BR112012008516B1 - Método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula - Google Patents

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Abstract

método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula. a invenção fornece um método para a purificação de adenovírus em larga escala a partir de suspensões de alta densidade celular, usando precipitação do dna da célula hospedeira seguida por uma etapa de clarificação.

Description

[0001] A invenção diz respeito ao campo da produção de vírus. Maisparticularmente, a mesma diz respeito a métodos melhorados para a purificação de partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula.
Fundamentos da invenção
[0002] Desenvolvimentos recentes no campo da produção devacina têm criado a necessidade quanto à fabricação em larga escala. Processos robustos e de alto rendimento são necessários para sustentar o mundo com quantidades suficientes de vacinas (recombinantes) para combater doenças infecciosas.
[0003] As vacinas contra doenças infecciosas podem estarfundamentadas nas partículas de adenovírus recombinantes. Por esta razão, esforços enormes estão sendo colocados na otimização de processos com base em célula para a produção de adenovírus. As células estão sendo cultivadas em densidades crescentes e subsequentemente infectadas de modo a obter rendimentos de vírus mais altos. Tais processos de densidade de célula alto estão sendo divulgados por exemplo na WO 2010/060719 da Crucell Holland BV, e em Yuk et al. (2004). Um processo para a produção de concentrações grandes de adenovírus recombinante foi aí descrito. Este processo otimizado conta com a capacidade de infectar culturas em densidade de célula alta (por exemplo mais alta do que 5 x 106 células/ml) com a preservação de uma alta produtividade viral por célula. Juntamente, a mesma oferece um método para se obter uma solução de vírus colhida com alta concentração de vírus em um único biorreator. Os rendimentos de partícula viral (VP) dos ditos processos são de cerca de 1,5 a 2,5 x 1012 VP/ml.
[0004] Processos em que as células são cultivadas em altasdensidades são propensos ao acúmulo de altas quantidades de fragmentos de célula e DNA da célula hospedeira. Estes contaminantes têm que ser descartados mais abaixo no processo de purificação, que é uma operação inconveniente. Um método para descartar DNA da célula hospedeira a partir de um cultura de célula colhida foi divulgado previamente na US7326555. O método consiste de precipitar seletivamente DNA da célula hospedeira fora da cultura de célula. Um agente de precipitação seletiva especificamente se ligaria ao DNA da célula hospedeira e deixaria as partículas de adenovírus não precipitadas. O método nesta referência entretanto foi descrito apenas para culturas de célula com baixa densidade de célula, em que os fragmentos de célula e DNA da célula hospedeira estão presentes em quantidades baixas.
[0005] Não foi conhecido até agora que o dito processo seriaaplicado em uma cultura contendo densidades de célula altas. Ao contrário, da técnica anterior uma sugestão forte seria deduzida que um agente de precipitação como usado no dito método não precipitaria seletivamente o DNA da célula hospedeira fora das culturas e precipitaria partículas virais quando usadas em concentrações altas (Goerke et al. 2004).
[0006] Visto que os processos de cultura de célula estão sendoampliados e as células estão sendo cultivadas em densidades crescentes, existe uma necessidade na indústria quanto a processos a jusante que possibilitem o tratamento de suspensões de célula de alta densidade. Isto se aplica em particular ao campo da produção de adenovírus.
Sumário da invenção
[0007] A presente invenção diz respeito a métodos de purificarpartículas de adenovírus de um lisado de célula a partir de uma suspensão de célula de densidade alta. Nós descobrimos aqui que o DNA da célula hospedeira em suspensões de célula de alta densidade pode ser seletivamente precipitado fora da suspensão de célula lisada, deixando partículas virais não precipitadas. A precipitação seletiva do DNA da célula hospedeira foi realizada com detergentes catiônicos.
[0008] A precipitação seletiva em suspensões de célula de baixadensidade foi previamente descrita, por exemplo na US7326555. A obtenção de precipitação seletiva em uma suspensão de célula de densidade alta entretanto foi sem precedentes e altamente inesperada. De fato, foi mostrado na técnica anterior, por exemplo na US7326555, que nas suspensões de célula de baixa densidade (até 1 x 106 células/ml), partículas de adenovírus precipitam quando a concentração de detergente catiônico é aumentada. Isto sugere, com base na extrapolação, que aumentar a concentração do detergente catiônico em um modo substancial (por exemplo com um fator 2) levaria à precipitação da totalidade das partículas de adenovírus presentes na suspensão.
[0009] Em suspensões de célula de alta densidade, em que adensidade de célula é por exemplo umas dez vezes maior e assim a concentração de DNA da célula hospedeira é umas dez vezes mais alta, é esperado que a concentração de detergente requerido para se obter a precipitação do DNA da célula hospedeira também seria significantemente mais alta. Consequentemente, seria esperado, com base nos resultados em suspensões de célula de baixa densidade, que uma tal concentração aumentada de detergente teria o efeito de precipitar todas as partículas virais presentes na solução.
[00010] Durante o teste experimental nas densidades de célula altas (aumentadas com um fator 10), nós descobrimos que oposto a qualquer sugestão ou expectativa com base na técnica anterior, a concentração aumentada de detergente catiônico (que foi aumentada com um fator de 2,5) precipitou o DNA da célula hospedeira (pelo menos em 80 %) mas não precipitou as partículas de adenovírus. Surpreendentemente, o efeito de precipitação seletiva do detergente foi mantido. Com isto, a presente invenção fornece um processo que pode ser usado para descartar o DNA da célula hospedeira em processos em larga escala de purificação de adenovírus usando culturas de densidade de célula alta.
[00011] A invenção fornece um método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula contendo entre 5 x 106 e 150 x 106 células por ml, o método compreendendo: a) lisar as células dentro da dita suspensão de célula; b) precipitar seletivamente o DNA da célula hospedeira fora das partículas de adenovírus pela adição de um agente de precipitação seletiva; e c) clarificar a dita suspensão contendo as ditas partículas de adenovírus para se obter uma suspensão contendo adenovírus purificado em que pelo menos 80 % do DNA da célula hospedeira é precipitado fora das suspensão contendo adenovírus.
[00012] Em algumas formas de realização preferidas, o dito vírus é purificado a partir de uma suspensão de célula tendo uma densidade de célula variando de 5 x 106 a 50 x 106 células por ml, por exemplo 10 x 106 a 50 x 106 células por ml ou 10 x 106 a 30 x 106 células por ml.
[00013] Em certas formas de realização, o agente de precipitação seletiva usado na etapa b) é um detergente catiônico. Em uma forma de realização preferida o dito agente de precipitação seletiva é o brometo de domifen (DB).
[00014] Em certas formas de realização, o dito agente de precipitação seletiva é adicionado em uma concentração variando de 1,2 a 5 mM. Em uma forma de realização preferida o dito agente de precipitação seletiva é adicionado a uma concentração variando de 1,3 a 2,2 mM.
