JPH02475A - Ｖｅｒｏ細胞、酵母細胞又はｌ細胞からの組換えエプスタイン−バールウイルス抗原の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９８４年７月２３日付で出願された米国特
許出願第６３３，５５８号と関連している。後者は１９
８４年１月３０日付で出願された米国特許出願第５７５
，３５２号の一部継続出願である１本出願は、１９８６
年２月２８日付で出願された米国特許出願第８３５．０
８８号、１９８５年５月６日付で出願された米国特許出
１［７３０，５３２号。

１９８６年７月１０日付で出願された米国特許出願第８
８４，１１４号及び　１９８６年２月２８日付で出願さ
れた米国特許出願第８３５．５０６号にも関連している
。

伝染性単球増加症の病原体は、ヘルペスウィルス群の一
種のエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）である、
この疾患は共面にＥＢＶ抗体価をもたないヒトで生じる
。ＥＢＶ特異性抗体は侵襲後半期に検出することができ
る。抗体価は回復期間中に低下するが、但し一生検出可
能なままであり、疾患に対する免疫と関係している。ウ
ィルスは伝染性単球増加症患者の口腔咽頭分泌液中に常
時存在し。

急性疾患接散か月間にもわたり存在することが多い。他
のヘルペス属ウィルスの場合も、潜在的キャリア状態が
一次ＥＢＶ感染後に続く。

疾患は、近接した接触を介して主に口内分泌物により広
がる。衛生設備及び衛生管理の乏しい地域において、−
次ＥＢＶ感染は通常幼時期に生じるが、診断するために
は沈黙的であるか又は軽微すぎる。高度社会経済群にお
いては、ＥＢＶとの一次接触は、感染が通常典型的伝染
性単球増加症につながる場合、思春期以後まで遅れてし
まうことがよくある。

ＥＢＶがリンパ球を速分割性細胞に形質転換させてしま
うという事実は、それが腫瘍形成性であることを示して
いる。ＥＢＶがパーキット（Ｂ　ｕｒｋｉｔｔ）　リン
パ腫及び鼻咽頭癌の病因に関与しているという強い証拠
がある。

ワクチンによるＥＢＶ感染の防止は、ウィルス脂質エン
ベロープ及びウィルス感染細胞の外表面上に存在するＥ
ＢＶ抗原での免疫処理によって行うことができる。３５
０，２２０及び８５　Ｋ　Ｄ　ａ移動度の糖タンパク質
（ｇｐ３５０、ｇｐ２２０．ｇｐ８５）はこれらの位置
で確認された。ｇｐ３５０及びｇｐ２２０による霊長動
物の免疫で、ウィルス侵襲による感染を防止することが
できる。ｇｐ３５０及びｇｐ２２０が免疫グロブリン産
生リンパ球の表面へのＥＢＶの特異的吸着に関与してい
ることについて、公表された証拠もある。

最後に、ｇｐ３５０又はｇｐ２２０に対して特異的なモ
ノクローナル又はポリクローナル源の抗体はウィルス感
染を中和することが知られている。これらすべての証拠
が、ＥＢＶ感染のコントロール及び予防に関し、ｇｐ３
５０又はｇｐ２２０の免疫学的認識を特に意味している
。

２種の主なエプスタイン−バール膜抗原、ｇｐ３５０及
びｇｐ２２０は、同一のＥＢＶＤＮＡオープン読取り枠
でコードされている。

ｇｐ３５０は連続的オープン読取り枠でコードされてい
るが、一方ｇｐ２２０はその同−枠の２つのエキソンで
コードされている０ｇｐ３５０及びｇｐ２２０間のこの
密接な関係は、モノクローナル抗体がｇρ３５０及びｇ
ｐ２２０双方としばしば反応するという免疫学的証拠と
一致している。

これらのヌクレオチド配列から、これらのタンパク質に
関するいくつかの重要な特徴が導かれる。即ち、ｇｐ３
５０の一次翻訳産物はアミノ酸９０７個であって、一方
ｇｐ２２０の場合はアミノ酸７１０個である。更に、ｇ
ｐ３５０の８５０アミノ酸領域及びｇρ２２０の６５３
アミノ酸領域は、推定シグナル及びアンカー配列間に存
在している。これらの中心領域はセリン及びスレオニン
に富み、３６個（ｇｐ３５０）又は２５個（ｇｐ２２０
）のアスパラギン−Ｘ−セリン又は−Ｘ−スレオニン配
列を有しているが、これはＮ−結合グリコジル化のため
のシグナルでもある。グリコジル化部位を有するそれら
の領域は、膜外表面上に存在しているらしい。

ｇｐ３５０及びｇｐ２２０の双方は、各糖タンパク質が
実質的に異常な電気泳動移動度を有していることから、
大規模にグリコジル化されていることが知られている。

タンパク質コアは、大きさ約３５０及び２２０ＫＤａの
完全グリコジル化糖タンパク質の半分以下を占めるにす
ぎない−ｇｐ３５０はＮ結合及びＯ結合グリコジル側鎖
の双方で大規模に修正されているが、その理由は複合及
び高マンノースＮ結合糖を除去するためのＮ−グリカナ
ーゼでの処理により大きさ約２３０ＫＤａとなり、一方
完全末グリコシル化ｇｐ３５０前駆体のおよその大きさ
は１３５ＫＤａだからである。

ｇｐａ５０及びｇｐ２２０の異常に大規模なグリコジル
化は、それらの構造、免疫原性及び疾患耐性に関するそ
れらの役割について明らかに影響を与えている。ｇｐ３
５０ＤＮＡ配列が大腸菌中で発現されかつそこから精製
された場合、抗体応答はＥＢＶを中和したウサギ体内で
誘導される。しかしながら、実質的量のタンパク質の多
数回注射がこの応答を引出すために必要とされたが、こ
のことはグリコジル化の非存在に起因して免疫原性に乏
しいことを示している。

本出願人らは１組換え真核細胞中におけるｇｐ３５０Ｄ
ＮＡ配列の発現でグリコジル化産物（ｒＥＢＭＡ）が得
られ、これがフロインドアジュバントで３回ウサギに注
射された場合に、対応抗原及びＢ９５−８リンパ球から
得られる天然弁組換え抗原と反応する抗体を誘導するこ
とを明らかにした。すべてのウサギは、間接免疫蛍光法
で検出されるようなＥＢＶ陽性リンパ球表面と反応する
抗体も産生じた。しかも、すべての哺乳動物細胞由来発
現産物がインビトロでエプスタイン−バールウィルスを
中和する抗体を誘導した。

本発明は、適切なワクチンを製造する目的で組換え真核
細胞により発現されたｇｐ３５０又はｇｐ２２０を精製
する方法に関する。例えばＢ９５−８細胞のような感染
リンパ球からワクチンを製造することは、非商業的かつ
非実用的である０組換え真核細胞系は、ＥＢＶによる疾
患状態時における天然又は自然型と最もよく似た構造的
及び免疫学的特徴をもつｇｐ３５０又はｇｐ２２０を発
現するために最も適したビヒクルである。ｇｐ３５０又
はｇｐ２２０のような大規模グリコジル化抗原を含むワ
クチンは９本発明の精製方法が行われる場合により有効
である。本発明は、免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーがなくかつ例えば尿素もしくはＳＤＳによる変性条
件のないｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ精製方法である。

Ｋｐ３５０又はｇｐ２２０を発現する哺乳動物又は酵母
細胞は破壊され、細胞破壊物は１段階以上のレクチンア
フィニティークロマトグラフィーの後、アニオン交換も
しくはゲル濾過グロマトグラフィーに付される。ゲルー
過のような追加段階も場合により必要とされる。各方法
は、用いられる細胞のタイプに応じて個別的に適合化さ
れている。

本発明は、商業的に産生されるワクチンに適した抗原を
大量に産生しうるようスケールアップすることができる
。抗原が精製されたならば、それはワクチンを製造する
ために、様々な免疫化学試験を行うために、あるいはＥ
ＢＶに対する抗体の診断試験法を確立するために使用す
ることができる。本発明の有用性、価値及び実施可能性
は、以前にポリオワクチン産生に用いられた細胞系であ
るトランスフェクトＶｓｒｏ細胞からのｒＥＢＭＡ精製
によって具体的に説明される。形質転換酵母細胞及びト
ランスフェクトマウスＬ細胞に関しても具体的に説明さ
れる。

グリコジル化組換えタンパク質の精製には新規方法又は
従来方法の新規組合せを時々必要とするが、その理由は
例えばトランスフェクト哺乳動物細胞のような組換え体
用供給源の組成物が従来の供給源とは異なっているため
である。タンパク質は細胞にとって外来性であるばかり
でなく、タンパク質は異なる方法でグリコジル化される
。古典的な又は古典的でない慣用的な供給源からタンパ
ク質を単離するために有用な方法の知識及びノウハウに
基づき組換え細胞培養物又は組換え哺乳動物もしくは酵
母発現系からタンパク質を単離しようとする場合、どの
ような方法が有用かを予測することはできない、しかも
、タンパク質のグリコジル化に関する多様性は種１組織
又は細胞系に特異的な差異と相関関係がある［コーンフ
ェルト、アールら、アニュアル・レビューズ・オブ・バ
イオケミストリー、第５４巻、第６３１頁、１９８５年
（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、　Ｒ。

ｅｔａｌ。Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ。

５４、６３１　（１９８５）　）　］、ワクチン製造用
に考えられた精製方法では生成物に関して極度に高い純
度を必要としており、当業界においてもう一つの予測不
可能性を示している。同様の見解について、米国特許第
４，６２４，９１８号明細書を参照せよ。

組換え哺乳動物発現系から組換えＥＢＶＩＰｉ抗原を精
製するための方法が開示されているが、この方法は： （ａ）組換えＥＢＶ膜抗原発現Ｖ　Ｅ　Ｒ○細胞を破壊
し； （ｂ）破壊物を１又は２段階のレクチンアフィニティー
クロマトグラフィーに付し て、ＥＢＶＩＩＩ抗原含有溶出画分を得；（ｃ）上記溶
出画分をゲル濾過クロマトグラフィーに付して、精製さ
れた組換えＥ ＢＶ膜抗原を得る； 工程からなる６本方法で付加工程が必要とされることも
ある６本方法は、ワクチンの商業的製造に際してスケー
ルアップ用に考えられている。

第二の方法が開示されており、組換え酵母発現系から分
泌された組換えＥＢＶ膜抗原を精製するために適してい
るが、この方法は：（ａ）ｒＥＢＭＡ分泌酵母細胞と接
触せしめられた培地を集め透析して、ｒＥＢＭ Ａ含有貯留液を得； （ｂ）上記貯留液を１又は２段階のレクチンアフィニテ
ィークロマトグラフィーに 付して、ｒＥＢＭＡ含有溶出画分を得；（ｃ）上記溶出
画分をアニオン交換クロマトグラフィーに付して、精製
された酵母 由来ｒＥＢＭＡを得る； 工程からなる０本方法で付加工程が必要とされることも
ある。この第二プロセスは、ワクチンの商業的製造に際
してスケールアップ用に考えられている。

