MX2012004222A - Metodo para purificacion de particulas de adenovirus. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para la purificación de adenovirus a gran escala a partir de una suspensión de alta densidad celular, usando precipitación de ADN de células huésped seguido de una etapa de clarificación.

Description

METODO PARA PURIFICACION DE PARTICULAS DE ADENOVIRUS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la producción de virus. Más particularmente, se relaciona con métodos mejorados para la purificación de partículas de adenovirus de una suspensión celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los últimos desarrollos en el campo de la producción de vacunas han creado la necesidad de una manufacturación a gran escala. Son necesarios procesos grandes y de alto rendimiento para ayudar al mundo con cantidades suficientes de vacunas (recombinantes) para combatir las enfermedades infecciosas.

Las vacunas contra las enfermedades infecciosas pueden basarse en partículas de adenovirus recombinantes. Por esta razón, se están haciendo grandes esfuerzos en la optimización de los procesos de base celular para la producción de adenovirus. Las células están siendo cultivadas a densidades aumentadas y, subsecuentemente, infectadas para obtener rendimientos de virus totales superiores. Tales procesos de alta densidad celular se describen, por ejemplo, en WO 2010/060719 de Crucell Holland BV, y en Yuk et al. (2004). Se describió ahí un proceso para la producción de grandes concentraciones de adenovirus recombinante . Este proceso REF. : 228831 optimizado depende de la capacidad de infectar cultivos a alta densidad celular (por ejemplo, mayor de 5xl06 células/ml) con la conservación de una alta productividad de virus por célula. Asimismo, se ofrece un método para obtener una solución de virus cosechado con alta concentración viral en un biorreactor simple. Los rendimientos de las partículas virales (VP, por sus siglas en inglés) típicas de estos procesos son de aproximadamente 1.5-2.5x1012 VP/mL.

Los procesos en donde se cultivan células a altas densidades son proclives a la acumulación de altas cantidades de residuos celulares y ADN de células huésped. Estos contaminantes tienen que desecharse adicionalmente del proceso de purificación, la cual es una operación problemática. Un método para desechar el ADN de la célula huésped de un cultivo celular cosechado se describió anteriormente en US7326555. El método consiste en precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped del cultivo celular. Un agente de precipitación selectivo podría unir específicamente al ADN de la célula huésped y dejar sin precipitar las partículas de adenovirus. Sin embargo, el método en esta referencia sólo tiene que describirse para los cultivos celulares con baja densidad celular, en donde el residuo celular y el ADN de la célula huésped están presentes en bajas cantidades.

Hasta ahora no se ha sabido que este proceso pudiera aplicarse en un medio de cultivo que contiene altas densidades celulares. Por el contrario, de la técnica previa puede inferirse una fuerte sugerencia de que un agente de precipitación, como se usó en tal método, no precipitaría selectivamente el ADN de la célula huésped del cultivo y precipitaría las partículas virales cuando se usa a altas concentraciones (Goerke et al. 2004) .

Dado que los procesos de cultivo celular están siendo sobre-escalados y las células están siendo cultivadas a densidades aumentadas, hay una necesidad en la industria de procesos en la dirección 3' que permitan el tratamiento de suspensiones a alta densidad celular. En particular, esto aplica para el campo de la producción de adenovirus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para purificar partículas de adenovirus de un lisado celular de una suspensión a alta densidad celular. Se ha encontrado en la presente que el ADN de la célula huésped en suspensiones a alta densidad celular, podría precipitarse selectivamente de la suspensión celular lisada, dejando partículas virales no precipitadas. La precipitación selectiva del ADN de la célula huésped se realizó con detergentes catiónicos.

La precipitación selectiva en las suspensiones de baja densidad celular se describió anteriormente, por ejemplo, en US7326555. Sin embargo, el logro de la precipitación selectiva en una suspensión a alta densidad celular fue inaudito y altamente inesperado. De hecho, se mostró en la técnica previa, por ejemplo, en US7326555, que en las suspensiones de baja densidad celular (hasta lxlO6 células/mL) , las partículas de adenovirus precipitan cuando se aumenta la concentración de detergente catiónico. Esto sugiere, con base en la extrapolación, que el aumento de la concentración de detergente catiónico de una manera sustancial (por ejemplo, con un factor de 2) conduciría a la precipitación de la totalidad de las partículas de adenovirus presentes en la suspensión.

En las suspensiones de alta densidad celular, en donde la densidad celular es, por ejemplo, diez veces' mayor, y de esta manera, la concentración de ADN de la célula huésped es diez veces mayor, se espera que la concentración de detergente requerida para lograr la precipitación del ADN de la célula huésped también sería significativamente mayor. Por esto, sería esperado, con base en los resultados en las suspensiones de baja densidad celular, que tal aumento en la concentración del detergente, tendría un efecto de precipitación de todas las partículas virales presentes en la solución .

Durante la prueba experimental a altas densidades celulares (aumento con un factor de 10) , se encontró que, contrario a cualquier sugerencia o esperanza, con base en la técnica previa, el aumento en la concentración de detergente catiónico (que se aumentó con un factor de 2.5) precipitó el ADN de la célula huésped (por lo menos 80%) , pero no precipitó las partículas de adenovirus. Sorprendentemente, se mantuvo el efecto de precipitación selectiva del detergente. Aquí, la presente invención proporciona un proceso que puede usarse para desechar el ADN de la célula huésped en procesos de purificación de adenovirus a gran escala usando cultivos a alta densidad celular.

La invención proporciona un método para purificar las partículas de adenovirus de una suspensión celular que contiene entre 5xl06 y 150xl06 células por mL; el método comprende: a) lisar las células con tal suspensión celular; b) precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped de las partículas de adenovirus, mediante la adición de un agente de precipitación selectiva; y c) clarificar la suspensión que contiene las partículas de adenovirus para obtener una suspensión que contiene adenovirus purificado, en donde por lo menos 80% del ADN de la célula huésped se precipita de la suspensión que contiene adenovirus.

En algunas modalidades preferidas, tal virus se purifica de una suspensión celular que tiene una densidad celular que oscila de 5xl06 a 50xl06 células por mL, por ejemplo, 10x10s a 50xl06 células por mi ó 10xl0e a 30 xlO6 células por mL.

En algunas modalidades, el agente de precipitación selectiva usado en la etapa b) es un detergente catiónico. En una modalidad preferida, el agente de precipitación selectiva es bromuro de domifeno (DB, por sus siglas en inglés) .

