JP2530847B2 - 帯状疱疹ウイルスに対するワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 水痘は、ヘルペスウイルス群の一員である帯状疱疹ウ
イルス（varicella−zoster virus）（VZV）により生じ
る。該疾患は、前もってVZV免疫を持たない人に起こ
る。VZV−特異抗体は発病後すぐに検出され、回復期間
に減少するが、多年の間残存し該疾患に対する免疫と関
連する。水痘は高伝染性である;20才以前に人工の90％
以上がVZVに曝される。全部ではないにせよ、大部分の
例においてVZVは明らかに後根神経節細胞（dorsal root
ganglion cells）中に潜伏する。この潜伏状態から、V
ZVは再活性化し、おそらくは低下した細胞性免疫の結
果、特異的抗体の存在下においてでも帯状疱疹を起こ
す。この疾患は免疫抑制された人および20才以上の人に
特に起こり易い。

VZVはその表面に５種の主要糖蛋白を有する:gp115（1
15キロダルトン（kD）糖蛋白）、gp105、gp92、gp83、g
p55。これら糖蛋白は明らかに３つの遺伝子の産物であ
る:gp III（gp105）、gp II（gp115、非還元状態、還元
種gp62およびgp57からなる）、そしてgp I（gp92、gp8
3、gp55）。以前は、これら遺伝子は各々gA、gB、およ
びgCとして参照されていた。gAおよびgBに対するモノク
ローナル（McAb）およびポリクローナル単一特異的抗体
はVZVの補体−非依存性中和を示し、gCに対するそのよ
うな抗体は補体依存性の中和を示す。

免疫原性外層ウイルス糖蛋白gp IIIをコードするVZV
の遺伝子がDNA配列分析により同定された。そのDNA配列
から帰属されたペプチドに対して向けられた抗体は、そ
れ自身中和抗体の標的であるgp III糖蛋白と反応するこ
とが出来る。精製されたgp IIIのアミノ末端の配列はDN
A配列から帰属されたアミノ酸配列の部分と同一であ
る。この糖蛋白は、VZVのためのワクチンの調製に有用
である。

VZV感染に伴う疾患を防ぐ抗原を供給することが本発
明の目的である。もう一つの目的は、VZVに対する抗体
を検出するための診断に用いられ得る抗体を供給するこ
とである。もう一つの目的は、これら抗原の調製のため
の方法を与えることである。もう一つの目的は、その抗
原をVZVに対する抗体を形成させるために用いる方法を
与えることである。もう一つの目的は、他の手段で合成
されるかまたは発現ベクター中で発現され得るペプチド
抗原を含むであろう蛋白抗原の全配列を記載することで
ある。本発明のこれらおよび他の目的は以下の記載によ
り明らかとなろう。

本発明は、防御免疫原性gp III糖蛋白をコードするVZ
V DNA部分の同定に向けられている。より特定すると、
各ヌクレオチド配列（および由来するアミノ酸配列）が
全VZVゲノム中に帰属されている2.5キロ塩基対（kbp）D
NA断片に向けられている。本発明はまた、この2.5kbp D
NA断片の全部または一部を含むベクターにも向けられて
いる。本発明はまた、これらベクターを含み、2.5kbp断
片によりコードされるポリペプチドの全部または一部を
発現することの可能な宿主細胞にも向けられている。既
知の技法に従って、本分野の熟練者においては、前述の
ポリペプチドが化学的に合成され得ること、または修飾
されてなお抗原性を保持し得ることは自明であろう。従
って、本発明はまた、この蛋白のドメイン、特に疎水領
域およびスレオニンまたはセリンおよびアスパラギン−
Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン残基、
ここにＸは任意のアミノ酸残基、を含みかつ取り囲む領
域の化学合成にも向けられている。これらドメインがウ
イルスの外表上に位置すると思われるからである。

