KR101749779B1

KR101749779B1 - 아데노바이러스 입자의 정제 방법

Info

Publication number: KR101749779B1
Application number: KR1020127011456A
Authority: KR
Inventors: 마르셀 레오 데 포흣; 마르루스 페엔스트라
Original assignee: 크루셀 홀란드 비.브이.
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2017-06-21
Also published as: EA028623B1; EP2488636B1; ES2472429T3; EA201290200A1; BR112012008516B1; AU2010305765A1; MX2012004222A; CN102791852B; CN102791852A; JP2013507140A; EP2488636A1; JP5393896B2; PL2488636T3; US20120202267A1; AU2010305765B2; BR112012008516A2; CA2776461C; ZA201202523B; DK2488636T3; CA2776461A1

Abstract

본 발명은 숙주 세포 DNA 침강법과 이어서 청정화 단계를 사용하여 고밀도 세포 현탁액에서 대규모 아데노바이러스를 정제하는 방법을 제공한다.

Description

아데노바이러스 입자의 정제 방법{Method for the purification of adenovirus particles}

본 발명은 바이러스 생산 분야에 관한 것이다. 더 특별하게는, 세포 현탁액(cell suspension)에서 아데노바이러스 입자를 정제하는 개선된 방법들에 관한 것이다.

백신 생산 분야에서의 최근 상황들이 대규모 대량 생산의 필요를 낳고 있다. 감염성 질환의 퇴치를 위해 전세계에 충분한 양의 (재조합형) 백신을 지원하는 데 높은 수율의 강력한 방법들이 요구된다.

감염성 질환의 백신은 재조합형 아데노바이러스 입자를 기초로 할 수 있다. 그런 이유로, 아데노바이러스 생산을 위한 세포-기반 공정의 최적화에 엄청난 노력이 투여돼 왔다. 세포는 점점 더 높은 밀도로 배양되고 추후에 더 높은 총 바이러스 수율을 얻기 위해 감염된다. 이와 같은 고밀도 세포 공정이 크루셀 홀란드 비브이의 WO 2010/060719와 Yuk et al.(2004)에 개시되었다. 고농도의 재조합형 아데노바이러스의 생산 공정이 상기 문헌들에 기술되었다. 이와 같이 최적화된 방법은 세포당 높은 바이러스 생산성을 유지하면서 고밀도 세포 배양액(예를 들어, 5x10⁶세포/ml보다 큼)을 감염시킬 수 있는 능력에 의존한다. 여기서, 상기 공정은 단일 생물반응장치(bioreactor)에서 바이러스 농도가 높은 수확된 바이러스 용액을 얻는 방법을 제공한다. 상기 공정의 전형적인 바이러스 입자(VP) 수율은 대략 1.5~2.5x10¹² VP/mL이다.

세포가 고밀도로 배양되는 공정들은 다량의 세포 잔사물(cell debris)과 숙주 세포 DNA를 축적하는 경향이 있다. 이와 같은 오염물들은 정제 공정이 진행됨에 따라 추가로 폐기되어야 하는데, 이것은 복잡하고 느린 공정이다. 수확된 세포 배양액에서 숙주 세포 DNA를 폐기하는 방법은 이미 미국 특허 제7326555호에 개시되었다. 상기 방법은 세포 배양액에서 숙주 세포 DNA를 선택적으로 침강시키는 것으로 이루어진다. 선택적 침강제는 구체적으로 숙주 세포 DNA에 결합하여 아데노바이러스 입자는 침강되지 않게 한다. 이와 같은 참조문헌에 기술된 방법은 세포 잔사물과 숙주 세포 DNA가 적은 양으로 존재하는, 저밀도 세포 배양액의 경우에 대해서만 기술되었다.

지금까지 상기 공정이 고밀도 세포 배양액에 적용될 수 있다고 알려진 바가 없다. 오히려, 종래 기술로부터, 상기 방법에서 사용되는 침강제는 배양액에서 숙주 세포 DNA를 선택적으로 침강시키지 않고, 고농도로 사용될 경우 바이러스 입자들을 침강시킴이 충분히 짐작될 수 있다(Goerke et al. 2004).

세포 배양 공정이 대규모화되고 세포가 점점 더 고밀도로 배양되고 있기 때문에, 업계에는 고밀도 세포 현탁액을 처리할 수 있는 다운스트림 공정(downstream processess)이 필요하다. 특히 이것은 아데노바이러스 생산 분야에 해당된다.

본 발명은 고밀도 세포 현탁액의 세포 용해물(cell lysate)로부터 아데노바이러스 입자를 정제하는 방법에 관한 것이다. 우리는 여기서 고밀도 세포 현탁액 중의 숙주 세포 DNA가 용해된 세포 현탁액으로부터 선택적으로 침강되고, 바이러스 입자들은 침강되지 않음을 발견하였다. 숙주 세포 DNA의 선택적 침강은 양이온 계면활성제로 수행되었다.

저밀도 세포 현탁액에서 선택적인 침강은 예를 들면 미국 특허 제7326555호에서와 같이 이미 기술된 바 있다. 그러나 고밀도 세포 현탁액의 선택적 침강의 수행은 유례가 없었고 전혀 예측되지 못했다. 사실상, 예를 들면 미국 특허 제7326555호와 같은 종래 기술에서는, 저밀도 세포 현탁액(최대 1x10⁶세포/ml)에서, 양이온 계면활성제의 농도가 증가될 때 아데노바이러스 입자가 침강되는 것이 나타났다. 이는 외삽(extrapolation)을 기초로 할 때, 양이온 계면활성제 농도의 실질적인 증가(예를 들면 2배 증가)가 현탁액에 존재하는 아데노바이러스 입자 전체의 침강을 초래할 것이라는 짐작을 하게 한다.

세포 밀도가 예를 들어 10배 더 크고 그래서 숙주 세포 DNA 밀도가 10배 더 큰 고밀도 세포 현탁액의 경우, 숙주 세포 DNA의 침강을 달성하기 위해 요구되는 계면활성제의 농도 역시 상당히 높으리라고 예상된다. 그러므로, 저밀도 세포 현탁액에서의 결과를 기초로 볼 때, 그와 같은 계면활성제의 농도 증가는 용액 중에 존재하는 바이러스 입자 모두를 침강하는 효과를 야기하리라고 예측될 것이다.

세포 고밀도(10배씩 증가)의 실험적 시험 중에, 우리는 종래 기술을 기반으로 한 모든 추측 또는 예상과는 정반대로, 양이온 계면활성제(2.5배 증가)의 농도 증가가 숙주 세포 DNA를 침강(최소 80%)시키지만 아데노바이러스 입자는 침강시키지 않음을 발견하였다. 놀랍게도, 계면활성제의 선택적 침강 효과는 유지되었다. 본 명세서에서, 본 발명은 고밀도 세포 배양액을 사용하는 대규모 아데노바이러스 정제 공정에서 숙주 세포 DNA를 폐기하는 데 사용될 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포 밀도가 5x10⁶~150x10⁶세포/ml인 세포 현탁액에서 아데노바이러스 입자를 정제하는 방법을 제공하고, 본 방법은 a) 상기 세포 현탁액 내의 세포들을 용해(lysing)하고; b) 선택적 침강제를 첨가하여 아데노바이러스 입자로부터 숙주 세포 DNA를 선택적으로 침강시키고; 그리고 c) 상기 아데노바이러스 입자를 함유하는 상기 현탁액을 청정화(clarifying)하여 숙주 세포 DNA의 80% 이상이 아데노바이러스-함유 현탁액으로부터 침강된 것인 정제된 아데노바이러스-함유 현탁액을 얻는 단계를 포함한다.