En algunas modalidades, el agente de precipitación selectiva se adiciona a una concentración que oscila de 12 a 5 mM . En una modalidad preferida, el agente de precipitación selectiva se adiciona a una concentración que oscila de 1.3 a 2.2 mM.

En algunas modalidades, el método de la invención además comprende una etapa de intercambio aniónico y una etapa de ultrafiltración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Recuperación de adenovirus y ADN de célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno en suspensiones celulares a baja densidad (2.5xl06-3.5xl06 vc/ml) y alta (20xl06-30xl06 vc/ml) .

Figura 2. Recuperación de adenovirus y ADN de célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno en suspensiones celulares a baja densidad (2.5xl06-3.5xl06 vc/ml) y alta (18xl06-25xl06 vc/ml).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para purificar partículas de adenovirus de un lisado celular de una suspensión a alta densidad celular.

De acuerdo con la invención, las suspensiones a alta densidad celular se obtienen cultivando las células a altas densidades celulares. Tal cultivo puede realizarse en una forma (no limitada) por lotes, alimentación por lotes o perfusión. Los métodos para cultivar las células a altas densidades celulares son conocidos por la persona experimentada en la técnica. Los métodos específicos para obtener los cultivos de alta densidad celular se describen en, por ejemplo, WO 2004/099396, O 2005/095578, O 2008/006494, WO 2010/060719.

De acuerdo con la presente invención, una suspensión a alta densidad celular contiene entre aproximadamente 5xl06 y 150x10s células/mL, por ejemplo, entre aproximadamente 8xl06 y 120xl06 células/mL, por ejemplo entre aproximadamente 12xl06 y lOOxlO6 células/mL, por ejemplo, entre aproximadamente 20xl06 y 80xl06 células/mL.

En una modalidad preferida de la presente invención, la densidad celular en la suspensión a alta densidad celular oscila entre aproximadamente lOxlO6 y 50xl06 células/mL, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15xl06 células/mL, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20xl06 células/mL, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25x1O6, por ejemplo, hasta aproximadamente 30xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 35xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 40xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 45xl06 células/mL.

De acuerdo con la presente invención, los cultivos a alta densidad celular se infectan subsecuentemente con partículas de adenovirus para permitir que los adenovirus se propaguen en el cultivo celular. Aquí, se obtienen suspensiones a alta densidad celular, las cuales contienen altas concentraciones de adenovirus, en un biorreactor simple. Los métodos para infectar los cultivos a alta densidad celular son conocidos por la persona experimentada en la técnica. Los métodos específicos para obtener tales cultivos a alta densidad celular con alta concentración de adenovirus se describen en, por ejemplo, EP0816818.9, Cortin et al. (2004) y Yuk et al. (2004). Estas referencias describen procesos para la producción de grandes cantidades de adenovirus recombinante . Estos procesos dependen de la capacidad de infectar los cultivos a alta densidad celular con conservación de una alta productividad de adenovirus por célula. Aquí, se ofrece un método para obtener una suspensión a alta densidad celular con altas concentraciones de adenovirus, en un biorreactor simple. Los rendimientos típicos de los procesos actuales, por ejemplo, para adenovirus recombinantes 35 (rAd35) son de aproximadamente 1.5-2.5xl012 VP/mL. Una vez que el adenovirus se ha propagado en el cultivo celular, las partículas de adenovirus, de acuerdo con la presente invención, se purifican de la suspensión a alta densidad celular.

El método de la presente invención, en una primera etapa, incluye lisar las células contenidas en la suspensión a alta densidad celular. Las suspensiones a alta densidad celular lisadas, las cuales se infectan con partículas de adenovirus, causan que se acumulen grandes cantidades de residuos celulares y ADN de célula huésped en la suspensión celular. Estas acumulaciones hacen problemático el procesamiento en la dirección 3' subsecuente de la suspensión celular .

La presente invención proporciona un método conveniente para purificar partículas de adenovirus del lisado celular de las suspensiones a alta densidad celular. Se precipitan selectivamente grandes cantidades de ADN de célula huésped de las partículas de adenovirus dentro de la suspensión a alta densidad celular, adicionando un agente de precipitación selectiva al lisado celular, de modo que por lo menos aproximadamente 80% de las moléculas de ADN de la célula huésped se precipitan de la suspensión de alta densidad celular que contiene las partículas de adenovirus. Como se describe en la presente, la etapa de precipitación permite la precipitación del ADN de la célula huésped contaminante, con por lo menos una reducción de 80% en el ADN de la célula huésped, de preferencia 90% e incluso más preferentemente, como se ejemplifica en la presente, aproximadamente una reducción de 95% en el ADN de la célula huésped después de la clarificación (por ejemplo, filtración profunda).

Lisis La primera etapa del proceso incluye lisar las células dentro de la suspensión celular. Esta primera etapa, en donde se lisan las membranas celulares, permite la cosecha del adenovirus celular asociado ( intracelular) y no asociado (extracelular) de la suspensión de alta densidad celular infectada. La lisis del detergente de la célula huésped, mientras que es el método preferido para lisar las células huésped que contienen virus, puede reemplazarse por métodos de lisis no mecánicos (tales como tratamiento enzimático) y/o métodos de corte mecánico (tales como ultrafiltración de fibra hueca) para liberar cantidades máximas de adenovirus. Los métodos que pueden usarse para la lisis celular activa son conocidos por la persona experimentada en la técnica, y por ejemplo, se han descrito en WO 98/22588, p. 28-35. Por ejemplo, los métodos útiles en este aspecto, son congelado-descongelado, corte sólido, lisis hipertónica e/o hipotónica, corte líquido, sonicación, extrusión a alta presión, lisis de detergente, combinaciones de los anteriores, y similares. En una modalidad de la invención, las células se lisan usando por lo menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis tiene la ventaja de que es un método fácil, y éste es fácilmente escalable.

Los detergentes que pueden usarse, y la manera en que se emplean, en general son conocidos por la persona experimentada en la técnica. Por ejemplo, varios ejemplos se describen en WO 98/22588, p. 29-33. Los detergentes, como se usan en la presente, pueden incluir, pero no se limitan a detergentes aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos y no iónicos. Ejemplos de los detergentes son, por ejemplo, Tritón y/o Polisorbato- 80. En una modalidad, el detergente usado es Tritón X-100. Además, puede adicionarse un solvente tal como TNBP al lisado o lisado clarificado, a baja concentración, para complementar estos detergentes en su capacidad para inactivar los virus envueltos. También, la autolisis de las células huéspedes infectadas por el adenovirus puede proporcionar una liberación sustancial del adenovirus intracelular, y puede usarse en los procesos de la invención. Por lo tanto, cualquier forma de la lisis de la célula huésped que es conocida en la técnica, puede usarse para liberar el virus intracelular en el medio de cultivo de la célula huésped, para la cosecha final por lo métodos descritos en la presente. Es claro para la persona experimentada en la técnica que podría variar la concentración óptima del detergente, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 0.1%-1% (p/p) .