第三の方法が開示されており、組換え哺乳動物発現系か
ら組換えＥＢＶ膜抗原を精製するために適しているが、
この方法は＝ （ａ）組換えＥＢＶ膜抗原発現マウスＬ細胞を破壊し； （ｂ）破壊物を１又は２段階のレクチンアフィニティー
クロマトグラフィーに付し て、ＥＢＶ膜抗原含有溶出画分を得； （ｃ）上記溶出画分をアニオン交換クロマトグラフィー
に付して１組換えＥＢＶ膜 抗原含有溶出画分を得； （ｄ）上記溶出画分をゲル濾過クロマトグラフィーに付
して、精製された組換えＥ ＢＶ膜抗［（ｒＥＢＭＡ）を得る； 工程からなる。本方法では付加工程が必要とされること
もある。この第三方法は、ワクチンの商業的製造に際し
てスケールアップ用に考えられている。

夷号又丈定且 ＣＨＡＰＳ　：　３−［（３−クロラミドブロビル）ジ
メチルアンモニオ］−１ 一プロパンスルホネート Δ　　　　：デルタ ＥＡ　　　　、初期抗原 ＥＢＭＡ　　：ウィルスエンベロープ又はＥＢＶ感染細
胞の外部表面上に存在 するＥＢＶ抗原をはじめとする、 あらゆる供給源からのエプスタ イン−パールウィルス膜抗原 ＥＢＮＡ　　：ＥＢＶ核抗原 ＥＢＶ　　　：エプスタインーパールウイルスＩＲＩ　
　　：内部反復ｌ ｌＲ５：内部反復配列 ｇｐ３５０　：　ｇｐ３００／３５０としても知られる
。みかけの電気泳動移動 度３５０キロドルトンのＥＢＭ Ａ又はｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ ｇ　ｐ　２００　／　２５０としても知られる。みかけ
の電気泳動移動 度２２０キロドルトンのＥＢＭ Ａ又はｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ ：糖タンパク質 ：キロドルトン 二キロ塩基対 ：リーダー ：プロモーター ｇｐ２２０： 　ｐ Ｄａ ｂｐ 組換えＥＢＶ：ベクター又はそれから誘導される配列で
コードされるＥＢＶ （ベクターは組換えＤＮＡ技術 により組立てられている） 組換え真核発現系：外来タンパク質又は外来オリゴペプ
チドを発現する外来 ＤＮＡを含んだ真核細胞 ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ　：外来ＤＮＡでコードされかつ組
換え真核発現系中で発現される 組換えエプスタイン−バールウ ィルス膜抗原又は抗原類（又は その部分） 組換えタンパク貿：例えばＶｅｒｏ細胞又は酵母細胞中
のｒＥＢＭＡのよう な、組換え真核発現系中で外来 ＤＮＡにより発現されるポリペ プチド又はオリゴペプチド ５ＯＳ−ＰＡＧＥ　ニドデシル硫酸ナトリウム含有ゲル
中でのポリアクリルア ミドゲル電気泳動 ＴＲ３：末端反復配列 ＵＬ　　：非反復長鎖配列 ＵＳ　　：非反復短鎖配列 ＶＣＡ　　：ウイルスキャプシド抗原 ＶＺＶ　　：水痘・帯状ヘルペスウィルス組換え真核発
現系から組換えＥＢＭＡｇｐ３５０又はｇｐ２２０を精
製するための方法が考案された。各方法の詳細は、抗原
供給源としての細胞系又は発現系に応じて変動する。

一般に、ｇｐ３５０又はｇｐ２２０抗原単離物はレクチ
ンアフィニティークロマトグラフィーによって抽出物か
ら得られた１例えばα−メチルマンノシドのような適切
なリガンドで溶出後、アニオン交換もしくはゲル濾過ク
ロマトグラフィー又は双方が行われる。適切な塩濃度で
溶出した物質は、純度約９０％以上であった。具体的プ
ロトコールは、用いられる具体的発現系に応じて適合化
せしめられる。

本発明の新規装造方法は様々な発現組換え１！：　１３
　Ｍ　Ａ　、特にｇｐ３５０及びｇｐ２２０に適用可能
であることが理解される。本発明の方法は、ｇｐ３５０
又はｇｐ２２０の変異体を含むワクチンの迅速かつ効果
的製造方法を堤供するためにも考えられている０例えば
。

アミノ酸配列［テーラ−、ダブル・アール。

ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１
８８巻、第２３３頁、１９８６年（”ｌ’ａｙｌｏｒ、
　Ｗ、Ｒ，＋　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ、　１８８．２３３　（１９８６）
　）の第１表で記載されている］の保存的置換えによっ
ても、本発明の原理及び実施に関して通常いかなる実質
的又は新たな変更にならない。

一方、コード領域内の削除には１本明細書で記載されて
いるワクチン製造方法においていかなる修正も通常必要
としないであろう。本出願のｒＥＩ３ＭＡ、ｇｐ３５０
又はｇｐ２２０としては、各々保存的アミノ酸置換え、
削除又は他の方法によるいずれのバリエーション又はア
ミノ酸配列部分も含んでいると解されるが、但し得られ
るｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ又はその部分は　えｐ　３５０　
＋　ｇ　ｐ　２２０　ｒエプスタイン−パールウィルス
、又はエプスタイン−バール膜抗原アミノ酸配列の他の
天然及び自然型に対して特異的な抗体と免疫化学的に反
応するものでなければならない。

Ａ五見里五 外来遺伝子を発現する真核細胞を産生ずることは、現在
比較的直接的な技術である。このような真核細胞はホス
トとして機能し、それには酵母、菌類、植物細胞及び動
物細胞が含まれる。多数のこれらホスト細胞用の発現ベ
クターは、単離されて特徴付けられているが、重要な外
来ＤＮＡインサートをもつベクターの慣用的組換えＤＮ
Ａ技術による組立てに際して出発物質として用いられる
。ＤＮＡインサートを発現させるために用いられるホス
ト細胞種から自然には誘導されないならば。

いかなるＤＮＡも外来である。外来ＤＮＡインサートは
染１色体外プラスミド上で又はホスト細胞染色体中への
全部もしくは一部の組込み後に発現せしめられるか、あ
るいは２以上の分子体の組合せとしてホスト細胞中に実
際上存在している。所望外来ＤＮＡ発現用のホスト細胞
及び発現ベクターの選択は、ホスト細胞の利用可能性及
びその培養条件の面倒さ、ホスト細胞が発現ベクターの
複製をサポートしているか否か、並びに所望組換えタン
パク貿のより簡単な精製方法を得る目的の構造遺伝子イ
ンサート上における分泌配列のスプライシングのように
当業者にとって容易に明らかとなる他のファクターに非
常に依存している。

組換え真核発現系の１種である酵母発現系には、組換え
タンパク質発現用の選択種として通常サツカロミセス・
セレビシアエ（Ｓａ−ｃｃｈａｒｏＩｌｙｃａｓ　ｃｅ
ｒａｖｉｓｉａｅ）を用いる。しかしながら、ｒＥＢＭ
Ａ発現用のホスト株又は細胞の選択　格別限定されない
がビチア（ＰＬ−ｃｈｘａ）　ｒカンジダ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ　）　、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、　　
トルロプシス（Ｔ　ｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）　ｒクルイベ
ロミセス（Ｋ　１ｕｙｖｅｒｏＩｌｙｃｅｓ）及びサツ
カロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｏｐｓｉｓ
）を含むサツカロミセタセアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ＋１
ｙｃｅｔａｃｅａｅ）及びクリプトコッカセアエ（Ｃｒ
ｙｐｔｏｃｏｅｃａｃｅａｅ）科の他の酵母属の種まで
拡張されることは、当業者にとって明らかである。同様
に、ホスト株又は細胞の選択は、サツカロミセス属の他
の種まで拡張される。この属の多くの種はＳ、セレビシ
アエと雑種形成することができ、格別限定されないが０
ＡＬＩＯ，ＡＤＨ２及び／又は　α交配因子プロモータ
ーを含むＳ。

セレビシアエ中のプロモーターと類似又は同一のプロモ
ーターを有しているようである。

したがって、組換えＥＢＶポリペプチド発現のホスト株
の選択は格別限定されないが力−ルスバーゲンシス（ｃ
ａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）　、ウバルム（ｕｖａｒ
ｕｍ）　＋　ロウキシイ　（ｒｏｕｘｉｉ）　＋　モン
タヌス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）　、クルイベリ　（ｋｌｕ
ｙｖｅｒｉ）　＋エロンギスボルス（ｅｌｏｎｇｉｓｐ
ｏｒｕｓ）　、ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）　
！　オビホルミス（ｏｖｉｆｏｒＩＩｌｉｓ）及びジア
スタチクス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）を含むサツカロ
ミセス属の他の種まで拡張されることは、当業者にとっ
て明らかであろう。

ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ発現用の組換え酵母発現系を作出す
るために有用な酵母ベクターとしては、格別限定されな
いが、シャトルベクター、コスミドプラスミド、キメラ
プラスミド、及び２ミクロン環状プラスミドから得られ
る配列をもつものがある。様々なプロモーター及び他の
酵母転写コントロール配列は、ＧＡＬｌＯ。

Ａ　Ｄ　ＨＩもしくはΔＤＨ■及びα交配因子をはじめ
として、ＥＢＭＡについてコードする挿入ＤＮＡ配列を
発現させるために用いられる。下記酵母ベクターのリス
トは１例示のみをｌ」的とする。

ｐ　Ａ　Ａ　Ｈ５ ｐ　Ａ　Ｉ（５ ｐ　Ａ　Ａ　Ｒ６ ＦＲＰｎ ｐＧＡＬ　　１０−ＭＦ　α　１ ｐＪｃ１９７ ρＭＡ５６ ＰＡＢＡＤＥ８ ＰＡＸα　１１ ＡＨ９ ｐ　Ａ　ＨＩ　Ｏ ｐ　Ａ　Ｈ２１ ＰＭＡ（：５６１ ＬＧ６６９ ＭＡ９Ｌ ＭＡ３０１ ＹＥＨＢｓ ｐＡＭ８２゜ ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａについてコードする適切なりＮＡ配
列又はその部分のこれらのベクター中への挿入によって
、修正ベクターが形質転換又は他の手段で適切なホスト
細胞中に導入された有用なｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ用組換え
酵母発現系が原則として得られる。酵母組換えＥＢＭＡ
がグリコジル化されているため、レクチンアフィニティ
ークロマトグラフィーは発現タンパク質の商業的精製用
に適した方法である。

組換え哺乳動物発現系は、本発明の組換えエプスタイン
−パールウィルス膜抗原を産生ずるもう１つの手段であ
る。一般に、ホスト咄乳動物細胞は細胞培養中に能率よ
く複製されるのであればいかなる細胞であってもよい。

１１＋ｔｉ乳動物細胞用発現ベクターはｎｅｏ遺伝子中
においである抗生物質に対する耐性のような選択可能マ
ーカーを有しているべきであり。

その結果細胞中のベクターの存在が検出可能となる。細
胞のＤＮＡ媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン（ｔｒａｎｓ　ｖ　ａｃｔｉｏｎ）又は形質転換は
５例えばリン酸カルシウム技術又は微鼠注射によって行
うことができる。

組換え哺乳動物発現系作出のために用いられるホスト補
乳動物細胞としては格別限定されないが、Ｖｅｒｏ細胞
、ＮＩＨ３Ｔ３．ＧＨ３，ＣＯ３，ネズミＣ１２７又は
マウスＬ細胞がある。哺乳動物用発現ベクターは、ウィ
ルスベクター、ＳＶ４０．ＢＰＶもしくは他のウィルス
レプリコンをもつプラスミドベクター、又は動物細胞用
レプリコンのないベクターを基本としている。　Ｉ’＋
ｔｆ乳動物発現ベクターに関する詳細な説明は、エルダ
ー、ジエイ・チーら、アニュアル・レビュース・オブ・
ゲネティクス、第１５巻、第２９５頁、　１９８１年［
Ｅｌｄｅｒ、　Ｊ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎｕ
ａｌ　Ｒｅｖｉａｔ＋＋ｓｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　
１５．２９５　（１９８１）　］；グルッマン、ワイ（
Ｇｌｕｚｍａｎ、　　Ｙ）　（編集）。