gp IIIをコードするDNA部分は以下のように正確に同
定された:McAbを介した免疫アフィニチークロマトグラ
フィーの利用により、該gp IIIポリペプチドは90％均質
性にまで精製された。この試料は、完全フロインドアジ
ュバント中でモルモットに投与されると中和抗体の生産
を誘起し得る。この精製試料は、調製用ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）により電気泳動され、ポリブレンでコートされたグ
ラスファイバーシート上に単一の105kDポリペプチドと
して単離される。この試料はアミノ末端配列分析にかけ
られる。その分析において明らかになった７連続アミノ
酸に基づいて、ヘプタペプチドのための各可能なコード
の組合せを意味するオリゴヌクレオチドのプールが合成
される。そのオリゴヌクレオチドプールは、VZV DNA断
片に対するハイブリダイゼーションプローブとして用い
るために放射能標識される。選択的なハイブリダイゼー
ションがHind III B断片中に見いだされる。Hind III B
断片のこの領域のDNA配列分析が2.5kbp解放読み取り枠
（ORF）を明らかにする。このDNA配列から帰属されたア
ミノ酸配列中で、残基18−27は上述のアミノ末端配列と
完全な一致を示す。帰属されたアミノ酸配列に基づい
て、13−22残基長の３ペプチドが免疫原性があると思わ
れ、選択される。これらペプチドが合成され、ウシ血清
アルブミンと連結され、ウサギに注射される。抗−ペプ
チド血清のいくつかは、ウエスタン（Western）ブロッ
トおよび免疫沈降分析によりgp IIIと反応する。抗−ペ
プチド血清の特異性はさらに、免疫沈降分析における抗
−ペプチド抗体のgp IIIに対するMcAbとの競合能力によ
り示される。加えて、その抗−ペプチド抗体は、2.5kbp
ORFにより選択されたmRNAハイブリッドの80kD試験管内
翻訳産物を免疫沈降することが出来る。

既知の技法に従って、本分野の熟練者にとってその防
御免疫原ポリペプチドの全部または一部を生産する目的
で上述のDNA断片の全部または一部を発現ベクター系に
置くことが出来るのは自明である。そのような発現ベク
ター系は、しばしば異種ポリペプチドの発現を指示する
ために、原核または真核細胞中に挿入されるプラスミド
からなる。そのようなプラスミドは通常、異種ポリペプ
チドを特定するコード配列それ自体に加えて、そのプラ
スミドを含んでいる宿主細胞の選択、宿主内でのプラス
ミドコピー数の増幅、異種ポリペプチドのための遺伝子
の転写開始、異種ポリペプチドのための遺伝子の転写終
結のための配列を含む。従って、本研究はまた、2.5kbp
DNA断片の全部または一部を含んでいる宿主細胞および
ベクターにも向けられている。VZV蛋白の発現のために
適当な宿主細胞の例には、E.コリ（E.coli）およびB.サ
チルス（B.subtilis）のような原核細胞および、S.セレ
ヴィシエ（S.cerevisiae）およびチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞およびベロ（Vero）細胞を含むがそれに限定
されない継続哺乳動物細胞系がある。

これらの蛋白は、単独または併用で、生理的に受容可
能な担体、例えば生理食塩水または燐酸緩衝生理食塩水
中におかれ、哺乳動物の一員例えばモルモットに投与当
り約５から150mcg、好ましくは投与当り約10から50mcg
の量で投与されると、VZV疾患に対する中和抗体を誘起
するのに有用である。一つまたはそれ以上の量がVZV疾
患に対する有効な防御をもたらすのに投与されよう。該
蛋白は、注射、例えば皮下または筋肉内、により投与さ
れよう。これら蛋白はアデノ、ワクチニア、または単純
ヘルプスのような適当なウイルス発現ベクターの方法に
よりヒトの中で直接発現され得ることもまた理解される
べきである。

