аденовируса 35 (гЛб35) составляет приблизительно 1,5-2,5χ1012 вч/мл. Как только произошла репродукция аденовируса в клеточной культуре, аденовирусные частицы являются, согласно настоящему изобретению, очищенными от суспензии с высокой плотностью клеток.
Способ согласно настоящему изобретению на первой стадии включает лизис клеток, содержащихся в суспензии с высокой плотностью клеток. Лизис суспензий с высокой плотностью клеток, которые инфицированы аденовирусными частицами, вызывает появление больших количеств клеточного детрита и ДНК клетки-хозяина для накопления в клеточной суспензии. Эти накопления приводят к последующей по течению обработке трудоемкой клеточной суспензии.
Настоящее изобретение относится к способу, подходящему для очистки аденовирусных частиц из клеточного лизата суспензий с высокой плотностью клеток. Большое количество ДНК клетки-хозяина селективно преципицируют от аденовирусных частиц в суспензии с высокой плотностью клеток при помощи добавления селективного преципитирующего средства к клеточному лизату так, что по меньшей мере 80% молекул ДНК клетки-хозяина преципитируются от суспензии с высокой плотностью клеток, содержащей аденовирусные частицы. Как раскрыто здесь, стадия преципитации обеспечивает преципитацию контаминирующей ДНК клетки-хозяина по меньшей мере с 80% снижением содержания ДНК клетки-хозяина, предпочтительно 90% и даже более предпочтительно, как приведено в примере здесь,
- 2 028623 приблизительно 95% снижением содержания ДНК клетки-хозяина последующим очисткам (например, глубинной фильтрацией).
Лизис
Первая стадия процесса включает лизис клеток в клеточной суспензии. Эта первая стадия, где клеточные мембраны лизируются, позволяет собрать как клеточно-ассоциированный (внутриклеточный), так и неассоциированный (внеклеточный) аденовирус из инфицированной суспензии с высокой плотностью клеток. Лизис детергентом клетки-хозяина, который является предпочтительным методом лизирования клетки-хозяина, содержащей вирус, можно заменить методами немеханического лизиса (такого как обработка энзимом) и/или методами механического сдвига (таким как поливолоконная ультрафильтрация) для высвобождения максимальных количеств аденовируса. Методы, которые можно применять для активного клеточного лизиса, известны специалистам в данной области техники и, например, обсуждаются в \νϋ 98/22588, с. 28-35. Полезными методами в этом отношении являются, например, замерзание-оттаивание, твердый сдвиг, гипертонический и/или гипотонический лизис, жидкий сдвиг, разрушение ультразвуком, прессование под высоким давлением лизис детергентом, комбинация вышеперечисленных методов и т.п. В одном варианте осуществления в изобретении клетки лизируют по меньшей мере одним детергентом. Применение детергента для лизиса имеет преимущество в виде простоты этого метода и его легкой масштабируемости.
Детергенты, которые можно использовать, и путь их использования в целом известны специалисту в данной области техники. Несколько примеров обсуждены, например, в νθ 98/22588, с. 29-33. Детергенты в рамках изобретения могут включать, но не ограничиваются анионными, катионными, цвиттерионными и неионными детергентами. Примерами детергентов являются, например, Тгйои и/или Ро1у8огЪа1е-80. В одном варианте осуществления используемым детергентом является Тгйои Х-100. К тому же сольвент, такой как ΤΝΒΡ, можно добавить к лизату или очищенному лизату в низкой концентрации для дополнения этих детергентов в их способности инактивировать захваченные вирусы. Также аутолизис инфицированных аденовирусом клеток-хозяев может предоставить существенное высвобождение внутриклеточного аденовируса и может быть использован в процессах в изобретении. Таким образом, любую форму лизиса клетки-хозяина, которая известна в данной области техники, можно применять для высвобождения внутриклеточного вируса в среду культуры клетки-хозяина для окончательного сбора при помощи любых методов, раскрытых здесь. Специалистам в данной области техники ясно, что оптимальная концентрация детергента может варьировать, например, в промежутке от приблизительно 0,1 до 1% (мас./об.).
Селективная преципитация
Вслед за лизисом ДНК селективно преципитирует при помощи добавления концентрированного раствора селективного преципитирующего средства (ЗРА), который оставляет аденовирусные частицы в жидкой фазе. Эта стадия обеспечивает селективную преципитацию ДНК клетки-хозяина, а также улучшает последующую надежность. Как пояснено здесь, эта ранняя фаза стадии преципитации приводит к приблизительно по меньшей мере 80% снижению в нуклеиновой кислоте (клетки-хозяина) следующего очистки.
ЗРА, который может быть полезным в применении в настоящем изобретении, включает, но ни в коей мере не ограничивается сополимерами аминов, соединениями четвертичного аммония и любой соответствующей смесью вышеперечисленных веществ. Более конкретно, многие формы полиэтилена (ΡΕΙ) очень эффективны в нейтрализации избытка анионного заряда (примеси ДНК). Перечень возможных 8РА, которые можно применять соответствующим образом в настоящем изобретении, дан в ИЗ 7326555 (колонка 12, строки 56-67 и колонка 13, строки 1-28), указанная здесь посредством ссылки. Соответствующие ЗРА для применения в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются, следующими классами и примерами средств, имеющихся в продаже: солями моноалкилтриметиламмония (примеры средств, имеющихся в продаже, включают цетилтриметиламмония бромид или хлорид в виде СТАВ, тетрадецилтриметилаамония бромид или хлорид (ТТА), алкилтриметиламмония хлорид, алкиларилтриметиламмония хлорид, додецилтриметиламмония бромид или хлорид, додецилдиметил-2феноксиэтиламмония бромид, гексадециламин: соли хлориды или бромиды, додециламин или соль хлорид и цетилдиметилэтиламмония бромид или хлорид), соли моноалкилдиметилбензиламония (примеры включают алкилдиметилбензиламмония хлориды и бензетония хлорид в виде ВТС), соли диалкилдиметиламмония (товарные продукты включают домифен бросид (ΌΒ), галогениды дидецилдиметиламмония галогенид и октилдодецилдиметиламмония хлорид или бромид), гетероароматические соли аммония (торговые продукты включают галогениды цетилпиридина (СРС) или соли бромиды и гексадецилпиридин бромид или хлорид), цис-изомер 1-[3-хлороаллил]-3,5,7-триаза-1-азониаадамантан, алкилизохинолина хлорид и алкилдиметилнафтилметиламмония хлорид (ВТС 1110). Полизамещенные соли четвертичного аммония (имеющиеся в продаже продукты включают, но не ограничиваются алкилдиметилбензиламмония сахаринатом и алкилдиметилэтилбензиламмония циклогексилсульфаматом), втор-соли четвертичного аммония (примеры продуктов включают 1,10-втор-(2-метил-4-аминохинолинхлорид)декан, 1,6-втор-{1-метил-3-(2,2,6-триметилциклогексил)пропилдиметиламмония хлорид} гексан или триклобисония хлорил, и втор-четвертичное аммонийное соединение под названием СОЦ от Висктап Вгосйигек) и
- 3 028623 полимерные соли четвертичного амония (включают полиионены, такие как поли[оксиэтилен(диметилимино)этилен(диметилимино)этилендихлорид], поли[Ы-(3-диметиламминий)пропил]-Н-[3(этиленоксиэтилендиметиламмоний)пропил]дихлорид мочевины, и альфа-4-[1-трет-(2-гидроксиэтил)]аммония хлорид). Как специалисты в данной области техники понимают из И8 7326555, где несколько из них были показаны в работе и где было показано, что специалист в данной области может легко установить подходящие концентрации для этих соединений для селективной преципитации ДНК, это примеры 8ΡΆ, и, основываясь на раскрытии здесь и на раскрытии текущего изобретения, ясно, что они будут также подходящими для настоящего изобретения.