Precipitación selectiva Después de la lisis, el ADN se precipita selectivamente mediante la adición de una solución de agente de precipitación selectivo concentrado (SPA, por sus siglas en inglés), mientras se dejan las partículas de adenovirus en la fase líquida. Esta etapa permite la precipitación selectiva del ADN de la célula huésped y también mejora la robustez en la dirección 3' . Como se ejemplifica en la presente, esta etapa de precipitación previa resulta en aproximadamente una reducción de 80% en el ácido nucleico (célula huésped) después de la clarificación.

Los SPAs que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, copolímero de amina, compuestos de amonio cuaternarios, y cualesquiera mezclas respectivas de los mismos. Más específicamente, las diferentes formas de polietileno (PEI) son muy eficientes en la neutralización de la carga iónica en exceso (impurezas de ADN) . Una lista de los posibles SPAs que puede usarse apropiadamente en la presente invención se proporciona en US7326555 (columna 12, líneas 56-67 y columna 13, líneas 1-28), incorporado en la presente por referencia. Los SPAs apropiados para el uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a las siguientes clases y ejemplos de productos comercialmente disponibles: sales de monoalquiltrimetilamonio (ejemplos de los productos comercialmente disponibles incluyen bromuro o cloruro de cetiltrimetilamonio como CTAB, bromuro o cloruro de tetradeciltrimetilamonio (TTA) , cloruro de alquiltrimetilamonio, cloruro de alquilariltrimetilamonio, bromuro o cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de dodecildimetil-2-fenoxietilamonio, sal de bromuro o cloruro de hexadecilamina, sal de cloruro de dodecilamina y bromuro o cloruro de cetildimetiletilamonio) , sales de monoalquildimetilbencilamonio (ejemplos incluyen cloruros de alquildimetilbencilamonio y cloruro de bencetonio como BTC) , sales de dialquildimetilamonio (los productos comerciales incluyen bromuro de domifeno (DB) , haluros de didecildimetilamonio y cloruro o bromuro de octildodecildimetilamonio) , sales de amonio heteroaromáticas (los productos comerciales incluyen haluros de cetilpiridio (CPC o sal de bromuro y bromuro o cloruro de hexadecilpiridinio) , isómero cis de 1- [3 -cloroalil] -3 , 5 , 7 -triaza-l-azoniaadamantano, bromuro de alquil - isoquinolinio y cloruro de alquildimetilnaftil -metil amonio (BTC 1110) . Las sales de amonio cuaternarias polisustituidas (los productos comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a sacarinato de alquildimetilbencil amonio y ciclohexilsulfamato de alquildimetiletilbencil amonio) , sales de amonio bis-cuaternarias (ejemplos de los productos incluyen cloruro de 1 , 10-bis (2-metil-4-aminoquinolinio-decano, cloruro de 1,6-bis { l-metil-3 - (2 , 2 , 6-trimetil ciclohexil) -propildimetil amonio] cloruro de hexano o triclorobisonio, y bis-cuat referido como CDQ por Buckman Brochures) y sales de amonio cuaternario poliméricas (incluyedo poliionenos, tales como dicloruro de poli [oxietilen (dimetiliminio) etilen (dimetiliminio) etileno] , dicloruro de poli [N-3 -dimetilamonio) propil] N- [3 -etilenoxietilendimetilamonio) propil] urea y cloruro de alfa-4- [1-tris (2-hidroxietil) amonio) . Como la persona experimentada entenderá a partir de US7326555, en donde varios de éstos se mostraron que trabajan, y en donde se mostró que la persona experimentada puede encontrar de manera rutinaria las concentraciones apropiadas para estos compuestos para precipitar selectivamente el ADN, éstos son ejemplos de SPAs, y se basan en la presente descripción y la descripción de la presente invención y es claro que éstos también serán convenientes en la presente invención.

En una modalidad preferida, los detergentes catiónicos se usan en la presente invención. En una modalidad aún más preferida, se usan en la presente invención las sales de dialquildimetilaminio, tales como bromuro de domifeno (DB) . El bromuro de domifeno se usa como un agente de precipitación selectivo para los esquemas de purificación que requieren la remoción de cualquier número de componentes celulares, especialmente ácidos nucleicos, de cualquier número de los diferentes tipos de productos biológicos, que incluyen, pero no se limitan a partículas virales, partículas similares a virus o cualquier otro producto biológico que puede separarse sustancialmente de un componente a base de cultivo contaminante, por medio de una etapa de precipitación selectiva. Aunque puede usarse un gran número de SPAs potenciales para practicar la presente invención, el bromuro de domifeno es de interés particular debido principalmente a su biodisponibilidad como una materia prima de grado GMP y el uso actual en otros productos destinados al uso humano. Más específicamente, dado que el bromuro de domifeno se usa extensivamente como un ingrediente activo en los productos de higiene oral, así como en cremas antibióticas tópicas, esta molécula se produce en grandes cantidades y se libera bajo condiciones de cGMP.

Se determinó en la presente la concentración óptima de SPA que se usa en las suspensiones a alta densidad celular para precipitar el ADN de la célula huésped de la suspensión celular. Aunque se anticipó, con base en la técnica previa, que las partículas de adenovirus precipitarían inmediatamente cuando se colocaran en contacto con altas concentraciones de SPA, inesperadamente, las partículas de adenovirus permanecieron sin precipitar. De hecho, se mostró en la técnica previa, por ejemplo, en US7326555, que en suspensiones de baja densidad celular (hasta lxlO6 células/mL) , las partículas de adenovirus precipitan cuando se aumenta la concentración de detergente catiónico. La suspensión como se produce, lisando cultivos de alta densidad celular como se describe en la presente, contendrá cantidades ampliamente aumentadas del ADN de la célula huésped y otras impurezas y, por lo tanto, necesitará mayores cantidades de detergente catiónico (por ejemplo, aumento por un factor de 2.5) . Se espera con base a la extrapolación de los resultados a baja densidad celular, que este aumento en la concentración del detergente catiónico, conduciría a la precipitación de la totalidad de las partículas de adenovirus presentes en la suspensión .