以下の実施例は本発明を説明するがそれだけに限定す
るものではない。以下の実施例中に指摘されている開示
はここに参考として取り入れられている。

実施例１ McAb（ケラー（Keller）ほか、ジャーナル オブ ヴ
ィロロジー（J.Virology）第52巻:293頁、1984年）を保
持する腹水液がマウスから収穫された。等量の0.15M Na
Clが添加された。次いで飽和（NH₄）₂SO₄溶液が全等量
添加され４℃で一夜保たれた。この混合液は10℃、2000
rpmで遠心された。そのペレットは蒸留水中に再懸濁（2
mg/ml）され、カップリングバッファー（0.1M NaHCO₃,
0.5M NaCl,pH8.4）に対して一夜透析された。１グラム
のシアン化臭素（cyanogen bromide）−活性化セファロ
ース4B（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウエイ
（Piscataway）、ニュージャージー）が0.001N HCl中で
膨潤され、60mlの粗珪酸ガラスロート中に空けられた。
このものは200mlの0.001N HClで、次いで50mlのカップ
リングバッファーで洗浄された。そのセファロースは次
いで10mlのMcAb溶液と混合され、23℃で２時間回転され
た。次いで、80μのエタノールアミンが添加され、そ
の溶液は23℃で１時間回転された。その樹脂は使い捨て
クロマトグラフィーカラム（BioRad）中に空けられ、水
を流出され、10ml容の以下の溶液で連続的に洗浄され
た： １） カップリングバッファー;2）0.1M Na₂HPO₄;0.5M
NaCl,pH8.2;3）0.1M NaOAc,0.5M NaCl,pH4.0;4）0.1M N
aHBO₄,pH8.2;5）3M KSCN;6）0.1M NaHBO₄,pH8.2。次い
で、使用前0.1M NaHBO₄,pH8.2,4℃で保存された。

VZV糖蛋白は、VZVの感染したMRC−５ヒト２倍体繊維
芽細胞より80％細胞変性効果を示すまで精製された。75
0cm²のローラーボトル中の細胞が、0.15M NaCl、0.01M
Na₂HPO₄、pH7.2で２回洗浄され水分がよく除かれた。10
mlの50mMトリス、pH7.5、２％Triton X−100、4mMフエ
ニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）がボトル
中で回転しつつ15分間インキュベートされた。同一の10
mlが次いで連続的にもう９つのローラーボトルを抽出す
るのに用いられた。新鮮な10ml量のバッファーが連続的
に10のローラーボトルをすすぐのに用いられ、最初の液
と共に貯められた。その結果20mlの抽出液が10のローラ
ーボトルからの素材に相当する。抽出液は用いられるま
で−70℃で貯蔵された。抽出液は融解され、４℃で0.15
M NaCl、0.01M Na₂HPO₄、0.05％トリトン（Triton）Ｘ
−100、pH7.2に一夜透析され、次いで４℃、1500rpm、1
5分の遠心により清澄化された。抽出液（20ml）は1gのM
cAb−結合樹脂に添加され、４℃で一夜振とうしつつイ
ンキュベートされた。そのスラリーは４℃、1500rpm、1
5分間遠心され、0.1M NaHBO₄、pH8.2で３回洗浄され
た。該糖蛋白は、23℃で10mlの3M KSCNとインキュベー
トすることにより溶出された。溶出物は直ちに４℃で0.
15M NaCl、0.01M Na₂HPO₄、0.05％トリトンＸ−100、pH
7.2に対して一夜透析され、約1mg/mlにまで濃縮され
た。

このピークは以下の基準によりVZV gp IIIであること
が確かめられた。還元条件下で行われたSDS−PAGEの銀
染色において、該試料は、ケラーほか、同上、すなわち
gp105;シラキ（Shiraki）ほか、シャーナル オブ ジ
ェネラル ヴィロロジー（J.Gen.Virology）第61巻、25
5頁（1982年）、すなわちgp1;グロウス（Grose）ほか、
インフェクシャス イムノロジー（Inf.immun.）第40
巻、381頁（1983年）、すなわちgp118、フォルガニ（Fo
rghani）ほか、シャーナル オブ ヴィロロジー 第52
巻、55頁（1984年）、すなわち118Kと述べられたよう
に、分子量105kDのひとつのポリペプチド種として解析
された。加うるに、その技法により精製された平行した
〔³⁵S〕−メチオニン標識細胞抽出液試料は、gp IIIに
対するMcAbで選択的に免疫沈降され、SDS−PAGEによる
解析において単一の105kD種を示した。