В настоящем изобретении в предпочтительном варианте осуществления используют катионные детергенты. В еще более предпочтительном варианте осуществления в настоящем изобретении используют соли диалкилдиметиламмония, такие как домифен бромид (ΌΒ). Домифен бромид используют в качестве селективного преципитирующего средства для очистительных процессов, которые требуют удаления любого числа клеточных компонентов, особенно нуклеиновых кислот, из любого числа различных типов биологических продуктов, включая, но не ограничиваясь вирусными частицами, вирусоподобными частицами или любыми другими биологическими продуктами, которые можно существенно отделить от контаминирующего компонента, основанного на культуре при помощи стадии селективной преципитации. Среди большого числа потенциальных 8ΡΑ, которые можно применять на практике в настоящем изобретении, домифен бромид представляет особенный интерес, во-первых, из-за его доступности в качестве основного исходного материала ГМФ (ΟΜΡ) и современного применения в других продуктах, направленных на применение человеком. Более конкретно, поскольку домифен бромид широко применяют в качестве активного ингредиента в продуктах для гигиены ротовой полости, а так же и в топических антибиотических кремах, эту молекулу выпускают в больших количествах и реализуют в условиях цГМФ (сСМР).
Оптимальная концентрация 8ΡΑ, которую применяют в суспензиях с высокой плотностью клеток для преципитирования ДНК клетки-хозяина из клеточной суспензии, определена здесь. Хотя на основании известного уровня техники ожидалось, что аденовирусные частицы будут немедленно преципитировать при взаимодействии с высокими концентрациями 8ΡΑ, неожиданно аденовирусные частицы остались непреципитированными. На самом деле, в известном уровне техники, например в И8 7326555, показано, что в суспензиях с низкой плотностью клеток (до 1х106 клеток/мл) аденовирусные частицы преципитируют, когда концентрацию катионного детергента повышают. Суспензия, полученная путем лизиса культур с высокой плотностью клеток, как описано здесь, будет содержать сильно увеличенные количества ДНК клетки-хозяина и других примесей и будет, таким образом, требовать повышенных количеств катионного детергента (например, повышенного на коэффициент 2,5). На основании экстраполяции результатов при низкой плотности клеток ожидают, что это повышение концентрации катионного детергента приведет к преципитации всех аденовирусных частиц, имеющихся в суспензии.
Неожиданно оказалось, что при высоких концентрациях 8ΡΑ селективное удаление контаминирующих ДНК клетки-хозяина из суспензии с высокой плотностью клеток, содержащей аденовирусные частицы, все еще возможно. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 8ΡΑ, предпочтительно ΌΒ, добавляют к концентрации, варьирующей от 1,2 до 5 ммоль. В еще более предпочтительном варианте осуществления 8ΡΑ, предпочтительно ΌΒ, добавляют к концентрации, варьирующей от 1.3 до 2,2 ммоль, например от 1,4 до 2 ммоль, например от 1,4 до 1,8 ммоль, например от 1,5 до 1 ммоль. На основании настоящего раскрытия ясно, что специалисты в данной области техники знают, как определить подходящие окна концентрации 8ΡΑ для заданной клеточной плотности в период сбора.
Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус суспензии с высокой плотностью клеток, включающей плотность клеток, варьирующую от 10х106 до 150х106 клеток/мл, варьирует приблизительно от 1,2 до 5 ммоль. Подходящая концентрация ΌΒ для обработки сбора содержащей аденовирус суспензии с высокой плотностью клеток, включающей плотность клеток, варьирующую от 10х106 до 30х106 клеток/мл, варьирует приблизительно от 1,3 до 2 ммоль, например, приблизительно от 1.4 до 1,9 ммоль, например, приблизительно от 1,4 до 1,8 ммоль, например, приблизительно от 1,4 до 1,7 ммоль, например, приблизительно от 1,45 до 1,65 ммоль, например, приблизительно составляет от 1,5 до 1,55 ммоль.
Нуклеазы (включающие, но ни в коей мере не ограничивающиеся ΒΕΝΖΟΝΑ8Ε™, ДНКазами и РНКазами) больше не требуются на этой стадии, но могут быть все еще полезными для максимального уменьшения содержания ДНК. В свете возможности на этой стадии преципитации убрать большую часть контаминирующих нуклеиновых кислот более поздняя стадия анионообменной хроматографии (АЕХ) может не являться основной для очистки продукта (в зависимости от окончательной дозы). Тем не менее, стадия АЕХ может оставаться в процессе для надежности.
В компетенции специалиста будет тестирование потенциальных замен для 8ΡΑ, раскрытых здесь, для определения компонента, который эффективно преципитирует молекулы нуклеиновой кислоты и другой клеточный детрит от аденовирусных частиц, как представлено здесь для домифен бромида (ΌΒ). Следовательно, это настоящее изобретение частично относится к способам очистки аденовирусных час- 4 028623 тиц из суспензий с высокой плотностью клеток, которые включают селективную преципитацию молекул нуклеиновых кислот клетки-хозяина от аденовирусных частиц в постлитической суспензии с высокой плотностью клеток путем добавления селективного преципитирующего средства в постлитическую среду культуры клетки-хозяина.
Очистка
Обработанный δΡΑ клеточный лизат, полученный в предыдущих стадиях, далее очищают для удаления преципитированных примесей и клеточного детрита. Указанную очистку можно провести при помощи глубинной фильтрации. Центрифугирование с или без доочистительной глубинной фильтрации также является возможным. Следовательно, очистку преципитированного лизата можно выполнить только при помощи центрифугирования или при помощи центрифугирования совместно со стадией доочистительной очистки, такой как глубинная фильтрация, как описано в υδ 7326555.