Sorprendentemente, a altas concentraciones de SPA, fue aún posible la remoción selectiva del ADN de la célula huésped contaminante de una suspensión a alta densidad celular que contiene partículas de adenovirus. En una modalidad preferida de la presente invención, el SPA, de preferencia DB, se adiciona a una concentración que oscila de 1.2 a 5 mM. En una modalidad aún más preferida, el SPA, de preferencia DB, se adiciona a una concentración que oscila de 1.3 a 2.2 mM, por ejemplo, 1.4 a 2 mM, por ejemplo, 1.4 a 1.8 mM, por ejemplo, 1.5 a 1.6 mM. Con base en la presente descripción, es claro que la persona experimentada en la técnica sabe cómo determinar los umbrales de concentración de SPA apropiados para una densidad celular dada en la cosecha.

La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre 10x10s y 150xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.2 mM y 5 mM. La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre lOxlO6 y 50xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.3 mM y 2.2 mM. La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una cosecha de suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus que comprende un densidad celular que oscila entre lOxlO6 y 30xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.3 y 2 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.4 y 1.9 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.4 y 1.8 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.4 y 1.7 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.45 y 1.65 mM, por ejemplo, aproximadamente 1.5-1.55 mM.

Las nucleasas (que incluyen, pero no se limitan a BENZONASE™, DNasas y RNAsas) ya no se requieren en esta etapa, pero aún pueden ser benéficas para la reducción de ADN máxima. Desde el punto de vista de la capacidad de esta etapa de precipitación para remover la vasta mayoría de los ácidos nucleicos contaminantes, una etapa de cromatografía de intercambio aniónico posterior (AEX, por sus siglas en inglés) no puede ser esencial para la pureza del producto (dependiendo de la dosificación final) . Sin embargo, una etapa AEX puede permanecer en el proceso para robustez.

Estará dentro del panorama de la persona experimentada probar los sustitutos potenciales para los SPAs descritos en la presente, para identificar un compuesto que precipita efectivamente las moléculas de ácidos nucleicos y otros residuos celulares de las partículas de adenovirus, como se ejemplifica en la presente, por el bromuro de domifeno (DB) . Por lo tanto, la presente invención se relaciona, en parte, con los métodos para purificar partículas de adenovirus de una suspensión a alta densidad celular, dentro de los cuales comprende: precipitar selectivamente las moléculas de ácido nucleico de célula huésped de las partículas de adenovirus dentro de la suspensión de alta densidad celular post-lisis, adicionando un agente de precipitación selectivo al medio de cultivo celular huésped post-lisis.

Clarificación El lisado celular tratado con SPA obtenido de las etapas previas, se clarifica subsecuentemente para remover las impurezas precipitadas y los residuos celulares. La clarificación puede realizarse por filtración profunda.

También es factible la centrifugación con o sin filtración profunda de pulido. Por lo tanto, la clarificación del lisado precipitado puede realizarse usando sólo centrifugación, o centrifugación en tándem con una etapa de clarificación de pulido, tal como filtración profunda, como se describe en US7326555.

En la elección de un filtro o esquema de filtrado, fue necesario asegurar un desempeño robusto en el caso de que se presenten cambios o variaciones en la dirección 5' . El mantenimiento del balance entre el buen desempeño de clarificación y los rendimientos de la etapa pueden investigarse probando una variedad de tipos de filtrado con medios internos variados. Los filtros apropiados pueden usar filtros de celulosa, fibras de celulosa regeneradas, fibras de celulosa combinadas con auxiliares de filtrado inorgánicos (por ejemplo, tierra diatomácea, perlita, vapor de sílice) , fibras de celulosa combinadas con auxiliares inorgánicos y resinas orgánicas, o cualquier combinación de las mismas, y filtros poliméricos (ejemplos incluyen, pero no se limitan a nailon, polipropileno, poliétersulfona) para lograr una remoción efectiva y recuperaciones de virus aceptables. En general, un proceso de etapa múltiple es preferible, pero no se requiere. Un ejemplo de un proceso de dos o tres etapas consistiría de un filtro (s) grueso para remover precipitado y residuos celulares grandes seguido de filtro (s) de una segunda etapa de pulido con tamaños de poro nominal mayores de 0.2 µp\, pero menor de 1 µp?. La combinación óptima será una función de la distribución del tamaño de precipitado, así como de otras variables. Además, las operaciones de una sola etapa que emplean un filtro relativamente estrecho o centrifugación, también puede producir un producto de buena calidad. Más generalmente, cualquier método de clarificación, que incluye filtración de extremo muerto, microfiltración, centrifugación o alimentación de cuerpos de auxiliares de filtración (por ejemplo, tierra diatomácea) en combinación con la filtración de extremo muerto o profunda, la cual proporciona un filtrado de claridad apropiada para no obstruir la membrana y/o resina en la etapa subsecuente, será aceptable para la práctica dentro de la presente invención. La filtración profunda muestra un método robusto de clarificación para la presente invención. Las membranas de filtrado profundo comercialmente disponibles se describen en US 7326555 (columna 14, línea 65 a columna 15, línea 19), incorporada en la presente por referencia.

La combinación de las etapas de precipitación y clarificación remueve por lo menos 70%, más probablemente por lo menos 80%, o incluso preferentemente por lo menos 90% del ADN de la célula huésped de las partículas de adenovirus después de la clarificación (por ejemplo, tal como filtración profunda sola o filtración profunda combinada con una etapa de filtración profunda de pulido) .

Métodos de purificación adicionales En algunas modalidades, las partículas virales cosechadas se purifican adicionalmente . La purificación adicional del virus puede realizarse en varias etapas, que comprenden concentración, ultrafiltración, diafiltración o separación con cromatografía, como se describe en, por ejemplo, WO 2005080556, incorporada en la presente por referencia. También pueden usarse otras etapas, tales como, cromatografía de membrana de intercambio aniónico, filtración estéril, adsorción de fase inversa, cromatografía de hidroxiapatita . Por ejemplo, estas etapas se describen en US 7326555, incorporada en la presente por referencia en la presente. La persona experimentada en la técnica sabe cómo encontrar las condiciones óptimas para cada etapa de purificación. También WO 98/22588, incorporada en la presente por referencia, describe métodos para la producción y purificación de partículas virales.