実施例２ 精製されたVZV gp IIIポリペプチドは試験管内でVZV感
染性を中和する抗体を誘導する モルモットが、完全フロインドアジュバント中の20マ
イクログラムのVZV gp III（実施例１で記載されたよう
に免疫−アフィニチークロマトグラフィーにより精製さ
れた）を筋肉内に投与され、続いて１月後に２週間おい
て不完全フロインドアジュバント中のVZV gp III各10マ
イクログラムづつ２回投与された。これら３回の投与の
後そのモルモットから血清が得られた。各モルモット血
清は、記載（ケラーほか、前出）されたように、試験管
内におけるVZV中和試験に用いられた。この試験によ
り、免疫後の血清はVZV−中和抗体を含んでいたが、免
疫前の血清は含まなかった。

実施例３ 精製されたVZV gp IIIポリペプチドのＮ−末端アミノ酸
配列 実施例１で記載されたように調製された200μｇのVZV
gp IIIが、調製用SDS−PAGE（7.5％ポリアクリルアミ
ド）により電気泳動され、ポリブレンでコートされたグ
ラスファィバー シート上に105kDの単一スポットとし
て単離された（ヴァン デ ケルコブ（van de Kerckov
e）ほか、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー（Eur.J.Biochem.）第152巻、９頁（1985
年））。この試料はアプライド バイオシステムズ 気
層 シクエネーターを用いるアミノ−末端配列分析にか
けられた（ヘウィック（Hewick）ほか、ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）第
256巻、7790頁（1981年））。各段階で産生したフエニ
ルチオヒダントイン アミノ酸は分離され、高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量された（スパイス（Speis
s）ほか、プロシーヂングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス 米国（Proc.Nat.Acad.
Sci.U.S.A.）第70巻、2970頁（1979年））。配列分析
は、gp IIIが単一のブロックされていないアミノ−末端
を有していることを明らかにした。表Ｉに示されるよう
に、この配列（２箇所欠けている）は、2.5kbp ORFのDN
A配列から帰属されていた実施例５（以下参照）中のア
ミノ酸18−27と完全に整合し得る。

実施例４ gp III遺伝子を同定するためのアミノ酸配列データに基
づくオリゴヌクレオチドの利用 実施例３において記載され表Ｉに与えられているgp I
IIのＮ−末端アミノ酸配列に基づいて、このアミノ酸配
列をコードすることのできる全ての可能なDNA配列の組
合せを現わすオリゴヌクレオチドのプールが設計され
た。このプールは lys−ser−tyr−val−thr−pro−thr（アミノ酸残基1
9−25）である。

これらオリゴヌクレオチドプールは、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼの存在下で〔³²P〕ATPにより標識された。
該プローブはVZVのHind III断片のサザーンブロットに
ハイブリダイズされた。この分析により、上述の遺伝子
配列は、Hind III B断片に帰属された。

実施例５ VZV DNAの2.5kbp部分のヌクレオチド配列の決定 該VZV−Hind III−B DNA部分の完全ヌクレオチド配列
はいくつかの大ORFを含む。これらORFのひとつは長さ2.
5kbpであり、90kDの蛋白をコードし、実施例３における
アミノ末端gp III配列をコードするDNA配列（実施例
４）を含む。該gp III糖蛋白をコードする全2.5kbp部分
のヌクレオチド配列は以下に与えられている： 実施例６ 実施例５のDNA配列およびその帰属されたアミノ酸配
列に基づいて、gp IIIに対する抗体の産生を誘起すると
思われるペプチドの合成の目的で３ドメインが選ばれ
た。これらドメインは： １）tyr¹⁵²−pro¹⁷³（22量体）、２）glu⁷⁹³−tyr
⁸⁰⁴（12量体）、３）gly⁸²⁸−thr⁸⁴¹（13量体）であ
る。最初の２つは、ペニンスラ ラボラトリーズ イン
ク（Peninsula Laboratories Inc.）から入手された。
後者はアプライド バイオシステムズ インク（Applie
d Biosystems Inc.）430A固層ペプチド合成機で合成さ
れた。アミノ−末端アセチルグループおよびカルボキシ
−末端水酸基をもつ全ての合成ペプチドは、逆層高速液
体クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析により特性付
けされた。各ペプチドは、確立された技法（ウオルター
（Walter）ほか、プロシーヂングス オブ ザ ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンス米国 第77巻、51
97頁（1980年）；グトコウスカ（Gutkowska）ほか、バ
イオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Commu
n.）第122巻、593頁（1984年））に従ってウシ血清アル
ブミンに結合された。５−10mg/mlの各結合物のある量
が、０週目に完全フロインド アジュバント中で、４週
目に不完全フロインド アジュバント中で、ウサギ筋肉
内に投与された。ウサギは８週目に放血された。血清は
ウエスタン ブロット解析に1:500希釈で用いられた。
該抗血清は105kDポリペプチドを認識した。免疫沈降分
析において、〔³⁵S〕メチオニン−標識感染細胞抽出液
とインキュベートされた血清の1:30希釈物は、105kDポ
リペプチドを免疫沈降した。該105kD種がgp IIIである
ことは、抗血清による105kDポリペプチドの免疫沈降性
に対する阻害により示されるように、gp IIIに対するMc
Ab（ケラーほか、前出、におけるA1）が２回の連続した
免疫沈降により、該ライゼート（細胞溶解液）から105k
Dポリペプチドを除去してしまう能力があるのに、gp I
またはgp IIに対するMcAb（ケラーほか、前出、におけ
る各C5およびB1）にはないことにより、決定的に示され
た。