В выборе фильтра или схемы фильтрации необходимо подтвердить надежность выполнения при появлении изменений предстоящего события или вариаций. Поддержание баланса между хорошим выполнением очистки и стадией результата можно исследовать при помощи тестирования фильтров различного типа с различающейся внутренней средой. Подходящие фильтры могут включать целлюлозные фильтры, регенерированные волокна целлюлозы, волокна целлюлозы в комбинации с неорганическими вспомогательными фильтровальными веществами (например, диатомитовая земля, перлит, коллоидальная двуокись кремния), волокна целлюлозы в комбинации с неорганическими вспомогательными фильтровальными веществами и органическими смолами или любую комбинацию вышеперечисленных веществ, и полимерные фильтры (примеры включают, но не ограничиваются нейлоном, полипропиленом, полиэфирсульфоном) для достижения эффекта удаления и приемлемого вирусного восстановления. В целом, многостадийный процесс является предпочтительным, но не требуемым. Примерный двух- или трехстадийный процесс состоит из крупнодисперсного(ых) фильтра(ов) для удаления преципитата и клеточного детрита с последующей доочисткой фильтром(ами) вторичной очистки с номинальным размером пор более 0,2 мкдюйма, но менее 1 мкдюйма. Оптимальная комбинация будет функцией распределения размера преципитата, так же как и других вариантов. К тому же одна стадия действий с применением относительно малопропускающего фильтра или центрифугирования также может давать продукт хорошего качества. Если говорить более в целом, любой подход к очистке, включая тупиковую фильтрацию, микрофильтрацию, центрифугирование или основную подпитку вспомогательными фильтровальными веществами (например, диатомитовой землей) в комбинации с тупиковой или глубинной фильтрацией, которая предоставляет фильтрат подходящей чистоты для незасорения мембраны, и/или смола в следующей стадии, будут приемлемыми для применения в условиях настоящего изобретения. Г лубинная фильтрация является надежным способом очистки для настоящего изобретения.
Имеющиеся в продаже мембраны для глубинных фильтров раскрыты в υδ 7326555 (колонка 14, строка 65 до колонки 15, строки 19), включенной в данное изобретение посредством ссылки.
Комбинация стадий преципитации и очистки удаляет по меньшей мере 70%, более вероятно по меньшей мере 80% и даже предпочтительно по меньшей мере 90% ДНК клетки-хозяина от аденовирусных частиц после очистки (например, только такой, как глубинная фильтрация или глубинная фильтрация в сочетании со стадией доочищающей глубинной фильтрации).
Способы дополнительной очистки
В конкретных вариантах осуществления собранные вирусные частицы дополнительно очищают. Дополнительную очистку вируса можно проводить при помощи нескольких стадий, включающих концентрирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию или разделение с хроматографией, как описано, например, в \νϋ 2005080556, включенной в настоящее изобретение посредством ссылки. Другие стадии, такие как анионообменная мембранная хроматография, стерилизующее фильтрование, обратнофазное адсорбирование, гидроксиапатитная хроматография, также можно применять. Эти стадии, например, раскрыты в υδ 7326555, полностью включенном в настоящее изобретение посредством ссылки. Специалисту в данной области техники известно, как найти оптимальные состояния для каждой стадии очистки. Также в νθ 98/22588, полностью включенной в настоящее изобретение посредством ссылки, описаны способы для получения и очистки вирусных частиц.
В конкретных вариантах осуществления, в соответствии с изобретением, очищенная, содержащая аденовирусные частицы суспензия может быть обработана ультрафильтрацией.
Ультрафильтрацию используют для концентрации вирусной суспензии. Суспензию можно концентрировать от 5 до 20 раз и, возможно, обработать нуклеазой (как указано здесь и выше). Другой аспект изобретения представляет собой последующее введение обменного буфера посредством диафильтрации. Диафильтрация или буферный обмен с применением ультрафильтров представляет собой способ для удаления и обмена солей, сахаров и т.п. Специалистам в данной области техники известно, при каких состояниях должен иметь место буферный обмен, и какие буферы являются подходящими для этой стадии.
Особенная выбираемая ультрафильтрационная мембрана имеет размер достаточно маленький, чтобы удержать аденовирусные частицы, но достаточно большой, чтобы эффективно очистить примеси. В зависимости от производителя и типа мембраны номинальный молекулярный вес отрезков от 10 до 1000
- 5 028623 кДа может быть подходящим. Предпочтительной является ультрафильтрация с применением режима тангенциального перпендикулярного потока. В указанном режиме стадию можно контролировать при помощи установления фиксированного перпендикулярного потока с или без обратного фильтрационного давления на концентратном возврате, установления фиксированного трансмембранного давления или установления как перпендикулярного потока, так и режимных параметров.
Обработку нуклеазой также можно считать включенной в способ на данном этапе, но ни в коей мере не требуемой.
Обработка нуклеазой может включать применение широкого спектра нуклеаз (например, ΒΕΝΖΘΝΆδΕ™), ДНКаз, РНКаз или комбинации вышеперечисленных веществ. Действие нуклеазы или смеси из РНКазы и ДНКазы является предпочтительным. Стадию нуклеазной обработки можно намечать на любой стадии процесса, до тех пор пока остаточное нуклеазное содержание в конечном продукте является приемлемым для применения. Является предпочтительным, чтобы обработку нуклеазой производили после стадий очистки и концентрирования, но перед стадией анионообменной хроматографии.
В соответствии с изобретением следующая стадия может быть стадией анионообменной хроматографии. Во время указанной стадии аденовирусные частицы связываются с положительно заряженным материалом, например мембраной, модулем фильтра или колонкой. Последующее элюирование позволяет отделить аденовирусные частицы от примесей и оставшихся ДНК клетки-хозяина.
Для очистки аденовируса при помощи мембранного абсорбента МикГаид О концентрация №С1 для загрузки и промывания может быть предположительно в любом диапазоне от 0,3 до 0,4 моль при рН 7,5 и сместится при изменении рН. Более предпочтительной концентрацией №С1 является 0,35 моль. рН буферов должна быть достаточно высокой для связывания аденовируса (больше чем приблизительно 6,5). К тому же рН буферной системы также должен быть достаточно низким для избежания вирусной нестабильности. Точный максимальный рН, который может быть использован, зависит от специфического профиля стабильности аденовируса и буферных компонентов и может быть определен специалистом в данной области техники для этого конкретного применения. Для примера, но ни в коем случае не для ограничения, рН может потенциально лежать в диапазоне приблизительно от 5 до 10.
