CN106574252B - 从细胞培养物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了使用洗涤剂随后进行澄清步骤从粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法。
Description
本发明涉及病毒生产领域。更具体地,本发明涉及从细胞悬浮液中纯化脊髓灰质炎病毒颗粒的改进方法。
发明背景
疫苗生产领域的最新发展已经产生了对大规模制造的需要。需要稳健和高产率的方法来支持世界上有足够量的(重组)疫苗来对抗传染病如脊髓灰质炎。
脊髓灰质炎病毒是微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属的成员。脊髓灰质炎病毒是小的、无包膜的病毒,具有包裹单链、正义RNA基因组的衣壳。有三种类型的脊髓灰质炎病毒:1型,2型和3型。脊髓灰质炎病毒对易感个体的感染可导致麻痹性脊髓灰质炎。脊髓灰质炎具有高度传染性。随着时间推移已经研发了两种不同的脊髓灰质炎疫苗,索尔克研究所(Salk)的灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)和萨宾研究所(Sabin)的减毒的口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。这两种疫苗都是安全有效的。每一种都有其具体的优点和缺点,并且都在控制脊髓灰质炎方面发挥了重要作用。关于脊髓灰质炎病毒和脊髓灰质炎疫苗的综述,参见克佑(Kew)等人,2005。
可用于疫苗的用于生产批量脊髓灰质炎病毒材料(特别是用于生产IPV)的培养和纯化系统在很大程度上导致相对高的成本。
因此,本领域仍然需要用于生产用于疫苗的脊髓灰质炎病毒的有效培养和纯化系统,特别是仍然需要高产率的脊髓灰质炎病毒的纯化方法。
在典型的脊髓灰质炎病毒生产过程中,细胞在特定培养基中生长,并且脊髓灰质炎病毒随后与这些细胞接触以允许该病毒感染所述细胞并繁殖。脊髓灰质炎病毒在所述细胞中繁殖后,从该细胞培养物中收获病毒或其组分。
一种优选的目前使用的IPV生产方法使用在微载体上生长并在补充有血清的培养基中培养的贴壁依赖性猴衍生的VERO细胞。
在细胞培养基中产生和释放的病毒可以通过常规方法例如深度过滤、离心从该细胞生物质中分离。在这种情况下,过滤或离心是收获步骤。经过滤的收获物通常被超滤以浓缩病毒悬浮液,随后可以例如使用凝胶过滤和/或离子交换色谱纯化脊髓灰质炎病毒。用于收获和纯化脊髓灰质炎病毒或病毒组分以及从其生产疫苗的方法已经在本领域中使用了几十年,因此是众所周知的并且已经充分描述于例如维茨尔(Van Wezel)等人,1978;蒙塔尼翁(Montagnon)等人,1984;WO 2007/007344和US 4,525,349中,它们均通过引用并入本文。所得的浓缩病毒悬浮液可以任选地稀释,并且为了制备IPV,其中的脊髓灰质炎病毒将被灭活(对于其可以使用常规方法)。
目前使用的脊髓灰质炎病毒生产工艺的生产力不足以在全球范围内增加根除脊髓灰质炎所需的IPV生产量。因此,全球生产能力存在局限性。此外,因为大的设备占地面积以及相应地高的介质和缓冲液消耗以及高(生物活性)废物生产,当前使用的生产工艺,由于其低生产率,具有高的单元操作成本。除了与疫苗生产过程相关的成本之外,产品批量控制和释放成本也随生产力而定,即高生产力批次驱使每个疫苗剂量的成本显著下降。
提高脊髓灰质炎病毒生产产率的一种方式是改进上游生产工艺。通过增加生产培养物的细胞密度已经实现了以高产率生产脊髓灰质炎病毒的方法(参见例如WO 2011/06823),然而这可能对下游加工提出额外的挑战。到目前为止,还没有描述用于改进脊髓灰质炎病毒纯化方法的进展以用于低密度或高密度培养。
因此,在工业中需要经改进的下游方法以进一步提高脊髓灰质炎病毒纯化方法的产率。
发明概述
本发明涉及从粗细胞收获物中纯化脊髓灰质炎病毒颗粒的改进方法,并且还适用于具有高细胞密度的收获物。在某些示例性实施例中,本发明的方法可以例如具有范围在15-25;6-12和10-16剂量IPV/ml病毒培养物之间的总生产率,在甲醛灭活后分别用于脊髓灰质炎病毒1、2和3型。这是比迄今为止比已知的方法明显更高的体积产率。事实上,克里夫顿伯格(Kreeftenberg)等人(2006)估计了常规的基于VERO细胞平台的IPV过程的总产率为0.64、1.04和0.34剂量/ml病毒培养物,对于脊髓灰质炎病毒1-3型分别基于40:8:32D-抗原单位/剂量,并假设灭活后的总D-抗原回收率为40%。生产力的显著提高将转化为设备占地面积的显著减少,从而降低生产成本,同时提供满足IPV剂量的全球需求所需的最大能力。
使用已知方法进行的高细胞密度悬浮液的下游处理通常需要许多步骤。第一过滤步骤由以下组成:层过滤以除去全细胞,随后用一系列较小尺寸的膜过滤器除去残余细胞碎片和沉淀物质。随后,在浓缩步骤后,需要两个或更多个选择性色谱步骤以根据管理要求(WHO/EP)获得足够纯化的脊髓灰质炎病毒悬浮液。
我们在本文中已经发现和披露了直接在细胞培养物中繁殖脊髓灰质炎病毒后,可以用洗涤剂处理所获得的含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物,该洗涤剂优选地选自下组:阳离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂,以便改善脊髓灰质炎病毒向该收获悬浮液中的释放。如此获得的总纯化产率是前所未有的。实际上,在某些实施例中,与使用迄今披露的方法获得的、常规的基于Vero细胞的平台0.3-1IPV剂量/ml细胞悬浮液的产率相比,本发明的方法达到6-25IPV剂量/ml细胞悬浮液的产率。
本发明提供了从粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,所述方法包括以下步骤:a)向粗细胞培养收获物中加入洗涤剂;和b)澄清所述含有脊髓灰质炎病毒的细胞培养收获物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清收获物。
本发明还提供了从粗细胞培养收获物中增强脊髓灰质炎病毒释放的方法,所述方法包括以下步骤:a)向粗细胞培养收获物中加入洗涤剂;和b)澄清所述含有脊髓灰质炎病毒的细胞培养收获物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清收获物。
该澄清步骤导致澄清的收获物,其包含与粗细胞培养收获物相比在宿主细胞DNA和细胞碎片中大幅减少的内容物。
令人惊奇的是,在澄清后,在基于尺寸分离的抛光步骤,即尺寸排阻色谱或渗滤方法步骤之前,高选择性阳离子交换捕获步骤能够适应于从澄清的收获物中去除高水平的宿主细胞蛋白(HCP)杂质。
因此,本发明还提供了从细胞培养物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,所述方法包括以下步骤:a)向细胞培养物中加入洗涤剂;b)澄清所述含脊髓灰质炎病毒的细胞培养物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清收获物;和c)对步骤b)中获得的澄清的收获物进行捕获步骤以获得含脊髓灰质炎病毒的悬浮液。优选地,所述捕获步骤是阳离子交换色谱步骤。
在优选的实施例中,通过尺寸排阻将先前方法的步骤c)中获得的脊髓灰质炎病毒进一步与含脊髓灰质炎病毒的悬浮液分离。优选地,所述尺寸排阻通过尺寸排阻色谱法进行。
在优选的实施例中,本发明还提供了从细胞培养物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,所述方法包括以下步骤:a)向细胞培养物中加入洗涤剂;b)澄清所述含脊髓灰质炎病毒的细胞培养物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清收获物;c)对步骤b)中获得的澄清的收获物进行阳离子交换色谱法步骤以获得含脊髓灰质炎病毒的悬浮液;和d)通过尺寸排阻色谱法从该含脊髓灰质炎病毒的悬浮液中进一步纯化该脊髓灰质炎病毒。
用于本发明的洗涤剂优选地选自下组:阳离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。在甚至更优选的实施例中,所述洗涤剂是阳离子洗涤剂,优选地所述阳离子洗涤剂选自下组:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)、苄索氯铵(BTC)和溴化度米芬(DB)。在更优选的实施例中,所述洗涤剂是溴化度米芬(DB)。
在又另一个实施例中,所述优选的洗涤剂是阴离子洗涤剂。优选地,所述阴离子洗涤剂选自下组:牛磺脱氧胆酸钠(STH)和十二烷基硫酸钠(SDS)。
在另一个实施例中,所述优选的洗涤剂是两性离子洗涤剂。优选地,所述两性离子洗涤剂选自下组:3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸盐(SB3-14)、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
本发明还提供了用于增强从粗细胞培养收获物中释放脊髓灰质炎病毒的洗涤剂的用途。
附图简要说明
图1(A、B和C)。作为用洗涤剂(溴化度米芬)处理的结果,D-抗原释放自含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物。用洗涤剂处理具有不同细胞密度并且各自含有不同脊髓灰质炎病毒株(马奥尼(Mahoney)、MEF-1或索科特(Saukett))的几种收获物,随后离心。上清液中的D-抗原浓度作为洗涤剂浓度的函数披露。
图2(A、B和C)。作为用洗涤剂(溴化度米芬)处理的结果,在含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中的宿主细胞DNA沉淀。用洗涤剂处理具有不同细胞密度并且各自含有不同脊髓灰质炎病毒株(马奥尼(Mahoney)、MEF-1或索科特(Saukett))的几种收获物,随后离心。上清液中的宿主细胞DNA浓度作为洗涤剂浓度的函数披露。
图3.在用洗涤剂处理之前和之后,上清液中D-抗原浓度/粗品中D-抗原浓度的比率。测量具有不同细胞密度并含有不同脊髓灰质炎病毒株(马奥尼、MEF-1或索科特)的几个收获物的比率。
图4.脊髓灰质炎病毒纯化流程图。
图5.脊髓灰质炎病毒株(A)马奥尼,(B)MEF-1,(C)索科特的SDS-PAGE的产物表征。1=标记,2=系统适用性对照,3=CEX洗脱液,4=SEC洗脱液。
图6(A)作为使用不同阳离子洗涤剂(分别是CTAB、CPC和BTC)处理的结果,D-抗原释放自含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物。
图6(B)作为使用不同阳离子洗涤剂(分别是CTAB、CPC和BTC)处理的结果,在含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中的宿主细胞DNA沉淀。
图7(A、B和C).作为用不同类型的洗涤剂(阴离子、两性离子和非离子洗涤剂)处理的结果,D-抗原释放自含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物。
图8(A、B和C).作为用不同类型的洗涤剂(阴离子、两性离子和非离子洗涤剂)处理的结果,在含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中的宿主细胞DNA沉淀。
发明详述
本发明涉及从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒颗粒的改进方法。在细胞培养后立即获得本发明中定义的粗细胞培养收获物。该收获物被称为粗品,因为它在用洗涤剂处理之前未经处理并且没有以任何形式进行澄清。与细胞培养收获物的上清液相比,该粗细胞培养收获物含有细胞和细胞碎片以及脊髓灰质炎病毒颗粒。
在先前披露的脊髓灰质炎病毒纯化方法中,例如在亨德森(Henderson)等人中,如本申请中描述的与粗细胞培养收获物相比处理澄清的收获物。不同之处在于亨德森(Henderson)等人所述的收获物已经经历澄清步骤,其中将该收获物离心以除去细胞碎片。在亨德森(Henderson)中,没有将阳离子洗涤剂加入到粗细胞培养收获物中,而是将其加入到澄清的收获物中,之前已经从该澄清的收获物中去除了细胞碎片。
在本发明的某些实施例中,这些脊髓灰质炎病毒颗粒从高细胞密度粗细胞收获物中纯化,导致高产率的纯化的脊髓灰质炎病毒。这些高细胞密度,粗细胞培养收获物通过将细胞培养至高细胞密度获得。这种培养可以例如以分批、补料分批或灌注模式进行。将细胞培养至高细胞密度的方法是本领域技术人员已知的。获得高细胞密度培养物的具体方法披露于例如WO 2004/099396、WO 2005/095578、WO 2008/006494中。
根据本发明,粗细胞培养收获物包含约5x 106和150x 106个细胞/mL之间,例如约8x 106和120x 106个细胞/mL之间,例如约12x 106和100x 106个细胞/mL之间,例如约20x106和80x 106个细胞/m之间,例如约10x 106和60x 106个细胞/mL之间的高细胞密度。
在本发明的优选实施例中,所述粗细胞培养收获物中的细胞密度的范围是在约10x 106和50x 106个细胞/mL之间,例如至少约15x 106个细胞/mL、例如至少约20x 106个细胞/mL、例如至少约25x 106个细胞/mL、例如至少约30x 106个细胞/mL、例如多达约35x 106个细胞/mL、例如多达约40x 106个细胞/mL、例如多达约45x 106个细胞/mL。
然而,根据本发明所述的方法也适用于来自具有较低细胞密度的细胞培养的收获物,例如约0.5x 106和10x 106个细胞/mL之间,例如约1x 106和5x 106个细胞/mL之间。
通常,细胞培养物被脊髓灰质炎病毒颗粒感染,以允许所述脊髓灰质炎病毒在细胞中繁殖。因此,在单个生物反应器中获得含有高浓度脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物。感染细胞培养物的方法是本领域技术人员已知的。用于获得具有高病毒浓度的高细胞密度培养物的具体方法披露于例如WO 2011/006823中。该参考文献描述了生产大量重组脊髓灰质炎病毒的方法。这些过程依赖于以高细胞密度感染培养物的能力,同时保持每个细胞的高脊髓灰质炎病毒生产力。因此,该文献提供了在单个生物反应器中获得具有高脊髓灰质炎病毒浓度的高细胞密度粗细胞培养收获物的方法。重组野生型脊髓灰质炎病毒的当前方法的典型产率(以例如12.5百万个/ml的细胞密度感染,则在感染后22-24小时收获)在5.0x 109至3.2x 1010TCID 50/ml的范围内。
一旦脊髓灰质炎病毒在细胞培养物中繁殖,杀死大部分细胞(裂解),根据本发明,将脊髓灰质炎病毒颗粒从粗细胞培养收获物中纯化。
目前描述的脊髓灰质炎病毒生产的方法完全依赖于来自这些细胞的脊髓灰质炎病毒自体释放到培养基中,这是针对脊髓灰质炎病毒的非常有效的方法。令人惊奇的是,本发明的诸位发明人发现当用洗涤剂处理细胞培养物(其已经含有释放的脊髓灰质炎病毒、细胞碎片、宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质)时,可以获得显著的产率增加,所述洗涤剂优选地选自下组:阳离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。此外,该步骤导致具有大幅降低的宿主细胞DNA和蛋白质的更清洁的澄清收获物。
用于在该工艺中定量宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白和脊髓灰质炎病毒颗粒的测定。
残留的宿主细胞DNA可以通过实时定量PCR,使用Taqman探针的定量实时PCR来确定。引物和探针设计用于核糖体18S DNA。通过与从生产细胞DNA制备的已知量的DNA标准曲线比较来确定样品DNA的量。标准曲线DNA原种用限制酶Apa I消化以模拟剪切和部分降解的DNA。
通过用脱氧胆酸和蛋白酶K处理来分离样品的DNA。使用快速实时PCR系统(ABIPrism 7500)进行实时PCR反应。DNA数量来源于样品的重复测量。
在对残留宿主细胞蛋白(HCP)特异的可商购的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Cygnus Technologies,F530)中确定HCP的浓度。参照试剂盒中包含的标准曲线样品确定浓度。测定的范围是25-200ng/ml。
脊髓灰质炎疫苗基于活病毒或灭活病毒。它们含有脊髓灰质炎病毒D-抗原,其是重要的保护性抗原。病毒产率可以通过标准病毒滴定技术测量,而作为效价量度的马奥尼、MEF-1和索科特脊髓灰质炎病毒株的D-抗原浓度的确定可以通过D-抗原酶联免疫吸附测定(ELISA)进行。该测定基于D抗原与血清型特异性抗体(向其中添加混合物过氧化物酶试剂)的结合。然后通过光密度定量过氧化物酶活性。D-抗原浓度参照来自欧洲药品和保健质量管理局(EDQM)的国际IPV标准确定,参见福克斯(Fuchs)等人。马奥尼测定范围为40-160DU/ml,MEF-1为8-32DU/ml,并且索科特为32-128DU/ml。
免疫原性可以例如通过在动物中的体内测试来确定。可使用D-抗原ELISA和通过对来自先前免疫的大鼠的血清进行脊髓灰质炎病毒中和细胞培养测定来对效力进行确定。
增加的D-抗原的释放和宿主细胞DNA的选择性沉淀
我们发现向含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中添加洗涤剂导致进入该收获物的液相中的D-抗原浓度的大大增加。同时,它使宿主细胞DNA沉淀。如本文所示例的,该沉淀步骤导致D抗原从粗细胞收获物释放到液相中增加约100%,并导致澄清后约至少5log10的宿主细胞DNA减少。
因此,本发明提供了适于从粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒颗粒的方法,并且也适合于来自具有高细胞密度的培养物的收获物。可用于实施本发明的洗涤剂包括但不限于,阳离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。
在优选的实施例中,可用于实施本发明的洗涤剂是阳离子洗涤剂,其包括但不限于胺共聚物,季铵化合物,例如溴化度米芬(DB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)和苄索氯铵(BTC),以及其任何相应的混合物。更具体地,已显示许多形式的聚乙烯亚胺(PEI)在中和过量阴离子电荷(DNA杂质)方面非常有效。用于本发明的合适的阳离子洗涤剂包括但不限于以下类别和可商购产品的实例:单烷基三甲基铵盐(可商购产品的实例包括十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵如CTAB、十四烷基三甲基溴化铵或十四烷基三甲基氯化铵(TTA)、烷基三甲基氯化铵、烷基芳基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基-2-苯氧基乙基溴化铵、十六烷基胺:氯化物或溴化物盐、十二烷基胺盐或十二烷基氯盐、和十六烷基二甲基乙基溴化铵或十六烷基二甲基乙基氯化铵)、单烷基二甲基苄基铵盐(实例包括烷基二甲基苄基氯化铵和苄索氯铵如BTC)、二烷基二甲基铵盐(商业化产品包括溴化度米芬(DB)、二癸基二甲基卤化铵、和辛基十二烷基二甲基氯化铵或辛基十二烷基二甲基溴化铵)、杂芳族铵盐(商业化产品包括卤化物十六烷吡啶盐(CPC)或溴化十六烷吡啶盐、和溴化十六烷基吡啶或氯化十六烷基吡啶)、顺式异构体1-[3-氯烯丙基]-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷、烷基-异喹啉氮鎓溴化物、和烷基二甲基萘基甲基氯化铵(BTC 1110)、多取代季铵盐(可商购产品包括但不限于邻磺酰苯酰亚胺烷基二甲基苄基铵盐和烷基二甲基乙基苄基铵环己基氨基磺酸盐)、双季铵盐(产品实例包括1,10-双(2-甲基-4-氨基喹啉鎓氯化物)-癸烷、1,6-双{1-甲基-3-(2,2,6-三甲基环己基)-丙基二甲基氯化铵]己烷或氯化三苯腈、和被巴克曼小册子(Buckman Brochures)称为CDQ的双季铵化合物)、和聚合季铵盐(包括聚烯烃例如聚[氧乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)-亚乙基二氯]、聚[N-3-二甲基铵基]丙基]N-[3-亚乙基氧基亚乙基二甲基铵基]丙基]脲二氯化物、和α-4-[1-三(2-羟乙基)氯化铵])。
本领域技术人员将理解这些是阳离子洗涤剂的实例,并且基于本发明的公开内容,清楚的是这些也将适用于本发明。
在甚至更优选的实施例中,二烷基二甲基铵盐如溴化度米芬(DB)用于本发明中。尽管大量潜在的阳离子洗涤剂可用于实施本发明,但是溴化度米芬是特别令人感兴趣的,主要是由于其作为GMP级原料的可用性和意图供人类使用的其他产品中的目前使用。更具体地,由于溴化度米芬广泛用作口腔卫生产品以及局部抗生素霜剂中的活性成分,所以该分子大量生产并在cGMP条件下释放。
在另一个优选的实施例中,可用于实施本发明的洗涤剂是阴离子洗涤剂,其包括但不限于,烷基磺酸盐,例如牛磺脱氧胆酸钠(STH)、1-辛基磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠和己烷磺酸钠;和烷基硫酸盐,例如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂和辛基硫酸钠;以及其任何相应的混合物。
在又另一个优选的实施例中,可用于实施本发明的洗涤剂是两性离子洗涤剂,其包括但不限于,3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸盐(SB3-14)、3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-([3-胆酰氨丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)、3-(N,N-二甲基辛基铵基)丙磺酸内盐(SB3-8)、3-[N,N-二甲基(3-棕榈酰氨基丙基)铵基]-丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十八烷基铵基)丙磺酸盐(SB3-18)、氨基磺基甜菜碱-14;3-[N,N-二甲基(3-肉豆蔻酰氨基丙基)铵基]丙磺酸盐(ASB-14)和N,N-二甲基十二胺N-氧化物(DDAO);及其任何相应的混合物。在另一个优选的实施例中,可用于实施本发明的洗涤剂是非离子洗涤剂,其包括但不限于,聚(氧乙烯)醚,例如4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇聚乙二醇十六烷基醚聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯聚乙二醇十二烷基醚糖苷洗涤剂,例如癸基-β-D-1-硫代麦芽吡喃糖苷(DTP)、6-环己基己基β-D-麦芽糖苷(Cymal-6)、癸基-β-D-1-硫代吡喃葡萄糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP)、辛基β-D-1-硫代吡喃葡萄糖苷;胆汁酸,例如N,N-双[3-(D-葡糖酰氨基)丙基]脱氧胆酰胺(脱氧-BigCHAP);及其任何相应的混合物。
用于治疗包含细胞密度范围在10x 106和150x 106个细胞/mL之间的含有高细胞密度悬浮液的脊髓灰质炎病毒的洗涤剂的合适浓度范围在约1mM和12mM之间。用于治疗包含细胞密度范围在10x 106和50x 106个细胞/mL之间的含有高细胞密度悬浮液的脊髓灰质炎病毒的DB的合适浓度范围在约1mM和4mM之间。用于治疗包含细胞密度范围在10x 106和30x106个细胞/mL之间的含有高细胞密度悬浮液收获物的脊髓灰质炎病毒的DB的合适浓度范围在约1mM和3mM之间。
测试本文披露的洗涤剂的潜在替代物以鉴定有效增加脊髓灰质炎病毒从细胞释放的化合物是在本领域技术人员的范围内,而该替代物可以进一步沉淀核酸分子和其他细胞碎片远离脊髓灰质炎病毒颗粒,如本文中所示例的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)、苄索氯铵(BTC)和溴化度米芬(DB),并且同时有效地沉淀核酸分子和其他细胞碎片远离脊髓灰质炎病毒颗粒。
因此,本发明部分涉及从高细胞密度悬浮液纯化脊髓灰质炎病毒颗粒但同时增强病毒回收的方法。所述方法增强脊髓灰质炎病毒颗粒的释放,并且同时通过向粗细胞培养收获物中添加洗涤剂而导致宿主细胞核酸分子选择性沉淀远离脊髓灰质炎病毒颗粒。
澄清方法
用洗涤剂处理的粗细胞培养收获物随后澄清以除去全细胞、沉淀的宿主细胞DNA、细胞碎片和其他杂质。所述澄清可以通过深层过滤进行。使用或不使用抛光深度过滤的离心也是可行的。因此,洗涤剂处理的收获物的澄清可以通过单独使用离心来完成,或与抛光澄清步骤如深层过滤一起进行离心来完成。
在选择滤波器或滤波器方案时,优选地在该事件上游变化或变化发生的情况下确保稳健的性能。通过使用不同的内部介质测试各种过滤器类型,可以研究保持良好澄清性能和步骤产率之间的平衡。合适的过滤器可以使用纤维素过滤器、再生纤维素纤维、与无机助滤剂组合的纤维素纤维(例如硅藻土、珍珠岩、热解法二氧化硅)、与无机助剂和有机树脂组合的纤维素纤维,或其任何组合,以及聚合物过滤器(实例包括但不限于尼龙、聚丙烯、聚醚砜)以实现有效的去除和可接受的病毒回收。通常,多阶段方法是优选的但不是必需的。示例性的两阶段或三阶段方法将由一个或多个粗过滤器组成,以去除大的沉淀物和细胞碎片,随后抛光具有大于0.2μm但小于1μm的标称孔径的一个或多个第二级过滤器。最佳组合将是沉淀物尺寸分布以及其他变量的函数。另外,采用相对紧密的过滤器或离心的单级操作也可以产生质量好的产品。更一般地,任何澄清方法(包括与终端或深度过滤组合的助滤剂(例如硅藻土)的死端过滤、微滤、离心或主体进料,其提供合适透明度的滤液以不污染膜和/或后续步骤中的树脂),在本发明中是可以接受的。深度过滤显示本发明的初级澄清的稳健方法。
在根据本发明所述的另一个优选实施例中,在线阴离子交换膜可以整合在澄清过滤器列中,以进一步除去残余水平的DNA或带负电荷的杂质,如在生理条件下没有脊髓灰质炎病毒损失的宿主细胞蛋白质。这些具有高孔(>3um)的高容量膜是众所周知的,以有效地去除带负电的污染物,像在例如单克隆抗体生产领域中的残留DNA、宿主细胞蛋白和/或外来病毒。合适的膜就是其他具有带正电荷的配体的强阴离子交换膜中的一种,典型地是季铵格栅为例如交联的纤维素基质。令人惊讶地发现,尽管典型地病毒在生理条件(pH7-8,电导率15-18mS/cm)下与这些膜结合,具有稍高的净等电点的脊髓灰质炎病毒流过这些膜,这使得其成为带负电荷的杂质去除的合适选择。在某些实施例中,可以使用基于色谱珠的树脂,但是由于高对流的优点,膜是优选的选择。
洗涤剂处理和澄清步骤的组合导致宿主细胞DNA减少了至少4log10,优选地至少5log10,或甚至更优选地至少5.5log10。在整个过滤器装置上建立的总压力保持低于0.8巴,这表明本领域技术人员已经适当地选择和确定了过滤器类型。
在优选的实施例中,阴离子交换膜可以整合在澄清过滤器列中,消除了对存在于所有目前已知的脊髓灰质炎病毒生产工艺中的专用阴离子交换步骤的需要。
在本发明的优选实施例中,通过多阶段澄清工艺流程处理收获的病毒颗粒,该工艺流程包括(以随后的顺序):经由带电过滤器单元(例如密理博(Millipore)MillistakDOHC过滤器)的深度过滤,双膜过滤器0.8μm/0.45μm(例如Sartopore 2),强阴离子交换吸附膜(例如Sartorius Single Sep Q)和具有相对小孔径的无菌膜过滤(例如0.22μm过滤器单元)。
进一步纯化步骤
澄清后,澄清的病毒颗粒悬浮液的浓缩可以被认为是根据本发明所述的方法中的另一步骤,但绝不是必需的。病毒颗粒悬浮液的浓缩可以通过超滤进行。悬浮液可以浓缩5至20次(并且可能用核酸酶处理,如下文所述)。所选择的具体的超滤膜将具有足够小的尺寸以保留病毒颗粒,但足够大以有效地清除杂质。取决于制造商和膜类型,10和1000kDa之间的标称分子量截留值可能是合适的。分子大小截断的选择由产率和杂质清除率之间的折衷决定。使用切向流动模式的超滤是优选的。在所述模式中,可以通过在滞留物上设置具有或不具有背压的固定交叉流,设置固定的跨膜压力或固定交叉流和渗透物通量来控制该步骤。
在该方法的这个阶段可以包括但不是必须的另一个方法步骤是随后通过渗滤引入缓冲液交换方法步骤。使用超滤单元的渗滤或缓冲液交换用于除去和交换盐、糖等。本领域技术人员已知缓冲液交换应该发生在哪种条件下并且哪种缓冲液适用于该步骤。
也可以考虑将核酸酶处理包括在该方法的这个阶段的方法中,但绝不是必需的。核酸酶处理可以包括广谱的核酸酶(例如,BENZONASETM、DNase、RNase或其任何组合)的用途。通常使用核酸酶或具有RNase和DNase活性的混合物。可以在该方法的任何点考虑核酸酶处理步骤,只要最终产物中的残余核酸酶含量对于该应用是可接受的。核酸酶处理可以在仅澄清之后或在澄清和浓缩步骤之后,但在进一步纯化步骤如捕获或抛光步骤之前进行。
可以用于杂质减少,但不是该方法必需的附加单元操作可以是例如,色谱单元。可以使用由不同形式的色谱介质(例如树脂,膜吸附剂和整体柱(monolith))组成的色谱单元。一个或多个色谱单元操作能以正模式或负模式操作(如下所述)。在本发明的某些实施例中,进料到一个或多个色谱单元的病毒颗粒悬浮液可以调节到某些进料条件,例如,pH和/或该溶液的离子强度。在所述步骤期间,通过将病毒颗粒与剩余杂质(例如宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白)分离而进一步纯化病毒颗粒。在所述步骤期间病毒颗粒的纯化可以通过以下步骤实现:例如亲和色谱法,阴离子交换色谱法,阳离子交换色谱法,尺寸排阻色谱法,反相色谱法,疏水色谱法,混合模式色谱法和/或羟基磷灰石色谱法(其用作独立的方法步骤或与几个方法步骤组合)。
在本发明的某些实施例中,在使用一个或多个色谱单元操作的情况下,可以通过将病毒颗粒从病毒颗粒悬浮液中的剩余杂质中分离来纯化病毒颗粒。可以通过在某些条件下将病毒颗粒结合到色谱介质上来分离病毒颗粒,而一些(如果不是大多数)杂质不结合到色谱介质。否则,可以通过将一些(如果不是大多数)杂质结合到色谱介质上,留下大部分病毒颗粒未结合到色谱介质上,来分离病毒颗粒。上述操作模式在本领域中分别以正结合模式和负结合模式被熟知。
取决于所使用的色谱介质,在没有任何结合相互作用下操作某些一个或多个色谱单元操作是可能的。示例性的色谱介质可以是但绝不限于尺寸排阻色谱介质(例如SepharoseTM 6FF)。本领域技术人员知道如何确定用于从杂质中分离病毒颗粒所需的条件。在文献中例如在巴克(Bakker)等人,2011和托马森(Thomassen)等人,2013中描述了不同单元操作连续使用以实现如上所述的高度纯化的脊髓灰质炎病毒溶液的实例。
在本发明的某些实施例中,一个或多个色谱单元操作可以用作捕获步骤,其实质上是浓缩和纯化步骤的组合,由此消除了对如前所述的独立浓缩步骤(例如,超滤步骤)的需要。不同格式的色谱介质可用于捕获步骤。色谱介质形式的实例是a.o.树脂、膜吸附剂和整体柱。本领域技术人员可以容易地确定用于特定处理步骤的最佳色谱介质格式。
在本发明的某些实施例中,在使用一个或多个色谱单元操作作为一个或多个捕获步骤的情况下,可以通过将病毒颗粒从病毒颗粒悬浮液中的剩余杂质中分离来纯化病毒颗粒。病毒颗粒可以通过在某些条件下将病毒颗粒结合到色谱介质上来分离,而一些(如果不是大多数)杂质不结合到色谱介质。
在本发明的某些实施例中,在使用一个或多个色谱单元操作作为一个或多个捕获步骤的情况下,需要将病毒颗粒悬浮液(也称为进料)调节至某些条件(为了与杂质的最佳分离)。要调节的进料材料的示例性条件是例如pH和病毒颗粒悬浮液的离子强度。病毒颗粒可以通过随后的洗脱步骤进一步纯化,该洗脱步骤可以通过例如,改变色谱介质的液相的pH和/或离子强度来实现。
在本发明的具体实施例中,阳离子交换色谱介质用作捕获步骤。可以通过添加酸或碱(例如柠檬酸、NaOH)以达到理想的pH并通过添加盐溶液或去离子水(例如NaCl或MilliQ)以达到理想的离子强度来调节进料材料的条件。作为指导并且肯定不是限制,pH可以潜在地在约4.5-7.0的范围内,并且离子强度可以潜在地在约10mS/cm-25mS/cm的范围内。在进料调节之后的额外澄清步骤(例如0.45μm或0.22μm过滤)可以考虑包括在该方法中,以便减少以下色谱步骤的负担,但该澄清步骤不是必须的。本领域技术人员可以容易地确定对于具体的工艺步骤使用什么溶液和过滤单元。
在本发明的具体实施例中,其中一个或多个色谱单元操作用作一个或多个捕获步骤并且其中病毒颗粒选择性地结合到强阳离子交换色谱介质上用于分离,通过随后通过在单元操作中改变液相的条件的选择性洗脱病毒颗粒来实现进一步的病毒颗粒纯化。作为指导并且当然不是限制,可以通过将液相的pH从酸性pH值改变为碱性pH值(例如pH 4-10之间的范围)来实现病毒颗粒的洗脱。作为指导并且当然不是限制,病毒颗粒的洗脱也可以通过将液相的离子强度从低离子强度变为高离子强度(例如在10mS/cm-35mS/cm之间的范围内)来实现。
在本发明的优选实施例中,将脊髓灰质炎病毒颗粒悬浮液(也称为进料)调节至酸性pH,范围为4.4-5.6,离子强度范围为14mS/cm-22mS/cm。随后,将调整的进料加载到阳离子交换色谱膜吸附器(例如Sartobind S)上,其中病毒选择性地结合到该膜上。在以下洗脱步骤中通过将洗脱缓冲液的离子强度增加到25mS/cm-40mS/cm之间的范围,同时保持pH范围恒定在4.4-5.6之间,从杂质进一步纯化病毒颗粒。洗脱的病毒颗粒悬浮液随后可以通过例如0.22μm过滤单元过滤,以减少生物负载和沉淀物。
根据本发明,如果需要达到一定的产品纯度,可以在该方法中加入称为“抛光”步骤的附加纯化步骤。“抛光”步骤绝对不是在整个纯化工艺流程中必不可少的,但是其是用于实现整个纯化工艺流程中的稳健性的优选的工艺步骤。
在所述步骤期间,理想的是除去微量的杂质,例如但不限于,来自该病毒颗粒悬浮液的宿主细胞核酸(例如DNA)和宿主细胞蛋白。该“抛光”步骤可以通过,但当然不限于以下步骤实现:亲和色谱法,阴离子交换色谱法,尺寸排阻色谱法,反相色谱法,疏水色谱法,混合模式色谱法,羟磷灰石色谱法和/或超滤(作为独立的工艺步骤或几个工艺步骤的组合使用)。在所述步骤期间,可以考虑将病毒悬浮液的缓冲液交换纳入该工艺流程,但绝不是必需的。
在本发明的某些实施例中,当一个或多个色谱单元操作用作一个或多个抛光步骤时,可使用不同形式的色谱介质,例如树脂、膜吸附剂和整体柱。一个或多个色谱单元操作能以正模式或负模式操作。在本发明的某些实施例中,进料到一个或多个抛光步骤的病毒颗粒悬浮液可以调节到某些进料条件,例如,pH和/或该溶液的离子强度。病毒颗粒可以通过随后的洗脱步骤进行纯化,该洗脱步骤可以通过例如,改变色谱介质的液相的pH和/或离子强度来实现。
在本发明的具体实施例中,病毒颗粒纯化也可以通过利用病毒颗粒和杂质之间的大小差异来实现。示例性的工艺步骤可以是尺寸排阻色谱和/或超滤。
在本发明的具体实施例中,除了纯化病毒颗粒之外,一个或多个抛光步骤可以用作缓冲液交换步骤。示例性的方法步骤可以是但绝不限于尺寸排阻色谱和/或渗滤。
在合并有超滤/渗滤步骤的本发明的具体实施例中,可以实现去除残余杂质(例如宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸)以及将该缓冲液交换为所需缓冲液(例如制剂缓冲液)。切向流超滤可用于除去残留的蛋白质和核酸,并将这些病毒颗粒交换为制剂缓冲液。所选择的超滤膜将具有足够小的尺寸以保留病毒颗粒,但足够大以有效地清除杂质。取决于制造商和膜类型,100和1000kDa之间的标称分子量截留值可能是合适的。
在本发明的优选的实施例中,可以通过尺寸排阻色谱法(例如SepharoseTM 6FF)将病毒颗粒与残余杂质分离,同时将缓冲液交换为制剂缓冲液。期望的病毒颗粒纯度水平以及缓冲液交换质量可以通过改变尺寸排阻色谱单元的几个变量来实现。本领域技术人员可以确定最佳操作条件以实现所需的纯度和工艺性能规格。
从本发明所述的细胞培养物中获得纯化的脊髓灰质炎病毒的特别优选的方法包括以下步骤:a)向细胞培养物中加入洗涤剂;b)澄清所述含脊髓灰质炎病毒的细胞培养物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清收获物;c)对步骤b)中获得的澄清的收获物进行阳离子交换色谱法步骤以获得含脊髓灰质炎病毒的悬浮液;和d)通过尺寸排阻色谱法从该含脊髓灰质炎病毒的悬浮液中进一步纯化该脊髓灰质炎病毒。
在该工艺结束时可以包括无菌过滤步骤以减少生物负载,但这样的步骤绝不是必需的。可以将产物通过0.22μm改性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(例如密理博Millipak)过滤。
细胞培养系统以及下游处理系统的规模
本发明的这些方法是比例可调的。本发明中可以使用的细胞培养范围为从小规模培养(例如,1-10升流量)至中规模培养(例如,20-1000L流量)乃至大型商业规模的制备,如1000至50 000L生产流量。初始工艺步骤例如深度过滤与培养体积一致,而阳离子交换色谱法或替代性捕获步骤和随后的步骤与脊髓灰质炎病毒颗粒量一致。因此,后面步骤的批量大小将基于至少5x109TCID50/ml和高达约1x 1011TCID50/ml的生物反应器生产率估计。这些高脊髓灰质炎病毒产率可以例如通过感染高细胞密度培养物获得(如WO2011/006823中所述)。利用本发明,能进一步纯化含有高浓度脊髓灰质炎病毒颗粒的这些高密度细胞悬浮液。处理这些含有大量细胞碎片和宿主细胞杂质的悬浮液的可能性允许每体积悬浮液纯化大量的脊髓灰质炎病毒颗粒。本发明的优点是提供用于处理具有高细胞密度的细胞培养批次的方法,所述细胞培养批次含有高浓度的脊髓灰质炎病毒颗粒,并且因此允许每个处理体积具有非常高的病毒产率。尽管本方法适用于大规模细胞培养,但是该方法也允许以较小规模培养细胞至较高细胞密度,并且仍然达到高脊髓灰质炎病毒产率,这些产物可以有效地被进一步处理。这种方法提供了处理高浓度脊髓灰质炎病毒批次的可能性,这将对整个脊髓灰质炎病毒纯化工业产生巨大影响。
脊髓灰质炎病毒和生产细胞
脊髓灰质炎疫苗可以是单价,含有一种类型的脊髓灰质炎病毒(1型、2型或3型),或二价(含有两种类型的脊髓灰质炎病毒,例如1型和2型、1型和3型或2型和3型),或三价(含有三种类型的脊髓灰质炎病毒,即1型、2型以及3型)。
可以从野生型脊髓灰质炎病毒产生IPV。可替代地,IPV可以从非毒性活脊髓灰质炎病毒(例如,从萨宾病毒株)产生,这将进一步降低从IPV生产重新引入野生型脊髓灰质炎病毒的风险(参见例如WO 2007/007344和多伊(Doi)等人,2001)。本发明适用于纯化野生型脊髓灰质炎病毒(1型、2型和3型,例如1型病毒株马奥尼,2型病毒株MEF-1,或3型病毒株索科特)以及非毒性类型的脊髓灰质炎病毒(例如萨宾病毒株)。根据本发明所述的用于产生IPV的这些方法可以用于将成本降低到IPV可以变得对较不发达和最不发达国家可用的程度。尽管一般来说,当根据常规方法制备时,OPV比IPV便宜,但是本发明的高效方法仍然可以降低用于OPV的批量材料的成本,因此也降低其成本。
一般来说,将每个脊髓灰质炎病毒株在单独的批次中培养,并且如果例如制备含有三种类型的脊髓灰质炎病毒的三价疫苗,则将这些(灭活的,对于IPV)病毒混合并进行配制用于制备单个剂量。在某些实施例中,例如,每剂量(例如0.5ml)的最终疫苗可以例如包含通过与参考制剂比较来确定的1型脊髓灰质炎病毒的40个D-抗原单位(DU)、2型脊髓灰质炎病毒的8个DU、和3型脊髓灰质炎病毒的32个DU。
根据本发明所述的方法可以应用于来自不同细胞类型的细胞培养收获物。可用于本发明所述的方法中的一种类型的细胞是PER.C6细胞,其是永生化细胞,在本领域中也称为连续细胞系,因此具有无限寿命的潜力(参见例如巴雷特(Barrett)等人,2009)。用于本申请所述的目的的PER.C6细胞应指1996年2月29日保藏在ECACC编号9602240的细胞。技术人员将清楚的是,此定义将包括来自这些保藏的细胞的上游或下游传代或者上游或下游传代的后代的细胞。PER.C6细胞在美国专利5,994,128和在(法罗克斯(Fallaux)等人,1998)中有所描述。这些细胞非常适合于脊髓灰质炎病毒生产以产生基于细胞的脊髓灰质炎病毒疫苗,因为这些细胞可以被感染并高效繁殖该病毒,如在WO 2011/006823中所述。本文证明了这些细胞也非常适合于在无血清悬浮培养中产生高水平的脊髓灰质炎病毒。
由于其他细胞类型可用于繁殖脊髓灰质炎病毒,本发明的方法也适用于加工包含其他细胞类型的含脊髓灰质炎病毒的粗细胞收获物。如本文所示,用本发明所述的方法处理来自Vero细胞和MRC-5细胞的收获物。
对于大规模生产灭活的脊髓灰质炎疫苗,脊髓灰质炎病毒通常在粘附的Vero细胞上繁殖,这些Vero细胞是猴来源的。在微载体上培养的Vero细胞广泛用于疫苗生产,包括灭活以及活减毒脊髓灰质炎疫苗,并且迄今为止是被用于制造病毒疫苗的管理机构最广泛接受的连续细胞系,并且本领域的专家有望提高这些细胞的用于疫苗生产的用途(巴雷特(Barrett)等人,2009)。蒙塔尼翁(Montagnon)等人(1982和1984)已描述了用于灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗的Vero细胞的大规模微载体培养。美国专利4,525,349中还描述了使用Vero细胞大规模生产脊髓灰质炎疫苗的方法,以及所得的疫苗。
在无血清培养基中发生的病毒生产期之前,在含有血清的培养基中在微载体上培养的Vero细胞中获得了高滴度的脊髓灰质炎病毒(萨宾1型)生产(几乎2x 109TCID50/ml)(默腾(Merten)等人,1997)。鉴于使用血清的缺点,作者指出需要完全无血清的方法。在无血清条件下,诸位作者能够获得6.3x 108TCID50/ml的脊髓灰质炎病毒生产滴度。通过本发明所述的方法在PER.C6细胞上获得的脊髓灰质炎病毒生产滴度的范围在5.0x 109至3.2x1010TCID50/ml(在感染的细胞密度为12.5百万/ml下)之间。
通常用于疫苗生产的常规替代性细胞平台,特别是IPV生产是由雅各布斯(J.B.Jacobs)(1966)发起的人类胎儿肺成纤维细胞(MRC-5细胞)。宿主细胞系比较研究(弗莱肯(Vlecken)等人,2013)显示,粘附的MRC-5和VERO细胞系是扩展的宿主细胞组中最高的生产者,这使这些细胞系成为病毒疫苗生产的合适候选者。使用烧瓶表面粘附培养物实现的MRC-5和Vero细胞培养物的病毒滴度分别为(0.7-2.6)x 106TCID50/ml和(1.4-5.8)x106TCID50/ml。
本发明所述的纯化方法适用于在适于脊髓灰质炎病毒繁殖的任何细胞类型中繁殖的脊髓灰质炎病毒,即本发明的方法不依赖于用于生长脊髓灰质炎病毒的细胞类型。
在以下实例中将进一步解释本发明。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用以阐明本发明。
实例
实例1:通过添加阳离子洗涤剂增加的来自含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物的脊髓灰质炎病毒纯化产率。
将来自PER.C6细胞系的细胞在以灌注模式操作的10L生物反应器中的无血清培养基中生长至约50x 106活细胞/ml(vc/ml)的细胞密度。在用脊髓灰质炎病毒1型(马奥尼)、2型(MEF-1)或3型(索科特)感染之前,将培养物用新鲜培养基稀释至12.5x 106和50x 106vc/mL之间的范围内的活细胞密度。批次感染工艺在35℃下在10L生物反应器中进行,感染复数为1。在收获时,感染后20-24小时,取出50ml样品,随后将其分成11份4mL的等分试样。
为了确定洗涤剂对含有脊髓灰质炎病毒的细胞培养收获物的影响,用溴化度米芬(DB)进行滴定实验。将离散量的DB储备溶液以目标DB浓度(0和4mM之间)加入到这些样品等分试样中。将样品混合并在35℃孵育一小时。随后,将样品在3000g下离心5分钟,以自旋减慢该沉淀的DNA。通过D抗原ELISA分析上清液样品的病毒量,使用Q-PCR分析上清液样品的宿主细胞DNA。
图1(A、B和C)显示了作为用洗涤剂(DB)处理的结果,含有脊髓灰质炎病毒的细胞培养收获物的D-抗原释放。用洗涤剂处理具有不同细胞密度并且各自含有不同脊髓灰质炎病毒株(马奥尼(Mahoney)、MEF-1或索科特(Saukett))的几种收获物,随后离心。针对洗涤剂添加稀释而被校正的上清液中的D-抗原浓度,作为该洗涤剂浓度的函数给出。图1显示在添加洗涤剂(DB)后,与添加洗涤剂(DB)之前相比,该病毒滴度显著增加。对于每个病毒株和对于每个活细胞密度,可以观察到相同的模式,即增加洗涤剂(DB)浓度导致病毒从该粗细胞收获物释放到该液相中的增加。
图2(A、B和C)显示了作为用洗涤剂(溴化度米芬)处理的结果的含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中的宿主细胞DNA沉淀。y轴上的浓度已经针对洗涤剂稀释因子进行了校正。对于每个病毒株和对于每个活细胞密度,从粗细胞培养收获物沉淀宿主细胞DNA。图2清楚地表明,对于高于1.3mM的洗涤剂(DB)浓度,在等分试样中发生有效的DNA清除。
此外,可以从每条单独的曲线(图1和2)确定最小DB浓度,为此获得了D-抗原的平台水平,并且同时获得了最大DNA清除率。洗涤剂的最小量随细胞密度增加以适应更高量的细胞和培养基中可溶性宿主细胞DNA的增加的水平。
由于洗涤剂的增加不会导致脊髓灰质炎病毒沉淀,本领域技术人员将这些结果外推到甚至更高细胞密度的含脊髓灰质炎病毒的细胞悬浮液中,例如约70x 106个细胞/mL,例如约90x 106个细胞/mL,例如高达约120x 106个细胞/mL,例如高达约150x 106个细胞/mL。技术人员将得出的结论是,可以通过本发明所述的方法纯化来自这种高细胞密度粗细胞培养收获物的脊髓灰质炎病毒。
实例2:洗涤剂处理对来自VERO和MRC5粗细胞培养收获物的脊髓灰质炎病毒释放的功效
处理来自粘附VERO细胞培养物的粗脊髓灰质炎病毒收获物
将Vero细胞在T-175烧瓶中预培养并按比例放大以在VERO旋转培养基(MEM+10%FBS+6mM谷氨酰胺+4.6g/L葡萄糖)和5g/L微载体Cytodex3中以30x 103个细胞/cm2接种1L旋转培养瓶Cytodex 3。将细胞在37℃,5%CO2下孵育,并在60rpm下搅拌第一个24小时,并在随后的几天内在90rpm下搅拌。在接种后(在微载体上)的第3天,用预热的PBS洗涤细胞,并用感染培养基(MEM+4mM谷氨酰胺)进行培养基更换。将补充的细胞培养物分布在含有以1x106个细胞/mL接种的20ml细胞培养物的50ml管中。以MOI为1,针对三种病毒株(马奥尼,MEF-1,索科特)中的每一种感染管针。感染在35℃、170rpm、5%CO2下进行,并且在感染后72小时收获病毒。为了确定洗涤剂对生长在微载体上的含有脊髓灰质炎病毒的粗VERO细胞收获物的影响,将DB储备溶液以1.6mM的终浓度加入到该收获物中。对于该实验,使用DB储备溶液(1.05%w/v,40mM NaCl)。将样品混合并在35℃孵育一小时。随后,将样品在3000g下离心5分钟,以自旋减慢该沉淀的DNA。通过D抗原ELISA分析上清液样品的病毒量,使用Q-PCR分析上清液样品的宿主细胞DNA。
处理来自粘附MRC5细胞培养物的粗脊髓灰质炎病毒收获物
将MRC-5细胞在BME+10%FBS(nHI)+4mM谷氨酰胺中培养并在T75烧瓶中在37℃和10%CO2下孵育。每3-4天,当培养物约80%-90%汇合时,将MRC-5培养物传代并扩增到T-175烧瓶中。当细胞达到约80%-90%的密度(第4天)时,用PBS洗涤细胞,并用BME+4mM谷氨酰胺进行培养基更换。以MOI为1,将T-175瓶以每个烧瓶总体积25ml感染三种病毒株(马奥尼,MEF-1,索科特)中的每一种。在35℃、10%CO2下进行感染,并且在感染后72小时收获病毒。为了确定洗涤剂对含脊髓灰质炎病毒的粗MRC5粘附细胞收获物的影响,将DB储备溶液以0.6mM的终浓度添加到该收获物中。将样品混合并在35℃孵育一小时。随后,将样品在3000g下离心5分钟,以自旋减慢该沉淀的DNA。通过D抗原ELISA分析上清液样品的病毒量,使用Q-PCR分析上清液样品的宿主细胞DNA。
表1:细胞培养收获物上清液中的D-抗原浓度[DU/ml]
表1显示,在对于VERO细胞脊髓灰质炎病毒收获物的DB浓度为1.6mM和对于MRC-5细胞脊髓灰质炎病毒收获物的DB浓度为0.6m时,DB处理时D-抗原的浓度。对表中的D-抗原浓度针对由添加洗涤剂引起的稀释进行校正。
结果表明,添加洗涤剂(DB)导致另外的病毒在VERO和MRC5细胞培养收获物的液相中释放,从而使DNA从病毒中沉淀出来。事实上,在1.6mM DB中的DNA清除在VERO细胞培养物中大于2log10。在MRC5细胞培养中,在0.6mM DB的DNA清除大于3log10(数据未显示)。这表明本发明适用于用于脊髓灰质炎病毒生产的各种细胞类型。
实例3:洗涤剂处理对细胞澄清前生物反应器中脊髓灰质炎病毒释放和DNA清除的影响。
PER.C6细胞在以灌注模式操作的10L玻璃生物反应器中在无血清培养基中生长至约50x 106vc/ml的细胞密度。在用脊髓灰质炎病毒1型(马奥尼)、2型(MEF-1)或3型(索科特)感染之前,将培养物用新鲜培养基稀释至12.5x 106vc/ml的活细胞密度。批次感染工艺在35℃下在10L生物反应器中进行,感染复数为1。在收获时,在感染后20-24小时,在搅拌下在30分钟内添加溴化度米芬(DB)储备溶液,以达到2.2mM DB的最终DB浓度。添加洗涤剂后,将生物反应器在35℃下孵育1小时,同时不断搅拌。
将粗细胞收获物(无DB处理和DB后处理)的样品离心(3000g,5分钟)以沉淀细胞。分别使用D-抗原ELISA和Q-PCR分析粗样品(在DB处理之前未离心,因此含有细胞)和上清液样品的脊髓灰质炎病毒和宿主细胞DNA定量。
图3所示的结果显示,在所有运行(对于所有三种病毒株)中,该洗涤剂处理导致D-抗原从粗脊髓灰质炎病毒收获物释放到液相中增加了两倍。此外,通过用DB处理有效地沉淀了DNA。在所有运行中,相对于在洗涤剂处理之前的2log(数据未显示),在洗涤剂处理后,相对于粗收获物的DNA清除大于5log。这表明本发明也能以生物反应器规模使用。
在腺病毒纯化工艺领域中,以前已经使用洗涤剂的添加来除去宿主细胞DNA,如在US 7326555和WO 2011/045378中所披露的。然而,迄今为止在脊髓灰质炎病毒纯化领域尚未披露选择性DNA沉淀。脊髓灰质炎病毒和腺病毒是非常不同的病毒。实际上,脊髓灰质炎病毒由用蛋白质衣壳包封的单链RNA基因组构成,并且病毒颗粒的直径为约30纳米。相反,腺病毒代表最大的无包膜病毒,直径约90-100nm。腺病毒的蛋白质衣壳含有双链DNA螺旋,并且独一无二地具有辅助附着于宿主细胞的纤维或刺突,这些纤维或刺突在脊髓灰质炎病毒中不存在。腺病毒的等电点为约pH 5.5,这意味着病毒在生理条件下带负电荷。关于脊髓灰质炎病毒等电点的综述文章表明该等电点的值高于腺病毒的pH 5.8-7.5(托马森等人,2013)。由于大小和电荷是色谱和沉淀方法中的关键决定因素,因此不能预测的是,用洗涤剂处理对含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物具有如洗涤剂对含有腺病毒的粗细胞培养收获物类似的作用。
更重要的是,在腺病毒的纯化方法中没有观察到洗涤剂处理对从粗细胞培养收获物到该收获物的液相中的脊髓灰质炎病毒颗粒的释放造成的意想不到的效果。因此,基于先前使用的病毒纯化方法不可能预见到这种令人惊讶的效果。
实例4:有和没有洗涤剂处理的脊髓灰质炎病毒纯化工艺和对D抗原回收和DNA清除的影响。
PER.C6细胞在以灌注模式操作的10L生物反应器中在无血清培养基中生长至约50x 106vc/ml的细胞密度。在用脊髓灰质炎病毒血清1型(马奥尼)或3型(索科特)感染之前,将该培养物用新鲜培养基分别稀释至11x106vc/ml和9.5x 106vc/ml的活细胞密度。批次感染工艺在35℃下在10L生物反应器中进行,感染复数为1。在收获时,在感染后22小时,从生物反应器取出两个1.5L批量样品并转移到2L瓶中。取一个瓶进行直接过滤,另一个用洗涤剂(DB)处理,并且随后经受过滤。
DB处理在室温下在2L瓶中进行。将DB储备溶液在30分钟内通过移液管以30等份添加,同时搅拌,以达到2.1mM的最终DB浓度。添加洗涤剂后,将该瓶在混合的同时孵育2小时。通过使未经处理的粗收获物或经DB处理的收获物通过一系列过滤器,即孔径分布为4-8/0.6-1.5μm的带正电荷的深度过滤器(密理博Millstak+HC POD D0HC),随后是两个连续的减小尺寸为0.8/0.45μm(Sartorius,Sartopore 2)和0.22μm(密理博,Millipak)的聚醚砜(PES)膜过滤器,进行细胞澄清。在过滤期间,弃去第一接收的滤液,然后将滤液收集在产物瓶中,直到进料瓶为空。通过向收集的滤液中添加1系统体积的PBS完成病毒的回收。分别使用D抗原ELISA、Q-PCR和宿主细胞特异性蛋白ELISA分析澄清的收获物的病毒量、宿主细胞DNA和HCP。DB处理对该收获物工艺的性能的影响描述于表2中。相对于在收获时从该粗收获物取得的全营养液样品计算回收率。
与前述实例一致,与不含溴化度米芬的方法相比,用洗涤剂(溴化度米芬)处理后的D-抗原回收率显著增加。结果,该方法的体积生产率显著增加。事实上,在洗涤剂(DB)处理后,澄清的收获物中的D-抗原的浓度加倍。
此外,观察到通过洗涤剂处理步骤的HC-DNA的清除,这与前述实例中描述的结果一致。根据表2,用洗涤剂(DB)处理含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞收获物有助于将DNA清除1000倍。此外,表2显示,通过使用洗涤剂部分去除宿主细胞蛋白(HCP)。
表2:两种病毒株的有(+)和无(-)DB处理的1.5L粗病毒收获物的澄清。
实例5:DB处理作为药物生产灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)方法的一部分
该实例说明了以20L规模从粗细胞培养收获物纯化野生型脊髓灰质炎病毒血清型(马奥尼、MEF-1和索科特)。涉及的下游工艺步骤如图3所示。
PER.C6细胞在以灌注模式操作的10L生物反应器中在无血清培养基中生长至约50x 106vc/ml的细胞密度。在用脊髓灰质炎病毒血清1型(马奥尼)、2型(MEF-1)或3型(索科特)感染之前,将该培养物分在三个生物反应器中并用新鲜培养基分别稀释至12x 106vc/ml、11x 106vc/ml和13x 106vc/ml的活细胞密度。批次感染工艺在35℃下在10L生物反应器中进行,感染复数为1。
在收获时,感染后23小时,将DB储备溶液在30分钟的时间内添加到生物反应器中,到最终DB浓度为2.2mM DB。在加入洗涤剂后,将DB处理的收获物混合60分钟。随后,通过将DB处理的收获物通过一系列过滤器,即两个并行的8-4/1.5-0.6μm Millistak DOHC POD过滤器,随后是0.8/0.45μm Sartopore 2过滤器、Single Sep Q过滤器、最后是0.22μmMillipak过滤器,进行澄清。
合并两次过滤的澄清的收获物,酸化至pH 5.0并稀释至电导率11mS/cm,并在装载至Sartorius Sartobind S膜之前通过Sartorius Sartopore 0.8/0.45μm过滤器过滤。使用PBS通过逐步洗脱从膜中回收该病毒。在最后步骤中,将阳离子交换(CEX)病毒级分装载在填充有Sepharose 6FF尺寸排阻色谱树脂的柱上,分离范围为10-4000kDa。在等度洗脱期间,从病毒级分池中分离残余的HCP,并且将脊髓灰质炎病毒的基质也完全交换为含有NaCl的磷酸盐缓冲液。
纯化后,用SEC洗脱缓冲液将纯化的病毒溶液进一步稀释至预设的吸光度单位(OD260nm),然后添加M199和甘氨酸(终浓度5g/L),并将该液体经过0.22μm孔径过滤器过滤,然后甲醛灭活。
根据世界卫生组织(WHO)和欧洲药典(EP)的要求,在37℃下使用0.025%福尔马林进行灭活13天(在0.22μm过滤之间)。
在上述方法中,分别使用D-抗原ELISA、Q-PCR和Bradford测定分析主要产物中间体、粗收获物、澄清的收获物、SEC洗脱液和灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的病毒量、宿主细胞DNA和总蛋白(TP)。
结果和讨论
表3总结了每种血清型的经纯化的脊髓灰质炎病毒的质量属性和产率。残留的特异性蛋白和DNA浓度满足法规要求(WHO/EP)。此外,吸光度比率OD260/OD280指示高度纯化的病毒(韦斯特迪克(Westdijk)等人,2011)。最后,不同血清型的SDS-PAGE凝胶显示对应于脊髓灰质炎病毒表面蛋白的四个主要蛋白条带(图5)。因此,本文所述的纯化方法对于纯化所有三种血清型都是稳健的,而不管血清型的表面性质和收获时的病毒滴度的差异。
表3:用于单价灭活脊髓灰质炎病毒生产工艺的单价灭活脊髓灰质炎病毒和纯化的脊髓灰质炎病毒(SEC洗脱液)的质量
基于宿主细胞杂质、DNA和HCP的清除以及不同生产阶段的步骤产率,评价工艺性能。结果示于表4中。
表4:单价灭活脊髓灰质炎病毒生产工艺的工艺性能
*无法确定去除,因为进料已低于检测水平
对于所有三种血清型,澄清步骤后的残留HC-DNA水平低于定量限制。表5显示以等价剂量/ml细胞培养物表达的脊髓灰质炎病毒的总生产力。该计算基于对于脊髓灰质炎病毒1-3型的40:8:32比率D-抗原单位/剂量。灭活后最终生产率的比较显示,该工艺超过了目前全世界IPV生产VERO细胞工艺平台,该平台针对类型1-3分别产生0.64、1.04和0.34剂量/ml的病毒培养物(克里夫顿伯格,2007)。因此,可以得出的结论是,尽管在来自高细胞密度收获物的饲料中具有高的初始杂质水平,但是研发了高分辨率和高回收率的方法,产生了用于单价灭活脊髓灰质炎病毒批量生产的无法超过的高生产力,成为IPV疫苗生产不可缺少的一部分。
表5:20L单价灭活脊髓灰质炎病毒生产工艺的生产力(#等效剂量/ml细胞培养物)
实例6:通过添加不同的阳离子洗涤剂从粗细胞培养收获物增加的脊髓灰质炎病毒纯化产率。
细胞在以灌注模式操作的10L生物反应器中在无血清培养基中生长至约50x 106vc/ml的细胞密度。在用2型脊髓灰质炎病毒(MEF-1)感染之前,将该培养物用新鲜培养基稀释至约12.5x 106vc/mL的活细胞密度。批次感染工艺在35℃下在10L生物反应器中进行,感染复数为1。在收获时,感染后20-24小时,取出120ml样品,随后将其分成18份5mL的等分试样。
为了确定洗涤剂对含有粗细胞收获物的脊髓灰质炎病毒的影响,用几种阳离子洗涤剂:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)和苄索氯铵(BTC)进行滴定实验。将固定量的CTAB、CPC和BTC储备溶液(分别为69、70、56mM,全部包括40mM NaCl)以目标洗涤剂浓度(0和4mM之间)添加到收获物等分试样中。将样品彻底混合并在35℃孵育一小时。随后,将样品在3000g下离心5分钟,以自旋减慢沉淀的DNA。通过D抗原ELISA分析上清液样品的病毒量,使用Q-PCR分析上清液样品的宿主细胞DNA。
图6(A)显示作为使用不同阳离子洗涤剂(分别是CTAB、CPC和BTC)处理的结果,D-抗原释放自含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物。针对洗涤剂添加稀释校正的上清液中的D-抗原浓度作为洗涤剂浓度的函数披露。图6(A)披露了在添加洗涤剂(CTAB、CPC和BTC)后,与添加洗涤剂(CTAB、CPC和BTC)之前相比,病毒滴度显著增加。对于每种阳离子洗涤剂,可以观察到相同的模式,即增加洗涤剂(CTAB、CPC和BTC)浓度导致病毒从粗细胞收获物释放到液相中的增加。
图6(B)显示了,作为用洗涤剂(CTAB、CPC和BTC)处理的结果,含脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中的宿主细胞DNA沉淀。y轴上的浓度已经针对洗涤剂稀释因子进行了校正。对于每种阳离子洗涤剂,可以观察到相同的模式,即宿主细胞DNA从粗细胞培养收获物中沉淀。图6(B)清楚地表明,在洗涤剂(CTAB、CPC或BTC)浓度高于0.5mM的等分试样中发生有效的DNA清除。
由于洗涤剂的增加不会导致脊髓灰质炎病毒沉淀,本领域技术人员将这些结果外推到甚至更高细胞密度的含脊髓灰质炎病毒的细胞悬浮液中,例如约70x 106个细胞/mL,例如约90x 106个细胞/mL,例如高达约120x 106个细胞/mL,例如高达约150x 106个细胞/mL。技术人员将得出的结论是,可以通过本发明所述的方法纯化来自这种高细胞密度粗细胞培养收获物的脊髓灰质炎病毒。
实例7:通过添加不同类型的洗涤剂(阴离子、两性离子和非离子)从粗细胞培养收获物增加的脊髓灰质炎病毒纯化产率。
细胞在以灌注模式操作的10L生物反应器中在无血清培养基中生长至约50x 106vc/ml的细胞密度。在用2型脊髓灰质炎病毒(MEF-1)感染之前,将该培养物用新鲜培养基稀释至约12.5x 106vc/mL的活细胞密度。批次感染工艺在35℃下在10L生物反应器中进行,感染复数为1。在收获时,感染后20-24小时,取出240ml样品,随后将其分成42份5mL的等分试样。
为了确定洗涤剂对含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞收获物的影响,用几种不同类型的洗涤剂进行滴定实验。阴离子洗涤剂(牛磺脱氧胆酸钠(STH)和十二烷基硫酸钠(SDS))、两性离子洗涤剂(3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸盐(SB3-14)和3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、和非离子洗涤剂(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇和癸基-β-D-1-硫代麦芽吡喃糖苷(DTP))被用作它们洗涤剂级别的示例性洗涤剂。将固定量的洗涤剂储备溶液以目标洗涤剂浓度加入到收获物等分试样中。阴离子洗涤剂(STH和SDS)、两性离子洗涤剂(SB3-14和CHAPS)和非离子洗涤剂(和DTP)的目标洗涤剂浓度为0和4mM之间。将所有洗涤剂类型的样品(阴离子、两性离子、非离子)彻底混合并在35℃孵育1小时。随后,将样品在3000g下离心5分钟,以自旋减慢沉淀的DNA。通过D抗原ELISA分析上清液样品的病毒量,使用Q-PCR分析上清液样品的宿主细胞DNA。
图7(A、B和C)显示了作为分别用不同类型的洗涤剂(阴离子洗涤剂(STH和SDS)、两性离子洗涤剂(SB3-14和CHAPS)和非离子洗涤剂(X-100和DTP))处理的结果的含脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物的D-抗原释放。针对洗涤剂添加稀释校正的上清液中的D-抗原浓度作为洗涤剂浓度的函数披露。图7(A、B和C)披露了在添加洗涤剂(STH、SDS、SB3-14、CHAPS、和DTP)后,病毒滴度与添加洗涤剂(STH、SDS、SB3-14、CHAPS、和DTP)前相比显著增加。对于每种类型的洗涤剂(阴离子、两性离子或非离子),可以观察到相同的模式,即增加洗涤剂(STH、SDS、SB3-14、CHAPS、和DTP)浓度导致病毒从粗细胞收获物释放到液相中的增加。图8(A、B和C)显示了作为用洗涤剂(STH、SDS、SB3-14、CHAPS、和DTP)处理的结果,从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中的宿主细胞DNA释放。y轴上的浓度已经针对洗涤剂稀释因子进行了校正。对于每种类型的洗涤剂(阴离子、两性离子或非离子),可以观察到相同的模式,即增加洗涤剂(STH、SDS、SB3-14、CHAPS、和DTP)浓度导致宿主细胞DNA从粗细胞收获物释放到液相中的增加。
由于洗涤剂类型(阴离子、两性离子或非离子)浓度的增加不会导致脊髓灰质炎病毒沉淀,本领域技术人员可以将这些结果外推到甚至更高细胞密度的含脊髓灰质炎病毒的细胞悬浮液中,例如约70x 106个细胞/mL,例如约90x 106个细胞/mL,例如高达约120x 106个细胞/mL,例如高达约150x 106个细胞/mL。技术人员将得出的结论是,可以通过本发明所述的方法纯化来自这种高细胞密度粗细胞培养收获物的脊髓灰质炎病毒。
实例8:DB处理和澄清作为萨宾IPV纯化系统的一部分
本实例描述了作为来自粗细胞培养收获物的减毒脊髓灰质炎病毒血清型(萨宾1型、萨宾2型和萨宾3型)的纯化工艺的一部分的收获物工艺(DB处理后接着进行细胞澄清)的应用。
细胞,来自PER.C6细胞系,将细胞在以灌注模式操作的10L生物反应器中在无血清培养基中生长至约50x 106vc/ml的细胞密度。在用脊髓灰质炎病毒血清1型(萨宾1型)、2型(萨宾2型)或3型(萨宾3型)感染前,将该培养物用新鲜培养基稀释至12.5x 106vc/ml或25x106vc/ml的活细胞密度。将1和0.1的感染复数分别用于12.5x 106vc/ml和25x 106vc/ml细胞培养物。在两种情况下,在32.5℃下在10L生物反应器中进行批次感染工艺。
在收获时(对萨宾1型或萨宾3型感染后48小时,和对于萨宾2型感染后72小时),将DB储备溶液在30分钟的时间内添加到生物反应器中至最终的DB浓度为2.2mM DB。在添加洗涤剂后,将DB处理的收获物(约11L)混合60分钟。最后,如对于图4和实例5中的索尔克IPV所述,类似地澄清和纯化DB处理的收获物。
表6显示了随后进行连续过滤的DB处理步骤的总D-抗原回收和HC-DNA去除。表7总结了纯化的萨宾脊髓灰质炎病毒的质量属性。
表6:DB处理和细胞澄清步骤后的D抗原回收和HC-DNA浓度。
表7:灭活前纯化的萨宾脊髓灰质炎病毒的质量
*由于一个或多个缺失的数据,因此不可用。
萨宾脊髓灰质炎病毒工艺的结果显示与野生型病毒株所达到的结果有大的相似性。同样地,对于萨宾脊髓灰质炎病毒株,组合的DB处理和澄清收获工艺实现高病毒回收,并完全去除HC-DNA(表6)。表7显示基于的萨宾脊髓灰质炎病毒细胞培养收获物可以使用本发明中描述的收获和纯化方法充分纯化。残留的特异性蛋白和DNA浓度满足法规要求(WHO/EP)。此外,吸光度比率OD260/OD280指示高度纯化的病毒(韦斯特迪克(Westdijk)等人,2011)。总纯度与野生型脊髓灰质炎病毒株获得的纯度相同(参见实例5中的表3)。
结果是非常有前途的,特别是当人们认为两种类型的病毒,野生型和萨宾病毒株,净表面电荷不同(托马森等人,2013)时。这再次证明了研发的通用高产率脊髓灰质炎病毒疫苗生产工艺的稳健性。
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Claims (10)
1.一种从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,所述方法包括以下步骤:
a)向该粗细胞培养收获物中添加阳离子洗涤剂以获得混合物;
b)澄清步骤a)中获得的混合物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清的收获物。
2.一种从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中增强脊髓灰质炎病毒释放的方法,所述方法包括以下步骤:
a)向该粗细胞培养收获物中添加阳离子洗涤剂以获得混合物;
b)澄清步骤a)中获得的混合物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清的收获物。
3.一种从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,所述方法包括以下步骤:
a)向该粗细胞培养收获物中添加阳离子洗涤剂以获得混合物;
b)澄清步骤a)中获得的混合物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清的收获物;和
c)使步骤b)中获得的澄清的收获物经受捕获步骤以获得含脊髓灰质炎病毒的悬浮液。
4.根据权利要求3所述的从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,其中所述捕获步骤是阳离子交换色谱法步骤。
5.根据权利要求3或4所述的从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,其中通过尺寸排阻将脊髓灰质炎病毒从步骤c)获得的含脊髓灰质炎病毒的悬浮液中分离出来。
6.根据权利要求5所述的从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,其中所述尺寸排阻通过尺寸排阻色谱法进行。
7.一种从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中纯化脊髓灰质炎病毒的方法,所述方法包括以下步骤:
a)向该细胞培养物中添加阳离子洗涤剂以获得混合物;
b)澄清步骤a)中获得的混合物,以获得具有脊髓灰质炎病毒颗粒的澄清的收获物;
c)使步骤b)中获得的澄清的收获物经受阳离子交换色谱法步骤以获得含脊髓灰质炎病毒的悬浮液;
d)通过尺寸排阻色谱法进一步从含有脊髓灰质炎病毒的悬浮液中纯化分离脊髓灰质炎病毒。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法,其中所述阳离子洗涤剂选自下组:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)、苄索氯铵(BTC)和溴化度米芬(DB)。
9.根据权利要求8所述的方法,其中该阳离子洗涤剂是溴化度米芬(DB)。
10.阳离子洗涤剂用于增强从含有脊髓灰质炎病毒的粗细胞培养收获物中释放脊髓灰质炎病毒的用途。
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