[00015] Em certas formas de realização, o método da invenção compreende ainda uma etapa de troca de ânion e uma etapa de ultrafiltração.
Descrição resumida das figuras
[00016] FIG. 1. Recuperação de adenovírus e DNA precipitado da célula hospedeira, plotados contra a concentração de brometo de domifen em suspensões de célula de densidade baixa (2,5 x 106 a 3,5 x 106 vc/ml) e alta (20 x 106 a 30 x 106 vc/ml).
[00017] FIG. 2. Recuperação de adenovírus e DNA precipitado da célula hospedeira, plotados contra a concentração de brometo de domifen em suspensões de célula de densidade baixa (2,5 x 106 a 3,5 x 106 vc/ml) e alta (18 x 106 a 25 x 106 vc/ml).
Descrição detalhada da invenção
[00018] A presente invenção diz respeito a métodos de purificar partículas de adenovírus de um lisado de célula a partir de uma suspensão de célula de densidade alta.
[00019] De acordo com a invenção, as suspensões de célula de alta densidade são obtidas cultivando-se células até densidades de célula altas. Tal cultivo pode ser realizado em lotes (não limitados), lote alimentado ou modo de perfusão. Os métodos para cultivar células até densidades de célula altas são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os métodos específicos para se obter culturas de densidade de célula alta são divulgados por exemplo na WO2004/099396, WO2005/095578, WO2008/006494, WO 2010/060719.
[00020] De acordo com a presente invenção, uma suspensão de célula de densidade alta contém entre cerca de 5 x 106 e 150 x 106 células/ml, por exemplo entre cerca de 8 x 106 e 120 x 106 células/ml, por exemplo entre cerca de 12 x 106 e 100 x 106 células/ml, por exemplo entre cerca de 20 x 106 e 80 x 106 células/ml.
[00021] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a densidade de célula na dita suspensão de célula de densidade alta varia entre cerca de 10 x 106 e 50 x 106 células/ml, por exemplo pelo menos cerca de 15 x 106 células/ml, por exemplo pelo menos cerca de 20 x 106 células/ml, por exemplo pelo menos cerca de 25 x 106, por exemplo até cerca de 30 x 106 células/ml, por exemplo até cerca de 35 x 106 células/ml, por exemplo até cerca de 40 x 106 células/ml, por exemplo até cerca de 45 x 106 células/ml.
[00022] De acordo com a presente invenção as culturas de densidade de célula alta são subsequentemente infectadas com partículas de adenovírus de modo a permitir que o dito adenovírus se propague na cultura de célula. Com isto, as suspensões de célula de alta densidade são obtidas que contém altas concentrações de adenovírus, em um único biorreator. Os métodos para infectar culturas de densidade de célula alta são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Métodos específicos para a obtenção das ditas culturas de densidade de célula alta com alta concentração de adenovírus são divulgadas por exemplo na EP08168181.9, Cortin et al (2004), e Yuk et al (2004). Estas referências descrevem processos para a produção de quantidades grandes de adenovírus recombinante. Estes processos contam com a capacidade de infectar culturas em densidade de célula alta com a preservação de uma alta produtividade de adenovírus por célula. Juntamente, a mesma oferece um método para se obter uma suspensão de célula de densidade alta com altas concentrações de adenovírus, em um único biorreator. Os rendimentos típicos de processos correntes por exemplo para adenovírus recombinante 35 (rAd35) são de cerca de 1,5 a 2,5 x 1012 VP/ml. Uma vez que os adenovírus tenham se propagado na cultura de célula, as partículas de adenovírus são, de acordo com a presente invenção, purificadas da suspensão de célula de densidade alta.
[00023] O método da presente invenção em uma primeira etapa inclui lisar as células contidas na suspensão de célula de densidade alta. Lisar suspensões de célula de alta densidade, que foram infectadas com partículas de adenovírus, faz com que quantidades grandes de fragmentos de célula e DNA da célula hospedeira acumulem na suspensão de célula. Estes acúmulos tornam o processamento a jusante subsequente da suspensão de célula inconveniente.
[00024] A presente invenção fornece um método adaptado para purificar partículas de adenovírus a partir do lisado de célula de suspensões de célula de alta densidade. Quantidades grandes de DNA da célula hospedeira são seletivamente precipitadas fora das partículas de adenovírus dentro da suspensão de célula de densidade alta pela adição de um agente de precipitação seletiva ao lisado de célula tal que pelo menos cerca de 80 % das moléculas do DNA da célula hospedeira são precipitados fora das suspensão de célula de densidade alta contendo as partículas de adenovírus. Como aqui divulgado, a etapa de precipitação permite a precipitação de DNA da célula hospedeira contaminante, com pelo menos uma redução de 80 % no DNA da célula hospedeira, preferivelmente 90 % e ainda mais preferivelmente, como aqui exemplificado, uma redução em torno de 95 % no DNA da célula hospedeira que segue a clarificação (por exemplo filtração profunda).Lise
[00025] A primeira etapa do processo inclui lisar as células dentro da suspensão de célula. esta primeira etapa, em que as membranas de célula são lisadas, permite a colheita do adenovírus tanto associado com a célula (intracelular) quanto não associado (extracelular) da suspensão de célula infectada de densidade alta. A lise com detergente da célula hospedeira, embora seja o método preferido de lisar células hospedeiras contendo vírus, pode ser substituído por métodos de lise não mecânicos (tais como tratamento enzimático) e/ou métodos de cisalhamento mecânico (tais como ultrafiltração de fibra oca) para liberar quantidades máximas de adenovírus. Os métodos que podem ser usados para a lise de célula ativa são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica, e foram por exemplo debatidos na WO 98/22588, p. 28-35. Os métodos úteis neste sentido são por exemplo, congelamento- descongelamento, cisalhamento de sólido, lise hipertônica e/ou hipotônica, cisalhamento líquido, sonificação, extrusão de alta pressão, lise em detergente, combinações dos acima, e os seus semelhantes. Em uma forma de realização da invenção, as células são lisadas usando pelo menos um detergente. O uso de um detergente para a lise tem a vantagem de que é um método fácil, e que é facilmente expansível.