実施例７ 該2.5kbp DNA ORFは、gp IIIへの前駆体蛋白をコードす
るRNAを選択することができる 細胞質性RNAが、VZV−感染 MRC−５細胞から、記載さ
れた（チャーグウィン（Chirgwin）ほか、バイオケミス
トリー 第18巻、5294頁（1979年））ように調製され
た。該VZV Hind III B断片内の2.5kbp ORFによりコード
されるRNAは、非選択ならびに他の断片により選択され
たRNAと同じように、ニトロセルロースに結合した（ク
ーパー（Cooper）ほか、ジャーナル オブ ヴィロロジ
ー 第37巻、284頁（1981年））クローン化されたVZV D
NA断片（エッカーおよびハイマン（Ecker ＆ Hyman）、
プロシーヂングス オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス 米国第79巻、156頁（1982年））
に対するハイブリダイゼーションにより選択された。こ
れらRNAは、ウサギ網状赤血球ライゼート中で翻訳され
た。該ポリペプチド産物は、実施例６中に記載された合
成ペプチドに対して形成されたひとつのポリクローナル
な単一特異的ウサギ抗体により免疫沈降された。この分
析により、該VZV Hind III−Ｂ断片中の2.5kbp ORFによ
り選択されたmRNAからの80kD試験管内翻訳産物が、抗−
ペプチド血清により免疫沈降されることが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/25 ＡＤＹ 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/04 Ｃ０７Ｋ 14/04 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 ロバート エス．ロウ アメリカ合衆国，19438 ペンシルヴア ニア，ハーレイスヴイル，メイプル ア ヴエニユー 323 (72)発明者 マーク ダブリユ．リーメン アメリカ合衆国，18901 ペンシルヴア ニア，ドイレスタウン，フエーサント ラン ドライヴ 326 (72)発明者 アンドリユー ジエー．デェイヴイソン イギリス国，スコツトランド，グラスゴ ー，ウイロービイ ドライヴ 24

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下のヌクレオチド配列を有するVZV DNA
   の2.5kbp断片。
2. 【請求項２】以下のヌクレオチド配列を有するVZV DNA
   の2.5kbp断片の全部または一部の断片を有するベクター
   であって、該全部または１部の断片によってコードされ
   る少なくとも免疫原性を有するVZVgp III蛋白断片を適
   当な宿主中で発現するように適応された発現ベクター。
3. 【請求項３】宿主が原核または真核生物である特許請求
   の範囲第２項に記載のベクター。
4. 【請求項４】免疫原性を有する当該蛋白の全部または１
   部を直接哺乳動物種中で発現できるウイルス性ベクター
   である、特許請求の範囲第２項に記載の発現ベクター。
5. 【請求項５】以下のヌクレオチド配列を有するVZV DNA
   の2.5kbp断片の全部または一部の断片を含んでいるベク
   ターであって、該全部または１部の断片によってコード
   される少なくとも免疫原性を有するVZVgp III蛋白断片
   を適当な宿主中で発現するように適応された発現ベクタ
   ーを有する原核または真核生物の宿主。