Присутствие 0,1% Ρδ-80 в буферах является высокопредпочтительным для достижения низких резидуальных уровней ДНК в продукте, поскольку он аттенуирует ассоциации аденовирус/ДНК и агрегации аденовируса. В области обычного экспериментирования для специалиста в данной области техники находится установление более высоких или низких концентраций детергента или альтернативных детергентов, которые полезны для активирования диссоциации аденовирусных частиц от другого аденовируса, а также других различных клеточных примесей. В той же области экспериментирования специалист в данной области техники может выбирать альтернативный детергент для буферного процесса. Примеры таких альтернативных детергентов могут быть обнаружены в И8 7326555. Продукты анионообменной мембранной хроматографии, такие как выпускаемые Ра11 (например, серия МикГаид™) и §агйгш8 (например, серия ЗагГоЫиб), являются подходящими для очистки вирусов в соответствии с настоящим изобретением. В патенте США 6485958 или в \УО 05/080556 описано применение анионообменной хроматографии для очистки рекомбинантного аденовируса.
Связывающая способность для вирусов на мембранном абсорбенте, таком как МикГаид О (Ра11 СогрогаГюи), является чрезвычайно высокой и составляет порядка 7х1013 вч/мл. Другие мембранные абсорбенты и смолы, которые являются подходящими для очистки вирусов в этом способе, включают, но ни в коей мере не ограничиваются §оигсе 150 и §оигсе 300 (СЕ 1ΐ& 5С1спес5). 0-§ерйаго8е ХЬ (СЕ 1Ие 5С1СПСС5). РгасГоде1 ТМАЕ (ЕМ шбикГпек), 8агйЪшб О (§агйгш8), ЛбкерГ О (ΝηΙηχ верагаГюик), С1М ОЛ (ΒΙΑ 8ерагайои8). Элюирование аденовируса предпочтительно производится при помощи буфера, содержащего №С1. Специалистам в данной области техники известно, как оптимизировать концентрацию №С1.
В конкретных вариантах осуществления является предпочтительным использование по меньшей мере одной стадии анионообменной хроматографии. После одной стадии анионообменной хроматографии аденовирус может быть достаточно очищенным. Тем не менее, в конкретных вариантах осуществления эксклюзионная хроматография дополнительно проводится для повышения надежности процесса. Эта стадия может иметь место до или после стадии анионообменной хроматографии. Очевидно, что другие стадии очистки также могут сочетаться подходящим образом со стадией анионообменной хроматографии. Применение анионообменной хроматографии для очистки аденовируса подробно описано, и этот аспект, таким образом, является хорошо доступным специалистам в данной области техники. Много различных хроматографических матриц применяются для очистки аденовируса и являются подходящими. Специалисты в данной области техники могут легко определить оптимальный анионообменный материал для очистки указанного аденовируса.
В любом частном варианте осуществления настоящего изобретения анионообменный продукт может подвергаться диафильтрации в буферной смеси и стерильной фильтрации. Как вариант, дополнительную стадию хроматографии (например, катионообменную) можно добавить как до, так и после диафильтрации с возможностью улучшения надежности очистки примесей и/или вируса/приона.
- 6 028623
Также возможно проведение на этой стадии дополнительной ультрафильтрации. Тангенциальная поточная фильтрация является полезной в отношении удаления резидуального протеина и нуклеиновой кислоты, а также для обмена аденовируса в буферной смеси. Выбор между мембранами в 300 и 500 кДа продиктован выбором оптимального соотношения между результатом или улучшенной очисткой примесей. Другие мембранные конфигурации (такие как половолоконная) являются приемлемым вариантом замены. Выбранные мембраны для ультрафильтрации имеют размер, достаточно маленький для удержания аденовирусных частиц, но достаточно большой для эффективной очистки примесей. В зависимости от производителя и типа мембраны номинальный молекулярный вес отрезков между 100 и 1000 кДа будет подходящим.
Стадия стерильной фильтрации может быть включена в способ для способствования элиминации бионагрузки. Продукт можно пропустить через модифицированную 0,22-микронную поливинилиденфторидовую мембрану (РУЭР) (например, МйНроте МПНрак).
Возможные стадии дальнейшей обработки могут быть добавлены к способу. Они могут включать, например, стадию эксклюзионной хроматографии, стадию обратнофазной адсорбции и/или стадию гидроксиапатитной хроматографии. Больше деталей по каждой из этих стадий можно найти, например, в И8 7326555, АО 03/097797, АО 02/44348.
В международной заявке АО 97/08298 описана очистка аденовирусов при помощи конкретных хроматографических матриц для предотвращения повреждения вирусов, включающая анионообменную и эксклюзионную стадии.
Конкретные способы ультрафильтрации также являются очень подходящими для очистки аденовируса, как раскрыто в АО 2006/108707. Такие стадии можно осуществлять в дополнение или вместо конкретных хроматографических стадий очистки.
Масштаб систем клеточных культур и систем дальнейшей обработки
Способ согласно настоящему изобретению является шкалируемым. Клеточные культуры, используемые в настоящем изобретении, варьируют от мелкомасштабных (например, 1-10 л партии) до среднемасштабных культур (например, 20-1000 л партии) вплоть до крупных торговых шкалируемых препаратов, таких как 1000-50000 л партии. Начальные стадии процесса (лизис, глубинная фильтрация и ультрафильтрация) шкалируются объемом культуры во время анионообменной хроматографии, а последующие стадии шкалируются введением аденовирусных частиц. Следовательно, размер более поздних стадий основывается на оценке продуктивности биореактора, равной по меньшей мере 1х1012 аденовирусных частиц в 1 мл (вч/мл). Эти высокие аденовирусные выходы могут быть получены, например, путем инфицирования культур с высокой клеточной плотностью (как описано, например, в ЕР 08168181.9). В настоящем изобретении возможна дальнейшая очистка этих суспензий с высокой плотностью клеток, содержащих высокие концентрации аденовирусных частиц. Возможность обрабатывать эти суспензии, которые содержат высокие концентрации клеточного детрита и ДНК клетки-хозяина, позволяет очищать большие количества аденовирусных частиц на объем суспензии. Преимуществом настоящего изобретения является разработка способа обработки партии клеточной культуры с высокими плотностями клеток, содержащей высокие концентрации аденовирусных частиц, и вместе с этим обеспечение высокого аденовирусного выхода на обработанный объем. Настоящий способ, хотя он и применим к высокомасштабным клеточным культурам, позволит культивировать клетки при меньшем масштабе, но при более высоких клеточных плотностях и при возможности достичь высокого аденовирусного выхода, который может быть дополнительно эффективно обработан. Этот способ предполагает возможность обрабатывать высококонцентрированные аденовирусные партии, что привнесет огромный вклад во всю индустрию очистки аденовирусов.