[00026] Os detergentes que podem ser usados, e o modo em que os mesmos são utilizados, são no geral conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Vários exemplos são por exemplo debatidos na WO 98/22588, p. 29-33. Os detergentes, como aqui usados, podem incluir mas não são limitados aos detergentes aniônicos, catiônicos, zuiteriônicos, e não iônicos. Os exemplos de detergentes são por exemplo Triton e/ou Polissorbato-80. Em uma forma de realização, o detergente usado é Triton X-100. Além disso, um solvente tal como TNBP pode ser adicionado ao lisado ou lisado clarificado em concentração baixa para complementar estes detergentes na sua capacidade para inativar vírus envelopados. Também, a autólise das células hospedeiras infectadas pelo adenovírus nelas pode fornecer a liberação substancial de adenovírus intracelular e pode ser usada nos processos da invenção. Portanto, qualquer forma de lise de célula hospedeira que seja conhecida na técnica pode ser usada para liberar vírus intracelular dentro do meio de cultura da célula hospedeira para eventual colheita pelos métodos aqui divulgados. Está claro pela pessoa habilitada na técnica que a concentração ótima do detergente pode variar, por exemplo dentro da faixa de cerca de 0,1 % a l % (p/p).
Precipitação seletiva
[00027] A seguir da lise, o DNA é seletivamente precipitado pela adição de uma solução concentrada de agente de precipitação seletiva (SPA) enquanto deixa as partículas de adenovírus na fase líquida. Esta etapa permite a precipitação seletiva de DNA da célula hospedeira e também melhora a robustez a jusante. Como aqui exemplificado, esta etapa de precipitação de estágio precoce resulta em cerca de pelo menos 80 % de redução no ácido nucléico (célula hospedeira) que segue a clarificação.
[00028] Os SPAs que podem ser úteis na prática da presente invenção incluem, mas não são de nenhum modo limitados a, copolímeros de amina, compostos de amônio quaternários, e qualquer uma de suas respectivas misturas. Mais especificamente, as muitas formas de polietileno (PEI) são muito eficientes na neutralização da carga aniônica em excesso (impurezas de DNA).
[00029] Uma lista de SPAs possíveis que pode ser usados apropriadamente na presente invenção é dada na US7326555 (coluna 12, linhas 56 a 67 e coluna 13, linhas 1 a 28), aqui incorporados por referência. Os SPAs apropriados para o uso na presente invenção incluem mas não são limitados às seguintes classes e exemplos de produtos comercialmente disponíveis: sais de monoalquiltrimetil amônio (os exemplos de produtos comercialmente disponíveis incluem brometo ou cloreto de cetiltrimetil amônio como CTAB, brometo ou cloreto de tetradeciltrimetil amônio (TTA), cloreto de alquiltrimetil amônio, cloreto de alquilariltrimetil amônio, brometo ou cloreto de dodeciltrimetil amônio, brometo de dodecildimetil-2-fenoxietil amônio, hexadecilamina: sal de cloreto ou brometo, dodecil amina ou sal de cloreto, e brometo ou cloreto de cetildimetiletil amônio), sais de monoalquildimetilbenzil amônio (os exemplos incluem cloretos de alquildimetilbenzil amônio e cloreto de benzetônio como BTC), sais de dialquildimetil amônio (os produtos comerciais incluem brometo de domifen (DB), haletos de didecildimetil amônio, e cloreto ou brometo de octildodecildimetil amônio), sais de amônio heteroaromáticos (os produtos comerciais incluem haletos de cetilpirídio (CPC ou sal de brometo e brometo ou cloreto de hexadecilpiridínio), isômero cis de 1-[3-cloroalil]-3,5,7-triazal-azoniaadamantano, brometo de alquil-isoquinolínio, e cloreto de alquildimetilnaftilmetil amônio (BTC 1110). Sais de amônio quaternárrios polissubstituídos, (os produtos comercialmente disponíveis incluem, mas não são limitados ao sacarinato de alquildimetilbenzil amônio e cicloexilsulfamato de alquildimetiletilbenzil amônio), sais de amônio bis- quaternários (os exemplos de produto incluem 1,10-bis(cloreto de 2-metil- 4-aminoquinolínio)-decano, 1,6-bis[cloreto de 1-metil-3-(2,2,6-trimetil ciclohexil)-propildimetil amônio] hexano ou cloreto de triclobisônio, e o bisquat aludido como CDQ pela Buckman Brochures), e sais de amônio quaternários poliméricos (inclui poliionenos tais como dicloreto de poli- [oxietileno(dimetiliminio)etileno(dimetiliminio)etileno], dicloreto de poli-[N- 3-dimetilamônio)propil]-N-[3-etilenooxietilenodimetilamônio)propil]-uréia, e alfa-4[cloreto de 1-tris(2-hidroxietile)amônio). Como a pessoa habilitada entenderá da US7326555, em que vários destes foram mostrados funcionar e em que foi mostrado que a pessoa habilitada pode rotineiramente encontrar as concentrações apropriadas para estes compostos para precipitar seletivamente DNA, estes são exemplos de SPAs, e com base na divulgação nesta e a divulgação da presente invenção está claro que estes também serão adequados na presente invenção.
[00030] Em uma forma de realização preferida, os detergentes catiônicos são usados na presente invenção. Em uma forma de realização ainda mais preferida, os sais de dialquildimetil amônio tais como brometo de domifen (DB) são usados na presente invenção. Brometo de domifen é usado como um agente de precipitação seletiva para os esquemas de purificação que requerem a remoção de qualquer número de componentes celulares, especialmente ácidos nucleicos, fora de qualquer número de tipos diferentes de produtos biológicos, incluindo mas não limitados a partículas virais, partículas como vírus ou qualquer outro produto biológico que pode ser substancialmente separado de um componente com base em cultura contaminante por intermédio de uma etapa de precipitação seletiva. Embora um grande número de SPAs potenciais possam ser usados para a prática da presente invenção, brometo de domifen é de interesse particular devido primariamente à sua disponibilidade como uma matéria prima de grau GMP e uso corrente em outros produtos intencionados para o uso humano. Mais especificamente, visto que o brometo de domifen é extensivamente usado como um ingrediente ativo em produtos de higiene oral assim como cremes antibióticos típicos, esta molécula é produzida em quantidades grandes e liberada sob condições de cGMP.
[00031] A concentração de SPA ótima que é usada em suspensões de célula de alta densidade para precipitar DNA da célula hospedeira fora da suspensão de célula foi aqui determinada. Embora fosse previsto, com base na técnica anterior, que as partículas de adenovírus imediatamente precipitariam quando fossem colocadas em contato com concentrações altas de SPA, inesperadamente, as partículas de adenovírus permaneceram sem precipitar. De fato, foi mostrado na técnica anterior, por exemplo na US7326555, que em suspensões de célula de baixa densidade (até 1 x 106 células/ml), as partículas de adenovírus precipitam quando a concentração de detergente catiônico é aumentada.
[00032] A suspensão como produzida pela lise de culturas de densidade de célula alta como aqui divulgado conterá quantidades vastamente aumentadas de DNA da célula hospedeira e outras impurezas e portanto necessitarão de quantidades aumentadas de detergente catiônico (por exemplo aumentadas por um fator 2,5). É esperado, com base na extrapolação dos resultados em baixa densidade de célula, que este aumento na concentração de detergente catiônico levaria à precipitação da totalidade das partículas de adenovírus presentes na suspensão.