″真核ウィルスベクター、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　　１９８２年；ポ
ーウェルズ、ビー・エッチ（Ｐｏｕｗｅｌｓ、　）’、
　Ｈ，）　　ら。

“クローニングベクター：実験マニュアル″エルスピア
−（Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ）、　１９８５年；　リグビー
、Ｐ、Ｗ、Ｊ、ジャーナル・オブ・ゼネラル・パイロロ
ジー、第６４巻、第２５５頁、１９８３年［Ｒｉｇｂｙ
、　Ｐ、Ｖ、Ｊ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＧｅｎｅｒａ
ｌ　Ｖｉｒｏｌｏｌ（ｙ、　６４　、２５５　（１９８
３）］　：スブラマニ、ニスら、アナライティカル・バ
イオケミストリー、第１３５巻、第　１　頁。

１９８３年［Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ
、、＾ｎａｌｙ−ｔｉｃａＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　１３５　、　ｌ　（１９８３）　］に記載されて
いる。

ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａの精製 精製操作中におけるｒＥＢＭＡの不安定化及び分解に対
抗するため、緩衝液は通常フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）又はＥ　Ｄ　’ｒ　Ａのようなプ
ロテアーゼ阻害剤を含有している。好ましい阻害剤は最
終濃度約２ｍＭのＰ　Ｍ　Ｓ　Ｆである。

本発明の操作及びプロトコールに適した代表的プロテア
ーゼ阻害剤としては、格別限定されないが、金属キレー
ト他剤１重金属イオン、５）−ｆ阻害試薬、プロテアー
ゼの基質様化合物又はプロテアーゼを阻害するポリペプ
チドがある。一部の有用なプロテアーゼ阻害剤が以下に
示されている： Ａｇ”、ＨＦ、＋＋、Ｃｕ”及び他の重金属イオアンチ
トロンビン■ アンチトロンビン■−ヘパリン α、−アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Ｎａ−フルオリ上４−ブロモフ
ェナシルプロミド 鶏卵白トリプシン阻害剤 キモスタチン シトレート システィン ４−ジニトロフェノールジエチルホスフェート ＤＦＰ　（ジイソプロピルホスホフルオリデート） ＤＴＴ　（ジチオスレイトール） Ｅ−６４［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ−ｒｉ
ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｌｌ）］１’：　Ｄ　Ｔ　Ａ
及び他のキレート他剤ホルムアルデヒド 塩化グアニジニウム ヘパリン ヒルジン ４−ヒドロキシメルクリベンゾエート ヨードアセトアミド ヨード酢酸 ロイペプチン α２−マクログロブリン メルカプトエタノール ｐ−メルクリベンゾエート 塩化第二水銀 α−ミクログロブリン α−Ｎ−（ｐ−二トロペンジルオキシ力ルボニル）−Ｌ
−アルギニルクロロメチルケトン オキサレート ストレプトミセスを含む様々な供給源からのペプスタチ
ン １．１０−フェナントロリン ２−フェナントロリン フェノチアジン−Ｎ−カルボニルクロリドホスホラミト
ン ＭＳ　Ｆ ピロホスフェート ＳＨ阻害試薬 硝酸銀 大豆トリプシン阻害剤 Ｐ−トルエンスルホニルフルオリド ＴＬＣＫ　（Ｌ−１−クロロ−（４−トシルアミド）−
７−アミノ−２−へブタノン塩酸塩） トリトンＸ−１００及び低濃度での他の界面活性剤 ＴＰＣＫ（Ｌ−１−クロロ−３−（４−トシルアミド）
−４−フェニル−２−ブタノン）鶏卵からのトリプシン
阻害剤 ＺＰＣＫ　（ベンジルオキシカルボニル−−フェニルア
ラニン） １種以上の上記阻害剤を含有する緩衝液は、ｒＥＢＭＡ
Ｍ製過程の１以上の工程で適用することができる。

レクチンアフィニティークロマトグラフィー筋勿剪亙亙
聚 Ａ．　酵母中の非分泌ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａは、下記のよ
うにして単離することができる。第５図参照。

ｇｐ３５０／２２０タンパク質についてコードする発現
ベクターで形質転換されかつそれを発現する酵母細胞又
はその変異体は増殖せしめられて回収される。細胞保存
が望まれる場合には、細胞は次いで細胞ペーストを形成
させるためにＰＢＳのような緩衝液で洗浄される．細胞
ペーストの保存は，典型的には液体窒素で凍結させるこ
とにより行われる。

精製は典型的には次のようにして開始される．凍結細胞
ペーストのバッチが解凍され、２ｍＭ　　Ｐ　Ｍ　Ｓ　
Ｆ中ＰＢＳ（７）ようなタンパク質分解阻害剤含有緩衝
液又は高張リン酸緩衝液に懸濁される０次いで、細胞は
好ましくは機械的手段によって破壊される。

酵母細胞破壊により、粗抽出物が得られる。

この時点で抽出物中の細胞残層を除くことが必要であり
、その結果法の精製工程において機械的障害が回避され
る１例えば４４００ｘｇで５分間又は他の様々な速度及
び時間の遠心分離が好ましい残層除去方法である。

上澄をレクチンアフィニティーカラムに付す前に、濃縮
し、しかる後透析ヂ過又は透析することが望ましい、一
方又は更に、アニオン交換クロマトグラフィー又は密度
勾配遠心分離が行われる。

Ｂ、　酵母中で分泌されたｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａの初期精
製は、下記操作により行われる。第５図参照。

ｇｐ３５０又はｇｐ２２０タンパク質についてコードす
る発現ベクターで形質転換されかつそれを発現する酵母
細胞又はその変異体は増殖せしめられて回収される。培
地中に放出された分泌タンパク質は、最初に例えば遠心
分離で酵母細胞を除去することによって処理される。濃
縮、透析デ過又は透析の付加的又は別の工程が、レクチ
ンアフィニティーカラム適用前に行われてもよい。

Ｃ、ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ発現咄乳動物細胞の場合には（
第５図）、格別限定されないが、凍結及び解凍、高ｐ　
Ｈ接触、カオトロピズム剤による処理又は界面活性剤に
よる抽出をはじめとする様々な操作のうちいずれか１つ
で細胞が破壊される。好ましい破壊技術は界面活性剤を
用いることであり、Ｉ＆も好ましくは最終１度約０．５
〜約２％（Ｗ／Ｖ）でオクチルフェノキシポリエトキシ
エタノール（商標名トＩＪトンＸ−１００（ＴＲＩＴＯ
Ｎ　Ｘ−１００）として市販）を用いる。

哺乳動物細胞の破壊後、細胞残層は通常遠心分離で除去
され、清澄化された上澄はレクチンアフィニティークロ
マトグラフィーにそのまま適用することができる。一方
、濃縮、透析濾過又は透析の付加工程が、サンプルをレ
クチンアフィニティーカラムに通す前に清澄化上澄で行
われてもよい。

レクチンアフィニティークロマトグラフイネ溶性レクチ
ンのアフィニティークロマトグラフィーは、ピーナツ、
トウゴマ実、麦芽、ナタマメ、ヒラマメ及び庭エントウ
由来のレクチンをはじめとする様々なレクチンを用いて
行われる。原理的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、マ
ンノース、ガラクトース又はシアル酸に特異的なレクチ
ンのように、グリコジル化ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａの糖残基
に対して特異性をもつものであれば、いかなるレクチン
も使用可能である。好ましいレクチンとしてはα−Ｄ−
マンノースを結合しているコンカナバリンＡ及びヒラマ
メレクチンがあるが、最も好ましくはヒラマメレクチン
である。一方、これらの及び他のレクチンも、望ましく
ない結合糖タンパク質の除去目的で使用可能である。

不溶性レクチンによるアフィニティークロマトグラフィ
ー技術は、クリスチャンセン、テ、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー、第３４巻、第３３１頁、１９７４年［
Ｋｒｉｇｔｉａｎｓｅｎ。

Ｔ、、　阿ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　　　３　４　　、　３　３　１（１９７４）］
に従い行われる。ヒラマメレクチンの他の同相レクチン
吸着剤による代用も。

グロマトグラフィー用に利用可能な様々なレクチンがあ
ることから、容易に明らかとなるであろう。例えば、シ
ャロン、エヌら、サイエンス、第１７７巻、第９４９頁
、１９７２年［５ｈａｒｏｎ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、
　５ｃｉｅｎｃｅ　１７７　。

９４９（１９７２）］　、　　リス、エッチ（Ｌ　ｉｓ
。

Ｈ，）ら、アニュアル・レビュース・オブ・バイオケミ
ストリー、第４２巻、第５４１頁。

１９７３年及びリス、エッチら、アニュアル・レビュー
ス・オブ・バイオケミストリー、第５５巻、第３５頁、
１９８６年参照。

アニオン交換グロマトグラフィー 大半の場合、レクチンアフィニティークロマトグラフィ
ー後に少なくとも１段階のアニオン交換クロマトグラフ
ィーを行うことが望ましい、典型的には、同相レクチン
に結合した糖タンパク質の両分かりガント競合又は変性
剤のいずれかによって溶出せしめられ、正電荷を帯びた
樹脂、ゲル又はマトリックスのイオン交換クロマトグラ
フィーに付される。

代表的アニオン交換マトリックスとしては格別限定され
ず、下記のものがある： ＤＥＡＥセルロース ＤＥＡＥアガロース ＤＥＡＥバイオゲル ＤＥＡＥデキストラン ＤＥＡＥセファデックス アミノへキシルセファ０−ス ＥＣＴＥＯＬＡセルロース ＴＥＡＥセルロース ＱＡＥセルロース ＭＯＮＯ−Ｑ又は ベンゾイル化ジエチルアミノエチルセルロース 好ましいアニオン交換剤は商標名ＭＯＮＯ−Ｑ［ファル
マシア（Ｐ　ｈａｒａ＋ａｃｉａ　）　］として市販さ
れている。イオン交換クロマトグラフィーについての一
般的背景情報は、たとえばワーク、チー・ニス（Ｗｏｒ
ｋ、　Ｔ　、　Ｓ　、　）　ら。

ラボラトリ−・テクニクス・イン・バイオケミストリー
・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、第２巻、第■部、第２２３頁以降、ノース
・ホランド（Ｎｏｒｔｈ−１１ｏ１１ａｎｄ）、　１９
７０年中の、イー薯ニーｅピーターソン（Ｅ　、　Ａ　
、　Ｐ　ｅｔｅｒｓｏｎ）。

″セルローシック・イオン・エクスチェンジャーズ（Ｃ
ｅｌｌｕｌｏｓｉｃ　Ｉｏｎ　Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ）
”に見い出すことができる。

アニオン交換クロマトグラフィーは、ｒＥＢＭＡＭ製過
程のいずれの時点でも付加工程として加えることができ
る５Ｖｅｒｏ細胞中で発現されるｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａの
精製の場合には。