Аденовирус и клетки-продуценты
Изобретение относится к очистке аденовируса. Аденовирус, в соответствии с этим изобретением, может быть любого дикого типа, модифицированным, мутировавшим аденовирусом и/или рекомбинантным переносчиком аденовируса. Особенный интерес в использовании генной вакцинации и/или генной терапии представляет собой применение первого или второго поколения неспособных к репликации аденовирусов, поврежденных Е1 или дополнительными делециями, включая вялые аденовирусные переносчики. Геном аденовируса в целом связывают с доброкачественными патологиями у людей. Геном ответственен за манипуляции, зависящие от принципов, используемых для создания соответствующего переносчика. Переносчик неспособного к репликации вируса, такого как рекомбинантный аденовирус 35 (тА435) или 26 (тА426) (как пояснено здесь), нуждается в линии клеток-продуцентов, которые дополняют делеции.
Клетка-продуцент (иногда также называемая в области техники и здесь пакующая клетка или дополняющая клетка или клетка-хозяин) может быть любой клеткой-продуцентом, в которой может происходить репродуцирование желаемого аденовируса. Например, репродуцирование переносчиков рекомбинантного аденовируса происходит в клетках-продуцентах, которые дополняют недостаток аденовируса. Такие клетки-продуценты предпочтительно имеют в своем геноме, по меньшей мере, последовательность аденовируса Е1 и, таким образом, способны дополнять рекомбинантные аденовирусы с делецией в области Е1. Дополнительно аденовирус может иметь делецию в области Е3, которая является
- 7 028623 допустимой для Ай генома, и, следовательно, она не нуждается в дополнении. Можно применять любую Е1-дополняющую клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки человека, увековеченные при помощи Е1, например, 9 11 или РЕИ.С6 клетки (см. патент υδ 5994128), Е1-трансформированные амниоциты (см. патент ЕР 1230354), Е1-трансформированные А549 клетки (см., например, \УР 98/3941 1, патент И8 5891690), СН329:НеЬа (Сао и соавт., 2000, Нитап Сеие ТЬегару 11:213-219), 293 и т.п. В конкретных вариантах осуществления клетки-продуценты представляют собой, например, НЕК293 клетки или РЕИ.С6 клетки или 911 клетки или 1Т2 93δΡ клетки и т.п. Предпочтительно РЕИ.С6 клетки (ЕСАСС заявка № 96022940, представленная для регистрации 29 февраля 1996 г. в ЕСАСС, САМИ, Ройои Όο\\η. δа1^8Ъшу δР4 01С, Великобритания; см. патент υδ 5994128) или полученные из них клетки применяются в качестве клеток-продуцентов.
Неспособные к репликации переносчики аденовируса можно получить при помощи применения любых видов, штаммов, подтипов или смеси видов, штаммов или подтипов аденовируса или гибридного аденовируса в качестве источника ДНК переносчика (см., например, \УО 96/26281, \УО 00/03029), которую, например, может предоставить аденовирусный переносчик со способностью инфицирования конкретных желаемых типов клеток. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве аденовируса применяют гАй35 или гАй26.
Специалисту в данной области техники известны возможности к репродуцированию аденовирусных переносчиков различных серотипов в специфических клетках-хозяевах при помощи способов, которые раскрыты, например, в υδ патенте 64 92169 или в \УО 03/104467 и ссылках в них. Например, для репродуцирования гАй35 с Е1-недостаточностью можно создать специфические клетки-продуценты, которые экспрессируют Е1В-55К Ай35, например, основанные на существующих клетках-продуцентах, которые экспрессируют Е1А и Е1В Ай5, такие как РЕИ.С6 или НЕК293 клетки (см., например, υδ 6492169), как известно специалистам в данной области техники. В качестве альтернативы и предпочтительно, существующие (Ай5-) дополняющие клеточные линии, такие как, например, РЕИ.С6 или НЕК293, можно применять без модифицирования клеток для репродуцирования гАй35с или гАй26 с Е1недостаточностью путем включения Е4-огГ6 кодирующей последовательности Ай5 в переносчик гАй35с или гАй26, как подробно раскрыто, например, в \УО 03/104467, включенной в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, репродуцирование аденовирусных переносчиков любых серотипов может происходить в клетках-продуцентах при помощи средств и способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Аденовирусные переносчики, способы их создания и способы их репродуцирования хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в патентах США № 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и ТЬотак δΙκαιΕ Айеиоушйае апй Шеи Керйсайоп, М. δ. НогМи, АйепоуЕ гикек, Главы 67 и 68 соответственно, в У1го1оду, Β.Ν. Ие1Й8 и соавт., ей8., 3-е изд., Вауеп Рге88, Ый, НьюЙорк (1996), и в других ссылках, упомянутых здесь.
Изобретение дополнительно объяснено в следующих примерах. Примеры не ограничивают изобретение ни в коей мере. Они всего лишь служат для освещения изобретения.
Примеры
Пример 1. Селективная преципитация ДНК клетки-хозяина в суспензиях с высокой плотностью клеток.
Селективная преципитация ДНК клетки-хозяина продемонстрирована в известном уровне техники (Соегке и соавт., υδ7326555) для клеточных плотностей вплоть до 1х106 клеток/мл. В ней показано, что (при низких клеточных плотностях) по меньшей мере 80% ДНК клетки-хозяина преципитируется из суспензии клеток с 90%> восстановлением вирусных частиц. Тем не менее, до настоящего времени полностью не известно, является ли такая селективная преципитация возможной при высокой плотности клеток, поскольку такие суспензии клеток содержат намного большие количества ДНК клетки-хозяина и клеточного детрита, и, таким образом, предполагается, что потребуются гораздо большие количества ДНК преципитирующего средства, тогда как экстраполяция данных из известного уровня техники предполагает, что такие более высокие концентрации ДНК преципитирующего средства также будут преципитировать аденовирус.
С целью изучения возможности преципитации ДНК при высоких плотностях клеток преципитацию ДНК клетки-хозяина тестировали в мелкомасштабных тестовых пробирках, содержащих плотность клеток вплоть до 30х106 клеток/мл. Модель мелкомасштабной тестовой пробирки использовали в качестве быстрого скринингового инструмента для тестирования, имеет ли место селективная преципитация ДНК при высоких плотностях клеток.
РЕИ.С6 клетки выращивают в биореакторе и инфицируют Аденовирусом 35 (Ай35) и выращивают при 37°С в свободной от сыворотки культурной среде в течение 3 дней. Клетки собирают при плотности клеток между 2 и 30х106 клеток/мл, и титр вируса составляет от 8х1010 до 1,5х1012 вч/мл. Лизис клеток производят в течение некоторого периода времени, равного от 2 до 24 ч, при помощи добавления неионных детергентов ТгПоп Х-100 и Т\уееп-80 до окончательных концентраций, равных 0,1 и 0,05% соответственно. Увеличенные концентрации домифен бромида (ΌΒ) в 40 ммоль ΝηΟ добавляют к 3,5 мл лизи- 8 028623 рованного сбора, вслед за этим следует интенсивное перемешивание в течение 1 мин. Преципитированный материал удаляют при помощи 0,45 мкдюймовых поливинилиденфторидовых (РУЭР) шприцевых фильтров. Фильтраты изучают на предмет концентраций АЙ35 и ДНК клетки-хояина, применяя НРЬСАЕХ и ф-РСР анализы соответственно.