[00033] Surpreendentemente, em altas concentrações de SPA, a remoção seletiva de DNA contaminante da célula hospedeira a partir de uma suspensão de célula de densidade alta contendo partículas adenovirais foi ainda possível. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o SPA, preferivelmente DB, é adicionado a uma concentração variando de 1,2 a 5 mM. Em uma forma de realização ainda mais preferido o SPA, preferivelmente DB, é adicionado a uma concentração variando de 1,3 a 2,2 mM, por exemplo de 1,4 a 2 mM, por exemplo de 1,4 a 1,8 mM, por exemplo de 1,5 a 1,6 mM. Com base na presente divulgação, está claro que a pessoa habilitada na técnica sabe como determinar as janelas de concentração de SPA apropriadas para uma dada densidade de célula na colheita.
[00034] A concentração apropriada de DB para tratar uma suspensão de célula de densidade alta contendo adenovírus que compreende uma densidade de célula variando entre 10 x 106 e 150 x 106 células/ml varia entre cerca de 1,2 mM e 5 mM. A concentração apropriada de DB para tratar uma suspensão de célula de densidade alta contendo adenovírus que compreende uma densidade de célula variando entre 10 x 106 e 50 x 106 células/ml varia entre cerca de 1,3 mM e 2,2 mM. A concentração apropriada de DB para tratar uma colheita de suspensão de célula de densidade alta contendo adenovírus que compreende uma densidade de célula variando entre 10 x 106 e 30 x 106 células/ml varia entre cerca de 1,3 e 2 mM, por exemplo entre cerca de 1,4 e 1,9 mM, por exemplo entre cerca de 1,4 e 1,8 mM, por exemplo entre cerca de 1,4 e 1,7 mM, por exemplo entre cerca de 1,45 e 1,65 mM, por exemplo de cerca de 1,5 a 1,55 mM.
[00035] As nucleases (incluindo mas de nenhum modo limitados a BENZONASE®, DNases, e RNases) não são mais requeridos nesta etapa mas podem ser ainda benéficas para a redução de DNA máxima. Em vista da capacidade desta etapa de precipitação para remover a vasta maioria dos ácidos nucleicos contaminantes, uma etapa de cromatografia de troca de ânion (AEX) posterior pode não ser essencial para a pureza do produto (dependendo da dosagem final). Entretanto, uma etapa AEX pode permanecer no processo quanto a robustez.
[00036] Estará dentro da competência do técnico habilitado testar substitutos potenciais para os SPAs aqui divulgados para identificar um composto que eficazmente precipite moléculas de ácido nucléico e outros fragmentos celulares fora das partículas de adenovírus como aqui exemplificado para o brometo de domifen (DB). Portanto, esta presente invenção diz respeito em parte aos métodos de purificar partículas de adenovírus a partir de suspensões de densidade de célula alta dentro das quais compreende precipitar seletivamente moléculas de ácido nucléico de célula hospedeira fora das partículas de adenovírus dentro da suspensão de célula de densidade alta após a lise pela adição de um agente de precipitação seletiva ao meio de cultura de célula hospedeira após a lise.
Clarificação
[00037] O lisado de célula tratado com SPA obtido das etapas anteriores é subsequentemente clarificado para remover impurezas de precipitado e fragmentos de célula. A dita clarificação pode ser realizada pela filtração profunda. A centrifugação com ou sem a filtração profunda de polimento também é praticável. Portanto, a clarificação de precipitado lisado pode ser realizada usando apenas a centrifugação, ou centrifugação em tandem com uma etapa de clarificação de polimento tal como filtração profunda como descrito na US7326555.
[00038] Na escolha de um filtro ou esquema de filtração foi necessário para garantir um desempenho robusto no evento de mudanças ou variações a montante ocorrerem. A manutenção do equilíbrio entre bom desempenho de clarificação e rendimentos escalonados pode ser investigada testando-se uma variedade de tipos de filtro com meios internos variáveis. Os filtros adequados podem utilizar filtros de celulose, fibras de celulose regeneradas, fibras de celulose combinadas com auxiliares de filtração inorgânicos (por exemplo terra diatomácea, perlita, sílica fumigada), fibras de celulose combinadas com auxiliares inorgânicos e resinas orgânicas, ou qualquer combinação destas, e filtros poliméricos (os exemplos incluem mas não são limitados a náilon, polipropileno, polietersulfona) para obter a remoção eficaz e recuperações de vírus aceitáveis. No geral um processo de estágio múltiplo é preferível mas não requerido. Um processo de dois ou três estágios exemplares consistiria de um filtro(s) grosso(s) para remover precipitado grande e fragmentos de célula seguido pelo filtro(s) do segundo estágio de polimento com tamanhos de poros nominais maiores do que 0,2 μm porém menores do que 1 μm. A combinação ótima será uma função da distribuição do tamanho do precipitado assim como outras variáveis. Além disso, operações de estágio único que utilizam uma filtração ou centrifugação relativamente fechadas também podem produzir um produto de boa qualidade. Mais no geral, qualquer método de clarificação incluindo a filtração convencional (dead-end), microfiltração, centrifugação, ou alimentação de corpo de auxiliares de filtração (por exemplo, terra diatomácea) em combinação com a filtração clássica ou profunda, que fornece um filtrado de clareza adequada para não entupir a membrana e/ou resina na etapa subsequente, será aceitável para a prática dentro da presente invenção. A filtração profunda apresenta um método robusto de clarificação para a presente invenção. as membranas de filtração profunda comercialmente disponíveis são divulgadas na US 7326555 (coluna 14, linha 65 até a coluna 15, linha 19), aqui incorporada por referência.
[00039] A combinação das etapas de precipitação e clarificação remove pelo menos 70 %, mais provavelmente pelo menos 80 %, ou ainda preferivelmente pelo menos 90 % do DNA da célula hospedeira fora das partículas de adenovírus depois da clarificação (por exemplo tal como filtração profunda sozinha ou filtração profunda combinada com uma etapa de filtração profunda de polimento).
Métodos de purificação adicionais
[00040] Em certas formas de realização, as partículas virais colhidas são purificadas ainda mais. Purificação adicional do vírus pode ser realizada em vários etapas que compreendem concentração, ultrafiltração, diafiltração ou separação com cromatografia como descrito por exemplo na WO 2005080556, aqui incorporada por referência. Outras etapas, tais como, cromatografia de membrana de troca aniônica, filtração estéril, absorção de fase reversa, cromatografia de hidroxiapatita também podem ser usadas. Estas etapas são por exemplo divulgadas na US 7326555, incorporada aqui na sua totalidade por referência. A pessoa habilitada na técnica sabe como encontrar as condições ótimas para cada etapa de purificação. Também a WO 98/22588, incorporada aqui na sua totalidade por referência, descreve métodos para a produção e purificação de partículas virais.