それは不必要であることが判明した。

ゲル・　゛　クロマトグラフィー レクチンアフィニティークロマトグラフィー後、又はア
ニオン交換クロマトグラフィー後においては、満足すべ
き純度のｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ産物が単離される前に、ゲ
ル濾過工程が通常必要である。様々なタイプのゲル濾過
マトリックスが使用可能である０例えば、ワーク、チー
・ニスら、ラボラトリ−・テクニクス・イン・バイオケ
ミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー中の
、フィッシャー、エル、　（Ｆ　１ｓｃｈｅｒ、　Ｌ、
）、　　“ゲル・フィルトレージョン・クロマトグラフ
ィー（Ｇ　ｅｌ　Ｆ　１ｌｔｒａ−ｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）”　、エルセヴイア（Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ）、　　１９８０年、参照、一部の組換え酵母
発現系の場合には、ゲルナ過は不必要であることが判明
した。

最初にレクチンアフィニティーしかる後二番ｌ」にアニ
オン交換及びゲル濾過の一方もしくは双方を行うという
クロマトグラフィー工程の特定の順序が本発明のｒ　Ｅ
　Ｂ　Ｍ　Ａ精製用の代表的プロトコールであるけれど
も、順序は変更可能であることが理解されるであろう。

更に、アニオン交換クロマトグラフィーはレクチンアフ
ィニティークロマトグラフィーの先であってもよい。

仕皿工抗 組換えタンパク質の精製に通常用いられる他の慣用的又
は公知の工程も、ｒＥＢＭＡ精製過程に加えることがで
きる。これらの工程としては格別限定されないが、下記
のものがある： （ａ）例えばシリカゲル、リン酸カルシウム、活性炭又
はセライトアルミナのような固相上における選択的吸着
又は分配； （ｂ）例えばブチルアガロースでの疎水性相互作用クロ
マトグラフィー； （ｃ）溶媒又は試薬による選択的抽出。例えば可溶化の
ような他の目的による他の溶媒又は試薬での抽出も別の
工程では必要かもしれない６例えば、ヘルメランド、エ
ル・エム（１４ｊｅＬｍｅｌａｎｄ、　Ｌ、　Ｍ、）ら
、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１０４巻、第
３０５頁、１９８４年参照。

（ｄ）硫酸アンモニウムのような塩による又はｐＨ勾配
上の等電沈殿による沈殿も含まれる； （ｅ）ペーパー、薄層、ゲル、モレキュラーシーブ、分
子排除、カチオン交換、リガンドアフィニティー、免疫
アフィニティー又は電気泳動をはじめとするいずれかの
標準的方法によるクロマトグラフィー； （ｆ）例えばＰＥＧ及びデキストランでの２相抽出によ
る溶媒分別［アンダーソン、イーら、　アンルズ・オブ
・ザ・ニューヨーク。

アカデミ−・オブ・サイエンス、第４１３巻、第１１５
頁、１９８３年（Ａｎｄｓｒｓｏｎ、　Ｅ、　ｅｔａｌ
、、　Ａｎｎａｌａｓ　ｏｆ　ｔｈａ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　Ａｅａｄｅ＋＊ｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ、　４１３
　、１１５　（１９８３）　）　］。

（Ｋ）透析、限外濾過又は透析す過； （ｈ）密度勾配遠心分離； （ｉ）等重点電気泳動； （ａｊ）凍結乾燥；又は （ｋ）結晶化 このリストは網羅的なものではない、この順序は好まし
い精製順序を示すものでもない。

好結果を与えるｒＥＢＭＡ精製はレクチンアフィニティ
ークロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー
と組合せて工程（ａ）〜（ｋ）のいずれか又は全部と共
に行いうろことが理解されるであろう。工程（ａ）〜（
ｋ）及び他の精製技術は、精製過程のいずれかの段階で
付加工程として加えることができる。

すべてのケースにおいて、ＥＢＭＡ、ｒＥＢＭＡ又は他
のタンパク質の確認及び純度の評価は、０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウムでのポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＯ８−ＰＡＧＥ）Ｌかる後銀染色及びタンパク質免
疫プロッティングにより行われた６分析用サンプルをミ
クロコンセントレータ−で約１０分の１に濃縮した。そ
の同一の２つのアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を４％ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ６，８の０．２
５ＭトリスＨＣＱ及び０．２０Ｍジチオスレイトール含
有の同量の緩衝液と混合し、１００℃で１５分間インキ
ュベートした。免疫プロット分析のために［バーネット
、ダブル・エヌ、アナライティカル・バイオケミストリ
ー、第１１２巻、第１９２頁、１９８１年（Ｂｕｒｎｅ
ｔｔｅ、　！７゜Ｎ、、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１１２　、　ｌ　９２（１９
ｓ　ｔ））］　、サンプルを７．５％ポリアクリルアミ
ド分離用ゲルで電気泳動に付し［レムリ、ニーら、ネー
チャー、第２２７巻、第６８０頁、１９７０年（Ｌａｅ
ａ＋ｍｌｉ、　Ｕ、　ａｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０　（１９７０））］　
、ニトロセルロースに移し、高力価ＥＢＶ免疫ヒト血清
又は大腸菌中で発現されるｇｐ３５０ポリペプチドに対
するマウスモノクローナル抗体及びウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体［カッペル（Ｃａｐｐｅｌ）　］と共にインキュ
ベートした。プロットを１２５１−タンパク質Ａ［アマ
−ジャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）　］で展開した。すべて
のインキュベーション及び洗浄はＢＬＯＴＴＯと名付け
られた溶液［ジョンソン、デーら、ジーン・アナライテ
ィカル・テクノロジー、第１巻、第３頁、１９８４年（
Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ＾ｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１　、３　
（１’Ｊ　８４　））；１０％Ｗ／Ｖ　無脂肪ドライミ
ルク、０，９％Ｗ／Ｖ　ＮａＣＱ、ｐＨ７，５の１０ｍ
Ｍトリス］中で行なった。ポリアクリルアミドゲルの銀
染色は、モリセー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）の方法［アナ
ライティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙ−ｔｉ
ｃａｌ　１３ｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ）、第１１７巻
、第３０７−３１０頁、１９８１年］により行なった。

一方、タンパク質は以下のようにタンパク質　ドツトプ
ロットアッセイにより測定した。

分泌されたｇｐ３５０を分析するために、清澄化された
培地をＴ　Ｉ３３　（ＰＩ（７，６の１０＋＋＋Ｍトリ
ス、２５０ｍＭ　　ＮａＣＱ　）中１％３−［（３−グ
ロラミドブロピル）ジメチルアンモニオ］＝１−プロパ
ンスルホネート［ＣＨＡＰＳ。

５ｅｒＶａ］ｌ　／　ｌ　Ｏ容量と混合した０次いで、
４０％メタノールと共に同地の２ＸＴＢＳを加えた。ａ
胞内ｇｐ３ｓｏアッセイのために、細胞を同量の２ＸＣ
ＨＡＰＳ溶菌緩衝液（ｐＨ７，５の２００ｍＭナトリウ
ムＨＥＰＥＳ緩衝液、３００ｍＭ　ＮａＣＱ、２０ｍＭ
　ＥＤＴＡ、Ｌ％ＣＨＡＰＳ）　に再ＩＭｍした。ｖｔ
ｌ量遠心機中２５℃で１０分間及び５分間の遠心分離後
、上澄を４倍容量のＩＸ”Ｌ’Ｂｓ／２０％メタノール
で希釈した１次いでサンプル（１００μＱ）を、９６ウ
工ルドツトプロツト装置中ＩＸＴＢｓ／２０％メタノー
ルで予め平衡化されたニトロセルロースに供した。各ウ
ェルをＬ　Ｘ　Ｔ　Ｂ　Ｓ　／　２０％メタノール５０
０μＱで洗浄した。ニトロセルロースを１時間風乾シ、
シかる後ｆ３Ｌ　ＯＴ　Ｔ　Ｏ中３７℃で２時間インキ
ュベートした。高力価ＥＢＶ免疫ヒト血ｌｌ？（ＶＣＡ
力価１　：　ｔｏ、０００．ＥＡ力価１：１０，０００
及びＥＢＮＡ力価１：１６０）を１３　Ｌ　ＯＴＴ　Ｏ
に加え、室温で１８時間インキュベー（−シた０次いで
、フィルターをブロン１−洗浄液（ｐＨ７，５の　５０
ｍＭ　　トリス。

２５０ｍＭ　ＮａＣＱ、３ａＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ポ
リオ、キシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
）中で３７℃１時間にわたり２回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯ
中アフィニティー精製−２Ｓｘ−タンパク質Ａ（アマ−
ジャム、２Ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍＱ）と共に３７℃で２
時間インキュベートした。３７℃で更に２回にわたる１
時間の洗浄後、フィルターを１時間乾燥し、Ｘ線フィル
ムに露出させた。既知量のアフィニティー精＊ｇｐ３５
０をドツトプロットアッセイにおいて標準として用いた
。その過剰グリコジル化のせいで、ｇｐ３５０タンパク
質測定値は近似値でしかない、更に。

Ｋｐ３５０及びｇｐ２２０の検出効率はみかけ上向−技
術の免疫アッセイ間でも変動した。

間接免疫螢光法による固定細胞分析のために、　トラン
スフェクト細胞をチャンバー（Ｃｈａｍｂｅｒ）スライ
ド［マイルス（Ｍｉｌｅｓ）］上で増殖させ、アセトン
又はメタノール中−２０℃で１０分間固定し、ｇｐ３５
０に特異的なマウスモノクローナル抗体の腹水（リン酸
緩衝液（ＰＢＳ）及び５％ヤギ血清で１：、２００希釈
）、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１２００希釈、
ＢＲＬ）及びフルオレセイン複合化ストレプトアビジン
（１：２００　希釈。

Ｂ　ＲＬ　）と共にインキュベ−１へした。スライドを
観察し、エビ螢光装備顕微鏡写真機で写真撮影した。

Ｂ、　プラスミドの組立て ＥＢＶｇｐ３５０　　ｍｌ−ド領域を　２工程でｐＵｃ
１９［ノランダー、ジエイら、ジーン。

第２６巻、第１ｏｔ頁、１９８３年（Ｎｏｒｒａｎｄｅ
ｒ。

Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　　２６．１０１　
（１９８３））］に組込んでＥＢＶ　　ＤＮＡ　　Ｂａ
ｍ　ＨＩＬ断片［ダムバラ、チーら、　プロシーディン
グ・オブ・ナショナＪし・アカデミ−・オブ・サイエン
ス、第７７巻、第２９９９頁、１９８０年（Ｄａａ＋ｂ
ａｕｇｈ、　Ｔ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇ　ｏｆＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　
５ｃｉｅｎｃｅ、　７７、２９９９（１９８０））］か
らサブクローニングした。ｔｌｋ初に、Ｎ末端について
コードする３４０ｂｐＢａｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ
断片をｐ　ＵＣ１９Ｈｉｎｃｒｌ及びＨｉｎｄｎ１部位
間に挿入した。次いで、３４０　ｂｐ　Ｂａｎ　Ｉ　−
Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片中のＸｈｏ１部位で始まりかつｇｐ
３５０コード領域の残部を有する４、２Ｋｂｐ　　Ｘｈ
ｏｌ断片を複製［Ｓａｎ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌ■断片に挿入
し、ｐＵｃ１９において完全コード配列を再生させた（
９ＭＡ１０２、第１Ａ図）。カルボキシ末端経膜アンカ
ー配列の前に挿入された停止コドンでｇｐ３５０遺伝子
を組立てるために（ｐＭＡΔ−ｇ　Ｐ　シ＋第１Ｂ図）
、完全ｇｐ３５０オープン読取り枠を含むｐＭＡ１０２
の４．４ＫｂＰＢａｍＨＩ−Ｂｇ（１１１断片を最初に
ｐＳＶ２−ｇｐｔ［ムリガン、アール・シー（Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ。