En algunas modalidades de acuerdo con la invención, la suspensión de partícula de adenovirus clarificada puede tratarse por ultrafiltración . La ultrafiltración se usa para concentrar la suspensión de virus. La suspensión puede concentrarse de 5 a 20 veces y, posiblemente, puede tratarse con nucleasa (como se mencionó anteriormente) . Otro aspecto de la invención es la introducción subsecuente de un amortiguador de intercambio mediante diafiltración . La diafiltración, o intercambio de amortiguador, usando ultrafiltradores es una manera para la remoción e intercambio de sales, azúcares y similares. La persona experimentada en la técnica sabe bajo que condiciones el intercambio de amortiguador debería llevarse a cabo y que amortiguadores son apropiados para esta etapa.

La membrana de ultrafiltración particular seleccionada será de un tamaño suficientemente pequeño para retener las partículas de adenovirus, pero suficientemente grande para clarificar efectivamente las impurezas. Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, pueden ser apropiados cortes de peso molecular nominal entre 10 y 1000 kDa . Se prefiere la ultrafiltración usando un modo de flujo tangencial. En este modo, la etapa puede controlarse ajustando un flujo transversal fijado con o sin contrapresión sobre el retorno retenido, a ustando una presión de transmembrana fijada o fijando el flujo transversal y el flujo de permeado.

El tratamiento con nucleasa también puede considerarse para la inclusión en el proceso en este punto, pero este medio no se requiere. El tratamiento con nucleasa puede incluir el uso de una nucleasa de amplio espectro (por ejemplo, BENZONASE™) , una DNasa, una RNasa o cualquier combinación de las mismas. Se prefiere una nucleasa o cóctel con actividad de RNasa y DNasa. Una etapa de tratamiento de nucleasa puede contemplarse en cualquier punto en el proceso, con tal de que el contenido de nucleasa residual en el producto final sea aceptable para la aplicación. Se prefiere que el tratamiento con nucleasa se presente después de la clarificación y, especialmente, se prefiere que el tratamiento con nucleasa se presente después de la etapa de clarificación y concentración, pero antes de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

De acuerdo con la invención, una etapa posterior puede ser una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Durante esta etapa, las partículas de adenovirus se unen a un material cargado positivamente, por ejemplo, una membrana, un cartucho o columna. La elución subsecuente permite la separación de las partículas de virus de las impurezas y el ADN de la célula huésped restante.

Para la purificación de adenovirus con un absorbedor de membrana Mustang Q, la concentración de NaCl para la carga y lavado podría ser presumiblemente de 0.3 a 0.4 M a pH 7.5 y cambiaría de pH's alternados. Más preferentemente, la concentración de NaCl es de 0.35 M. El pH de los amortiguadores necesita ser suficientemente alto para la unión del adenovirus (mayor de aproximadamente 6.5). Además, el pH del sistema amortiguador también debería ser suficientemente bajo para evitar la inestabilidad viral. El pH máximo preciso que es usado dependerá del perfil de estabilidad específico del adenovirus y los componentes amortiguadores, y puede determinarse fácilmente por la persona experimentada en la técnica para tal aplicación particular. Como una guía y naturalmente no como una limitación, el pH podría oscilar potencialmente de aproximadamente 5-10.

Se prefiere altamente la presencia de 0.1% de PS-80 en los amortiguadores para lograr niveles bajos de ADN residual en el producto, debido a que atenúa la asociación de adenovirus/ADN y la agregación de adenovirus. Estará dentro del campo de la experimentación rutinaria para la persona experimentada en la técnica, establecer concentraciones de detergentes mayores o menores o detergentes alternativos que serían útiles para promover la disociación de las partículas de adenovirus de los otros adenovirus, así como diferentes contaminantes celulares. También está dentro de este mismo campo de concentración que la persona experimentada en la técnica puede elegir un detergente alternativo para el amortiguador del proceso. Ejemplos para tales detergentes alternativos pueden encontrarse en US 7326555. Los productos de cromatografía de membrana de intercambio aniónico, tales como los producidos por Pall (por ejemplo, la serie Mustang™) y Sartorius (por ejemplo, la serie Sartobind) son apropiados para la purificación viral de acuerdo con la presente invención. La patente US 6,485,958 y O 05/080556 describen el uso de cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de adenovirus recombinante .

La capacidad de unión para el virus en un absorbedor de membrana, tal como Mustang Q (Pall Corporation) es extremadamente alta, y en el orden de 7xl013 VP/ml. Otros absorbedores de membrana y resinas que son apropiados para la purificación de virus en este proceso incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a Source 15Q y Source 30Q (GE life sciences) , Q-Sepharose XL (GE life sciences) , Fractogel TMAE (EM industries) , Sartobind Q (Sartorius) , Adsept Q (Natrix separations) , CIM QA (BIA separations) . La elución de adenovirus sería realizada preferentemente usando un amortiguador que contiene NaCl. La persona experimentada sabe cómo optimizar la concentración de NaCl.

En algunas modalidades, se prefiere usar por lo menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico, el adenovirus puede ser suficientemente puro. Sin embargo, en algunas modalidades, se realiza además una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño para aumentar la robustez del proceso. Esta etapa puede ser antes o después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Obviamente, también pueden combinarse convenientemente otras etapas de purificación con una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. El uso de la cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de adenovirus se ha descrito extensivamente, y, por lo tanto, este aspecto está bien dentro del alcance de la persona experimentada en la técnica. Se han empleado muchas matrices de cromatografía diferentes para la purificación de adenovirus y son apropiadas. La persona experimentada en la técnica puede encontrar fácilmente el material de intercambio aniónico óptimo para purificar tal adenovirus.

En cualquier modalidad particular de la presente invención, el producto de intercambio aniónico puede diafiltrarse en el amortiguador de formulación y filtrarse estéril. Alternativamente, una etapa de cromatografía adicional (por ejemplo, intercambio catiónico) puede agregarse ya sea antes o después de la diafiltración con el potencial para mejorar la solidez de impurezas y/o la clarificación del virus/prión.

Una etapa de ultrafiltración adicional también puede ser posible en esta etapa. La ultrafiltración de flujo tangencial es útil para remover la proteína residual y el ácido nucleico y para intercambiar el adenovirus en un amortiguador de formulación. La elección entre membranas de 300 kDa y 500 kDa se dictamina por los intercambios entre el rendimiento y la clarificación de la impureza mejorada. Otras configuraciones de membrana (tales como una fibra hueca) son sustitutos aceptables. La membrana de ultrafiltración seleccionada será de un tamaño suficientemente pequeño para mantener las partículas de adenovirus, pero suficientemente grande para clarificar efectivamente las impurezas. Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, pueden ser apropiados los cortes del peso molecular nominal entre 100 y 1000 kDa.