[00041] Em certas formas de realização de acordo com a invenção, a suspensão de partícula de adenovírus clarificada pode ser tratada pela ultrafiltração. A ultrafiltração é usada para concentrar a suspensão viral. A suspensão pode ser concentrada de 5 a 20 vezes e possivelmente ser tratada com nuclease (como mencionado acima). Um outro aspecto da invenção é a introdução subsequente de um tampão de troca por intermédio da diafiltração. A diafiltração, ou troca de tampão, usando ultrafiltros é um modo para a remoção e troca de sais, açúcares e os seus semelhantes. A pessoa habilitada na técnica sabe sob quais condições a troca de tampão deve ocorrer e quais tampões são apropriados para esta etapa.
[00042] A membrana de ultrafiltração particular selecionada será de um tamanho suficientemente pequeno para reter as partículas de adenovírus mas grandes o suficiente para limpar eficazmente impurezas. Dependendo do fabricante e tipo de membrana, os cortes de peso molecular nominais entre 10 e 1000 kDa podem ser apropriados. A ultrafiltração usando o modo de fluxo tangencial é preferida. No dito modo, a etapa pode ser controlada ajustando-se um fluxo cruzado fixo com ou sem retro pressão no retorno de tecido, ajustando uma pressão de transmembrana fixa, ou fixando tanto o fluxo cruzado quanto o fluxo de permeado.
[00043] O tratamento com nuclease também pode ser considerado para a inclusão no processo neste ponto, mas não é de nenhum modo requerido. O tratamento com nuclease pode incluir o uso de uma nuclease de espectro amplo (por exemplo BENZONASE®), uma DNase, uma RNase, ou qualquer combinação destes. Uma nuclease ou coquetel com atividade tanto de RNase quanto de DNase é preferida. Uma etapa de tratamento com nuclease pode ser considerada em qualquer ponto no processo, contanto que o teor de nuclease residual no produto final é aceitável para a aplicação. É preferido que o tratamento com nuclease ocorra depois da clarificação e especialmente preferido que o tratamento com nuclease ocorra depois da clarificação e uma etapa de concentração, mas antes de uma etapa de cromatografia de troca de ânion.
[00044] De acordo com a invenção, uma etapa seguinte pode ser uma etapa de cromatografia de troca de ânion. Durante a dita etapa as partículas de adenovírus são ligadas a um material positivamente carregado, por exemplo uma membrana, cartucho ou coluna. A eluição subsequente permite separar as partículas virais das impurezas e DNA da célula hospedeira remanescente.
[00045] Para a purificação de adenovírus com um absorvedor de membrana Mustang Q, a concentração de NaCl para carregar e lavar presumivelmente seria em qualquer lugar de 0,3 a 0,4 M no pH 7,5 e mudaria na alternação do pH. Mais preferivelmente a concentração de NaCl é de 0,35 M. O pH dos tampões precisa ser alto o bastante para que o adenovírus se ligue (maior do que aproximadamente 6,5). Além disso, o pH do sistema de tampão também deve ser baixo o bastante para evitar a instabilidade viral. O pH máximo preciso que é utilizável dependerá do perfil de estabilidade específico do adenovírus e dos componentes do tampão, e pode ser facilmente determinado pela pessoa habilitada na técnica para esta aplicação particular. Como uma orientação e certamente não uma limitação, o pH potencialmente variaria de cerca de 5 a 10.
[00046] A presença de 0,1 % de PS-80 nos tampões é altamente preferida para se alcançar níveis de DNA residual baixos no produto porque isto atenua a associação de adenovírus/DNA e agregação de adenovírus. Estará dentro do domínio da experimentação de rotina para a pessoa habilitada na técnica estabelecer concentrações de detergente mais alta ou mais baixa ou detergentes alternativos que seriam úteis para promover a dissociação das partículas de adenovírus para longe de outros adenovírus assim como vários contaminantes de célula. Também está dentro deste mesmo domínio de experimentação que a pessoa habilitada na técnica possa escolher um detergente alternativo para o tampão do processo. Os exemplos para tais detergentes alternativos podem ser encontrados na US 7326555. Os produtos de cromatografia de membrana de troca aniônica tais como aquelas produzidas pela Pall (por exemplo a série Mustang®) e pela Sartorius (por exemplo a série Sartobind) são adequados para a purificação viral de acordo com a presente invenção. A Patente US 6.485.958 ou WO 05/080556 descrevem o uso da cromatografia de troca aniônica para a purificação de adenovírus recombinante.
[00047] A capacidade de ligação para o vírus em um absorvedor de membrana tal como Mustang Q (Pall Corporation) é extremamente alta, e da ordem de 7 x 1013 VP/ml. Outros absorvedores de membrana e resinas que são adequados para a purificação de vírus neste processo incluem nas não são de nenhum modo limitados ao Source 15Q e Source 30Q (GE life sciences), Q-Sepharose XL (GE life sciences), Fractogel TMAE (EM industries), Sartobind Q (Sartorius), Adsept Q (Natrix separations), CIM QA (BIA separations). A elução de adenovírus preferivelmente seria realizada usando um tampão contendo NaCl. A pessoa habilitada sabe como otimizar a concentração de NaCl.
[00048] Em certas formas de realização, é preferido usar pelo menos uma etapa de cromatografia de troca de ânion. Depois da etapa de cromatografia de troca de ânion, o adenovírus pode ser suficientemente puro. Em certas formas de realização entretanto uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho é realizada ainda para aumentar a robustez do processo. Esta etapa pode ser antes ou depois da etapa de cromatografia de troca de ânion. Obviamente, outras etapas de purificação também podem ser adequadamente combinados com uma etapa de cromatografia de troca de ânion. O uso da cromatografia de troca de ânion para a purificação de adenovírus foi extensivamente descrita, e este aspecto portanto está bem dentro do alcance do técnico habilitado. Muitas matrizes de cromatografia diferentes foram utilizadas para a purificação de adenovírus e são adequadas. A pessoa habilitada na técnica pode facilmente encontrar o material de troca de ânion ótimo para purificar o dito adenovírus.
[00049] Em qualquer forma de realização particular da presente invenção, o produto de troca de ânion pode ser diafiltrado no tampão de formulação e filtrado estéril. Alternativamente, uma etapa de cromatografia adicional (por exemplo troca de cátion) pode ser adicionada antes ou depois da diafiltração com o potencial para melhorar a robustez da depuração da impureza e/ou vírus/prion.