Фиг. 1 демонстрирует восстановление вируса и преципитированные ДНК клетки-хозяина, отложенные напротив концентрации домифен бромида. Кривые, изображенные треугольниками, получены из сборов клеточных культур, имеющих клеточные плотности между 2,5х106 и 3,5х106 клеток/мл. Кривые, изображенные кругами, получены из сборов клеточных культур, имеющих клеточные плотности между 20х106 и 30х106 клеток/мл. С* (концентрация домифен бромида, которая демонстрирует 90% восстановление вируса) на низкой и высокой клеточных плотностях и соответствующее процентное содержание преципитированных ДНК клетки-хозяина отображены на графике.
Концентрация ΌΒ, которая необходима для преципитирования более 90% ДНК клетки-хозяина при плотностях клеток между 20х 106 и 30х 106 клеток/мл, повышают по меньшей мере на коэффициент 2,5 по сравнению с концентрацией ΌΒ, необходимой при плотностях клеток в 10 раз ниже. Удивительно, повышенная концентрация ΌΒ не преципитирует вирусные частицы, как ожидалось из экстраполяции кривых, полученных при более низкой плотности клеток.
Эксперимент повторяют со сборами клеточных культур, имеющих плотности клеток между 18х106 и 25х106 клеток/мл. Фиг. 2 демонстрирует восстановление вируса и преципитированные ДНК клеткихозяина, отложенные напротив концентрации домифен бромида. Кривые, изображенные треугольниками, получены из сборов клеточных культур, имеющих клеточные плотности между 2,5х106 и 3,5х106 клеток/мл. Кривые, изображенные кругами, получены из сборов клеточных культур, имеющих клеточные плотности между 18х106 и 25х106 клеток/мл. С* (концентрация домифен бромида, которая обеспечивает 90% восстановление вируса) на низкой и высокой клеточных плотностях и соответствующее процентное содержание преципитированных ДНК клетки-хозяина отображены на графике.
Как можно заметить из графиков на фиг. 1 и 2, концентрация ΌΒ, которая обеспечивает 90% восстановления вируса (С*) для суспензий с высокой плотностью клеток, может незначительно отличаться в отдельных экспериментах, и это является частью нормальных вариаций. Тем не менее, графики согласованно демонстрируют, что селективная преципитация ДНК возможна также при высоких плотностях клеток, и что подходящая концентрация §РА (здесь ΌΒ) значительно выше, чем для культур с низкой плотностью, но значительно ниже, что можно было ожидать, основываясь на экстраполяции. Таким образом, специалист в данной области техники определит, что существует диапазон, а не фиксированная величина подходящих концентраций для селективного преципитирующего средства, и, основываясь на данном раскрытии, сможет найти подходящий диапазон. Например, подходящие концентрации ΌΒ для обработки сборов суспензий с высокой плотностью клеток, содержащих аденовирус, включающих клеточную плотность, варьирующую между приблизительно 10х106 и 30х106 клеток/мл, варьируют между приблизительно 1,3 и 2 ммоль.
На основании этих результатов специалист в данной области техники теперь будет знать, что преципитация ДНК может быть экстраполирована в содержащие аденовирус суспензии, содержащие даже более высокие плотности клеток, например, приблизительно 40х 106 клеток/мл, например приблизительно 50х106 клеток/мл, например вплоть до приблизительно 100х106 клеток/мл, например вплоть до приблизительно 150х106 клеток/мл, и что аденовирус из таких суспензий с высокой плотностью клеток можно очистить при помощи процесса из настоящего изобретения.
Пример 2. Селективная преципитация ДНК клетки-хозяина в суспензиях с высокой плотностью клеток при большей шкале.
Преципитацию ДНК тестируют при шкалах, варьирующих между 0,5 л и 20 л. Концентрации ΌΒ, применяемые для преципитации ДНК, основаны на предшествующих результатах экспериментов (фиг. 2). Применяли приблизительно 80% концентрации С*, как определили в модели мелкомасштабной тестовой пробирки.
РЕК.С6 клетки культивируют в периодическом или перфузионном режиме в 2 л или 10 л биореакторах. В периодическом режиме клетки культивируют в течение 4 дней и инфицируют после того, как они достигли плотности, варьирующей между 1х 106 и 1,6 х106 клеток/мл. После инфицирования клетки культивируют дополнительно в течение 3 дней и собирают.
В перфузионном режиме перфузию, которую проводят при помощи АТР системы, начинают через 4 дня после инокуляции при плотности клеток приблизительно 2,5х106 всех клеток/мл. Через 14 дней перфузии клеточную суспензию разводят свежей свободной от сыворотки средой в биореакторе до плотности клеток приблизительно 13 х 106 клеток/мл. Затем биореактор инфицируют вирусом АЙ35. АТР систему включают через 5 ч после инфицирования на среднем уровне восстановления объема 2 сосудов в день. Через 3 дня (после инфицирования) клетки собирают. Плотность клеток в сборе (СЭАН) дана в таблице далее.
После сбора клетки лизируют в течение периода времени от 2 до 24 ч путем добавления неионных детергентов Тгйоп Х-100 и Т\уссп-80 до конечных концентраций, соответственно равных 0,1 и 0,05%>.
- 9 028623
После этого к лизированному сбору добавляют домифен бромид до конечных концентраций 0,72 и 1,52 ммоль в 40 ммоль ЫаС1. Преципитированный лизат очищают двумя заряженными глубинными фильтрами с установленными размерами пор между -10—5 мкдюйма (МгШ81ак + СЕ20) и ~1—0,2 мкдюйма (Сипо ΖοΙα р1и5 50 СР) соответственно. Очистку производят в постоянном объеме 100 л/м2/ч (литр на метр квадратный в час) до достижения давления в 5 фунтов/кв.дюйм.
Табл. 1 демонстрирует параметры процесса и результаты процесса очистки. Лизис, преципитацию ДНК (ΌΝΑ р!1) и очистку производят при помощи различных сборов, которые отличаются по объему, плотности клеток в сборе (СЭАН) и вирусному титру. Сборы собирают из 2- и 10-л биореакторов. Определяют процентное содержание преципитированной ДНК клетки-хозяина (НС-ΌΝΆ) и восстановление вируса в стадию преципитации.