Ｒ，Ｃ，）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス、第７８巻、第２０７２
頁、１９８１年］のＢａｍＨ１部位に挿入して、ｐＭＡ
−ｇｐｔを得た。次いで、３つの読取り枠の停止コドン
及びＢｃＱ１部位を含む合成オリゴヌクレオチドを、膜
アンカー領域開始後のｓｂｐ遺伝子を遮断するｇｐ３５
０遺伝子の５ｅａ１部位に挿入した。

Ｖｅｒｏ細胞トランスフェクト株用に、２つのタイプの
水痘・帯状ヘルペスウィルス（ＶＺＶ）ｇｐｌプロモー
ター／ＥＢＶｇｐ３５０組換えプラスミドを組立てた（
第２図）。

ＶＺＶ　Ｐ、Ｌ　（ｇｐｌ）−ｇｐ３５０は、枠内１’
　ＥＢＶ　　ｇｐ３５ｃ）＋トン２１に融合した最初（
７）３５ＶＺＶ　　ｇｐｌ：＋トンを含む８９０ｂｐの
ＶＺＶ　　ｇｐ　　Ｉプロモーター領域からなる■Ｚ■
プロモーターーリーダー／　Ｅ　Ｂ　Ｖｇｐ３５０組換
え体である［第２Ｂ図、デビソン、ニー・ジェイ、ＥＭ
ＢＯ・ジャーナル。

第２巻、第２２０３頁、１９８３年（Ｄａｖｉｓｏｎ。

Ａ、Ｊ、、　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、２，２　２　
０　３（１９８３））も参照コ。ＶＺＶ　　Ｐ　（ｇｐ
ｌ）−ｇｐ３５０は、翻訳開始コドンの１９ｂｐ上流で
始まるＥＢＶｇｐ３５０遺伝子に融合した■Ｚ■ｇｐｔ
翻訳開始コドンの２ｂｐ前に伸びてい６９５０ｂｐのＶ
ＺＶ　ｇｐ　［プｏ−ｒ−−ター領域からなる組換えプ
ラスミドである（第２Ｃ図）。

ＶＺＶ　Ｐ、Ｌ　（ｇｐ　Ｉ）−ｇｐ３５０　（第２Ｂ
図参照）は、ｐｓＶＧｏ−４２［ＶＺＶｇｐｌ遺伝子含
有ＶＺＶ　ＤＮＡの５ａｃｌＧ断片を含んだプラスミド
（エリス、アール・ダブル（Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、）
ら、ジャーナル・オブ・パイロロジー、第５３巻、第８
１頁。

１９８５年）コ由来Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理８９０
ｂｐ　　５ｆａＮＩ断片を　ＰＵＣ１９のＨｉｎｃ■部
位に挿入することによって組立てた１次いで、ｇｐ３５
０／２２０遺伝子含有ＥＢＶ　　Ｂａｍ　ＨＩ　　Ｌ　
　Ｘｈｏ■断片（第２Ａ図）をｐＵｃ１９ポリリンカー
のＢａｍＨ１部位に挿入して、ＥＢＶ　　ｇｐ３５０の
２１番目のコドンがｐ　ＵＣ１９ポリリンカーの２つの
コドンによってＶＺＶｇｐｌの　３３番目のコドンから
分離されるようにした。続いて、これら２つのコドンを
合成オリゴヌクレオチドリンカーで置換え、ＶＺＶｇｐ
ｌ　　コドン３４及び３５を復元した（第２Ｂ図）。

ＶＺＶ　Ｐ　（ｇｐｌ）−ｇｐ３５０　（第２Ｃ図参照
）は、８９８ｂｐ　　ＥｃｏＲＶ−Ａｖａ　ＩＶＺＶ　
　Ｋｐ＋断片をＡ　ｖ　ａ　Ｉ　　Ｘ　ｂ　ａ　＋合成
オリゴヌクレオチドに結合させることによって組立てた
。これにより、ＶＺＶ配列がｖｚ■ｇｐｔ翻訳開始部位
から一２ｂｐの位置で終結するように、ＥｃｏＲＶ−Ａ
ｖａｌ断片の下流で５０ｂｐの■ｚ■配列を復元した。

得られたＥｃｏＲＶ−Ｘｂａｌ断片を、完全ｇｐ３５０
遺伝子の１４ｂＰ上流にＶＺＶ配列を有するｐＭＡ１０
２　（上記されかつ第１図で示されている）のＸｂａ１
部位に挿入した。これらのプラスミド中の組換え部位は
、ＥＢＶ又は■ｚ■プライマーと共に鎖終結法［サンガ
ー、エフ・ニーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー、第１４３巻、第１６１頁、１９８０年（
Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、＾、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ”ｏＬｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、１４３　、　ｌ　６１（１９８０））］を用
いて各部位にわたり配列決定することにより確認した。

マウスＬｊｋ−ａｐａｔ−細胞のトランスフェクション
用に、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）から部分的に得
られる構造体を製造した。ｐＣＭＶ　Ｉ　Ｅ−ＥＢＭＡ
（第３Ａ図参照）及びｐｃＭＶＩＥ−ＭＡ−Δ（第３Ｂ
図参照）は、ｐＭＡ１０２の４．４ｋｂｐ　　Ｂａｍ　
ＨＩ−１３ｇＱ■断片及びｐＭＡ−Δ−ｇｐｔの２．６
ｋｂｐ　　ＢａｍＨＩ−ＢｃＱＩ断片を各々発現ベクタ
ーｐ　ＣＭＶ　ｒ　Ｅ−ＡＫ　Ｉ−ＤＨＦ　Ｒの唯一の
Ｂ　ｇ　Ｑ１１部位に挿入することによって組立てた。

第４図のベクターｐ　ＣＭＶＩＥ−ΔＫｌ−ＤＨＦＲは
次のようにして組立てた。プラスミドρＢＲｄ［ジマイ
オ、デ（ＤｉＭａｉｏ、　Ｄ、）ら、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、
第７９巻、第４０３０頁、１９８２年］をＥｃ　ｏ　Ｒ
Ｖ　で切断し、末端を　８斌体合成Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉリン
カ−［コラボレーティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ　ｌ１ｅｓｅａｒｃｈ）　］で修正した。約
２　ｋ　ｂ　ｐ　　Ｐｖｕ　Ｕセグメントを含む単純ヘ
ルペスエチミジンキナーゼ（ｔ　ｋ）プロモーター調節
下のＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
（ｎｅｏ）遺伝子［コルビアーガラビン、エフ（Ｃｏｌ
ｂｅｒａ−Ｇａｒａｐｉｎ、ｌ’、　）ら。

ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１
５０巻、第１頁、１９８２年］を８量体Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ
１リンカ−（コラボレーティブ・リサーチ）の各端部で
付加修正し、ｐＢＲｄの　ＢａｍＨ１部位に挿入した。

この時点で、２つの別のセグメントを、ｔｋ−ｎｅｏ配
列で修正されたｐ　Ｂ　Ｒｄへの挿入前に、以下のよう
にして組立てた； （ａ）　　ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨ）の翻訳終
結及びポリ（Ａ）シグナル領域を含むＰｖｕｌｌ−Ｅｃ
ｏＲＩセグメント［ウォイチク、アールら、ヌクレイツ
ク・アシッズ・リサーチ、第１０巻、第７１９１頁、１
９８２年（Ｗｏｙｃｈｉｋ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ
ｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１０．７
１９１　　（１９８２）　）　］をＰ　ｖ　ｕ　１１末
端において８量体ＢｇＱ■リンカー［ニューイングラン
ド・バイオラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）　］で修正し、得られたＢ　ｇ　Ｑ　ＩＩ　−Ｅ
　ｃ　ｏ　Ｒ！断片を下記（ｂ）に結合させた。

（ｂ）サイトメガロウィルスの主な即時型初期プロモー
ター（ＣＭＶＩＰ）［パスル−エフ（Ｐａｓｌｅａｕ、
　Ｆ）ら、ジーン、第３８巻、第２２７頁、１９８５年
］を含むＣ１１ａ［−ＢｇＱ■セグメント： 得られたＣＱａｌ−ＥｃｏＲＩ断片をプラント末端化し
、両末端においてＸｈｏｌＢｉ体リンカ−で修正し、し
かる後ＰＢＲｄ　　の５ａｉ１部位に挿入して、ｔｋ−
ｎｅｏ配列で修正されかつサイトメガロウィルスの主な
即時型初期プロモーターとウシ成長ホルモン遺伝子の翻
訳終結及びポリ＜Ａ）シグナル領域との間におけるいず
れかの構造又はコード遺伝子の挿入用に独特なりｇＱ１
１部位を有するＰＢＲｄを得た１発現ベクターρＣＭＶ
　Ｉ　Ｅ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲの組立てにおける最終工程
では、ＳＶ４０初期プロモーター調節下のマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（Ｄ）（ＦＲ）を含むプラント末端
化Ｐ　ｖ　ｕ■−ＢａｍＨＩ断片の挿入を要した［スブ
ラマニ、ニスら。

モル・セル・パイオル、第１巻、第８５４頁、１９８１
年（Ｓｕｂｒａ＋５ａｎｉ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　
Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１．８５４　（１９８１）
）　］。

挿入前に、ＤＨＦＲ遺伝子はフレノウＤＮＡポリメラー
ゼで連続制限されたＤＮＡのプラント末端化を介するＨ
　ｉｎｄ　１１１部位及びＢｇＱ■部位（双方とも非コ
ード領域に存在）の連続削除としかる後再環化とによっ
てその公表された型から修正済であって、しかる後修正
されたＤＨＰＲ遺伝子はその末端に相同８量体合成５ａ
Ｑｌリンカ−と結合させていた。得られたプラスミドは
ｐＣＭＶ　Ｉ　Ｅ−ＡＫ　Ｉ　−Ｄ　ＨＦ　Ｒである。

マウスＬｔＫ−ａｐａｔ−細胞［ウィグラーエム（ｗｉ
ｇｌａｒ、　Ｍ、）ら、プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第７６巻、第
１３７３頁、１９７９年］を１０％子牛血清補充ダルベ
ツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で保存した。Ｖｅ
ｒ。

細胞を１０％牛脂児血清（ＦＢＳ）補充ＤＭＥＭ中で保
存した。

トランスフェクション用に、プラスミドをＣ５ＣＱ−臭
化エチジウム勾配中での平衡バンディング（ｂａｎｄｉ
ｎｇ）により製造したが、これは少なくとも９０％共有
結合した閉環ＤＮＡであった。ＬｔＫ−細胞のトランス
フェクションのために、プラスミドＤＮＡ　　１μｇ（
及びＬ　ｔ　Ｋ−ＤＮＡ　１９μｇ）をプレート毎に２
０〜２４時間供した。細胞を１５％グリセロールショッ
クに付し［ロバタ、エム（Ｌｏｐａｔａ。