[00050] Uma etapa de ultrafiltração adicional também pode ser possível neste estágio. A ultrafiltração de fluxo tangencial é útil na remoção de proteína e ácido nucléico residuais e para trocar o adenovírus em um tampão de formulação. A escolha de membranas entre 300 kDa e 500 kDa é ditada pelos intercâmbios entre rendimento e depuração de impureza melhorada. Outras configurações de membrana (tais como uma fibra oca) são substitutos aceitáveis. A membrana de ultrafiltração selecionada será de um tamanho suficientemente pequeno para reter partículas de adenovírus mas grandes o bastante para eficazmente depurar impurezas. Dependendo do fabricante e tipo de membrana, os cortes de peso molecular nominais entre 100 e 1000 kDa podem ser apropriados.
[00051] Uma etapa de filtração estéril pode ser incluída no processo, que é útil na eliminação da biocarga. O produto pode ser filtrado através de uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 mícron modificada (por exemplo Millipore, Millipak).
[00052] As etapas de processamento a jusante opcionais podem ser adicionadas no processo. Estas por exemplo incluiriam uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho, uma etapa de absorção de fase reversa e/ou um etapa de cromatografia de hidroxiapatita. Mais detalhes em cada uma destas etapas podem ser encontrados por exemplo na US 7326555, WO 03/097797, WO 02/44348.
[00053] O pedido internacional WO 97/08298 descreve a purificação de adenovírus usando certas matrizes cromatográficas para prevenir danos aos vírus, incluindo as etapas de troca de ânion e exclusão de tamanho.
[00054] Certos métodos de ultrafiltração também são muito adequados para a purificação de adenovírus, como divulgados na WO 2006/108707. Tais etapas podem ser realizadas além ou ao invés de certas etapas de purificação cromatográficas.Escala de sistemas de cultura de célula e dos sistemas de processamento a jusante
[00055] Os processos da presente invenção são escaláveis. As culturas de célula usadas na presente invenção variam de culturas em escala pequena (por exemplo rodadas de 1 a 10 litros) a culturas na escala média (por exemplo rodadas de 20 a 1000 L) até preparações em escala grande comercial, tais como rodadas de produção de 1.000 a 50.000 L. As etapas iniciais do processo (lise, filtração profunda e ultrafiltração) se ampliam com o volume de cultura enquanto que a cromatografia de troca de ânion e as etapas subsequentes se ampliam com a entrada de partícula adenoviral. Portanto, o tamanho das últimas etapas será com base em uma estimativa de produtividade de biorreator de pelo menos l x 1012 partículas de adenovírus por ml (vp/ml). Estes rendimentos de adenovírus altos por exemplo podem ser obtidos infectando-se culturas de densidade de célula alta (como descrito por exemplo na EP08168181.9). A outra purificação destas suspensões de célula de densidade alta contendo concentrações altas de partículas de adenovírus é feita possível com a presente invenção. A possibilidade para processar estas suspensões, que contém altas quantidades de fragmentos de célula e DNA da célula hospedeira permitem a purificação de altas quantidades de partículas de adenovírus por volume de suspensão. É o mérito desta invenção fornecer um método para processar lotes de cultura de célula com densidades de célula altas, contendo altas concentrações de partículas de adenovírus e deste modo permitir rendimentos adenovirais muito altos por volume processado. O presente método, embora seja aplicável para culturas de célula em larga escala permitirá que as células sejam cultivadas em escala menor, embora para densidades de célula mais altas e ainda atinjam altos rendimentos de adenovírus que possam ser ainda eficientemente processados. Este método oferece a possibilidade de processar lotes de adenovírus altamente concentrados de modo que terá um impacto enorme sobre toda a indústria de purificação de adenovírus.
Adenovirus e células produtoras
[00056] A invenção diz respeito à purificação de adenovírus. Umadenovírus de acordo com esta invenção pode ser qualquer adenovírus do tipo selvagem, modificado, mutado e/ou vetor adenoviral recombinante. De interesse específico em aplicações de vacinação de gene e/ou terapia de gene é o uso de um adenovírus incompetente de replicação de 1a ou 2a geração, mutilado por E1 ou outras deleções, incluindo vetores adenovirais “gutless”. O genoma de adenovírus é no geral associado com patologias benignas em seres humanos. O genoma é receptivo à manipulação, dependendo da estratégia utilizada para a construção do respectivo vetor. Um vírus incompetente de replicação, tal como um vetor de adenovírus recombinante 35 (rAd35) ou 26 (rAd26) (como aqui exemplificado) requer uma linhagem de célula produtora que complementa as deleções.
[00057] Uma célula produtora (algumas vezes também aludida na técnica e aqui como ‘célula empacotadora’ ou ‘célula complementar’ ou ‘célula hospedeira’) pode ser qualquer célula produtora em que um adenovírus desejado pode ser propagado. Por exemplo, a propagação de vetores adenovirais recombinantes é feita em células produtoras que complementam deficiências no adenovírus. Tais células produtoras preferivelmente têm no seu genoma pelo menos uma sequência de adenovírus E1, e deste modo são capazes de complementar adenovírus recombinantes com uma deleção na região E1. Além disso, o adenovírus pode ter uma deleção na região E3, que é dispensável do genoma Ad, e consequentemente uma tal deleção não tem que ser complementada. Qualquer célula produtora que complementa E1 pode ser usada, tal como células da retina humana imortalizadas por E1, por exemplo células 911 ou PER.C6 (ver a Patente US 5.994.128), amniócitos transformados em E1 (Ver a patente EP 1230354), células A549 transformadas em E1 (ver por exemplo a WO 98/39411, Patente US 5.891.690), GH329: HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, e os seus semelhantes. Em certas formas derealização, as células produtoras são por exemplo células HEK293, ou células PER.C6, ou células 911, ou células IT293SF, e os seus semelhantes. Preferivelmente células PER.C6 (depósito ECACC no 96022940, depositada em 29 de fevereiro de 1996 na ECACC, CAMR, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, Reino Unido; ver a Patente US 5.994.128), ou células derivadas destas são usadas como células produtoras.
[00058] O vetor adenoviral deficiente e, replicação pode ser gerado pelo uso de qualquer espécie, cepa, subtipo, ou mistura de espécies, cepas, ou subtipos, de um adenovírus ou um adenovírus quimérico como a fonte do vetor de DNA (ver por exemplo a WO 96/26281, WO 00/03029), que por exemplo pode fornecer o vetor adenoviral com a capacidade de infectar certos tipos de célula desejados. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, rAd35 ou rAd26 é usado como um adenovírus.