Экспе- римент Параметры процесса Результаты
Преципи- тация ДНК Очистка
№ СЭАН Титр ϋΒ Стадия Стадия Сниже-
(X106 вируса (ММОЛЬ) восста- восста- ние НС-
клеток/ (ДО11 новле- новле- ΏΝΑ (%)
мл) ВЧ/мл) ния т ния (%)
1 1,36 2, 13 0, 72 92 86 99, 6
2 2,47 2,24 91 86 99, 9
3 2,37 1,85 90 90 99, 2
4 9, 1 6, 7 1,52 69 97 99, 9
5 18, 6 8, 9 88 98 99, 8
6 20, 1 15 90 82 98,3
7 16, 7 11 99 71 99, 9
8 25, 8 15, 9 104 92 99, 8
Авторы пришли к выводу, что селективная преципитация ДНК возможна при высокой плотности клеток. На самом деле, хотя концентрация ΌΒ повышена (на коэффициент 2), вирусные частицы остаются непреципитированными (см. восстановление выше 69%) и снижение НС-ΌΝΑ составляет более 98%.
При этом это позволяет подвергать процессу большие объемы суспензий с высокой плотностью клеток, которые необходимы в производственных процессах.
Следует отметить, что для практики отдельные концентрации ΌΒ (1,52 ммоль) использовали для селективной преципитации ДНК в экспериментах 4-8. Указанные эксперименты показывают, что суспензии, содержащие аденовирус, имеющий широкий диапазон (9, 1х106-25, 8х106 вч/мл) клеточных плотностей, можно обработать 1,52 ммоль ΌΒ. Это соответствует точке зрения, высказанной выше, что связь между подходящими концентрациями селективного преципитирующего средства и клеточной плотностью не является очень фиксированной, но предоставляет такие варианты, что диапазон концентраций преципитирующего средства является подходящим для указанной клеточной плотности.
Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус суспензии с высокой плотностью клеток, включающей плотность клеток, варьирующую между 10х106 и 50х106 клеток/мл, варьирует между приблизительно 1,3 и 2,2 ммоль. Подходящая концентрация ΌΒ для обработки сбора суспензии с высокой плотностью клеток, включающей плотность клеток, варьирующую между 10х106 и 30х106 клеток/мл, варьирует между приблизительно 1,3 и 2 ммоль.
Ссылки
Сотки V, ТЫЬаик .1, ЛасоЬ Ό, Оагтег А. НщЬ-Ткег Αάεηονίηιβ Уес(ог РгоЗисйош ίη 2938 СеН РегГивюп Сикиге. ВкНесЬпоР Рго§. 2004.
Ооегке А, То В, Ьее А, 8а§аг 8, Κοπζ К. Όϋνείορπιβηΐ οί а Νονβΐ Αάβηονίηΐδ РипКсакоп Ргосезз ΤΤίίΙΐζίηΰ, Зе1ес(ке РгескркаНоп оГ Се11и1аг ΌΝΑ. Вю1ес1ито1оу.у агк) Ьюепдтееппд, Уо1. 91, Νο. 1,1и1у 5, 2005.
Уик ΙΗΥ, ОКеп ММ, Сеуег 8, РогеЧеП 8Р. РегГизюп Сикигез οί Нитап Титог Се11к: А 8са1аЫе Ргойисбоп Р1а1Гогт Гог Опсо1убс Айепоуна! Уес1огк. Вю1есЬпо1. Вюепдт. 86: 637-641 (2004),

Claims (3)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ очистки аденовирусных частиц из суспензии клеток-продуцентов, включающий:
    а) лизирование клеток в указанной клеточной суспензии;
    б) отделение ДНК клеток-продуцентов от аденовирусных частиц путем селективного преципитирования ДНК бромидом домифена в концентрации, составляющей от 1,3 до 2,2 мМ;
    в) очистку путем центрифугирования и/или глубинной фильтрации указанной суспензии, содержащей указанные аденовирусные частицы, в результате чего по меньшей мере 80% ДНК клетокпродуцентов удаляется из суспензии, содержащей аденовирус;
    причем плотность клеток в указанной клеточной суспензии варьирует от 10х106 до 50х106 клеток/мл.
  2. 2. Способ по п.1, где плотность клеток варьирует приблизительно от 10х106 до 30х106 клеток/мл и концентрация бромида домифена составляет от 1,3 до 2 мМ.
  3. 3. Способ по любому из пп.1, 2, дополнительно включающий стадию анионобменной хроматографии и стадию ультрафильтрации.
EA201290200A 2009-10-15 2010-10-14 Способ очистки аденовирусных частиц EA028623B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27901409P 2009-10-15 2009-10-15
EP09173090.3 2009-10-15
EP09173090 2009-10-15
US61/279,014 2009-10-15
PCT/EP2010/065430 WO2011045378A1 (en) 2009-10-15 2010-10-14 Method for the purification of adenovirus particles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290200A1 EA201290200A1 (ru) 2012-08-30
EA028623B1 true EA028623B1 (ru) 2017-12-29

Family

ID=41618043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290200A EA028623B1 (ru) 2009-10-15 2010-10-14 Способ очистки аденовирусных частиц

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8460920B2 (ru)
EP (1) EP2488636B1 (ru)
JP (1) JP5393896B2 (ru)
KR (1) KR101749779B1 (ru)
CN (1) CN102791852B (ru)
AU (1) AU2010305765B2 (ru)
BR (1) BR112012008516B1 (ru)
CA (1) CA2776461C (ru)
DK (1) DK2488636T3 (ru)
EA (1) EA028623B1 (ru)
ES (1) ES2472429T3 (ru)
HK (1) HK1174948A1 (ru)
MX (1) MX2012004222A (ru)
PL (1) PL2488636T3 (ru)
WO (1) WO2011045378A1 (ru)
ZA (1) ZA201202523B (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012004222A (es) 2009-10-15 2012-06-08 Crucell Holland Bv Metodo para purificacion de particulas de adenovirus.