일부 바람직한 구현예에서, 상기 바이러스는 세포 밀도 범위가 5x10⁶~50x10⁶ 세포/ml, 예를 들면 10x10⁶~50x10⁶세포/ml 또는 10x10⁶~30x10⁶세포/ml인 세포 현탁액으로부터 정제된다.

특정 구현예에서, 단계 b)에서 사용되는 선택적 침강제는 양이온 계면활성제이다. 바람직한 한 구현예에서, 상기 선택적 침강제는 도미펜 브로마이드(DB)이다.

특정 구현예에서, 상기 선택적 침강제는 1.2~5mM의 농도로 첨가된다. 바람직한 한 구현예에서, 상기 선택적 침강제는 1.3~2.2mM의 농도로 첨가된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 음이온-교환 단계 및 한외여과 단계를 추가로 포함한다.

도 1. 저밀도 세포 현탁액(2.5x10⁶~3.5x10⁶vc/ml) 및 고밀도 세포 현탁액(20x10⁶~30x10⁶vc/ml)에서 도미펜 브로마이드 농도에 따라 표시된 아데노바이러스 회수율 및 숙주 세포 DNA 침강률.
도 2. 저밀도 세포 현탁액(2.5x10⁶~3.5x10⁶vc/ml) 및 고밀도 세포 현탁액(20x10⁶-30x10⁶ vc/ml)에서 도미펜 브로마이드 농도에 따라 표시된 아데노바이러스 회수율 및 숙주 세포 DNA 침강률.

본 발명은 고밀도 세포 현탁액의 세포 용해물로부터 아데노바이러스 입자를 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 고밀도 세포 현탁액은 세포를 고밀도로 배양하여 얻어진다. 이와 같은 배양은 배치, 유기(fed-batch) 또는 관류(perfusion) 방식으로 수행될 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다. 세포를 고밀도로 배양하는 방법들은 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다. 고밀도 세포 배양액을 얻는 구체적인 방법들은 예를 들어 WO2004/099396, WO2005/095578, WO2008/006494, WO2010/060719에 개시되었다.

본 발명에 있어서, 고밀도 세포 현탁액은 세포 밀도가 약 5x10⁶~150x10⁶ 세포/mL으로, 예를 들면, 약 8x10⁶~120x10⁶ 세포/mL, 약 12x10⁶~100x10⁶ 세포/mL, 약 20x10⁶~80x10⁶ 세포/mL이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 고밀도 세포 현탁액의 세포 밀도는 약 10x10⁶~50x10⁶ 세포/mL로, 예를 들면 적어도 약 15x10⁶ 세포/mL, 적어도 약 20x10⁶ 세포/mL, 즉, 적어도 약 25x10⁶, 최대 약 30x10⁶ 세포/mL이고, 최대 약 35x10⁶ 세포/mL, 최대 약 40x10⁶ 세포/mL, 최대 약 45x10⁶ 세포/mL이다.

본 발명에 있어서, 고밀도 세포 배양액은 추후에 아데노바이러스 입자로 감염되어 상기 아데노바이러스가 세포 배양액에서 증식(propagate)하게 된다. 본 발명에서는 단일 생물반응장치에서 고농도의 아데노바이러스를 함유하는 고밀도 세포 현탁액이 얻어진다. 고밀도 세포 배양액을 감염시키는 방법들은 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 농도가 높은 상기 고밀도 세포 배양액을 얻는 구체적인 방법들이 예를 들어 EP08168181.9, Cortin et al (2004) 및 Yuk et al (2004)에 개시되었다. 이와 같은 참조문헌들은 다량의 재조합형 아데노바이러스의 생산 방법들을 기술한다. 이와 같은 방법들은 세포당 높은 아데노바이러스 생산성을 유지하면서 고밀도 세포 배양액을 감염시키는 능력에 의존한다. 본 발명은 단일 생물반응장치에서 아데노바이러스의 농도가 높은 고밀도 세포 현탁액을 얻는 방법을 제공한다. 예를 들어 재조합형 아데노바이러스 35(rAd35)의 경우 현 공정들의 전형적인 수율은 약 1.5~2.5x10¹² VP/mL이다. 아데노바이러스가 일단 세포 배양액에서 증식하면, 상기 아데노바이러스 입자들은 본 발명에 따라서 고밀도 세포 현탁액으로부터 정제된다.

본 발명의 방법은 1단계로 고밀도 세포 현탁액에 함유된 세포들을 용해(lysing)한다. 아데노바이러스 입자로 감염된 고밀도 세포 현탁액을 용해하면 다량의 세포 잔사물과 숙주 세포 DNA가 세포 현탁액에 축적된다. 이와 같은 축적 때문에 상기 세포 현탁액의 추후 다운스트림(downstream) 공정들이 번거로워진다.

본 발명은 고밀도 세포 현탁액의 세포 용해물에서 아데노바이러스 입자를 정제하는 데 적합한 방법을 제공한다. 고밀도 세포 현탁액 중에 세포 용해물에 선택적 침강제를 첨가함으로써 다량의 숙주 세포 DNA가 아데노바이러스 입자로부터 선택적으로 침강되어 숙주 세포 DNA 분자 중 적어도 약 80%가 아데노바이러스 입자를 함유하는 고밀도 세포 현탁액으로부터 침강된다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 침강 단계는 오염성 숙주 세포 DNA의 침강을 허용하여, 청정화(clarification) (예를 들면, 심층 여과 방식) 이후, 숙주 세포 DNA가 최소 80% 감소되고, 바람직하기는 90% 그리고 더 바람직하기는, 본 명세서에 실시예에 나타냈듯이, 숙주 세포 DNA가 95% 감소된다.

용해(lysis)

상기 방법의 첫 번째 단계는 세포 현탁액 내의 세포 용해다. 세포막이 용해되는 제1 단계는 감염된 고밀도 세포 현탁액으로부터 세포-결합된(세포내) 및 비-결합(세포외) 아데노바이러스 둘 다의 수확을 허용한다. 숙주 세포 계면활성제 용해는, 바이러스 함유 숙주 세포를 용해하는 바람직한 방법이지만, 비-기계적 용해 방법들(예를 들면 효소 처리) 및/또는 기계적 전단 방법(예를 들면 중공사형 한외여과)에 대체되어 최대량의 아데노바이러스를 방출할 수 있다. 활성 세포 용해에 사용될 수 있는 방법들은 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있고, 예를 들면 WO 98/22588, p. 28-35에 개시되었다. 이와 같은 상황에서 효과적인 방법들은 예를 들면, 냉동-해동, 고체 전단, 고삼투압성(hypertonic) 및/또는 저삼투압성(hypotonic) 용해, 액체 전단, 초음파 분해(sonication), 고압 압출, 계면활성제 용해, 그들의 조합 등이다. 본 발명의 한 구현예에서, 세포들은 적어도 하나의 계면활성제를 사용하여 용해된다. 용해를 위한 계면활성제의 사용은 방법이 용이하고 쉽게 무게를 달 수 있다는 이점이 있다.

사용될 수 있는 계면활성제와 그들이 사용되는 방법은 통상의 기술자들에게 일반적으로 잘 알려져 있다. 예를 들면 여러 실시예들이 WO 98/22588, p. 29-33에서 논의되었다. 본 발명에 사용된 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 쌍성이온성 및 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다. 계면활성제의 예는 즉 트리톤 및/또는 폴리소르베이트-80이다. 한 구현예에서, 사용된 계면활성제는 트리톤 X-100이다. 게다가, TNBP와 같은 용매는 낮은 농도로 용해물 또는 청정화된 용해물에 첨가되어 외피 보유(enveloped) 바이러스를 불활성화하는 계면활성제의 능력을 보완할 수 있다. 또한, 그 속의 아데노바이러스에 의해 감염된 숙주 세포의 자기용해(autolysis)는 세포 내 아데노바이러스의 실질적인 방출을 가능하게 하고, 본 발명의 공정에서 사용될 수 있다. 따라서, 종래 기술에 잘 알려진 모든 형태의 숙주 세포 용해법은 본 명세서에 개시된 방법들에 의해 최후의 수확을 수행하기 위해 세포내 바이러스를 숙주 세포 배양액 배지에 방출시키는 데 사용될 수 있다. 통상의 기술자에게, 계면활성제의 최적 농도는 분명히 예를 들어 약 0.1~1%(w/w)의 범위 내에서 변할 수 있다.

선택적 침강

용해 이후, DNA는 농축된 선택적 침강제(SPA) 용액의 첨가에 의해 선택적으로 침강되는 반면 아데노바이러스 입자는 액체상에 남는다. 본 단계는 숙주 세포 DNA의 선택적 침강을 가능하게 하고, 또한 다운스트림 부문의 견고성을 개선한다. 본 명세서에 예로 나타낸 바와 같이, 본 초기 침강 단계는 청정화 이후 (숙주 세포) 핵산의 적어도 80% 감소의 결과를 초래한다.

본 발명을 실천하는 데 유용할 수 있는 SPA는 아민 공중합체, 4차 암모늄 화합물 및 그것의 모든 각각의 혼합물을 포함하지만, 이것에 한정되지는 않는다. 더 구체적으로는, 폴리에틸렌(PEI)의 여러 형태들이 과도한 음이온 전하(DNA 불순물)의 중성화에 아주 효율적이다. 본 발명에 적절히 사용될 수 있는 가능한 SPA의 목록은 US7326555(12단, 56~67줄 및 13단, 1~28줄)에 개시되어 있고, 본 명세서에 참조로 병합되었다. 본 발명에 사용하기에 적절한 SPA는 시중에 판매 중인 제품들의 하기 부류들과 예들을 포함하는데, 이것에 한정되지는 않는다: 모노알킬트리메틸 암모늄염(시판 중인 제품의 예를 들면, CTAB와 같은 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 또는 클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드 또는 클로라이드(TTA), 알킬트리메틸 암모늄 클로라이드, 알킬아릴트리메틸 암모늄 클로라이드, 도데실트리메틸암모늄 브로마이드 또는 클로라이드, 도데실디메틸-2-페녹시에틸암모늄 브로마이드, 헥사데실아민: 클로라이드 또는 브로마이드 염, 도데실아민 또는 클로라이드 염 및 세틸디메틸레틸 암모늄 브로마이드 또는 클로라이드), 모노알킬디메틸벤질 암모늄염(예를 들면 알킬디메틸벤질 암모늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드(BTC)), 디알킬디메틸 암모늄염(시판 제품은 도미펜 브로마이드(DB), 디데실디메틸 암모늄 할라이드 및 옥틸도데실디메틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드), 헤테로방향족 암모늄염(시판 중인 제품은 세틸피리듐 할라이드(CPC 또는 브로마이드 염 및 헥사데실피리디늄 브로마이드 또는 클로라이드), 시스-아이소머 1-[3-클로로알릴]-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄, 알킬-이소퀴놀리늄 브로마이드 및 알킬디메틸나프틸메틸 암모늄 클로라이드(BTC 1110). 다중 치환된 제4기 암모늄염 (시판 중인 제품은 알킬디메틸벤질 암모늄 사카리네이트 및 알킬디메틸에틸벤질 암모늄 시클로헥실설파메이트를 포함하나, 이것에 한정되지는 않는다), 비스-4차 암모늄염들(제품예는 1,10-비스(2-메틸-4-아미노퀴놀리늄 클로라이드)-데칸, 1,6-비스{1-메틸-3-(2,2,6-트리메틸 시클로헥실)-프로필디메틸 암모늄 클로라이드] 헥산 또는 트리클로비소늄 클로라이드를 포함하고, 상기 비스-4차는 Buckman Brochures에 의해 CDQ로 불린다) 및 중합체성 4차 암모늄염들(폴리[옥시에틸렌(디메틸리미니오)에틸렌(디메틸리미니오)에틸렌 디클로라이드], 폴리[N-3-(디메틸암모니오)프로필]N-[3-에틸렌옥시에틸렌디메틸암모니오)프로필]유레아 디클로라이드 및 알파-4-[1-트리스(2-히드록시에틸레)암모늄 클로라이드]와 같은 폴리이온넨들을 포함). 통상의 기술자가 US7326555(여기서 상기 물질들 중 여러 가지가 효과가 있음이 나타나 있고, 통상의 기술자가 DNA의 선택적 침강을 위해 이들 화합물들의 적절한 농도를 일상적으로 찾을 수 있음이 보여졌다)로부터 이해할 수 있듯이, 이들은 SPA의 예들이고, 그리고 상기 명세서의 개시 및 본 발명의 개시를 기반으로, 이와 같은 것들이 또한 본 발명에 적절할 것이라는 점이 분명하다.

바람직한 구현예에서, 양이온 계면활성제가 본 발명에 사용된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 도미펜 브로마이드(DB)와 같은 디알킬디메틸암모늄염들이 본 발명에 사용된다. 도미펜 브로마이드는 정제 계획용 선택적 침강제로서 사용되는데, 정제 계획은 여러 유형의 수많은 생물학적 생성물(선택적 침강 단계를 통해 오염성 배양액-기초 성분으로부터 실질적으로 분리될 수 있는 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자 또는 기타 생물학적 생성물들)로부터 수많은 세포 구성물들, 특히 핵산들의 제거를 요구한다. 비록 본 발명을 실행하기 위해 다수의 잠재적 SPA가 사용될 수 있지만, 특히 도미펜 브로마이드가 GMP급 원료로서의 가용성 및 인체용으로 고안된 다른 생성물들에서의 현 사용 때문에 주요 관심대상이다. 더 구체적으로는, 도미펜 브로마이드는 구강청결제와 국소 항생제 크림의 활성성분으로 광범위하게 사용되고 있기 때문에, 이 분자는 대량으로 생산되고 cGMP 조건 하에서 방출된다.

세포 현탁액으로부터 숙주 세포 DNA를 침강시키기 위해 고밀도 세포 현탁액에 사용되는 SPA의 최적 농도는 본 발명에서 결정되었다. 비록 종래 기술에서 볼 때, 아데노바이러스 입자가 고농도의 SPA와 접촉하면 그 즉시 침강할 것으로 예측되었지만, 아데노바이러스 입자는 예상 밖으로 침강되지 않았다. 사실상, 예를 들어 US7326555와 같은 종래 기술에서는, 저밀도 세포 현탁액(최대 1x10⁶세포/ml)에서, 아데노바이러스 입자는 양이온 계면활성제의 농도가 증가될 때 침강한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이 고밀도 세포 배양액을 용해함으로써 생성된 현탁액은 상당히 증가된 양의 숙주 세포 DNA와 기타 불순물들을 함유할 것이고, 따라서 증가된 양의 양이온 계면활성제가 필요할 것이다(예를 들면 2.5배 증가). 세포 저밀도에서의 결과를 외삽한 것으로 짐작컨대, 양이온 계면활성제 농도의 증가는 현탁액에 존재하는 총량의 아데노바이러스 입자의 침강을 초래할 것이다.

놀랍게도, SPA 고농도에서, 아데노바이러스 입자를 함유하는 고밀도 세포 현탁액으로부터 오염성 숙주 세포 DNA의 선택적 제거는 여전히 가능하였다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, SPA는 바람직하기는 DB가 1.2~5mM의 농도로 첨가된다. 좀 더 바람직한 구현예에서, SPA는 바람직하기는 DB가 1.3~2.2mM의 농도로, 예를 들면 1.4~2mM, 또는 1.4~1.8mM, 또는 1.5~1.6mM의 농도로 첨가된다. 본 개시를 기반으로, 통상의 기술자는 틀림없이 수확 시 주어진 세포 밀도에 대한 적절한 SPA 농도의 계산 방법을 알 것이다.

세포 밀도가 10x10⁶~150x10⁶세포/mL인 아데노바이러스 함유 고밀도 세포 현탁액의 처리용 DB의 적절 농도는 약 1.2~5mM이다. 세포 밀도가 10x10⁶~50x10⁶ 세포/mL인 아데노바이러스 함유 고밀도 세포 현탁액의 처리용 DB의 적절 농도는 약 1.3~2.2mM이다. 세포 밀도가 10x10⁶~30x10⁶ 세포/mL인 아데노바이러스 함유 고밀도 세포 현탁액 수확물(harvest)의 처리용 DB의 적당한 농도는 1.3~2mM이고, 예를 들면 약 1.4~1.9mM, 또는 약 1.4~1.8mM, 또는 약 1.4~1.7mM, 또는 약 1.45~1.65mM, 또는 약 1.5~1.55mM이다.

이 단계에서 뉴클레아제(벤조나제^TM, DNases 및 RNases를 포함하나, 이것에 한정되지 않음)는 더 이상 요구되지 않지만, 여전히 DNA 최대 감축에 이로울 수 있다. 오염성 핵산의 막대한 다수를 제거하기 위한 본 침강 단계의 가능성을 고려할 때, 이후의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 단계는 생성물 순도에 필수적인 단계가 아닐 수 있다(최종 용량에 따라 좌우됨). 그러나, AEX 단계는 견고성(robustness)을 위한 공정에 존재할 수 있다.

본 명세서에 예시된 도미펜 브로마이드(DB)와 같이, 아데노바이러스 입자들로부터 핵산 분자들 및 기타 세포 잔사물들을 효과적으로 침강시키는 화합물을 동정하기 위한 본 명세서에 개시된 SPA들의 잠재적 치환체들의 실험은 통상의 기술자의 이해 범위 안에 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 부분적으로 고밀도 세포 현탁액에서 아데노바이러스 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 용해-후(post-lysis) 숙주 세포 배양액 배지에 선택적 침강제를 첨가함으로써, 용해-후 고밀도 세포 현탁액 내의 아데노바이러스 입자로부터 숙주 세포 핵산 분자를 선택적으로 침강시키는 것을 포함한다.

청정화( Clarification )

이전 단계들로부터 얻은 SPA-처리된 세포 용해물은 추후에 청정화되어 침강된 불순물 및 세포 잔사물을 제거한다. 상기 청정화는 심층 여과에 의해 수행될 수 있다. 연마(polishing) 심층 여과가 있는 또는 없는 원심분리 또한 가능하다. 따라서, 침강된 용해물의 청정화는 원심 분리를 단독 사용하거나 또는 US7326555에 기술된 심층 여과와 같은 연마 청정화(polishing clarification) 단계와 함께 원심분리를 사용하여 수행될 수 있다.

필터 또는 여과 계획을 선택할 때, 업스트림의 변화 또는 변동에서 견고한 성능이 보장되어야 했다. 내부 매체를 바꿔가면서 다양한 유형의 필터를 시험하여 양호한 청정화 성능과 단계 수율 사이의 균형 유지가 연구될 수 있다. 적절한 필터는 셀룰로오스 필터, 재생된 셀룰로오스 섬유, 무기성 여과 보조물(예를 들면 규조토, 펄라이트, 건식 실리카)과 결합된 셀룰로오스 섬유, 무기 보조물 및 유기 수지와 결합된 셀룰로오스 섬유 또는 그들의 모든 조합물 및 중합체성 필터(예를 들면 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에테르술폰을 포함하나, 이것에 한정되지 않음)를 활용하여 효과적인 제거 및 허용가능한 바이러스 회수를 달성할 수 있다. 일반적으로, 다단계 공정이 바람직하지만, 반드시 그런 것은 아니다. 모범적인 2- 또는 3-단계 공정은 올이 굵은 필터(들)로 큰 침강물과 세포 잔사물을 제거하고, 이어서 명목상 공극 크기가 0.2㎛보다 크고 1㎛보다 작은 2-단계 필터(들)을 연마하는 것으로 이루어진다. 최적의 조합은 침강물 크기 분산을 비롯하여 기타 변수들에 의해 좌우될 것이다. 뿐만 아니라, 비교적 촘촘한 필터 또는 원심 분리를 활용하는 단일 단계 작업들 역시 양호한 생성물을 생산할 것이다. 좀 더 일반적으로, 전량(dead-end) 여과, 미세여과, 원심 분리, 또는 전량 여과나 심층 여과와 결합된 필터 보조물(예를 들면 규조토)의 투입함(body feed)을 포함하는 모든 청정화 방법(이것은 그 다음 단계에서 막 및/또는 수지를 더럽히지 않을 정도의 적당한 투명도를 갖는 여과액을 제공)은 본 발명에서 실행하는 것이 허용된다. 심층 여과 방식은 본 발명의 강력한 청정화 방법을 나타낸다. 시판 중인 심층 여과 막들이 US 7326555호에 개시되었고(14 단락, 65줄부터 15 단락 19줄), 이 내용이 참조에 의해 본 명세서에 병합되었다.

침강 및 청정화 단계들의 조합은 청정화 후(예를 들면, 심층 여과 단독으로 또는 연마 심층 여과 단계와 결합된 심층 여과로), 아데노바이러스 입자로부터 숙주 세포 DNA의 70% 이상, 특히 80% 이상, 또는 심지어 바람직하기는 90% 이상을 제거한다.

추가 정제 방법들

특정 구현예들에서, 수확된 바이러스 입자는 추가로 정제된다. 상기 바이러스의 추가 정제는 농축, 한외여과, 희석여과 또는, 예를 들면 WO 2005080556에 기술된 크로마토그래피를 이용한 분리를 포함하는 여러 단계들로 수행될 수 있고, 이 모든 내용은 참조에 의해 본 명세서에 병합되었다. 음이온 교환 크로마토그래피, 살균 여과, 역상 흡착, 히드록시아파타이트 크로마토그래피와 같은 다른 단계들 역시 사용될 수 있다. 이와 같은 단계들이 예를 들면 US 7326555호에 개시되었고, 전체가 참조로서 본 명세서에 병합되었다. 통상의 기술자는 각각의 정제 단계에 대한 최적의 조건을 찾는 법을 알고 있다. 또한 전체가 참조로서 본 명세서에 병합된 WO 98/22588는 바이러스 입자의 생성 및 정제 방법들을 기술한다.

본 발명에 따른 특정 구현예에서, 청정화된 아데노바이러스 입자 현탁액은 한외여과에 의해 처리될 수 있다. 한외여과는 바이러스 현탁액을 농축하기 위해 사용된다. 현탁액은 5~20배 농축될 수 있고 (앞서 언급된) 뉴클레아제로 처리하는 것이 가능하다. 본 발명의 또 다른 면은 희석여과를 통한 추후의 완충액 교환의 도입이다. 한외여과를 사용한 희석 여과, 즉 완충액 교환은, 염과 당 등의 제거 및 교환 방법이다. 통상의 기술자는 어떤 조건 하에서 완충액 교환이 일어나야 하는지 그리고 이 단계에서 어떤 완충액이 적당한지 안다.

선택된 특정 한외 여과막은 크기가 아데노바이러스 입자를 보유할 만큼 충분히 작고 불순물을 효과적으로 제거할 만큼 충분히 크다. 제조업체와 막의 유형에 따라, 명목상 분획 분자량(molecular weight cutoffs)은 10~1000kDa가 적절할 것이다. 접선 유동 모드(tangential flow mode)를 사용하는 한외 여과가 바람직하다. 상기 모드에서, 본 단계는 배압이 있는 또는 없는 고정된 횡류(cross-flow)를 농축물 반환부(return)에 고정시키거나, 고정된 투석막압(transmembrane pressure)을 설정하거나, 또는 횡류와 막투과 플럭스 둘 다를 고정시킴으로써 제어될 수 있다.

뉴클레아제 처리는 또한 이 시점의 공정에 포함되는 것이 고려될 수 있는데, 그러나 반드시 필요한 것은 아니다. 뉴클레아제 처리는 폭넓은 스펙트럼의 뉴클레아제(예를 들면 벤조나제^TM),DNase, RNase 또는 그들의 모든 조합물의 사용을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 또는 RNase 및 DNase 둘 다의 활성을 갖는 칵테일이 바람직하다. 뉴클레아제 처리 단계는, 최종 생성물 중의 잔류 뉴클레아제 함유량이 본 출원에 허용될 수 있을 때, 공정의 어떤 시점에서나 고려해볼 수 있다. 뉴클레아제 처리는 청정화 후에 수행하는 것이 바람직하고, 특히 뉴클레아제 처리는 청정화 및 농축 단계 후, 그러나 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 앞서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 그 다음 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계일 수 있다. 상기 단계에서, 아데노바이러스 입자는 양전하를 띤 물질, 예를 들면 막, 카트리지 또는 칼럼에 결합되어 있다. 이후의 용리(elution)가 불순물 및 잔여 숙주 세포 DNA로부터의 바이러스 입자의 분리를 가능하게 한다.

무스탕 Q 막 흡착기를 사용한 아데노바이러스 정제의 경우, 적하(loading) 및 세척을 위한 NaCl의 농도는 pH 7.5에서 0.3~0.4M 사이 어딘가로 추정될 수 있고, pH 값이 변하면서 농도 역시 변경될 것이다. 좀 더 바람직하기는, NaCl 농도는 0.35M이다. 완충액의 pH 값은 아데노바이러스가 결합할 수 있게 충분히 높아야 한다(대략 6.5 초과). 뿐만 아니라, 완충 시스템의 pH 값은 바이러스의 불안정을 피할 수 있게 충분히 낮아야 한다. 사용가능한 정확한 최대 pH 값은 아데노바이러스 및 완충액 성분들의 구체적인 안정성 프로파일에 좌우되고, 특정 응용을 위해 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 지표이지만 결코 제약조건이 아닌 pH 값은 잠재적으로 약 5~10일 수 있다.

완충액 중의 0.1% PS-80의 존재는, 이것이 아데노바이러스/DNA 결합과 아데노바이러스 집합을 약화시키기 때문에, 잔류 DNA의 낮은 함량을 달성하는 데 상당히 바람직하다. 다른 아데노바이러스뿐만 아니라 다양한 세포 오염물로부터 아데노바이러스 입자의 해리(dissociation)를 촉진하는 데 유용한 더 높은 또는 더 낮은 계면활성제 농도 또는 선택적 계면활성제들을 밝히는 것은 통상의 기술자의 일상적인 실험의 범위 내에 있다. 통상의 기술자가 공정 완충액에 쓸 선택적 계면활성제를 선택하는 것 역시 위와 동일한 실험 영역에 포함된다. 이와 같은 선택적 계면활성제의 예들은 US 7326555에서 발견될 수 있다. Pall사(예를 들면 Mustang^TM 시리즈) 및 Sartorius사(예를 들면 Sartobind 시리즈)에 의해 제조된 것들과 같은 음이온 교환막 크로마토그래피 생성물들은 본 발명에 따른 바이러스 정제에 적합하다. US 6,485,958 또는 WO 05/080556은 재조합형 아데노바이러스의 정제를 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 사용을 기술한다.

무스탕 Q (Pall사 제품)와 같은 막 흡착제에 바이러스의 결합능력은 굉장히 높아, 약 7x10¹³ VP/ml이다. 본 공정에서 바이러스 정제에 적합한 기타 막 흡착제 및 수지는 Source 15Q 및 Source 30Q (GE life sciences 제조), Q-Sepharose XL (GE life sciences 제조), Fractogel TMAE (EM industries 제조), Sartobind Q (Sartorius 제조), Adsept Q (Natrix separations 제조), CIM QA (BIA separations 제조)를 포함하나, 이것에 한정되지는 않는다. 바람직하기는, 아데노바이러스 용리는 NaCl 함유 완충액을 사용하여 수행된다. 통상의 기술자는 NaCl 농도를 최적화하는 방법을 안다.

특정 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 적어도 1회 사용하는 것이 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 아데노바이러스는 충분히 순수할 것이다. 그러나, 특정 구현예에서는 공정의 견고성(robustness)을 증가시키기 위해 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피 단계가 추가로 수행된다. 이 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 분명한 것은 기타 정제 단계들 역시 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 적절하게 조합될 수 있다는 점이다. 아데노바이러스 정제를 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 사용이 광범위하게 기술된 바 있는데, 따라서 이와 같은 측면은 통상의 기술자의 이해 범위에 속한다. 아데노바이러스의 정제에 활용되어온 여러 다른 크로마토그래피 매트릭스가 적합하다. 통상의 기술자는 상기 아데노바이러스의 정제를 위한 최적의 음이온 교환 물질을 용이하게 찾을 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 음이온 교환 생성물은 희석여과되어 제형화 완충액(formulation buffer)이 되고 살균여과될 수 있다. 선택적으로, 불순물 및/또는 바이러스/프리온 제거의 견고성을 개선할 수 있는 잠재력을 갖는 추가적인 크로마토그래피 단계(예를 들면, 양이온 교환)가 희석 여과 전 또는 후 어느 때라도 첨가될 수 있다.

추가적인 한외여과 단계 또한 이 단계에서 수행할 수 있다. 접선 유동 한외 여과는 잔류 단백질 및 핵산을 제거하고, 아데노바이러스를 제형화 완충액으로 교환하는 데 유용하다. 300~500kDa 막 중의 선택은 수율과 개선된 불순물 정리 사이의 균형에 의해 좌우된다. 기타 막 구성물(예를 들면 중공사)은 허용가능한 치환체들이다. 선택된 한외여과막은 크기가 아데노바이러스 입자를 보유할 만큼 충분히 작고 효과적으로 불순물을 정리할 수 있을 만큼 충분히 클 것이다. 제조업체 및 막의 유형에 따라, 명목상 분획 분자량은 100~1000kDa가 적합할 것이다.

살균 여과 단계가 본 공정에 포함될 수 있는데, 이 단계는 생균수 시험(bioburden)을 없애는 데 도움이 된다. 생성물은 0.22 마이크론 변형 폴리피닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(예를 들면, Millipore Millipak 제조)을 통해 여과될 수 있다.

임의의 다운스트림 처리 단계들이 본 공정에 추가될 수 있다. 이와 같은 단계들은 예를 들어 크기배제 크로마토그래피 단계, 역상 흡착 단계 및/또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 각각의 단계에 대한 상세 설명은 예를 들어 US 7326555, WO 03/097797, WO 02/44348에서 찾을 수 있다.

국제 출원 WO 97/08298은 바이러스의 손상을 막기 위해 특정 크로마토그래피 매트릭스를 사용하는 아데노바이러스 정제 방법을 기술하는데, 이 방법에는 음이온 교환 및 크기배제 단계들이 포함된다.

WO 2006/108707에 개시된 바와 같이, 특정 한외여과 방법이 또한 아데노바이러스 정제에 적합하다. 그와 같은 단계들은 특정 크로마토그래피 정제 단계들에 덧붙여 또는 그 단계들 대신에 수행될 수 있다.

세포 배양 시스템 및 다운스트림 처리 시스템의 규모

본 발명의 공정들은 축소 및 확장이 가능하다. 본 발명에 사용된 세포 배양액들은 작은 규모의 배양액(예를 들면, 1~10L 생산량)부터 중간 규모 배양액(예를 들면, 20~1,000L 생산량), 그리고 1,000~50,000L 생산량과 같은 최대 규모의 상업적 규모의 제제까지 다양하다. 초기 공정 단계들(용해, 심층여과 및 한외여과)은 배양액 부피에 따라 규모가 오르내리는 반면, 음이온 교환 크로마토그래피와 추후 단계들은 아데노바이러스 입자 유입량에 따라 규모가 오르내린다. 따라서, 후반부 단계들의 크기는 적어도 1x10¹² 아데노바이러스 입자/mL(vp/mL)인 생물반응장치 생산성 추산치를 기반으로 한다. 이와 같이 높은 아데노바이러스 수율은 예를 들어 고밀도 세포 배양액을 감염시킴으로써(예를 들어 EP08168181.9에 기술된 바와 같이) 얻을 수 있다. 이와 같은 고밀도의 아데노바이러스 입자를 함유하는 고밀도 세포 현탁액의 추가 정제는 본 발명으로 수행이 가능하다. 많은 양의 세포 잔사물과 숙주 세포 DNA를 함유하는 이와 같은 현탁액들을 처리할 수 있는 능력 덕분에 현탁액 부피당 다량의 아데노바이러스 입자의 정제가 가능하다. 본 발명의 장점은 세포 밀도가 높은 세포 배양액 배치를 처리하고, 고농도의 아데노바이러스 입자를 함유하며, 그리고 그것과 함께 처리된 부피당 아주 높은 아데노바이러스 수익률을 허용하는 방법을 제공한다는 점이다. 본 방법은, 비록 대규모 세포 배양액에 적용가능하지만, 세포가 더 작은 규모로 배양되어, 심지어 고밀도 세포가 되는 것을 허용하고, 그뿐만 아니라 효율적으로 추가 처리될 수 있는 높은 아데노바이러스 수율을 달성한다. 이와 같은 방법은 아데노바이러스 정제 업계 전체에 큰 영향을 끼칠, 상당히 농축된 아데노바이러스 배치의 처리 가능성을 제공한다.

아데노바이러스 및 생산자 세포( producer cells )

본 발명은 아데노바이러스의 정제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아데노바이러스는 모든 자연적인, 변형된, 변이된 아데노바이러스 및/또는 재조합형 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 유전자 백신 및/또는 유전자 치료 응용에서 특히 관심 사항은 E1 또는 추가 결실(deletions)에 의해 무능력해진 1 또는 2 세대 복제-불능 아데노바이러스(최종 세대 아데노바이러스 벡터 포함)의 사용이다. 아데노바이러스 게놈은 일반적으로 인간의 심각하지 않은 질병들과 연관된다. 상기 게놈은 각각의 벡터를 구성하기 위해 활용되는 전략에 따라, 조작이 용이하다. 재조합형 아데노바이러스 35(rAd35) 또는 26(rAd26) 벡터(본 명세서에 예시됨)과 같은 복제-불능 바이러스는 결실을 보완하는 생산자 세포주를 요구한다.

생산자 세포(때때로 종래 기술에서 그리고 본 명세서에서 '패키징 세포(packaging cell)', 또는 '보완 세포(complementing cell)' 또는 숙주 세포로 불림)는 원하는 아데노바이러스가 증식될 수 있는 모든 생산자 세포일 수 있다. 예를 들어, 재조합형 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스의 결함을 보완하는 생산자 세포에서 이루어진다. 이와 같은 생산자 세포는 바람직하기는 그들의 게놈에 적어도 하나의 아데노바이러스 E1 염기서열을 갖고, 그것으로 인해 E1 구역의 결실로 재조합형 아데노바이러스를 보완할 수 있다. 추가로, 아데노바이러스는 Ad 게놈으로부터 불필요한 E3 구역에 결실을 가질 수 있고, 그래서 그와 같은 결실은 보완될 필요가 없다. 예를 들면 911 또는 PER.C6 세포와 같이 E1에 의해 불멸화된 인간 망막 세포(US 특허 제5,994,128호 참조), E1-변형된 양수세포(EP 특허 제1230354호 참조), E1-변형된 A549 세포(WO 98/39411, US 특허 제5,891,690호 참조), GH329:HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293 등과 같은 E1-보완 생산자 세포가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 생산자 세포는 예를 들면 HEK293 세포, PER.C6 세포, 911 세포, 또는 IT293SF 세포 등이다. 바람직하기는 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940, 1996년 2월 29일 ECACC에 기탁, CAMR, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom; US 특허 제5,994,128호 참조), 또는 그것으로부터 유래된 세포가 생산자 세포로서 사용된다.

복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 벡터 DNA(예를 들어 WO 96/26281, WO 00/03029 참조)의 공급원으로서 아데노바이러스 또는 키메라 형태 아데노바이러스의 모든 종, 변종, 아류형 또는 종, 변종, 아류형의 혼합물을 사용함으로써 생성될 수 있는데, 이로써 예를 들면 원하는 특정 세포 유형을 감염시킬 수 있는 능력이 상기 아데노바이러스 벡터에 제공될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, rAd35 또는 rAd26이 아데노바이러스로서 사용된다.

통상의 기술자는 US 특허 제6,492,169호 또는 WO 03/104467, 그리고 그들의 참조문헌들에 개시된 방법들을 사용하여 특이 숙주 세포에서 서로 다른 항원형(serotypes)의 아데노바이러스 벡터를 증식할 수 있는 가능성을 인식할 것이다. 예를 들어, 통상의 기술자에게 알려진 E1-결핍 rAd35의 증식을 위해, 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 PER.C6 또는 HEK293 세포와 같이 Ad5의 E1A 및 E1B를 발현하는 기존 생산자 세포들을 기반으로(US 특허 제6,492,169호 참조), Ad35의 E1B-55K를 발현하는 특이적 생산자 세포가 구성될 수 있다. 선택적으로 그리고 바람직하기는, 예를 들어 PER.C6 또는 HEK293와 같은 기존 (Ad5-) 보완 세포주는, E1-결핍 rAd35 또는 rAd26의 증식을 위해 세포의 변형 없이, 예를 들어 참조에 의해 본 명세서에 전체가 병합된 WO 03/104467에 광범위하게 개시된 바처럼, Ad5의 E4-orf6 코딩 염기서열을 rAd35 또는 rAd26 벡터에 포함시킴으로써, 사용될 수 있다. 따라서 모든 항원형의 아데노바이러스 벡터의 증식은 통상의 기술자에게 잘 알려진 수단과 방법들을 사용하여 생산자 세포 상에서 이루어질 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 그것의 구성 방법들, 그리고 그것의 증식 방법들은 종래 기술에 잘 알려져 있고, 예를 들어 U.S. 특허 제5,559,099호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,994,106호, 제5,994,128호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제6,040,174호, 제6,020,191호 및 제6,113,913호 및 Thomas Shenk의 "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz의 "Adenoviruses" (각각 Raven Press, Ltd., New York (1996) 3판 Virology, B. N. Fields et al. 제67장 및 제68장), 그리고 본 명세서에 언급된 기타 참조문헌에 기술되었다.

본 발명은 다음 실시예에서 추가로 설명된다. 실시예들은 본 발명을 어떤 식으로든 제한하지 않는다. 이들은 본 발명을 명확하게 할 뿐이다.

실시예

실시예 1: 고밀도 세포 현탁액에서 숙주 세포 DNA 의 선택적 침강

세포 밀도가 최대 1x10⁶세포/ml인 경우, 숙주 세포 DNA의 선택적 침강이 종래 기술(Goerke et al, US7326555)에 나타나 있다. 상기 명세서에서는 저밀도 세포에서 숙주 세포 DNA의 80% 이상이 세포 현탁액으로부터 침강되고, 바이러스 회수율은 90%였다. 그러나, 그와 같은 선택적 침강이 고밀도 세포에서 가능할지 지금까지는 잘 알려지지 않았는데, 그 이유는 그와 같은 세포 현탁액이 훨씬 더 많은 양의 숙주 세포 DNA와 세포 잔사물을 함유하고, 그래서 훨씬 더 많은 양의 DNA 침강제가 필요할 것으로 예상되기 때문이고, 반면에 종래 기술의 데이터의 외삽으로 짐작컨대 그와 같이 높은 DNA 침강제의 농도는 아데노바이러스 또한 침강시킬 것이다.

세포 고밀도에서 DNA 침강의 가능성을 탐색하기 위해, 세포 밀도 30x10⁶ 세포/ml를 함유하는 소규모 시험관에서 최대 숙주 세포 DNA 침강을 시험하였다. 선택적 DNA 침강이 세포 고밀도에서 여전히 발생하는지 여부를 시험하기 위해 빠른 스크리닝 도구로서 소규모 시험관 모델을 사용하였다.

PER.C6 세포들을 생물반응장치에서 성장시키고 아데노바이러스 35 (Ad35)로 감염시킨 다음, 무혈청 배지에서 37℃로 3일간 성장시켰다. 2~30x10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에서 그리고 바이러스 역가 범위가 8x10¹⁰~1.5x10¹² VP/ml 일 때 세포를 수확하였다. 비이온성 계면활성제 트리톤 X-100과 트윈-80을 각각 최종 농도 0.1% 및 0.05%로 첨가하여, 2~24 시간에 걸쳐 세포 용해를 수행하였다. 40mM의 NaCl 중의 도미펜 브로마이드(DB)의 농도를 증가시키면서 3.5ml의 용해된 수확물에 첨가하였고, 이어서 1분 동안 즉각적인 교반을 실시하였다. 0.45㎛의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 주사기 필터로 침강된 물질을 제거하였다. HPLC-AEX와 Q-PCR 분석기를 사용하여 각각 Ad35 및 숙주 세포 DNA의 농도 측정을 위해 여과액을 분석하였다.

도 1은 도미펜 브로마이드 농도에 대해 표시한 바이러스 회수율과 숙주 세포 DNA 침강률을 나타낸다. 삼각형으로 묘사된 곡선은 세포 밀도가 2.5x10⁶~3.5x10⁶ 세포/ml인 세포 배양액 수확물에서 얻었다. 원으로 묘사된 곡선은 세포 밀도가 20x10⁶~30x10⁶ 세포/ml인 세포 배양액 수확물에서 얻었다. 세포 저밀도 및 고밀도에서 C*(바이러스 회수율이 90%를 나타내는 도미펜 브로마이드 농도)와 이와 관련한 숙주 세포 DNA의 침강률이 그래프 상에 부각되어 있다.

세포 밀도 20x10⁶~30x10⁶ 세포/ml에서 숙주 세포 DNA의 90% 이상을 침강시키기 위해 필요한 DB 농도는 세포 밀도가 10배 낮을 때 필요한 DB 농도와 비교하여, 적어도 2.5배 증가된다. 놀랍게도, 증가된 DB 농도는, 더 낮은 세포 밀도에서 얻은 그래프의 외삽으로 예상된 바와 달리, 바이러스 입자들을 침강시키지 않았다.

세포 밀도가 18x10⁶~25x10⁶ 세포/ml인 세포 배양액 수확물로 상기 실험을 반복하였다. 도 2는 도미펜 브로마이드 농도에 대해 표시된 바이러스 회수율과 숙주 세포 DNA 침강률을 나타낸다. 삼각형으로 묘사된 곡선들은 세포 밀도가 2.5x10⁶~3.5x10⁶ 세포/ml인 세포 배양액 수확물에서 얻었다. 원으로 묘사된 곡선들은 세포 밀도가 18x10⁶~25x10⁶ 세포/ml인 세포 배양액 수확물에서 얻었다. 세포 저밀도 및 고밀도에서 C*(바이러스 회수율 90%를 나타내는 도미펜 브로마이드 농도)와 관련된 숙주 세포 DNA의 침강률이 그래프 상에 부각되어 있다.

도 1 및 2의 그래프에서 볼 수 있듯이, 고밀도 세포 현탁액의 경우 90% 바이러스 회수율(C^*)을 제공하는 DB 농도는 개별 실험들에서 약간씩 다를 수 있고, 이것은 정상적인 변형의 일부이다. 그러나, 그래프는 DNA의 선택적인 침강은 세포 고밀도에서도 가능하고, SPA(본 발명에서는 DB)의 적합한 농도가 저밀도 세포 배양액의 경우보다 상당히 높지만, 외삽을 기반으로 예측된 것보다 훨씬 낮다는 것을 일관되게 보여준다. 따라서, 통상의 기술자는 선택적 침강제의 적합한 농도는 고정된 수치가 아닌 범위가 있음을 이해할 것이고, 본 명세서의 개시를 기반으로 적합한 범위를 찾을 수 있다. 예를 들어, 세포 밀도가 약 10x10⁶~30x10⁶ 세포/mL인 아데노바이러스 함유 고밀도 세포 현탁액 수확물의 처리 시 DB의 적절한 농도는 약 1.3~2mM이다.

이와 같은 결과들을 기초로, 통상의 기술자는 이제 DNA 침강률이 세포 밀도가 훨씬 더 높은 약 40x10⁶ 세포/mL, 예를 들면 약 50x10⁶ 세포/mL, 예를 들면 최대 약 100x10⁶ 세포/mL, 예를 들면 최대 약 150x10⁶ 세포/mL인 아데노바이러스 함유 현탁액에 대해 추정될 수 있고, 본 발명의 공정에 의해 그와 같은 고밀도 세포 현탁액으로부터 아데노바이러스가 정제될 수 있음을 인식할 것이다.

실시예 2: 고밀도 세포 현탁액으로부터 대규모 선택적 숙주 세포 DNA 침강

0.5~20L의 규모로 DNA 침강을 시험하였다. DNA 침강에 사용되는 DB 농도는 이전 실험 결과들(도 2)을 기초로 하였다. 소규모 시험관 모델에서 측정된 C* 농도의 80%를 사용하였다.

PER.C6 세포를 2L 또는 10L 생물반응장치에서 배치 방식 또는 관류 방식 중 하나로 배양하였다. 배치 방식으로, 4일 동안 세포를 배양하고, 세포 밀도가 1x10⁶~1.6x10⁶ 세포/ml에 도달한 후 감염시켰다. 감염 후, 세포를 3일 동안 추가 배양한 뒤 수확하였다.

관류식에서, ATF 시스템으로 수행된 관류식 배양은 대략 2.5x10⁶ 총세포/mL의 세포 밀도에서의 접종 4일 후 시작하였다. 관류식 배양 14일 후, 세포 현탁액을 생물반응장치에서 신선한 무혈청 배지로 희석하여 세포 밀도를 약 13x10⁶ 세포/mL로 만들었다. 나중에 Ad35 바이러스로 생물반응장치를 감염시켰다. 감염 5시간 후, 1일당 2 베셀(vessel)의 중간 리프레시 속도로 ATF 시스템을 가동시켰다. (감염 후) 3일이 지나, 세포를 수확하였다. 수확 시 세포 밀도(CDAH)는 표 1에 나타내었다.

수확에 이어, 비이온성 계면활성제 트리톤 X-100 및 트윈-80을 각각 최종 농도 0.1 및 0.05%로 첨가하여, 2~24시간에 걸쳐 세포를 용해하였다. 그러고 나서, 도미펜 브로마이드를 NaCl 40mM 중에 최종 농도 0.72~1.52mM로 용해된 수확물에 첨가하였다. 각각 약 10~5㎛(Millistak + CE20) 및 약 1~0.2㎛(Cuno Zeta plus 50CP)로 추정되는 공극 크기를 갖는 전하를 띤 두 심층여과 필터를 사용하여 침강된 용해물을 청정화하였다. 청정화는 압력이 5psi에 도달할 때까지 100LMH(L/m²/hr)의 지속적인 플럭스에서 수행하였다.

표 1은 공정 매개변수들과 정제 공정의 결과들을 나타낸다. 8가지 서로 다른 수확물을 사용하여 용해(Lysis), DNA 침강(DNA ptt) 및 청정화를 수행하였는데, 이때 수확물들은 부피, 수확 시 세포 밀도(CDAH) 및 바이러스 역가가 모두 달랐다. 2L 또는 10L 생물반응장치에서 수확물들을 취했다. 침강 단계에 걸쳐 숙주 세포 DNA (HC-DNA)의 침강률과 바이러스 회수율을 계산하였다.

세포 고밀도에서 선택적 DNA 침강이 가능하다는 결론을 도출하였다. 사실상, DB 농도가 증가했지만(2배), 바이러스 입자는 침강되지 않고 남아 있고(69% 이상의 회수율 참조), 숙주 세포-DNA 감소율은 98%보다 컸다.

여기서, 산업 공정에 필요한 대량의 고밀도 세포 현탁액의 공정이 허용되었다.

실질적인 이유로, 실험 4~8에서 선택적 DNA 침강을 위해 단일 DB 농도 (1.52mM)를 사용하였음을 유의해야 한다. 상기 실험들은 세포 밀도의 범위가 넓은(9.1x10⁶~25.8x10⁶ vc/ml) 아데노바이러스 함유 현탁액이 1.52mM의 DB로 처리될 수 있음을 나타낸다. 이것은 선택적 침강제의 적합한 농도와 세포 밀도의 관계가 고정된 것이 아니라, 오히려 변동이 가능하여 주어진 세포 밀도에 일정 농도 범위의 침강제가 적합하게 된다는 상기 개념과 일맥상통한다.

세포 밀도 범위가 10x10⁶~50x10⁶ 세포/mL인 아데노바이러스 함유 고밀도 세포 현탁액을 처리하기 위해 적합한 DB 농도는 약1.3~2.2mM이다. 세포 밀도 범위가 10x10⁶~30x10⁶ 세포/mL인 아데노바이러스 함유 고밀도 세포 현탁액을 처리하는 데 적합한 DB 농도는 약 1.3~2mM이다.

참조문헌

European Collection of Cell Cultures

96022940

19960229

Claims

생산자 세포(producer cell) 현탁액에서 아데노바이러스 입자의 정제방법으로, 상기 방법은:
a) 상기 세포 현탁액 내의 세포들을 용해(lysing)하고;
b) 도미펜 브로마이드(DB)를 1.3~2.2mM의 농도로 첨가하여 아데노바이러스 입자로부터 숙주 세포 DNA를 선택적으로 침강시키고;
c) 상기 아데노바이러스 입자를 함유하는 상기 현탁액을 청정화(clarifying)하여 정제된 아데노바이러스-함유 현탁액을 얻는 단계들을 포함하고,
여기서 숙주 세포 DNA의 80% 이상이 아데노바이러스-함유 현탁액에서 침강되고;
상기 세포 현탁액의 세포 밀도가 10x10⁶~50x10⁶세포/ml인 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 세포 밀도가 10x10⁶~30x10⁶세포/ml이고, 도미펜 브로마이드(DB)의 농도가 1.3~2mM인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법이 음이온-교환 단계 및 한외여과 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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