[00059] A pessoa habilitada na técnica estará ciente das possibilidades para propagar vetores adenovirais de sorotipos diferentes nas células hospedeiras específicas, usando métodos tais como por exemplo divulgados na Patente US 6.492.169 ou na WO 03/104467, e referências nestas. Por exemplo, for propagação de rAd35 deficiente em E1, células produtoras específicas que expressam E1B- 55K de Ad35 podem ser construídas, por exemplo com base nas células produtoras existentes que expressam E1A e E1B de Ad5 tais como células PER.C6 ou HEK293 (ver, por exemplo US 6.492.169), como é conhecido pela pessoa habilitada. Alternativa e preferivelmente, as linhagens de célula complementares (Ad5-) existentes tais como por exemplo PER.C6 ou HEK293 podem ser usadas sem modificação das células para a propagação de rAd35 ou rAd26 deficientes em E1, pela inclusão da sequência codificadora de E4-orf6 de Ad5 dentro do vetor rAd35 ou rAd26, como extensivamente divulgado por exemplo na WO 03/104467, incorporada aqui na sua totalidade por referência. Assim, a propagação dos vetores adenovirais de qualquer sorotipo pode ser feita em células produtoras usando meios e métodos bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os vetores adenovirais, métodos para a sua construção e métodos para a sua propagação, são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Pats. U.S. Nos 5.559.099, 5.837.511, 5.846.782, 5.851.806, 5.994.106, 5.994.128, 5.965.541,5.981.225, 6.040.174, 6.020.191, e 6.113.913, e Thomas Shenk,“Adenoviridae and their Replication”, M. S. Horwitz, “Adenoviruses”, Capítulos 67 e 68, respectivamente, em Virology, B. N. Fields et al., eds., 3a ed., Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1996), e outras referências aqui mencionadas.
[00060] A invenção é explicada ainda nos seguintes exemplos. Os exemplos não limitam a invenção de nenhum modo. Eles meramente servem para clarificar a invenção.
EXEMPLOS
[00061] Exemplo 1: Precipitação seletiva do DNA da célulahospedeira em suspensões de célula de alta densidade
[00062] A precipitação seletiva do DNA da célula hospedeira foidemonstrada na técnica anterior (Goerke et al, US7326555) paradensidades de célula de até 1 x 106 células/ml. Foi aí mostrado que (em densidades de célula baixas) pelo menos 80 % do DNA da célula hospedeira foi precipitado para fora da suspensão de célula com uma recuperação de 90 % das partículas virais. Entretanto, foi até agora completamente desconhecido se tal precipitação seletiva seria praticável em densidade de célula alta, visto que tais suspensões de célula conteriam quantidades muito altas de DNA da célula hospedeira e fragmentos de célula, e portanto seria esperado que quantidades muito maiores de agente de precipitação de DNA seriam requeridas, ao passo que a extrapolação dos dados da técnica anterior sugeririam que tais concentrações mais altas de agente de precipitação de DNA também precipitariam o adenovírus.
[00063] De modo a explorar a possibilidade de precipitação de DNA em densidades de célula altas, a precipitação do DNA da célula hospedeira foi testada e, tubos de teste em escala pequena contendo densidades de célula de até 30 x 106 células/ml. O modelo do tubo de teste em escala pequena foi usado como uma ferramenta de triagem rápida para testar se a precipitação de DNA seletiva ainda ocorre nas densidades de célula altas.
[00064] As células PER.C6 foram cultivadas em um biorreator e infectadas com Adenovírus 35 (Ad35) e cultivadas a 37° C em meio de cultura isento de soro por 3 dias. As células foram colhidas em uma densidade de célula entre 2 e 30 x 106 células/ml e títulos virais variando de 8 x 1010 a 1,5 x 1012 VP/ml. A lise de célula foi realizada em um período de 2 a 24 horas (horas), pela adição dos detergentes não iônicos Triton X-100 e Tween-80 até concentrações finais de 0,1 % e 0,05 % respectivamente. As concentrações aumentadas de brometo de domifen (DB) em 40 mM de NaCl foram adicionadas a 3,5 ml de colheita lisada, seguidos pelo turbilhonamento imediato por 1 minuto. O material precipitado foi removido com filtros de seringa com 0,45 g de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Os filtrados foram analisados quanto a concentrações de Ad35 e DNA da célula hospedeira usando um ensaio de HPLC-AEX e Q-PCR respectivamente.
[00065] A Fig. 1 mostra a recuperação viral e DNA precipitado da célula hospedeira, plotados contra a concentração do Brometo de domifen. As curvas representadas em triângulos são obtidas a partir de colheitas de cultura de célula tendo densidades de célula variando entre 2,5 x 106 e 3,5 x 106 células/ml. As curvas representadas nos círculos são obtidas a partir das colheitas de cultura de célula tendo densidades de célula variando entre 20 x 106 e 30 x 106 células/ml. O C* (concentração de Brometo de domifen que apresenta 90 % derecuperação viral) em densidades de célula baixas e altas e a porcentagem relacionada de DNA precipitado da célula hospedeira é salientada nos gráficos.
[00066] A concentração de DB que é requerida para precipitar mais do que 90 % do DNA da célula hospedeira em densidades de célula variando entre 20 x 106 e 30 x 106 células/ml é aumentada por um fator de pelo menos 2,5 vezes comparado com a concentração de DB requerida nas densidades de célula que são 10 vezes mais baixas. Surpreendentemente, a concentração de DB aumentada não precipitou as partículas virais, como seria esperado da extrapolação das curvas obtidas em densidades de densidade de célula mais baixas.
[00067] O experimento foi repetido com colheitas de cultura de célula tendo densidades de célula variando entre 18 x 106 e 25 x 106 células/ml. A Fig. 2 mostra a recuperação viral e DNA precipitado da célula hospedeira, plotados contra a concentração de Brometo de domifen. As curvas representadas em triângulos são obtidas a partir das colheitas de cultura de célula tendo densidades de célula variando entre 2,5 x 106 e 3,5 x 106 células/ml. As curvas representadas em círculos são obtidas a partir de colheitas de cultura de célula tendo densidades variando entre 18 x 106 e 25 x 106 células/ml. A C* (concentração de Brometo de domifen que dá 90 % de recuperação viral) em densidades de célula baixas e altas e a porcentagem relacionada de DNA precipitado da célula hospedeira são salientadas nos gráficos.
[00068] Como pode ser mencionado a partir dos gráficos nas Figs 1 e 2, a concentração de DB que dá 90 % de recuperação viral (C*) para as suspensões de célula de alta densidade podem diferir levemente entre experimentos individuais, e isto é parte da variação normal. Entretanto, os gráficos compativelmente demonstram que uma precipitação seletiva de DNA é possível também em densidades de célula altas, e que a concentração adequada de SPA (aqui DB) é significantemente mais alta do que para as culturas de baixa densidade de célula, mas muito mais baixo do que seria esperado com base na extrapolação. Assim, a pessoa habilitada reconhecerá que existe uma faixa ao invés de um ponto fixo de concentrações adequadas para o agente de precipitação seletiva, e com base na divulgação aqui pode- se encontrar a faixa adequada. Por exemplo, as concentrações apropriadas de DB para tratar uma colheita de suspensão de célula de densidade alta contendo adenovírus que compreende uma densidade de célula variando entre cerca de 10 x 106 e 30 x 106 células/ml variam entre cerca de 1,3 e 2 mM.
[00069] Com base neste resultado, a pessoa habilitada na técnica agora estará ciente de que a precipitação de DNA pode ser extrapolada para suspensões contendo adenovírus mesmo em densidades de célula mais altas, por exemplo de cerca de 40 x 106 células/ml, por exemplo de cerca de 50 x 106 células/ml, por exemplo até cerca de 100 x 106 células/ml, por exemplo até cerca de 150 x 106 células/ml, e que o adenovírus de tais suspensões de célula de alta densidade pode ser purificado com o processo da presente invenção.
[00070] Exemplo 2: Precipitação seletiva do DNA da célula hospedeira em suspensões de célula de alta densidade em escala maior
[00071] A precipitação de DNA foi testada em escalas variando entre 0,5 L e 20 L. As concentrações de DB usadas para a precipitação do DNA foram com base nos resultados experimentais anteriores (Fig. 2). Cerca de 80 % da concentração C* como determinada no modelo do tubo de teste em escala pequena foram usados.
[00072] A células PER.C6 foram cultivadas no modo por batelada ou em perfusão em biorreatores de 2L ou 10L. No modo de batelada, as células foram cultivadas durante 4 dias e infectadas depois que elas atingiram uma densidade variando entre 1 x 106 a 1,6 x 106 células/ml. Depois da infecção, as células foram cultivadas ainda durante 3 dias e foram colhidas.
[00073] No modo de perfusão, a perfusão que foi realizada com um sistema ATF, foi iniciada 4 dias após a inoculação em uma densidade de célula de aproximadamente 2,5 x 106 células totais/ml. Depois de 14 dias de perfusão a suspensão de célula foi diluída com meio isento de soro fresco no biorreator a uma densidade de célula de cerca de 13 x 106 células/ml. Subsequentemente o biorreator foi infectado com vírus Ad35. O sistema ATF foi iniciado 5 horas após a infecção em uma taxa de alívio de meio de 2 volumes do vaso por dia. Depois de 3 dias (após a infecção) as células foram colhidas. A densidade de célula na colheita (CDAH) é dada na Tabela 1.
[00074] Subsequente à colheita, as células foram lisadas em um período de 2 a 24 horas pela adição dos detergentes não iônicos Triton X-100 e Tween-80 até concentrações finais de respectivamente 0,1 e 0,05 %. Depois disso, Brometo de Domifen foi adicionado à colheita lisada até concentrações finais de 0,72 e 1,52 mM em 40 mM de NaCl. O lisado precipitado foi clarificado usando dois filtros profundos carregados com tamanhos de poro estimados entre ~10 a ~5 μm (Millistak + CE20) e ~1 a ~0,2 μm (Cuno Zeta plus 50CP)respectivamente. A clarificação foi realizada a um fluxo constante de 100 LMH (litro por metro quadrado por hora) até que a pressão atingisse 5 psi (34,5 kPa).
[00075] A Tabela 1 mostra os parâmetros do processo e resultados do processo de purificação. A lise, precipitação de DNA (ptt DNA) e clarificação foram realizadas usando 8 colheitas diferentes, que diferiram em volume, densidade de célula na colheita (CDAH) e título viral. As colheitas foram coletadas de biorreatores de 2L ou 10L. A porcentagem de DNA precipitado da célula hospedeira (HC-DNA) e a recuperação viral na etapa de precipitação foram determinadas.
Figure img0001
[00076] É concluído que a precipitação seletiva do DNA é possíve em densidade de célula alta. De fato, embora a concentração de DB fosse aumentada (com um fator de 2), as partículas virais permaneceram não precipitadas (ver recuperação mais alta do que 69 %) e a redução de HC-DNA foi mais alta do que 98 %.
[00077] Com isto a mesma permite o processamento de grandes volumes de suspensões de célula de alta densidade, que é necessário nos processos industriais.
[00078] Deve ser mencionado que por razões práticas, uma única concentração de DB (1,52 mM) foi usada para a precipitação seletiva do DNA nos experimentos 4 a 8. Os ditos experimentos mostram que as suspensões contendo adenovírus tendo uma faixa ampla (9,1 x 106 a 25,8 x 106 vc/ml) de densidades de célula podem ser tratadas com 1,52 mM de DB. Isto é compatível com a noção acima de que a relação entre concentrações adequadas de agente de precipitação seletiva e densidade de célula não é uma relação muito fixa, mas ao invés fornece variação de modo que uma faixa de concentrações de agente de precipitação seja adequada para uma dada densidade de célula.
[00079] A concentração apropriada de DB para tratar uma suspensão de célula de densidade alta contendo adenovírus que compreende uma densidade de célula variando entre 10 x 106 e 50 x 106 células/ml varia entre cerca de 1,3 mM e 2,2 mM. A concentração apropriada de DB para tratar uma colheita de suspensão de célula de densidade alta contendo adenovírus que compreende uma densidade de célula variando entre 10 x 106 e 30 x 106 células/ml varia entre cerca de 1,3 e 2 mM.ReferênciasCortin V, Thibault J, Jacob D, Gamier A. High-Titer Adenovirus Vector Production in 293S Cell Perfusion Culture. Biotechnol. Prog. 2004.Goerke A, To B, Lee A, Sagar S, Konz K. Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA. Biotechnology and bioengineering, Vol. 91, No 1, 5 de Julho de 2005.Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusion Cultures of Human Tumor Cells: A Expansível Production Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors. Biotechnol. Bioengin. 86: 637-641 (2004).

Claims (2)

1. Método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) cultivar uma suspensão de células hospedeiras tendo uma densidade celular entre 5 x 106 a 150 x 106 células por mL e infectar a suspensão de células, em que as células têm uma sequência de adenovírus E1 em seu genoma, tal como células PER.C6, número de depósito ECACC 96022940;b) lisar as células dentro da dita suspensão de célula com um detergente;c) precipitar seletivamente DNA da célula hospedeira fora das partículas de adenovírus pela adição de um agente de precipitação seletiva, tais como compostos de amônio quaternário, copolímeros de amina e quaisquer respectivas misturas;d) clarificar a dita suspensão contendo as ditas partículas de adenovírus, por centrifugação ou filtração profunda, para se obter uma suspensão contendo adenovírus purificado em que pelo menos 80 % do DNA da célula hospedeira é precipitado fora da suspensão contendo adenovírus;e) realizar cromatografia de troca de ânion e uma etapa de ultrafiltração.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de brometo de domifen (DB) está variando de 1,3 a 2 mM.
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