Puede incluirse en el proceso una etapa de filtración estéril, la cual es útil en la eliminación de la bio-carga. El producto puede filtrarse a través de una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) modificada de 0.22 micrómetros (por ejemplo, Millipore Millipak) .

Las etapas de procesamiento en la dirección 3', opcionales podrían adicionarse en el proceso. Por ejemplo, éstas podrían incluir una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño, una etapa de adsorción de fase inversa y/o una etapa de cromatografía de hidroxiapatita . Más detalles en cada una de estas etapas pueden encontrarse en, por ejemplo, US 7326555, WO 03/097797, WO 02/44348.

La solicitud internacional WO 97/08298 describe la purificación de adenovirus usando algunas matrices cromatográficas para evitar el daño a los virus, incluyendo las etapas de intercambio aniónico y exclusión de tamaño.

Algunos métodos de ultrafiltración son muy apropiados para la purificación de adenovirus, como se describe en WO 2006/108707. Estas etapas pueden realizarse además de, o en lugar de, algunas etapas de purificación cromatográficas .

Escala de los sistemas de cultivo celular y sistemas de procesamiento en la dirección 3' Los procesos de la presente invención son escalables. Los cultivos celulares usados en la presente invención oscilan desde cultivos a pequeña escala (por ejemplo, corridas de 1-10 litros) hasta cultivos de media escala (por ejemplo, corridas de 20-1000 L) hasta preparaciones comerciales a gran escala, tales como corridas de producción de 1000 a 50,000 L. Las etapas de proceso iniciales (lisis, filtración profunda y ultrafiltración) se escalan con el volumen de cultivo, mientras que la cromatografía de intercambio aniónico y las etapas subsecuentes se escalan con la entrada de la partícula adenoviral. Por lo tanto, el tamaño de las etapas anteriores será basado en un estimado de productividad del biorreactor de por lo menos lxlO12 partículas de adenovirus por mL (vp/mL) . Por ejemplo, estos altos rendimientos de adenovirus pueden obtenerse infectando cultivos de alta densidad celular (como se describe, por ejemplo, en EP08168181.9 ) . La purificación adicional de estas suspensiones de alta densidad celular que contienen altas concentraciones de partículas de adenovirus, se hace posible con la presente invención. La posibilidad para procesar estas suspensiones, las cuales contienen altas cantidades de residuos celulares y ADN de la célula huésped, permiten la purificación de altas cantidades de partículas de adenovirus por volumen de suspensión. Es el mérito de esta invención proporcionar un método para procesar lotes de cultivo celular con altas densidades celulares, que contienen altas concentraciones de partículas de adenovirus y, de esta manera, permitiendo muy altos rendimientos de adenovirus por volumen procesado. El presente método, aunque es aplicable a cultivos celulares a gran escala, permitirán que las células sean cultivadas a una escala más pequeña, aún a densidades celulares mayores y incluso alcanzar altos rendimientos de adenovirus que además pueden procesarse eficientemente. Este método ofrece la posibilidad de procesar lotes de adenovirus altamente concentrados que tendrán un gran impacto sobre la industria de purificación de adenovirus total .

Adenovirus y células productoras La invención se relaciona con la purificación de adenovirus. Un adenovirus de acuerdo con esta invención puede ser cualquier adenovirus de tipo silvestre, modificado, mutado y/o un vector adenoviral recombinante . De interés específico en las aplicaciones de vacunación génica y/o la terapia génica es el uso de un adenovirus incompetente de replicación de primera o segunda generación, lisiado por El o además eliminaciones, incluyendo vectores de adenovirus "sin intestino" . El genoma del adenovirus en general se asocia con patologías benignas en los humanos. El genoma es susceptible a manipulación, dependiendo de la estrategia usada para construir el vector respectivo. Un virus de replicación incompetente, tal como un vector de adenovirus recombinante 35 (rAd35) ó 26 (rAd26) (como se ejemplifica en la presente) requiere una línea celular productora que complementa las eliminaciones .

Una célula productora (a menudo también llamada en la técnica y en la presente como "célula de empaque" o "célula de complemento" o "célula huésped") puede ser cualquier célula productora, en donde puede propagarse un adenovirus deseado. Por ejemplo, la propagación de los vectores de adenovirus recombinantes se realiza en las células productoras que complementan las deficiencias en el adenovirus. De preferencia, tales células productoras tienen en su genoma por lo menos una secuencia de adenovirus El, y por lo tanto, son capaces de complementar los adenovirus recombinantes con una eliminación en la región El. Además, el adenovirus puede tener una eliminación en la región E3 , la cual es prescindible del genoma Ad, y por esto tal eliminación no tiene que ser complementada. Puede usarse cualquier célula productora de complemento El, tal como las células de la retina humana inmortalizada por El, por ejemplo, células 91 1 o PER.C6 (ver la patente US 5,994,128), amniocitos El transformados (ver la patente EP 1230354), células A549 transformadas El (ver, por ejemplo, WO 98/39411, patente US 5,891,690), GH329 : HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, y similares. En algunas modalidades, las células productoras son, por ejemplo, células HEK293 o células PER.C6 o células 91 1 o IT293SF y similares. De preferencia, las células PER.C6 (depósito ECACC No. 96022940, depositado el 29 de febrero de 1996 y ECACC, CAMR, Portón Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido; ver la patente US 5,994,128) o las células derivadas de las mismas se usan como células productoras.

El vector adenoviral de replicación deficiente puede generalizarse usando cualquier especie, cepa, subtipo o mezcla de especies, cepas o subtipos, de un adenovirus o un adenovirus quimérico como la fuente de ADN de vector (ver, por ejemplo, WO 96/26281, WO 00/03029) , que, por ejemplo, puede proporcionar el vector adenoviral con la capacidad de infectar algunos tipos de células deseadas. En una modalidad preferida de la presente invención, se usa rAd35 o rAd26 como un adenovirus .

La persona experimentada en la técnica estará consciente de las posibilidades para propagar los vectores adenovirales de diferentes serotipos sobre las células huésped específicas, usando los métodos, tales como, por ejemplo, se describen en la patente US 6,492,169 o en WO 03/104467 y sus referencias. Por ejemplo, la propagación de rAd35 deficiente en El, las células productoras específicas que expresan E1B-55K de Ad35 pueden construirse, por ejemplo, con base en las células productoras existentes que expresan ElA y ElB de Ad5 , tales como las células PER.C6 o HEK293 (ver, por ejemplo, US 6,492,169) como se conoce por la persona experimentada. Alternativamente, y de preferencia, las líneas celulares complementarias existentes (Ad5-), tales como por ejemplo, PER.C6 o HEK293 pueden usarse sin modificación de las células para la propagación de rAd35 o rAd26 deficiente en El, por inclusión de la secuencia de codificación E4-orf6 de Ad5 en el vector rAd35 o rAd26, como se describe extensivamente en, por ejemplo, WO 03/104467, incorporado en la presente en su totalidad por referencia. De esta manera, la propagación de los vectores adenovirales de cualquier serotipo puede hacerse sobre las células productoras usando los medios y métodos bien conocidos por la persona experimentada en la técnica. Los vectores adenovirales, métodos para la construcción de los mismos y los métodos para propagarlos, son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191 y 6,113,913 y Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication" , M. S. Horwitz, "Adenoviruses" , capítulos 67 y 68, respectivamente, en Virology, B.N. Fields et al., eds . , 3ra. edición, Raven Press, Ltd., New York (1996) y otras referencias mencionadas en la presente.

La invención se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no limitan la invención de ninguna manera. Sirven exclusivamente para clarificar la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Precipitación selectiva de ADN de célula huésped en las suspensiones de alta densidad celular Se demostró la precipitación selectiva de ADN de células huésped en la técnica previa (Goerke et al., US 7326555) para densidades celulares de hasta lxlO6 células/mL. Se mostró en la presente que (a bajas densidades celulares) por lo menos 80% del ADN de la célula huésped se precipitó de la suspensión celular con una recuperación 90% > de las partículas de virus. Sin embargo, es desconocido completamente hasta ahora si tal precipitación selectiva sería factible a alta densidad celular, dado que tales suspensiones celulares contendrían cantidades mucho mayores del ADN de la célula huésped y residuo celular, y por lo tanto, sería esperado que serían requeridas cantidades mucho mayores de agente de precipitación de ADN, mientras que la extrapolación de los datos de la técnica anterior sugeriría que tales concentraciones mayores de agente de precipitación de ADN también precipitarían el adenovirus.

Para explorar la posibilidad de la precipitación del ADN a altas densidades celulares, la precipitación del ADN de la célula huésped se probó en tubos de prueba a pequeña escala, que contienen densidades celulares de hasta 30xl06 células/mL . El modelo del tubo de prueba a pequeña escala se usó como una herramienta de selección rápida para probar si la precipitación de ADN selectiva se presenta aún a altas densidades celulares.

Las células PER.C6 se crecieron en un biorreactor y se infectaron con el adenovirus 35 (Ad35) y se crecieron a 37°C en medio de cultivo libre de suero durante 3 días. Las células se cosecharon a una densidad celular entre 2 y 30xl06 células/mL y titulaciones de virus que oscilan de 8xl010 a 1.5xl012 VP/mL. La lisis celular se realizó durante un periodo de 2 a 24 horas (hrs) , adicionando los detergentes no iónicos Tritón X-100 y Tween-80 a concentraciones finales de 0.1% y 0.05%, respectivamente. El aumento en las concentraciones de bromuro de domifeno (DB) en NaCl 40 mM, se adicionaron a 3.5 mL de cosecha lisada, seguido de la formación del vórtice inmediata durante 1 minuto. El material precipitado se removió con filtros de jeringa de fluoruro de polivinilideno (PVDF) 0.45 µ??. Los filtrados se analizaron para Ad35 y las concentraciones de ADN de la célula huésped, usando una prueba HPLC-AEX y Q-PCR, respectivamente.

La Figura 1 muestra la recuperación del virus y el ADN de la célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno. Las curvas representadas en triángulos se obtienen de las cosechas de los cultivos celulares que tienen densidades celulares que oscilan entre 2.5xl06 y 3.5xl06 células/mL. Las curvas representadas en círculos se obtienen de cosechas de cultivo celular que tienen densidades celulares que oscilan entre 20xl06 y 30xl06 células/mL. La C* (concentración de bromuro de domifeno que muestra una recuperación de virus de 90%) a densidades celulares baja y alta y el porcentaje relacionado del ADN de la célula huésped precipitada, se resaltan en las gráficas .

La concentración de DB que se requiere para precipitar más de 90% del ADN de la célula huésped a densidades celulares que oscilan entre 20xl06 y 30xl06 células/mL, se aumenta por un factor de por lo menos 2.5 veces comparado con la concentración de DB requerida a densidades celulares que son 10 veces menores. Sorprendentemente, el aumento de la concentración de DB no precipitó las partículas de virus, como se esperaría de la extrapolación de las curvas obtenidas a una densidad celular menor.

El experimento se repitió con los cosechas del cultivo celular que tienen densidades celulares que oscilan entre 18xl06 y 25xl06 células/mL. La Figura 2 muestra la recuperación del virus y el ADN de la célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno. Las curvas representadas en triángulos se obtienen de las cosechas del cultivo celular, que tienen densidades celulares que oscilan entre 2.5xl06 y 3.5xl06 células/mL. Las curvas representadas en círculos se obtienen de las cosechas del cultivo celular que tienen densidades celulares que oscilan entre 18xl06 y 25xl06 células/mL. La C* (concentración de bromuro de domifeno que da una recuperación de virus de 90%) a densidades celulares baja y alta y el porcentaje relacionado del ADN de la célula huésped precipitado se resaltan en las gráficas.

Como puede observarse de las gráficas en las Figuras 1 y 2, la concentración de DB que da 90% de recuperación de virus (C*) para las suspensiones de alta densidad celular pueden diferir ligeramente entre los experimentos individuales, y esto es parte de la variación normal. Sin embargo, las gráficas demuestran consistentemente que una precipitación selectiva de ADN es posible también a altas densidades celulares, y que la concentración apropiada de SPA (aquí DB) es significativamente mayor que para los cultivos de baja densidad celular, pero mucho menor que la que se esperaría con base en la extrapolación. De esta manera, la persona experimentada reconocerá que hay un intervalo en lugar de un punto fijado de concentraciones apropiadas para el agente de precipitación selectivo, y con base en la descripción de la presente, pueden tener el intervalo apropiado. Por ejemplo, las concentraciones apropiadas de DB para el tratamiento de una cosecha de suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus, comprende una densidad celular que oscila entre un intervalo de aproximadamente lOxlO6 y 30xl06 células/mL, entre aproximadamente 1.3 y 2 mM.

Con base en estos resultados, la persona experimentada en la técnica estará consciente ahora que la precipitación del ADN puede extrapolarse a las suspensiones que contienen adenovirus, que contienen incluso mayores densidades celulares, por ejemplo, de aproximadamente 40xl06 células/mL, por ejemplo, de aproximadamente 50xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 100x10s células/mL, por ejemplo, aproximadamente 150xl06 células/mL, y que los adenovirus de tales suspensiones de alta densidad celular pueden purificarse con el proceso de la presente invención.

Ejemplo 2: Precipitación selectiva de ADN de células huésped en suspensiones de alta densidad celular a gran escala La precipitación de ADN se probó a escalas que oscilan entre 0.5 L y 20 L. Las concentraciones de DB usadas para la precipitación de ADN se basaron en los resultados experimentales previos (Figura 2) . Se usó aproximadamente 80% de la concentración C* como se determinó en el modelo del tubo de prueba a pequeña escala.

Las células PER.C6 se cultivaron en un modo de lotes o en perfusión en biorreactores de 2 L ó 10 L. En el modo de lotes, las células se cultivaron durante 4 días y se infectaron después de que alcanzaron una densidad que oscila entre lxlO6 a 1.6xl06 células/mL. Después de la infección, las células se cultivaron adicionalmente durante 3 días y se cosecharon .

En el modo de perfusión, la perfusión que se realizó con un sistema ATF, se inició 4 días post-inoculación a una densidad celular de aproximadamente 2.5xl06 células totales/mL. Después de 14 días de perfusión, la suspensión celular se diluyó con medio libre de suero fresco en el biorreactor a una densidad celular de aproximadamente 13xl06 células/mL. Subsecuentemente, el biorreactor se infectó con el virus Ad35. El sistema ATF se inició 5 horas post-infección a una velocidad de refresco media de 2 volúmenes de recipiente por día. Después de 3 días (post-infección) las células se cosecharon. La densidad celular en la cosecha (CDAH) se proporciona en la Tabla 1.

Subsecuente a la cosecha, las células se lisaron durante un periodo de 2 a 24 horas, adicionando el detergente no iónico Tritón X-100 y Tween-80 a concentraciones finales de 0.1 y 0.05%>, respectivamente. Posteriormente, se adicionó bromuro de domifeno a la cosecha lisada a concentraciones finales de 0.72 y 1.52 mM en NaCl 40 mM. El lisado precipitado se clarificó usando dos filtros de profundidad cargada, con tamaños de poro estimados entre -10 - ~ -5 µ?? (Millistak + CE20) y -1 - ~ -0.2 µp\ (Cuno Zeta plus 50 CP), respectivamente. La clarificación se realizó a un flujo constante de 100 LMH (litros por metro cuadrado por hora) hasta que la presión alcanzó 5 psi (34.4 kPa) La Tabla 1 muestra los parámetros de proceso y los resultados del proceso de purificación. La lisis, precipitación de ADN (ADN ptt) y la clarificación se realizaron usando 8 diferentes cosechas, que difirieron en volumen, densidad celular en la cosecha (CDAH, por sus siglas en inglés) y titulación viral. Las cosechas se tomaron de biorreactores de 2 L ó 10 L. De determinaron el porcentaje de ADN de la célula huésped precipitada (HC-ADN) y la recuperación del virus durante la etapa de precipitación.

Tabla 1 Se concluye que la precipitación de ADN selectiva es posible a alta densidad celular. De hecho, aunque se aumentó la concentración de DB (con un factor de 2) , las partículas de virus permanecieron sin precipitar (ver la recuperación mayor de 69%) y la reducción de HC-ADN fue mayor de 98%.

En la presente se muestra el procesamiento de grandes volúmenes de suspensiones de alta densidad celular, la cual es necesaria en los procesos industriales.

Debe observarse que por razones prácticas, una concentración de DB simple (1.52 mM) se ha usado para la precipitación selectiva de ADN en los experimentos 4-8. Estos experimentos muestran que las suspensiones que contienen adenovirus que tienen un amplio intervalo (9. lxl06-25.8xl06 vc/ml) de las densidades celular pueden tratarse con DB 1.52 mM. Esto es consistente con la noción anterior de que la relación entre las concentraciones apropiadas del agente de precipitación selectiva y la densidad celular no está muy fijada, pero en vez de esto proporciona una variación, de modo que es apropiado un intervalo de concentraciones del agente de precipitación para una densidad celular dada.

La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una suspensión de alta densidad celular que contiene el adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre lOxlO6 y 50xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.3 mM y 2.2 mM. La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una cosecha de suspensión de alta densidad celular que contiene el adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre 10x10s y 30xl06 células/mL oscila entre aproximadamente 1.3 y 2 mM.

Referencias Cortin V, Thibault J, Jacob D, Gamier A. High-Titer Adenovirus Vector Productioni in 293S Cell Perfusión Culture. Biotechnol. Prog. 2004.

Goerke A, To B, Lee A, Sagar S, Konz K. Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA. Biotechnology and bioengineering, Vol . 91, No. 1, 5 de julio de 2005.

Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusión Cultures of Human Tumor Cells: A Scalable Production Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors . Biotechnol. Bioengin. 86: 637-641 (2004) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (3)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Método para purificar partículas de adenovirus de una suspensión celular productora, que comprende las etapas de: a) lisar las células dentro de la suspensión celular; b) precipitar selectivamente el ADN de las partículas de adenovirus, mediante la adición de bromuro de domifeno a una concentración que oscila de 1.3 a 2.2 mM; c) clarificar la suspensión que contiene las partículas de adenovirus para obtener una suspensión que contiene adenovirus purificado, en donde por lo menos 80% del ADN de la célula huésped se precipita de la suspensión que contiene adenovirus; caracterizado porque la densidad celular de la suspensión celular oscila de lOxlO6 a 50xl06 células por mL .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la densidad celular oscila de aproximadamente lOxlO6 a 30xl06 células por mL y la concentración de bromuro de domifeno (DB) oscila de 1.3 a 2 mM.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque además comprende una etapa de intercambio aniónico y una etapa de ultrafiltración .