に、）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ。

第１２巻、第５７０７頁、１９８４年］、完全培地で給
餌し、２４時間後Ｇ４１８４００μｇ　／　ｍ　Ｑ含有
培地に移した。

Ｖｅｒｏ細胞をリン酸カルシウム法〔ウィグラー、エム
（す１ｇ１ｅｒ、　Ｍ、）ら、同上］によりＴ２５フラ
スコ当たりプラスミドＤＮＡｌ０μｇでトランスフェク
トした。ＤＮＡを６時間細胞上に残した１次いで、細胞
を非選択的培地で給餌し、２日後取出した。ＰＳＶ２−
ｇｐｔにおいてＣＭＶＩ　Ｅプロモーターの下流にｇｐ
３５０遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトされ
たＶ　ｅ　ｒ、ｏ細胞を、キサンチン２５０μｇ　／　
ｍ　Ｑ及びミコフェノール酸３３μｇ　／　ｍ　Ｑ補充
ＨＡＴ培地中で増殖させることにより選択した。ＶＺＶ
ｇｐｌプロモーターの下流にｇｐ３５０遺伝子を含むプ
ラスミドをｐＳＶ２−ｇｐ　ｔで同時にトランスフェク
トした。Ｌｔｋ−コロニーをシリンダークローニングに
より　選択し、拡大させ。

間接免疫螢光法又はドツトプロットアッセイのいずれか
によってｇｐ３５０発現に関し分析した。トランスフェ
クトされたＶｅｒｏ細胞を間接免疫螢光法又はＲＢＣロ
ゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）アッセイによりｇ
ｐ３５０発現について分析した。

ＲＢＧロゼッティングアッセイは、確立された操作法に
より実施されるその場における赤血球アッセイである［
リットマン、デー・アールら、セル、第４０巻、第２３
７頁。

１９８５年　（Ｌｉｔｔｍａｎ、　　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　　
ａｌ、、　　Ｃｅ１ｌ。

４０．２３７　（１９８５））］、　　ココロニを最初
にｇｐ３５０に特異的なモノクローナル抗体と共にイン
キュベートした。洗浄後、それらをウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ被覆ＲＢＣと共にインキュベートした。この高感度ア
ッセイにより、はぼすべての細胞コロニーが　ｇｐ３５
０を発現していることが判明した。１回目のＩＸＭで約
１０００のコロニーがプールされたが、最表面ｇｐ３５
０発現細胞をＦＡＣＳＩＩ［カリフォルニア州、マウン
テンビューベクトン・ディキンソンＦＡＣＳシステムズ
（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣ５Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）　］での細細胞板により分離した。簡便軽微
にトリプシン処理された細胞を特異的モノクローナル抗
体及びフルオレセイン複合化ヤギ抗マウスＩｇＧで染色
した１通常約６０％の細胞が上記バックグラウンドで螢
光を発した。これらの細胞を集めて培養した。２回目の
単離では。

１５％の最強度螢光細胞を集め、クローンを限界希釈培
養することにより得た。

ｐＳＶ２−ｇｐｔ及びｖｚｖ　ｐ　（ｇｐ　Ｉ）−ｇｐ
３５０での同時トランスフェクションにより得られたＶ
ｅｒｏｊ［胞の１つのクローンは、ｇｐ３５０及びｇｐ
２２０を発現することが判明した。このクローン（ＣＬ
８．ｌ）はＥＢＶを複製するように誘導されたＢ９５−
８細胞（ＥＢＶ細胞系）以上ニｇ　ｐ　３５０及びｇｐ
２２０を発現し、電気泳動移動度は誘導Ｂ９５−８＃１
胞から得られるｇｐ３５０及びｇｐ２２０の場合と同一
であった。発現は少なくとも１年間安定であった。この
細胞系中のｖｚｖｇｐｒプロモーター及びｇｐ３５０配
列のサザンプロット分析では、これらの細胞中にトラン
スフェクトされた組換えプラスミドにおいてｇｐＩプロ
モーターの上流及びｇｐ３５０遺伝子内で切断する制限
エンドヌクレアーゼを用いた場合に、これらの配列はト
ランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの場合と同じ大
きさの断片中に結合せしめられたままであることを立証
した。

、ＩＲＹ１８８　　　ＹＥＢＶ−１の　地から泌される
ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａ　　　３５０の精製発現系ＪＲＹ１
８８　［ｐＹＥＢＶ−１１の産生及びその実験的増殖に
関する実験詳細は。

シュルツ、エル・デー（Ｓｃｈｕｌｔｚ、　Ｌ、Ｄ、）
ら、ジーン、第５４巻、第１１３−１２３頁、１９８７
年に記載されているが、これはそれらの目的のために参
考として組込まれる。Ｎタンパク貿ｒＥＢＭＡｇｐ３５
０はＪＲＹ１８８　［ｐＹＥＢＶ−１１の培地中に有意
量分泌される。

大量の発現系を増殖させるために、ＪＲＹ１８８［ｐＹ
ＥＢＶ−１コをＹＥＨＤ培地［大豆ペプトン（１０ｇＩ
Ｑ）、酵母エキス（２０ｇ／Ｑ、ジフコ（Ｄｉｆｃｏ）
　）、デキストロース（１６ｇ／Ｑ）］で培養した。培
養後、培地約９．５Ｑをｌαまで濃縮し、しかる後０．
４５ミクロン膜を用いｐＨ７，４のＯ，１Ｍ　ＨＥＰＥ
Ｓ。

０．１５Ｍ　ＮａＣＱＣ透析濾過用緩衝液）５Ｑで透析
濾過した。酵母細胞を貯留して、ｇｐ３５０を膜から透
過させた。透過液を１００ｍＱまで濃縮し、透析ｐ適用
緩衝液７００ＩＩＱで透析濾過した。貯留液を細胞から
除き。

ＣａＣＱ、及びＭ　ｎ　ＣＱ　２に関し１ｍＭに調整し
、全容量を５（！Ｉ（内径）Ｘ２４．２（！１のヒラマ
メレクチンセファロース４Ｂ（ファルマシア）アフィニ
ティーカラムに流速８０ｍＱ／ｈｒでポンプ注入した。

カラムをＬｍＭＣａＣＱ、及びＬｍＭＭｎＣＱ２含有透
析」適用緩衝液の２倍層容量で洗浄した６次いで、カラ
ムをｌ　ｍ　Ｍ　Ｃａ　ＣＱ　、　、　１　ｍ　Ｍ　Ｍ
　ｎ　ＣＱ　。

含有透析」適用緩衝液（全容量３リツトル）中Ｏ〜１０
０＋ｓＭ　α−メチル−Ｄ−マンノピラノシドの直線勾
配で溶出させた。タンパク質含有画分を２８０ｎｍの吸
光度から検出し、プール液５１５＋ｗＱを得た。プール
液を３０．５ｍＭまで濃縮し、ｐＨ８，０の２０１１Ｍ
トリス２００　ｍ　Ｑで透析−過した。濃縮透析濾過さ
れたプール液をＭＯＮＯ−Ｑアニオン交換カラム（ファ
ルマシア）にポンプ注入し、ファルマシアＦＰＬＣ系で
操作した。カラムを更にＵＶ吸吸物物質放出されなくな
るまでｐＨ８，０の２０ＩＩＭトリスで溶出させ、しか
る後ｇｐ３５０をｐＨ８，０の２０ｆｆｉＭトリス中Ｏ
〜３００ｍＭＮａＣＱの直線勾配で溶出させた。各８．
０ｍＭの両分を免疫ブロッティングにより　ｇｐ３５０
の存在について分析し、プール液をｇｐ３５０含有画分
からＦＡ製した。

プール液を１８ｓＱかつタンパク質濃度１．３２ｍｇ／
ｍＱまで濃縮した。この精製ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａｇｐ３
５０調製液は免疫プロッティングで検出可能な一成分を
含有しており、銀染色による判定では純度約９０％であ
った。

クローンＣＬ８．ｌ　　を選択培地中で増殖させ、１〜
２ｇアリコート中−７０℃でウェットパック（ｗｅｔ　
ｐａｃｋ）として保存した。細胞６．６５　ｇ　のサン
プルを細胞１ｇにつき抽出用緩衝液３ｍＱ（ｐＨ７，４
の２０ｍＭトリスＨＣｌ１１中、２％トリトンＸ−１０
０，０，１５ＭＮａＣｌ２）に懸濁した。フェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を濃度２ｍＭまで
加えた。細胞愚濁液を５０　ｍ　Ｑチューブ中に入れ、
水中に詰め込み、超音波処理し。

しかる後８５００ｐｐｍで４０分間清澄化させた。上澄
はタンパク質１７２ｍｇを含有しており、細胞抽出物が
得られた。

ヒラマメレクチンセファ０−ス−４Ｂの２．５ｃｍＸ２
．０ｃｍカラムを、溶出用緩衝液１００ｍＱ　（ｐＨ７
，４の２０　ｍ　Ｍ　ｈリスＨＣＱ中、０．１％トリト
ンＸ−１００，１ｍＭＭｎＣＱ、、１ｍＭ　ＣａＣＱ、
、０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．２Ｍ　　α−メチルマン
ノシド）により流速１０ｍＡ／ｈｒで洗浄しｗＵ製した
０次いで、容量５０ｍＱのカラム用緩衝液（ｐＨ７，４
の２０　ｍ　Ｍ　トリスＨＣＱ中、０．１％トリトンＸ
−１００，１ｍＭ　ＭｎＣＱ、、１ｍＭＣａＣｎ２，０
．１５Ｍ　ＮａＣＱ＞で洗浄した。

細胞抽出物をカラムに供し、未吸着タンパク質を１０倍
層容量のカラム用緩衝液で洗浄した。吸着された抗原物
質を溶出用緩衝液で脱着させ、］ａ＋Ｑ画分毎に集めた
。５ＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色及びタンパク質ドツトプロ
ットにより抗原を含有することが判明した溶出画分をプ
ールして、１４．５ｍＱ中５．５８ｍｇを回収し、溶出
抗原プール液を得た。

次いで、溶出抗原プール液を以下のように濃縮し、透析
濾過した：小さな″混合″界面活性ミセルを作るために
、溶出抗原プールを同量の透析−適用緩衝液（ｐＨ８，
０の２０ｍＭトリスＨＣＱ中０．８％ＣＨＡＰＳ、２０
ｍＭＤＴＴ）と混合した。″混合″ミセルを作る目的は
、透析濾過によるトリトンＸ−１００からＣＨＡＰＳ界
面活性剤への交換を促進するためである０次いで、抗原
プール液を３０■ｎまで濃縮し、透析」適用緩衝液３０
０ＩＩＱで透析濾過して、低分子量タンパク質及びトリ
トンＸ−１００を除去した。透析ミ濾過濃縮液は６　、
６　ｍ　ｎ中タンパク質１．９８ｍｇを含有していた（
透析濾過前の物質の３５％）。

ＭＯＮＯ−Ｑ　ＨＲＩＯ／１０カラム（ファルマシア）
を、緩衝液Ａ（ＰＨ’８．０の　２０ｍＭトリスＨＣＱ
中０．８％ＣＨＡＰＳ）で洗浄することにより、高速タ
ンパク質液体クロマトグラフィー（ファルマシアＦＰＬ
Ｃ：）系で調製した。透析濾過濃縮液を２．２ｍＱアリ
コートとじて充填し、未吸着タンパク質を緩衝液へで洗
出しだ。吸着タンパク質をＯ〜０．５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ
勾配で１ｍＱ画分毎に溶出させた。