AU2010305768B2 (en) 2009-10-15 2015-05-14 Crucell Holland B.V. Process for adenovirus purification from high cell density cultures
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
AU2013231423B2 (en) 2012-03-12 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
AP2014007993A0 (en) 2012-03-22 2014-10-31 Crucell Holland Bv Vaccine against RSV
PL2988780T3 (pl) 2013-04-25 2019-06-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizowane rozpuszczalne prefuzyjne polipeptydy F RSV
WO2014202570A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Crucell Holland B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
US20150225713A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Zymo Research Corporation Methods for nucleic acid capture
EP3172317B1 (en) * 2014-07-24 2019-05-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Process for the purification of poliovirus from cell cultures
CN107466324B (zh) 2015-04-14 2022-01-14 扬森疫苗与预防公司 具有双向启动子的表达两种转基因的重组腺病毒
KR102638978B1 (ko) 2015-07-07 2024-02-22 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 백신
US10457708B2 (en) 2015-07-07 2019-10-29 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides
CA3018139A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
KR102506895B1 (ko) 2016-04-05 2023-03-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 용해성 융합-전 rsv f 단백질
US11473105B2 (en) 2016-05-12 2022-10-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
KR102421049B1 (ko) 2016-05-30 2022-07-15 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합-전 rsv f 단백질
CN109312362B (zh) 2016-06-20 2022-06-28 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
US10744196B2 (en) 2016-07-14 2020-08-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HPV vaccines
US11034978B2 (en) 2017-02-09 2021-06-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
KR20200053518A (ko) 2017-09-15 2020-05-18 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 면역의 안전한 유도를 위한 방법
KR101906319B1 (ko) 2017-12-04 2018-10-10 주식회사 삼양바이오팜 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제방법
GB202019454D0 (en) * 2020-12-10 2021-01-27 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Method for purifying virus
CN115073549B (zh) * 2022-07-07 2023-10-20 澳斯康生物(南通)股份有限公司 Hek293细胞裂解液的纯化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997000326A1 (en) * 1995-06-15 1997-01-03 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
WO2006052302A2 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying adenoviral vectors
US7326555B2 (en) * 2002-05-14 2008-02-05 Merck & Co., Inc. Methods of adenovirus purification

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
JP3816518B2 (ja) 1994-06-10 2006-08-30 ジェンベク、インコーポレイティッド 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
WO1997008298A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
CA2177085C (en) 1996-04-26 2007-08-14 National Research Council Of Canada Adenovirus e1-complementing cell lines
AU3447097A (en) 1996-07-01 1998-01-21 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Method for producing recombinant adenovirus
ATE550429T1 (de) 1996-11-20 2012-04-15 Crucell Holland Bv Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren
WO1998039411A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
CN1139656C (zh) * 1999-11-17 2004-02-25 本元正阳基因技术股份有限公司 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
US20020064860A1 (en) 2000-11-29 2002-05-30 Schering Corporation Method for purifying adenoviruses
ATE447037T1 (de) 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
EA008670B1 (ru) 2003-05-09 2007-06-29 Круселл Холланд Б.В. Культуры e1-иммортализованных клеток и способы их культивирования с целью повышения выхода их продукции
EP1718738A2 (en) * 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
EP2308958A3 (en) 2004-03-05 2011-08-10 DSM IP Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
ATE412737T1 (de) 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
MX340242B (es) 2006-07-14 2016-07-01 Dpx Holdings Bv Proceso mejorado para el cultivo de celulas.
CA2742474C (en) 2008-11-03 2016-05-31 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors
MX2012004222A (es) 2009-10-15 2012-06-08 Crucell Holland Bv Metodo para purificacion de particulas de adenovirus.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997000326A1 (en) * 1995-06-15 1997-01-03 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US7326555B2 (en) * 2002-05-14 2008-02-05 Merck & Co., Inc. Methods of adenovirus purification
WO2006052302A2 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying adenoviral vectors

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERDICHEVSKY MARINA, ET AL: "Establishment of higher passage PER.C6 cells for adenovirus manufacture.", BIOTECHNOLOGY PROGRESS., AMERICAN INSTITUTE OF CHEMICAL ENGINEERS, US, vol. 24, no. 1, 1 January 2008 (2008-01-01), US, pages 158 - 165, XP002561835, ISSN: 8756-7938, DOI: 10.1021/bp070258u *
CORTIN V, ET AL: "High-titer adenovirus vector production in 293S cell perfusion culture", BIOTECHNOLOGY PROGRESS., AMERICAN INSTITUTE OF CHEMICAL ENGINEERS, US, vol. 20, no. 3, 1 May 2004 (2004-05-01), US, pages 858 - 863, XP002317549, ISSN: 8756-7938, DOI: 10.1021/bp034237l *
FALLAUX F. J., ET AL.: "CHARACTERIZATION OF 911: A NEW HELPER CELL LINE FOR THE TITRATION AND PROPAGATION OF EARLY REGION 1-DELETED ADENOVIRAL VECTORS.", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, INC. PUBLISHERS, US, vol. 07., no. 02., 20 January 1996 (1996-01-20), US, pages 215 - 222., XP000764943, ISSN: 1043-0342 *
GOERKE AARON R, ET AL: "Development of a novel adenovirus purification process utilizing selective precipitation of cellular DNA", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY ETC., vol. 91, no. 1, 5 July 2005 (2005-07-05), pages 12 - 21, XP002567246, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/BIT.20406 *
MARANGA LUIS, AUNINS J G, ZHOU W: "Characterization of changes in PER.C6 (TM) cellular metabolism during growth and propagation of a replication-deficient adenovirus vector", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY ETC., vol. 90, no. 5, 1 June 2005 (2005-06-01), pages 645 - 655, XP002496483, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/bit.20455 *
YUK INN H Y, ET AL: "Perfusion cultures of human tumor cells: A scalable production platform for oncolytic adenoviral vectors", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY ETC., vol. 86, no. 6, 20 June 2004 (2004-06-20), pages 637 - 642, XP002496481, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/bit.20158 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2012004222A (es) 2012-06-08
US20120202267A1 (en) 2012-08-09
ZA201202523B (en) 2012-12-27
PL2488636T3 (pl) 2014-07-31
CN102791852A (zh) 2012-11-21
KR101749779B1 (ko) 2017-06-21
US8460920B2 (en) 2013-06-11
WO2011045378A1 (en) 2011-04-21
AU2010305765B2 (en) 2015-07-02
BR112012008516A2 (pt) 2015-09-15
EP2488636A1 (en) 2012-08-22
HK1174948A1 (en) 2013-06-21
KR20120083896A (ko) 2012-07-26
BR112012008516B1 (pt) 2021-10-19
JP5393896B2 (ja) 2014-01-22
DK2488636T3 (da) 2014-06-23
CA2776461A1 (en) 2011-04-21
EA201290200A1 (ru) 2012-08-30
JP2013507140A (ja) 2013-03-04
EP2488636B1 (en) 2014-03-12
ES2472429T3 (es) 2014-07-01
AU2010305765A1 (en) 2012-04-12
CN102791852B (zh) 2014-05-07
CA2776461C (en) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA028623B1 (ru) Способ очистки аденовирусных частиц
KR101805938B1 (ko) 고밀도 세포 배양액에서 아데노바이러스의 정제 방법
EP1783212B1 (en) Methods of adenovirus purification
CN106574252B (zh) 从细胞培养物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法
EP1869171A1 (en) Virus purification using ultrafiltration
CN105316296A (zh) 一种纯化腺病毒颗粒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM