CZ2001570A3

CZ2001570A3 - Způsob čištění částic, podobných lidskému papillomaviru

Info

Publication number: CZ2001570A3
Application number: CZ2001570A
Authority: CZ
Inventors: James C. Cook Iii.
Original assignee: Merck & Co., Inc.
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2001-09-12
Also published as: DE69931053T2; WO2000009671A1; NZ509610A; JP4440471B2; DE69931053D1; EP1105466A1; ES2262333T3; EP1105466B1; AU5469899A; SK2232001A3; US6602697B1; BR9913026A; HUP0103091A2; PT1105466E; CN1354787A; DK1105466T3; SI1105466T1; IL141130A0; JP2003520188A; CA2339034A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu čištěni části, podobných lidskému papillomaviru (VLP) z lidského papillomaviru (HPV) . Tyto částice je možno použit jako složky vakcin.

Dosavadní stav techniky

Infekce papillomavirem se vyskytuje u celé řady živočichů včetně člověka, ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a krav. Uvedený virus infikuje epitheliální buňky a obvykle vyvolává benigní epitheliální nebo fibroepitheliální nádory v místě infekce. Viry jsou specifické pro daný druh živočichů. Papillomavirus člověka nemůže infikovat žádný jiný živočišný druh.

Papillomaviry je možno klasifikovat na odlišné skupiny v závislosti na hostiteli, kterého infikují. Lidské papillomaviry (HPV) se dále klasifikují na více než 70 typů v závislosti na homologii sekvence DNA, podrobnosti je možno nalézt v souhrnné publikaci Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press, lne., 1990. Různé typy papillomaviru jsou typově specifické immunogeny v tom smyslu, že neutralizační imunita k infekci jednoho typu papillomaviru nezajistí imunitu proti dalším typům papillomaviru.

Papillomaviry jsou malé s velikostí v rozmezí 50 až 60 nm, jsou bez obalu a jde o dvacetistěnné DNA viry, které kódují až 8 časných a 2 pozdní geny. Otevřený čtecí rámec (ORF) v genomu viru pro jednotlivé geny se označuje

El až E7 a LI a L2, kde E označuje časné geny a L označuje pozdní geny. Čtecí rámce Li a L2 kódují proteiny kapsidu viru. Časné geny jsou spojeny s životními funkcemi viru, například s replikací viru a s buněčnou transformací.

Protein LI je hlavní protein kapsidu a jeho molekulová hmotnost je v rozmezí 55 000 až 60 000. Protein L2 je vedlejší protein kapsidu, předpokládaná molekulová hmotnost je 55 000 až 60 000, zjevná molekulová hmotnost je 75 000 až 100 000 při stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Imunologické údaje předpokládají, že většina proteinu L2 je vnitřní protein vzhledem k proteinu LI. Proteiny L2 jsou vysoce konzervované u různých papillomavirů, zvláště pokud jde o 10 základních aminokyselin na C-terminálním konci. Také ORF pro LI je vysoce konzervován u různých papillomavirů.

Rekombinantní protein LI byl připraven u celé řady hostitelů a za příznivých podmínek samovolně vytváří částice, podobné viru, VLP sám o sobě nebo v kombinaci s proteinem L2. Částice typu VLP jsou využitelné pro výrobu vakcíny. Aby však bylo možno pomocí těchto částic připravit vakcínu pro použití v lidském lékařství, musí být VLP vysoce čištěné a prosté kontaminace hostitelských buněk. Až dosud se užívá k odstranění kontaminujících biologických mulekul ultrafiltrace v protiproudu a diafiltrace. Při tomto postupu však může dojít k proteolytické degradaci HPV Ll. Je však zřejmé, že by bylo zapotřebí mít k dispozici způsob čištění proteinu Ll, který by poskytoval vysoce čistý, nedegradovaný produkt.

♦ · • · · · · · · • · ····· · ·

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob čištěni částic, podobných lidskému papillomaviru, tento postup spočívá v tom, že se uvede do styku částečně čištěný lysát buněk s obsahem VLP s prostředím s obsahem hydroxyapatitu v chromatografickém sloupci za podmínek, při nichž se VLP mohou vázat na prostředí s obsahem hydroxyapatitu, načež se vázané VLP vymývají roztokem, obsahujícím fosfátové anionty a VLP, získané touto elucí se izolují.

Čištění je možno použít v případě VLP, které jsou tvořeny v podstatě proteinem LI, může však také jíž o VLP, obsahující proteiny LI a L2. Mimo to je postup možno použít pro chimérní VLP, obsahující protein LI a protein L2 jako fuzní protein. Obecně pro použití ve vakcíně jsou výhodné VLP, obsahující pouze proteiny Ll.

Způsob podle vynálezu je využitelný pro VLP v podstatě z jakéhokoliv kmene papillomaviru. Výhodné je použití lidského papillomaviru HPV. Výhodné kmeny HPV jsou zejména takové kmeny, o nichž je známo, že vyvolávají nejzávažnější onemocnění a chorobné stavy. Jde zejména o HPV typ 6a, HPV typ 6b, HPV typ 11, HPV typ 16, HPV typ 18, HPV typ 31, HPV typ 33 a HPV typ 45.

Obecně je možno uvést, že hostitelská buňka se transformuje vektorem, obsahujícím kódovou sekvenci pro protein Ll nebo pro proteiny Ll a L2 nebo pro proteiny Ll a L2 ve formě fuzního proteinu.

V průběhu přihlášky a patentových nároků se pod pojmem „L2 ve formě fúzniho proteinu rozumí, že kódová DNA pro protein L2 je operativně vázána na jinou kódovou DNA pro požadovaný protein, přičemž s výhodou jde o jiný protein z HPV, například El, E2, E3, E4, E5, E6 nebo E7. Část L2 ve fúzním proteinu může mít plnou délku, avšak může také být zkrácena a/nebo v ní mohou být vynechány některé zbytky aminokyselin. Příklady takových materiálů je možno nalézt v současně projednávané US patentové přihlášce č. S.N. 60/096638.

Hostitelskou buňkou může být jakákoliv hostitelská buňka, o níž je známo, že se snadno pěstuje, může například jit o kvasinky Saccharomyces cerevisiae, o hmyzí buňky nebo také o buňky bakterií nebo savců. Zvláště vhodné jsou kvasinky.

Vektor může také obsahovat další známé prvky, například prvky pro řízení transkripce a translace a/nebo markerové geny. Proteiny Ll, LI a L2 nebo Li a L2 ve formě fúzniho proteinu budou po expresi samovolně vytvářet VLP. Hostitelské buňky se pak obvyklým způsobem rozruší a lysát buněk se pak částečně čistí.

Stupeň částečného čištění může zahrnovat běžně užívané čisticí postupy a není pro způsob podle vynálezu kritický. Je například možno lysát buněk podrobit mikrofiltraci a alespoň jednomu chromatografickému stupni, například na kationtoměniči.

Bylo prokázáno, že pomocí chromatografíe, v němž náplň sloupce tvoří hydroxyapatit s eluci pufrem, obsahujícím fosfátový anion, je možno odstranit velké • · • · množství nečistot z částečně čištěného lysátu buněk. Specificky bylo prokázáno, že je tímto způsobem možno z lysátu odstranit většinu kontaminujících biologických molekul včetně DNA, lipidů a proteinů.

Podle vynálezu jsou čištěné VLP čisté nejméně ze 75 %, s výhodou je jejich čistota nejméně 80 % a zvláště nejméně 90 % při stanoveni na SDS/PAGE.

Při prováděni způsobu podle vynálezu je zásadně možno použit jakýkoliv materiál s obsahem hydroxyapatitu jako náplň chromatografického sloupce. S výhodou se užívá hydroxyapatit pro keramické účely se středním průměrem částic přibližně 20 až 50 mikrometrů a velikostí pórů přibližně 800 A. Z běžně dodávaných typů hydroxyapatitu jde například o typ „Ceramic hydroxyapatite, Type II (BioRad) . Je však možno stejně dobře použít i jiné typy.

Při přípravě chromatografického stupně čištění svrchu uvedených částic se doporučuje, aby eluční činidlo, přiváděné do sloupce, byl pufr o pH 6 až 8 a s výhodou přibližně 7. Výhodným pufrem je 50 mM MOPS, což je kyselina 3-(N-morfolino) propansulfonová o pH 7,0, pufr také obsahuje 1,25 M NaCl.

Další systémy pufrů, které je také možno pro tyto účely použít, budou odborníkům zřejmé a zahrnují následující látky: MES, kyselinu 2-(N-morfolino)ethansulfonovou, BIS-TRIS, to znamená [bis-(2-hydroxyethyl)-amino]tris-(hydroxymethyl)methan, ADA, což je monosodná sůl kyseliny N-2-acetamidoiminodioctové, ACES, kyselina N-2-acetamido-2-aminoethansulfonová, PIPES, kyselina piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonová), MOPSO, kyselina • · • · · · (3-N-morfolino)-2-hydroxypropansulfonová, BIS-TRIS

PROPANE, což je 1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino] propan, BES, kyselina N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonová, TES, kyselina N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonová a kyselina 2,2-( [2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino)ethansulfonová, HEPES, kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová, DIPSO, kyselina 3-(N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino)-2-hydroxypropansulfonová, TAPSO, kyselina [3-N-tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonová, TRIS, tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, HEPPSO, kyselina N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N'-[2-hydroxypropansulfonová], POPSO, kyselina piperazin-N,N'-bis(2-hydroxypropansulfonová), EPPS, kyselina N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N'- [3-propansulfonová] a HEPPS, TEA, triethanolamin, TRICINE, N [tri-(hydroxymethyl)methyl]glycin, BICINE, N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-glycin, TAPS kyselina 3-{[tris-(hydroxymethyl)methyl]amino}propansulfonová, imidazol, HEPPS, kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-3-propansulfonová, glycinamidhydrochlorid, glycylglycin, citráty, acetáty a sukcináty jako pufry.

Částečně čištěné VLP v roztoku pufru se pak uvádějí do styku s prostředím s obsahem hydroxyapatidu za podmínek, při nichž se mohou VLP vázat na hydroxyapatit. Tyto podmínky zahrnují široké teplotní rozmezí, výhodná je teplota místnosti. Rychlost průtoku se rovněž může měnit v širokém rozmezí, výhodné množství je přibližně 90 cm/h.

Po vazbě VLP na hydroxyapatit je následujícím stupněm izolace čištěných VLP z hydroxyapatitu při • · ·· ······ ···· ···· ·· ·· ·· · použiti elučního pufru. Výhodný pufr pro eluci obsahuje fosfátový anion a jde například o roztok fosfátu sodného nebo draselného. Výhodné molární rozmezí je 0,05 M až 1 M, výhodné je molární množství přibližně 0,2 M. Eluční pufr by měl mít pH v rozmezí 6 až 8, výhodná hodnota pH je 7 .

Další výhodou způsobu podle vynálezu je skutečnost, že není zapotřebí používat specifické vybavení pro chromatografii, mimo to je postup rychlý, nevyžaduje výměnu pufru a při použití uvedeného postupu je možno dosáhnout velmi dobrého výtěžku HPV LI.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava částečně čištěného lysátu

Buňky kvasinek, transformované k expresi VLP se izolují a zmrazí pro uskladnění při teplotě -70 °C. Zmrazená suspenze kvasinkových buněk se vyjme a nechá roztát po dobu přibližně 3 hodiny při teplotě místnosti, načež se ponechá přibližně 18 hodin při teplotě 4 °C. K buněčné suspenzi se přidá prostředek BENZONASE® (Nycomed Pharma A/S, Copenhagen, Dánsko) v množství 2,8 x 10⁵jednotek/ml a 0,21 mg proteinu/ml, prostředek se přidá do konečné koncentrace 750 jednotek na 1 g vlhkých buněk, v jednom pokusu bylo toto množství sníženo až na 335 jednotek na gram vlhkých buněk. Buněčný materiál byl • · • · · · • · · · φ · ♦····· ········ ·« «· míchán 15 minut, pak byly buňky rozrušeny dvěma průchody homogenizátorem APV Gaulin 30CD při tlaku v komoře 14 500 až 16 000 psi, čímž došlo k rozrušení 95 % buněk. Lysát byl opatrně míchán 18 hodin při teplotě 4. °C.

Čeření a mikrofiltrace

Buněčný lysát byl vyčeřen mikrofiltrací v protiproudu a diafiltrací následujícím způsobem. Lysát byl přenesen ke zpracování do sterilního tanku se vstupním otvorem s průměrem 1 palec a výstupním otvorem téhož průměru. Mikrofiltr byl tvořen filtrem z dutých vláken s průměrem pórů 0,65 mikrometru, celková plocha filtru byla 5 stop² (A/G Technologies #CFP-6-D-8A, Needham, ΜΑ), filtr byl uložen v systému A/G Technologies FlexStand® Benchtop Pilot Hollow Fiber systém. Retentát byl podroben diafiltraci při použití tří objemů dále uvedeného diafiltračního pufru, čímž byl získán vyčeřený lysát. Pufr pro diafiltraci obsahoval 0,2 M (Na⁺)MOPS, pH 7,0 + 0,4 M NaCl.

Chromatografie vyčeřeného lysátu

Vyčeřený lysát byl frakcionován chromatografií na sloupci s náplní kationtoměničové pryskyřice POROS® 50 HS (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). Sloupec byl promyt před použitím 0,5 N NaOH. Pak byl sloupec uveden do rovnovážného stavu s pufrem pro diafiltraci HPV, který obsahoval 0,2 M (Na⁺)MOPS, ph 7,0 + 0,4 M NaCl při teplotě místnosti. Lysát s teplotou 4 °C byl čerpán do sloupce rychlostí 125 ml/min a sloupec byl vymýván 8 objemy sloupce při teplotě místnosti při použití pufru A, obsahujícího 0,05 M (Na⁺)MOPS, pH 7,0 + 0,5 M NaCl a • ··· ···· rychlosti 125 ml/min lineárním gradientem 100 % pufru A pro vymýváni sloupce až 100 % pufru B pro vymývání sloupce, obsahujícího 0,05 M (Na⁺)MOPS, pH 7,0 + 1,5 M NaCl. Objem lineárního gradientu byl celkem 10 objemů sloupce, tento objem byl odebírán po 10 frakcích se stejným objemem. Po průchodu uvedeného gradientu byl sloupec vymýván při teplotě místnosti dvěma objemy pufru B rychlostí 125 ml/min, čimž byly získány 2 další frakce. Frakce byly odebírány do sterilních lahví z plastické hmoty s objemem 2 litry a uloženy při teplotě 4 °C. Frakce, které obsahovaly poslední absorpční vrchol v ultrafialovém světle při A280 nm a A230 nm v oblasti gradientu, byly spojeny, zfiltrovány přes filtrační jednotku pro jedno použití MILLIPAK-200 (Millipore, Bedford, MA) a uloženy při teplotě 4 ’C.

Příklad 2

Chromatografie na hydroxyapatitu

Všechny stupně byly prováděny při teplotě místnosti. Chromatografický sloupec s délkou 36 mm a vnitřním průměrem 13 mm byl naplněn keramickým hydroxyapatitem, typ II (BioRad, Cat. #7320081, Hercules, CA), byl uveden do rovnovážného stavu v 50 mM MOPS, pH 7,0 + 1,25 M NaCl. Částečně čištěný roztok HPV z příkladu 1 byl nanesen do sloupce při lineárním průtoku 90 cm/h. Po nanesení vzorku byl sloupec promyt 8 objemy sloupce, v němž byl sloupec uveden do rovnovážného stavu, až byla optická hustota efluentu přibližně 0. Pak byly HPV ze sloupce vymývány gradientem 0 až 100 %, šlo o lineární gradient elučního pufru, obsahujícího 0,2 M fosfátu sodného, pH 7,0 + 1,25 M NaCl, rovněž při lineární rychlosti průtoku 90 cm/h. Celkový objem gradientu byl 4 objemy sloupce. Frakce, • · • · ♦ · · · ·····» ········ « · ·· obsahující požadovaný produkt byly identifikovány pomocí RIA a Bradfordovou zkouškou na protein. Koncentrace proteinu v produktu byla 100 mikrogramů/ml.

Provedení zkoušky

Bradfordova zkouška na protein byla provedena při použití barviva Coomassie s reakčním činidlem (Pierce, Rockford, IL) při použití sérové albuminu skotu BSA jako standardu. Lowryho zkouška na protein byla provedena způsobem podle publikace Lowry a další, 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-270 při použití BSA jako kalibračního standardu. Antigen byl stanoven pomocí vrcevrstvé zkoušky ELISA při použití monoklonální protilátky, rozpoznávající konformační epitop VLP. Mikrotitrační plotny byly opatřeny povlakem polyklonálních kozích protilátek proti HPV VLP. Standardní a zkušební vzorky byly zředěny PBS s obsahem 1 % hmotnostní BSA, 0,1 % TWEEN-20 a 0,1 % azidu sodíku a byly přidány do vyhloubení, v nichž byl antigen zachycen protilátkami, vázanými na plotnu. Do vyhloubení byla pak přidána monoklonální protilátka proti HPV LI VLP (Chemicon, Temecula, CA) k vazbě antigenu, zachyceného vázanými protilátkami. Monoklonální protilátky proti HPV VLP byly prokazovány pomocí myších protilátek IgG, konjugovaných s peroxidázou z křenu. Byl přidán chromogenní substrát pro peroxidázu z křenu,

3,3', 5,5'-tetramethylbenzidin (Pierce), absorbance při 450 nm pak byla úměrná koncentraci LI VLP ve vzorku.

Dynamická kapacita sloupce pro produkt, použitelný ve vakcíně, byla 2,9 mg/ml pryskyřice (Bradford) a

4,6 mg/ml pryskyřice (RIA). Výtěžek v tomto stupni byl • 99 • 9 • ··· % při zkoušce na protein podle Bradforda nebo 82 % při zkoušce RIA v případě, že byla kapacita sloupce využita na 100 %. Výtěžek poklesl na 63 % (Bradford) a na 50 % (RIA) v případě, že sloupec byl využit z 8 %.

Příklad 3

Odstranění jiných biologických molekul

Vzorek HPV 11 LI, připravený v podstatě způsobem podle příkladu 1 a 2, byl sledován na přítomnost DNA při použití PCR. Výsledky, které jsou uvedeny v následující tabulce prokazují, že uvedený chromatrografický postup je vysoce účinný pro odstranění kontaminující DNA z výsledného produktu.

Vzorek	Protein (μ,ς/ιηΐ)	DNA (pg/ml)	Poměr pg DNA/pg proteinu
Obsah sloupce	107	3270	30,6
Promytí (frakce#6)	<10	196	>19, 6
Eluát (frakce #20)	230	<2,6	<0,011

Příklad 4

Čištění chimérních VLP

Čištění HPV typ 16 Ll/L2_mi_ni/E2 chimérních VLP

Konstrukce modifikovaného genu L2

Vektor YP3 (minimální L2)

Uvedený vektor uchovává kódovou sekvenci pro 69 amino-terminálních zbytků aminokyselin a pro 84

Φ · · · · ♦ ♦ 9 99 ♦ * φφ»*· ·* • · ··♦*··* ΦΦΦΦ 9999 99 99 99999 karboxyterminálních zbytků aminokyselin (aa) proteinu HPV16 L2, tyto zbytky jsou spojeny v rámci syntetickým polylinkerem, který zavádí jediné místo pro působení restrikčních enzymů Notl, Sací a Xhol a mimo to zbytek kyseliny glutamové tak, že se zbytek šeřinu podrobí mutaci na kyselinu glutamovou.

PCR primery (Midland Certified Reagents) byly zkonstruovány k amplifikací sekvencí L2 nativního genu L2 ve vektoru, pGalllO HPV16 L1+L2.

Primer I se sekvencí 5'-CCT CCC CCC GGG CAC AAA ACA

AAA TGC-3', SEQ.ID. NO. 1) a C se sekvencí 5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3', SEQ. ID. NO. 2 amplifikovaly sekvenci 265 bp s kódem pro aminoterminálních 69 zbytků a 23 bp pro nepřenášenou sekvenci po směru exprese včetně místa pro restrikční enzym Smál. Primer C modifikoval a prodloužil aminoterminální kódovou oblast L2 při vnesení míst působení restrikčních enzymů Notl, Sací a Xhol proti směru exprese kódové sekvence L2.

Primery A se sekvencí 5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT

ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3' , SEQ. ID. NO. 3, C a D se sekvencí 5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3', SEQ.ID. NO. 4 amplifikcvaly sekvenci 285 bp, která je kódovou sekvencí pro 84 karboxyterminálních zbytků aminokyselin L2 a 6 bp, v níž se nachází místo působení restrikčního enzymu BglII. Primer A také přidává sekvenci 17 bp s místem působení enzymů Notl, Sací a Xhol proti směru exprese kódové sekvence L2.

·· ·· ♦ · φφ ·· · • Φφφ · φ · · φ · · φ φφφ Φ·· φφφ * φφφ φφ φφφφ · ♦ φ · · φ · φ φ φ • φφφ Φ·Φ· ·· *· φφφ

Minimální konstrukt pro expresi L2 byl zkonstruován komplementárními sekvencemi, které byly přidány pomocí primerů A a C. Izolované produkty DNA z amplifikačních reakcí I/C a A/D byly použity při PCR-reakci, při níž byly jako amplifikační primery použity oligonukleotidy I a D. K usnadnění spojení fragmentů s komplementární sekvencí o 17 bp byly provedeny 3 cykly PCR při použití teploty vazby 37 °C, následovalo 15 cyklů při teplotě 57 °C. Výsledný produkt amplifikace byl navázán svými vyplněnými konci do plasmidu pcrScript (Stratagene, LaJolla) a použit k transformaci buněk XL-1 Blue MRF (Stratagene, La Jolla). Pozitivní klony byly identifikovány pomocí PCR při použití primerů I a D a potvrzeny restrikční analýzou. Konstrukce pak byla ověřena automatickou analýzou sekvence (Perkin Elmer, lne., Foster City, CA).

Plasmidová DNA z příslušného izolátu pak byla rozštěpena enzymy Smál a BglII. Fragment s velikostí přibližně 0,5 kb byl čištěn na gelu a navázán na fragment, vektoru o 14 kb Smál a BglII plasmidu pGAL 110 HPV16 LI. Kompetentní buňky DH5 E. coli (Gibco BRL, Rockville, MD) byly transformovány uvedenou směsí a transformanty byly podrobeny selekci na plotnách LB s ampicilinem (Remel, Lenexa, KS) . Klony byly zpočátku sledovány pomoci PCR, při niž byly primery Dal použity k amplifikaci části L2, příslušné klony pak byly ověřeny štěpením restrikčními enzymy. Klon YP3#1 byl ověřen automatickou analýzou sekvence, jak bylo uvedeno svrchu. Uvedený klon byl pak použit jako základní konstrukt, do nějž byly ukládány kódové geny pro otevřené čtecí rámce HPV 16 El, E2 nebo E7.

·♦ φφ φφ φφ φφ φ φφφφ · φ φ φφφφ φ φ φφφφφ φφ φ • φφφ φφφφφφ φ • φ φφφφ φφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφφ

Uloženi kódových genů pro protein HPV E

Kódový gen pro HPV16 E2 byl získán PCR amplifikaci HPV16 pozitivního klinického vzorku a byl pak přímo uložen do vektoru pro subklonován! pCRII (Stratagene, La Jolla, CA) a sekvence byla ověřena stejně jako svrchu. Sekvence genu E2 pak byla modifikována následujícím způsobem:

1) Sekvence DNA, obsahující v rámci místa působení Xhol, Nael, Notl byly přidány na aminoterminální konec E2 . Mimo to byly sekvence, obsahující tato místa, přidány na karboxyterminální část E2 k usnadnění uložení E2 pomocí těchto míst.

2) Sekvence DNA byla pozměněna mutagenezí pomocí PCR, tak aby řetězec byl kódem pro zbytky alaninu v místě zbytků kyseliny glutamové v poloze 39 a isoleucinu v poloze 73. Tímto způsobem byla inaktivována funkce proteinu E2.

Svrchu popsaný modifikovaný gel HPV16 E2 byl rozštěpen enzymy Notl, Xhol a navázán do podobně rozštěpeného vektoru YP3#1. Transformanty, obsahující správně uloženou sekvenci E2, byly podrobeny selekci pomocí PCR a sekvence byla ověřena.

Tentýž postup byl použit pro kódové geny pro HPV16 El a HPV16 E7. V případě El byl zbytek glycinu v poloze 482 nahrazen zbytkem kyseliny aspargové a v případě E7 byl cysteinový zbytek v poloze 24 i zbytek kyseliny glutamové v poloze 26 nahrazen glycinovým zbytkem k inaktivaci funkce proteinu. Výsledné konstrukty pak byly použity k transformaci kvasinek pro analýzu exprese.

·· ·· φ· φφ φφ • · · * · · ♦ φ ·· • · · · ·φφ· φ • · « φ φ φ φ ·φ ···· φφφφ φφ φφ φφ φφφ

Příklad 5

Identifikace a růst kvasinek, u nichž dochází k expresi chimérních VLP

Plasmidová DNA z YP3#1 a svrchu popsané deriváty byly použity k transformaci Saccharomyces cerevisiae (MATa, leu2~04, prbl::HIS3, mnn9::URA3,cir°) metodou s použitím spheroplastů podle publikace Hinnen a další 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933. Transformované spheroplasty byly naneseny na plotny se selektivním prostředím, které neobsahovalo leucin (Remel, Lenexa, KS) . Klony byly izolovány dvojím výběrem jednotlivých kolonií. Z klonů, které pravděpodobně obsahovaly žádaný materiál, byly připraveny malé kultury v tekutém prostředí, které byly pěstovány až do vysoké hustoty buněk v prostředí s obsahem galaktózy. Surové extrakty byly připraveny energickým mícháním spolu se skleněnými kuličkami s následným odstředěním. Vyčeření extrakty byly analyzovány na expresi složek LI a L2 a na VLP různými postupy včetně SDS PAGE, ELISA, pomocí immunoblotu a EIA, s použitím monoklonálních protilátek nebo monospecifických polyklonálních antisér, rozpoznávajících Li nebo L2 nebo aminoterminální nebo karboxyterminální zakončení L2 nebo LI VLP nebo El nebo E2 nebo E7 nebo jakýkoliv jiný protein nebo peptid, spojený s modifikovaným L2. Klony, u nichž dochází k expresi složek L2 nebo vytvořených VLP se vybírají pro další charakterizaci. Kultury vybraných klonů s objemem 1 litr nebo 16 litrů byly pěstovány v prostředí kalaktózy pro přípravu velkého množství chimérních VLP.

♦ · · · * · · · < · • ♦ ····· · · • · ···· ··· ···· ···· ·· ·· ·· ···

Usazenina buněk byla uložena ve zmrazeném stavu při teplotě -70 °C. Zmrazené buňky s vlhkou hmotností 148 g byly ponechány roztát a pak byly uvedeny do suspenze v 740 ml pufru pro rozrušení bur.ěk, který obsahuje 200 mM MOPS, pH 7, 1 mM CaC12, byla připravena suspenze s obsahem buněk přibližně 20 % hmotnostních. Pak bylo přidáno 750 jednotek/g vlhké hmotnosti buněk nukleázy, byla použita nukleáza ΒΕΝΖΟΝΑΞΞ® (Nycomed Pharma).

Suspenze buněk byla rozrušena při tlaku přibližně 19 000 psi pěti průchody zařízením M110-Y Microfluidizer (Microfludics Corp., Newton, MA) . V průběhu postupu byla buněčná suspenze udržována na ledu. Pomocí hematokritu bylo prokázáno rozrušení buněk z více než 80 %.

Lysát buněk byl po určité době stání vyčeřen mikrofiltrací přes vrstvu filtru z dutých vláken s průměrem otvorů 0,65 mikrometrů (A/G Technologies) při použití zařízení pro mikrofilcraci s tangenciálním průtokem při použití diafiltrace. Lysát byl podroben diafiltraci při použití tří objemů 0,25 M citrátu sodného, 0,2 M MOPS, pH 7,0. Antigen prošel membránou a byl izolován v permeátu.

3,9 litru frakce permeátu, která prošla otvory s průměrem 0,65 mm byla nanesena na sloupec s objemem 325 ml, vnitřním průměrem 11,2 cm x 3,3 cm s náplní pryskyřice POROS® 50HS (Persepcive Biosystems, Cambridge, MA) v rovnovážném stavu ve 20C mM MOPS, pH 7, 250 mM citrátu sodného. Sloupec se promyje 8 objemy 50 mM MOPS, 0,5 M NaCl, 5 mM fosfátu sodného, pH 7 a pak se provádí eluce při použití 10 objemů lineárního gradientu 0,5 až 1,5 M NaCl v tomtéž pufru. Jednotlivé frakce při promývání se oddělí najednou, kdežto při eluci se ««·· · · · 9 · · « « ····· · · • · ···· 9 9 9

9999 9999 99 99 99 999 odebírají frakce s objemem, rovným objemu sloupce. Jednotlivé frakce se analyzují metodou western blott a SDS-PAGE při detekci koloidní Coomassie. Frakce, obsahující převážně protein p55 se spojí.

Spojený materiál 50 HS byl analyzován na celkový obsah proteinu zkouškou BCA (Pierce). Na bázi celkového obsahu proteinu 168 mg byl připraven sloupec s obsahem keramického hydroxyapatitu HA typu II (Bio-Rad) tak, aby byl k dispozici vždy 1 ml pryskyřice na 2 mg proteinu. Tento sloupec měl vnitřní průměr 2,6 cm při délce

15,7 cm. Sloupec byl uveden do rovnovážného stavu v 50 mM MOPS, pH 7, 1,25 M NaCl, 5 mM fosfátu sodného. 770 ml spojených frakcí 50 HS bylo zfiltrováno filtrem s průměrem otvorů 0,22 mm a naneseno na sloupec HA při rychlosti průtoku 113 cm/h. Promývaci tekutina byla odebrána v jedné frakci. Sloupec byl promyt pěti objemy pufru pro dosažení rovnovážného stavu, pak byla provedena eluce 8 objemy lineárního gradientu 5 až 200 mM fosfátu sodného, pH 7 v 1,25 M NaCl. Frakce, odebírané v průběhu eluce, byly analyzovány metodou western bíot a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie. Frakce se srovnatelnou čistotou a obohacením proteinem LI, byly spojeny. Spojené frakce byly asepticky zfiltrovány přes membránu s průměrem otvorů 0,22 mm a pak uloženy při teplotě 4 °C.

Jednotlivé složky produktu i dalších materiálů byly analyzovány HPV 16 Li při použití specifické metody EIA a na protein metodou BCA. Výsledný čištěný produkt obsahoval 27 mg proteinu se specifickou aktivitou 1,00 mg Ll/mg proteinu. Elektronová mikroskopie potvrdila přítomnost neporušených částic VLP se středním průměrem nm. Pro stanoveni čistoty analýzou SDS-PAGE byl podíl výsledného produktu koncentrován vysrážením TCA a analyzován metodou western blot a SDS-PAGE při detekci koloidní Coomassie. Bylo provedeno kvantitativní stanovení Li při použití 2,5 mg materiálu, nečistoty, pocházející z kvasinek byly kvantitativně stanoveny při použití 20,0 mg materiálu. Bylo prokázáno, že protein LI je densitometricky homogenní z více než 94 %. Současné čištění LI a L2_mi_ni/E2 bylo provedeno specifickou imunoblotovou analýzou zpracovávaných frakcí.

Zastupuj e:

Claims

1. Způsob čištěni částic, podobných lidskému papillomavirů, VLP, vyznačující se tím, že se

a) uvede do styku částečně čišcěný lysát buněk s obsahem

VLP s prostředím s obsahem hydroxyapatitu v chromatografickém sloupci za podmínek, při nichž dochází k vazbě VLP na prostředí s obsahem hydroxyapatitu,

b) VLP, vázané ve sloupci, se vymývají roztokem s obsahem fosfátových aniontů a

c) vymyté VLP se izolují.·

2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c i se tím, že VLP jsou v podstatě cvořeny proteinem Ll.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že VLP jsou VLP lidského papillomavirů HPV.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se VLP volí ze skupiny HPV typ 6a, HPV typ 6b,

HPV typ 11, HPV typ 16, HPV 3.3 a HPV typ 45. ~yp 18, HPV typ 31, HPV typ 5 . Způsob podle nároku 4, v y z n a č u j ící s e t i m, že VLP po eluci mají čistotu alespoň 75 %. 6. Způsob podle nároku 4, v y z n a č u j ící s e t i m, že VLP po eluci mají čistotu alespoň 90 %.

»· ·· <· «4 ·· 9

9 9 9 9 · · · r · ·· • · · · ·♦* · · · • ······*·» » • 9 » » · » ··· ·♦·· M<4 ·· ·· «· «»·

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že VLP obsahují protein LI a L2 ve formě fúzního proteinu.

8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že L2 ve formě fúzního proteinu obsahuje část L2, která je kratší než její plná délka.

9. Způsob výroby čištěných VLP lidského papillomaviru, vhodných pro použití v lidské vakcíně, vyznačující se tím, že se

a) částečně čistí lysát buněk, přičemž buňkami lysátu jsou kvasinkové buňky, které byly transformovány pro expresi HPV Li VLP,

b) částečně čištěný lysát buněk s obsahem VLP se uvede do styku v prostředí s obsahem hydroxyapatitu v chromatografickém sloupci za podmínek, při nichž dochází k vazbě VLP na prostředí s obsahem hydroxyapatitu,

c) vázané VLP se vymývají roztokem s obsahem fosfátových aniontů a

d) vymyté VLP se izolují.