ｇｐ３５０物質は０．２３〜０．２６Ｍで溶出したが、
これをプールし、３３分の１に濃縮した。タンパク質回
収率はＭＯＮＯ−Ｑカラム充填量の７％であった。

得られた濃縮抗原プール液を以下のようにしてゲル濾過
に供した：スペロース（ＳｕＰＥＲＯ５Ｅ）６ＨＲ１０
／３０カラムを緩衝液Ａで洗浄することにより調製した
。濃縮抗原プール液２００μＱアリコートを１操作当た
りで充填し、ＬｍＱ画分を集めた。免疫ブロッティング
で組換えｇｐ３５０を含有することが判明した両分をプ
ールし、濃縮した。銀染色ゲル及び免疫プロットでは、
その物質が９０％以上の組換えｇｐ３５０又はｇｐ２２
０を含有していることを示した。

ｐＣＭＶＩＥ−ＥＢＭＡでトランスフェクトされＥＢＭ
Ａに関する免疫螢光法で陽性の凍結マウスＬ細胞３．６
ｇ　パッチを解凍し。

２ｍＭＰＭＳＦ含有抽出用緩衝液１０．８ｍＱに再懸濁
した。細胞懸濁液を５０ｍＱポリカーボネート遠心管内
で水中に浸し、しかる後２０秒パルスで５回超音波した
６次いで混合物を冷却遠心管中８５００ｘｇ４℃で４０
分間遠心分離することにより清澄化した。清澄化上澄培
地をデカントし、細胞ペレットを初めの容量の抽出用緩
衝液中に再Ｓ濁し、超音波処理及び清澄化処理を繰返し
た６次いで。

デカントされた上澄を合わせた。

次いで、ヒラマメレクチンセファ０−ス４Ｂ及びｃｏｎ
Ａセファロース４Ｂのアフィニティークロマトグラフィ
ーしかる後ＭＯＮＯ−Ｑ（ファルマシア）のアニオン交
換クロマトグラフイー及びスペロース１２（ファルマシ
ア）のゲル濾過クロマ１−グラフィーにより。

以下のようにして１組換えＥＢＭＡを合わせたデカント
上澄から単離した： １ＯｍＱ層容址のヒラマメレクチンセファロース４Ｂ（
ファルマシア）カラムを溶出用緩衝液１００ｍＱ（０，
１％トリトンｘ−１００゜１　ｒｓＭ　Ｍ　ｎ　ＣＱ２
＊　ｌ　ｍＭ　Ｃａ　ＣＱ２＋　Ｏ−１５Ｍ　　Ｎ　ａ
　Ｑ　Ｑ　、　２００　ｍ　Ｍ　　ａ　−Ｄ−メチルマ
ンノシド）しかる後カラム用緩衝液５０ｍＱ（０，１％
トリトンＸ−１００，１ｍＭ　ＭｎＣＱ２１ｍＭ　Ｃａ
ＣＯ２，０，１５Ｍ　ＮａＣＱ）で充填し、溶出させる
ことにより、使用のために調製した。デカントされた上
澄液サンプル２０　ｍ　Ｑをカラムに供し、タンパク質
が更に除去されなくなるまで未吸着タンパク質をカラム
用緩衝液で溶出させた。次いで、カラムを溶出用緩衝液
で溶出させた。しかしながら。

この場合にｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａは未吸着タンパク質画分
中に存在しているため、それを更に以下のようにしてｃ
ｏｎＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し
た： １０ｍＭ層容量のｃｏｎＡセファロース４Ｂ（ファルマ
シア）カラムを溶出用緩衝液しかる後カラム用緩衝液で
充填し洗浄した。ヒラマメレクチンカラムからの未吸着
タンパク質両分サンプル２０　ｍ　ＱをｃｏｎＡカラム
に供し、タンパク質が更に溶出しなくなるまでそれをカ
ラム用緩衝液で洗浄した。カラム溶出液を２　ｍ　２画
分毎に集め、各々をタンパク質ドツトブロッティング及
び銀染色によりｒＥＢＭＡの存在に関してモニターした
。ｒＥＢＭＡ陽性画分を合わせて、プール液１２．５ｍ
Ｑを得た。ｒＥＢＭＡ含有画分は溶出用緩衝液により溶
出したものであって、これらを合わせてプール液１２．
５ｍＱとし、ｃｏｎ　Ａ精製ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａを得た
。

ｃｏｎＡ精製ｒＥＢＭＡ５ｍ’Ｑアリコートを、ＭＯＮ
Ｏ−Ｑカラム（ファルマシア）のＱＡＥアニオン交換ク
ロマトグラフィーにより高速タンパク質液体クロマトグ
ラフィー（ＦＰＬＣ）糸上で操作して更に精製した。Ｍ
ＯＮｏ−Ｑカラム（５ｍｍＸ５ｃｍ）を出発用緩衝液（
０，１％トリトンＸ−１００，ｐＨ８の２０ｍＭトリス
）で平衡化した。ｃｏｎＡ精’ｔＪ　ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　
Ａ　５　ｍ　Ｑアリコートを、出発用緩衝液で平衡化さ
れたセファデックスＧ−２５（ＰＤ−１０；ファルマシ
ア）の既充填カラムにおいて緩衝液を交換することによ
り１Ｍ０Ｎｏ−Ｑ　ＱＡＥ　　アニオン交換クロマトグ
ラフィー用に調製した。適用されたサンプルからの未吸
着タンパク質を出発用緩衝液で溶出させ、しかる後吸着
タンパク質を出発用緩衝液中Ｏ〜０．５ＭＮａＣＱの直
線勾配で溶出させた（勾配の全容量は２０ｍＭであった
）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析ではｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａが０．３
〜０．３８ＭＮａＣＱで溶出することが示されたが、こ
れらの両分を合わせて３ｍＱプール液とし、ＭＯＮＯ−
Ｑ精製ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａを得た。

ＭＯＮＯ−ＱＭ製ｒＥＢＭＡを以下のようにしてゲル濾
過の最終分別工程に供した：ＦＰＬＣを用いるスペロー
ス６分析カラム（３０ｍＭ層容量）を、それに１．ｏｍ
Ｑ／ｍｉｎで緩衝液１５０ｍ１２を通ずることにより、
０．１５Ｍ　　ＮａＣＱ、０．１％トリトンＸ−１００
゜ｐ　Ｈ８の２０　ｍ　Ｍ　ｈリスＨＣＱで平衡化させ
た。ＭＯＮＱ−Ｑ精製ｒＥＢＭＡ　　０．５ｍＱアリコ
ートをゲル濾過で分別し、溶出液１．ＯｍＱ画分を集め
た。各画分を５Ｏ８−ＰＡＧＥ後銀染色及び免疫プロッ
ティングによりモニターし、プール液をｒＥＢＭＡに関
して陽性の両分から作った。この最終分別工程の結果、
細胞１グラム（湿潤重量）当たりのｒＥＢＭＡ収量０．
１ｍｇで、純度９０％以上であつた・ エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）を産生しかつ
１膜抗原ｇｐ３５０又はｇｐ２２０（ＥＢＭＡ）に関す
る免疫螢光試験で陽性のマーモセットリンパ芽球細胞（
Ｂ９５−８）をペニシリン（１００１，Ｕ、／ｍＱ）、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＱ）及び５％牛脂
児血清（Ｆｅ２）含有培地中で培養した。

これらの細胞を以下のようにＴＰＡ　（１２−〇−テト
ラデカノイルホルボールー１３−アセテート、米国プー
ルのシグマ社）と−緒のインキュベートにより誘導した
：　ＴＰＡを窒素充填アンプル内−２０℃でジメチルス
ルホキシド中濃度２ｍｇ／ｍＱで保存し、使用するため
培養物添加直前に加温無菌リン酸緩新液（ＰＢＳ）で希
釈した。誘導用培養物を細胞５ＸＩＯ’個／　ｍ　Ｑで
フラスコに接種ししかる後−夜インキユベートすること
により調製した。ＴＰＡ及び酪酸ナトリウム（シグマ８
５８８７）を各々最終濃度１０ｍＭ及び２００　ｎ　ｇ
　／　ｍ　Ｑ　　で培養物に加え、　しかる後更に７２
時間インキュベートした。細胞を２００Ｏｒｐｍで１０
分間回転しＰＢＳで２回洗浄しかつペレットを凍結する
ことにより、保存用に回収した。

湿潤重量６．５ｇの凍結Ｂ９５−８細胞ペレットを解凍
し、Ｍ胞１グラム対緩新液３ｍＡの比率で抽出用緩衝液
（２％トリトンＸ−１００゜０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、ｐ
Ｈ７，４の２０ｍＭトリス）に懸濁した。２００ｍＭフ
ェニルメチルスルホニルフルオリドの貯蔵溶液を最終濃
度２ｍＭまで加えてセリンプロテアーゼをβｎ害し、細
胞ｍ濁液を５０ｍＱポリカーボネート遠心管中に３５ｍ
Ｑだけ入れた。管を水中に浸し、混合物を２０秒パルス
で５回超音波処理した。次いで、混合物を冷却遠心管中
８５００ｘｇ４℃で４０分間遠心分離することにより清
澄化した９清澄化された上澄培地をデカントし、細胞ペ
レットを初めの容量の抽出用緩衝液に再懸濁し、超音波
処理及び清澄化処理を繰返した。デカントされた上澄培
地を１つのプール液とし、ヒラマメレクチングロマトグ
ラフィーにより分別した。

１０ｍＱ層容量のヒラマメレクチンセファ０−ス４Ｂ（
ファルマシア）カラムを溶出用緩衝液１００ｍＱ（ｐＨ
７，４の２０ｍＭトリス中。

０．１％トリトンＸ−１００，１ｍＭ　ＭｎＣＱ、。

１ｍＭ　ＣｒｒＣＱ、、　０．１５Ｍ　　ＮａＣＱ　、
　２００ｍＭ　　α−Ｄ−メチルマンノシド）しかる後
カラム用緩衝液５０ｍＡ（ｐＨ７，４の２０ｍＭトリス
中、０．Ｉ％トリトンＸ−１００，１ａ＋ＭＭｎＣＱ２
．１ｍＭ　ＣａＣＱ２．Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣＱ）で充填
し、溶出させることにより、使用のために調製した０次
いで、デカント上澄培地プール液の一部（タンパク質１
９５ｍｇ含有１３ｍＱ）をカラムに供した。すべての溶
液がカラムに入った後５未吸着タンパク質をカラム用緩
衝液５０ｍΩで洗出させ、吸着画分を溶出用緩衝液５０
ｍＱで脱着させた。

カラムからの溶出液を１ｍＭ画分毎に集め。

これを免疫プロッティングによりＥＢＭＡについてモニ
ターした。ＥＢＭＡは選択された溶出画分中に存在して
おり、これらの両分のプール液を作った。それは８ｍＭ
中にタンパク質２．５２ｍｇを含有していた。

ヒラマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーで
の分別により得られたＥＢＭＡをＭＯＮＯ−Ｑカラム（
ファルマシア）のＱＡＢ−アニオン交換クロマトグラフ
ィーにより　高速タンパク質液体クロマトグラフィー（
Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）系で操作して更に精製した。ＭＯＮｏ
−Ｑカラム（５ｍｍＸ５ｃｍ）を出発用緩衝液（０，１
％トリトンＸ−１００，ｐＩ−（８の２０ｍＭトリス）
で平衡化させた。ヒラマメレクチンアフィニティークロ
マトグラフィーで得られたＥＢＭＡ含有プール液サンプ
ル（５，０ｍＭ、）を、出発用緩衝液で平衡化されたセ
ファデックスＧ−２５（ＰＤ−１０；ファルマシア）の
既充填カラムにおいて緩衝液を交換することにより、Ｍ
ＯＮＯ−Ｑアニオン交換クロマトグラフィー用にｍｆＢ
ｔ、ｆ：、Ｍ用サンプルの未吸着タンパク質を出発用緩
衝液で溶出させ、しかる後吸着タンパク質を出発用緩衝
液中Ｏ〜０．５ＭＮａＣＱの直線勾配で溶出させた（勾
配の全容量は２０ｍｆｌであった）。免疫プロッティン
グ及び銀染色アッセイでは、ＥＢＭＡは０．２５〜０．
３０ＭＮａＣＱで溶出する両分中に存在することを示し
た。精ＩＱＥＢＭＡのプール液を集め、ＥＰＬＣを用い
てスペロース６　（３０ｍＱ層容ｆｉｔ）分析カラムの
ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に分別した。カラ
ムに１．ＯｍＱ／ｍｉｎで緩衝液１５０ｍＡを通すこと
により、カラムをＯ，１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．１％トリ
トンＸ、　　１００．ｐＨ８の２０ｆｆ１ＭトリスＨＣ
Ｑで平衡化させた。ＭＯＮＯ−Ｑクロマトグラフィーで
得られたＥＢＭＡ含有プール液０．５ｍＱアリコートを
ゲルミ濾過により分別し、溶出液１．ＯｗＱ画分を集め
た。各両分を５ＤＳ−ＰＡＧＥ後に銀染色及びタンパク
質ドツトブロッティングでモニターし、プール液をＥＢ
ＭＡに関し陽性の両分から作った。

この操作で８９５−８細胞１グラムにつき（湿潤重量）
ＥＢＭＡＩＬμｇを得たが、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる評
価では純度９０％以上であった（物質及び方法、前掲参
照）。

以上の明細書は説明目的で記載されている実施例と共に
本発明の原理について教示しているが、本発明の実施に
は特許請求の範囲内に属する限り本明細書に記載された
操作及びプロトコールのすべての通常のバリエーション
、適合、修正、削除又は付加を包含している。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図：　プラスミドｐＭＡ１０２の地図。 ＥＢＶ　ＤＮＡ断片は　ｇｐ３５０ オープン読取り枠（オープンボッ クスで示されている）の１０ｂｐ 上流で始まりｇｐ３５０ｍＲＮＡ ポリアデニル化部位の２Ｋｂ　Ｐ下 流で終わるが、これをＰＵＣ１９ のポリリンカーに挿入して、ｐＭ Ａ１０２を得た。 第１Ｂ図ニブラスミドｐＭＡΔ−ｇｐｔの地図。ｐＭＡ
Δ−ｇｐｔは、ｐＭＡ １０２（７）ＥＢＶｇｐ３５０ＤＮＡ 断片を含むｐＳＶ２ｇｐｔである。 ３つすべての枠内にＢｃｆｆｉＩ部位 及び停止コドンを含むオリゴヌク レオチドは、疎水性経膜ドメイン のコード領域の開始部に位置する ５ｃａｒ部位に挿入されている。 Ｖｅｒｏ細胞用ＶＺＶｇｐＩプロ モー９−／ＥＢＶｇｐ３５０遺伝 子構造体のアセンブリー 第２図： Ａ、各ウィルスゲノム中におけるｖＺ ＶｇｐＩプ０−Ｔ−一ター及びＥＢＶ ｇｐ３５０遺伝子の位置が拡大し て示されている。 Ｂ、ＶＺＶ　Ｐ、Ｌ（ｇｐＩ）−ｇｐ３５０の地図、融
合ｇｐ３５０構造体に おける配置が示されている。コド ン３５までのｖＳｖｇｐＩタンパ ク質ＶＺＶｇｐＩプ０モー９−（Ｐ） 及びリーダー配列（Ｌ）は、コド ン２１においてｇｐ３５０配列に 枠内で結合している。 Ｃ，ＶＺＶ　Ｐ（ｇｐＩ）−ｇｐ３５０の地図、非融合
ｇｐ３５０構造体に おける配置が示されている。ｖＳ ｖｇｐｒプロモーター配列は、オ リシナ）Ｌｔ　ＶＺＶｇｐＩ　　ＡＴＧ（７１２ｂｐ以
内までＥＣｏＲＶ部位か ら伸長している。追加塩基がｇｐＩ プロモーター及びｇｐ３５０の配 列を連結させるために挿入されて いる。 マウスＬ　ｔ　ｋ−ａ　ｐ　ｒ　を−細胞用サイトメガ
ロウィルス／　ｇ　ｐ　３５０構造体の地図。 Ａ、ｐＣＭＶＩＥ−ＥＢＭＡは、ｐＣ ＭＶＩ　Ｅ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ中の サイトメガロウィルス即時型初期 転写プロモーターの下流において Ｂ　ｇ　Ｑ　１１部位に挿入せしめられたｐＭＡ１０２
（７）ＥＢＶｇｌ）３５０ＤＮＡ断片である。この発現
ベク ターは２種の選択可能なマーカー 遺伝子、即ちネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子及び
ジヒドロ葉酸レダ クターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）遺伝子を含 んでいる。 Ｂ、ｐｃＭＶＩＥ−ＭＡΔは、ρＭＡ Δ−ｇｐｔから得られかつＰＣ：ＭＶ ＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ中に挿入 第３図： 第４図： 第５図： されたＥＢＶｇｐ３５０ＤＮＡ配 列を含んでいる。 ｐｃＭＶＩＥ−ＡＫｌ−ＤＨＦＲ は哺乳動物発現ベクターであって。 その中にはＥＢＶｇｐ３５０ＤＮＡ 配列がｐｃＭＶＩ　Ｅ−ＥＢＭＡ又 はｐｃＭＶＩＥ−ＭＡΔを得るた めに挿入されている。 ｒ　Ｅ　Ｂ　Ｍ　Ａの精製経路図 ＦＩＧ−５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換え哺乳動物発現系から組換えＥＢＶ膜抗原を精
   製するための方法であって、 （ａ）組換えＥＢＶ膜抗原発現ＶＥＲＯ細胞を破壊し； （ｂ）破壊物を１又は２段階のレクチンアフィニティー
   クロマトグラフィーに付して、ＥＢＶ膜抗原含有溶出画
   分を得； （ｃ）上記溶出画分をゲル濾過クロマトグラフィーに付
   して、精製された組換えＥＢＶ膜抗原を得る； 工程からなることを特徴とする方法。 ２、組換えＥＢＶ膜抗原発現Ｖｅｒｏ細胞がＣＬ８．１
   細胞である、請求項１記載の方法。 ３、工程（ｂ）が破壊物をヒラマメレクチンカラムによ
   る１段階のレクチンアフィニティークロマトグラフィー
   に付すことからなる、請求項１記載の方法。 ４、組換えＶｅｒｏ細胞からＥＢＶの組換えｇｐ３５０
   を精製するための方法であって、（ａ）組換えｇｐ３５
   ０又はｇｐ２２０を発現するＣＬ８．１細胞を破壊し； （ｂ）破壊物を清澄化し； （ｃ）清澄化された上澄を１段階のヒラマメレクチンク
   ロマトグラフィーに付し、溶出ｇｐ３５０又はｇｐ２２
   ０プール液を集め； （ｄ）上記溶出ｇｐ３５０又はｇｐ２２０を１段階のア
   ニオン交換カラムクロマトグラフィーに付し； （ｅ）ｇｐ３５０又はｇｐ２２０含有画分をゲル濾過に
   付して、精製された組換えｇｐ３５０又はｇｐ２２０を
   得る； 工程からなることを特徴とする方法。 ５、組換え酵母発現系から分泌される組換えＥＢＶ膜抗
   原を精製するための方法であって、 （ａ）ｒＥＢＭＡ分泌酵母細胞と接触せしめられた培地
   を集め透析して、ｒＥＢＭＡ含有貯留液を得； （ｂ）上記貯留液を１又は２段階のレクチンアフィニテ
   ィークロマトグラフィーに付して、ｒＥＢＭＡ含有溶出
   画分を得； （ｃ）上記溶出画分をアニオン交換クロマトグラフィー
   に付して、精製された酵母由来ｒＥＢＭＡを得る； 工程からなることを特徴とする方法。 ５、組換え酵母発現系から非分泌性組換えＥＢＶ膜抗原
   を精製するための方法であって、（ａ）ｒＥＢＭＡ発現
   酵母細胞を集め； （ｂ）上記細胞を破壊し； （ｃ）残屑を除去して、清澄化された上澄を得； （ｄ）清澄化された上澄を透析して、貯留液を得； （ｅ）貯留液を１以上の段階のレクチンアフィニティー
   クロマトグラフィーに付して，ｒＥＢＭＡ含有溶出画分
   を得； （ｆ）上記溶出画分をアニオン交換クロマトグラフィー
   に付して、精製された酵母由来ｒＥＢＭＡを得る； 工程からなることを特徴とする方法。 ７、ｒＥＢＭＡ分泌酵母細胞がＪＲＹ１８８［ｐＹＥＢ
   Ｖ−１］である請求項５記載の方法。 ８、工程（ｂ）が貯留液を１段階のレクチンアフィニテ
   ィークロマトグラフィーに付すことからなる、請求項５
   記載の方法。 ９、工程（ｃ）のアニオン交換クロマトグラフィー用装
   置がＭＯＮＯ−Ｑアニオン交換カラムである、請求項５
   記載の方法。 １０、組換え酵母発現系から分泌される組換えＥＢＶｇ
   ｐ３５０又はｇｐ２２０を精製するための方法であって
   、 （ａ）ＪＲＹ１８８［ｐＹＥＢＶ−１］と接触せしめら
   れた培地を集め透析して、組換えＥＢＶｇｐ３５０又は
   組換えＥＢＶｇｐ２２０含有画分を得； （ｂ）工程（ａ）の産物をレクチンアフィニティークロ
   マトグラフィーに付して、結合画分を溶出させ； （ｃ）結合画分をアニオン交換カラムに通して、精製さ
   れた酵母由来組換えＥＢＶｇｐ３５０又はｇｐ２２０を
   得る； 工程からなることを特徴とする方法。 １１、組換え哺乳動物発現系から組換えＥＢＶ膜抗原を
   精製するための方法であって、 （ａ）組換えＥＢＶ膜抗原発現マウスＬ細胞を破壊し； （ｂ）破壊物を１又は２段階のレクチンアフィニティー
   クロマトグラフィーに付して、ＥＢＶ膜抗原含有溶出画
   分を得； （ｃ）上記溶出画分をアニオン交換クロマトグラフィー
   に付して、組換えＥＢＶ膜抗原含有溶出画分を得； （ｄ）上記溶出画分をゲル濾過クロマトグラフィーに付
   して、精製された組換えＥＢＶ膜抗原を得る； 工程からなることを特徴とする方法。 １２、組換えＥＢＶ膜抗原発現マウスＬ細胞がｐＣＭＶ
   ＩＥ−ＥＢＭＡでトランスフェクトされかつｒＥＢＭＡ
   を発現するマウスＬ細胞である、請求項１１記載の方法
   。 １３、工程（ｂ）が、細胞破壊物を清澄化し、しかる後
   ヒラマメレクチンカラムに通すことにより望ましくない
   汚染物質を吸着除去し、未吸着タンパク質画分をｃｏｎ
   Ａゲルクロマトグラフィーに付して、ｃｏｎＡに吸着さ
   れかつｒＥＢＭＡを含有する溶出タンパク質画分を集め
   ることからなる、請求項１１記載の方法。