-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Post-Herpes-Neuralgie
ist die vorherrschende Krankheit, die mit der Entwicklung von Herpes
zoster, auch als Gürtelrose
bekannt, assoziiert ist. Die Neuralgie dauert typischerweise ein
bis sechs Monate und ist oft äußerst schmerzvoll.
-
In
den letzten Jahren häuften
sich Befunde, welche zeigen, daß Herpes
zoster durch die Reaktivierung von latentem Varicella-Virus verursacht
wird [Straus et al., Ann. Int. Med (1988); 108, 221–237; Hyman
et al., Lancet (1983); 2, 814–816;
Gilden et al., Nature (1983); 306, 478–480; Croen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1988); 85, 9773–9777;
Mahalingham et al., New Eng. J. Med. (1990); 323, 627–631]. Die
ursprüngliche
Varicella-Infektion kann als Ergebnis von Windpocken in der Kindheit
oder als Ergebnis einer Immunisierung mit einem Lebendvakzin von
abgeschwächtem
Varicella-Zoster-Virus zur Verhütung
von Windpocken stattgefunden haben. In jedem Fall scheint das Virus
im System des infizierten Individuums lang nach den Windpocken oder
der Impfung zu verbleiben. Es scheint, daß der Ort der VZV-Latenz Nervenzellen
in Spinalganglien sind.
-
Jahre
nachdem VZV latent wurde, reaktiviert sich das Virus durch einen
noch schlecht verstandenen Mechanismus. Nichtsdestoweniger führt die
Reaktivierung von VZV und dessen anschließende Replikation zu Herpes
zoster. Im Verlauf dieser Reaktivierung von VZV und im Anschluß daran
entwickelt sich schwere Post-Herpes-Neuralgie.
-
Zahlreiche
Berichte in der Literatur legten nahe, daß es eine Korrelation zwischen
verringerter Immunkompetenz und Reaktivierung von Herpes zoster
aus seinem latenten Zustand geben könnte. Vorschläge hinsichtlich
des Mechanismus, durch den die Reaktivierung stattfindet, umfassen
eine verringerte Immunität
auf Zellbasis, wie z. B. die Verringerung der Anzahl der einen CD4+-Rezeptor tragenden Blut-T-Lymphozyten,
welche für
die Erkennung von Nicht-Selbst-Antigenen,
die von MHC-Typ-II-Molekülen
nach Phagozytose von VZV präsentiert
werden, verantwortlich sind. Alternativ wurden auch die verringerten
Niveaus von CD8+-T-Lymphozyten, verantwortlich
für die
Abtötung
von Zellen, in denen MHC-Typ-I-Moleküle Nicht-Selbst-Antigene erkennen
und präsentieren,
als möglicher
Mechanismus, der die VZV-Reaktivierung erlaubt, vorgeschlagen. Neumeyer
et al., [N. E. J. Med., S. 1456, 29. Mai 1986) stellten eine Abnahme
des Verhältnisses
von CD4+/CD8+ vor
Zoster und eine anschließende
Erhöhung
des Verhältnisses
nach Ende des klinischen Syndroms fest.
-
In
einer Studie wurde ein Varicella-Vakzin älteren Versuchspersonen in
einem Versuch verabreicht, deren CMI-Reaktionen auf VZV zu stimulieren.
Die VZV-Immunisierung dieser seropositiven Personen wurde aufgrund
der zuvor beschriebenen altersbezogenen Abnahme der VZV-spezifischen
CMI [Miller AE, Neurology (1980); 30, 582–587; Berger R, Florent G,
Just M, Infect. Immun. (1981); 32, 24–27; Burke BL, Steele, RW, Beard
OW, Arch. Intern. Med. (1982); 142, 291–293] und der Möglichkeit,
daß die
altersbezogene Reaktivierung von VZV (als Herpes zoster) eine Folge
dieser Abnahme ist, unternommen. Dieses abgeschwächte Lebendvakzin wurde gut
toleriert; es traten keine schwerwiegenden lokalen oder systemischen
Reaktionen auf und die milden Reaktionen waren nicht sehr häufig. Eine
systemische Ausbreitung des Vakzin-Virus, wie durch minimalen Hautausschlag
manifestiert, trat gelegentlich auf (möglicherweise in 6/245 Injektionen).
Obwohl dies von theoretischer Bedeutung bei älteren Patienten mit einer
dokumentierten Verringerung spezifischer zellvermittelter Immunität ist, erwiesen
sich die resultierenden Läsionen
und Symptome als von keiner klinischen Bedeutung. Dies stimmt mit
in Erzählungen
wiedergegebenen Beobachtungen überein,
daß seropositive
Großeltern
nach Exposition gegenüber
Enkeln mit Varicella nicht infiziert sind.
-
Die
Defizite bei der VZV-spezifischen Immunität bei älteren Personen treten im Kontext
von allgemein verringerten OMI-Reaktionen auf. Diese werden in Assays
von verzögerten
Haut-Überempfindlichkeitsreaktionen
[Goodwin JS, et al., Clin. Exp. Immunol. (1982); 48, 403–410] und
in in-vitro-Proliferationsreaktionen von durch Mitogene stimulierten
T-Lymphozyten [Hayward AR, et al., J. Clin. Immunol. (1987); 7,
174–178;
Tice RR, et al., J. Exp. Med. (1979); 149, 1029–1041; Murasko DM, et al.,
Am. J. Med. (1986); 81, 612–618]
nachgewiesen. Die meisten Studien dokumentieren eine normale T-Zellzahl,
es gibt jedoch eine Abnahme der CD4+-Zellen
[Nagel Je, et al., J. Immunol. (1981); 127, 2086–2088; Thompson JS, et al.,
J. Am. Geriate Soc. (1984); 32, 274–281]. Die Anzahl und Funktion
der natürlichen
Killerzellen sind bei diesen Patienten normal [Hayward AR, Herberger
M, J. Clin. Immunol. (1987); 7, 174–178; Nagel Je, et al., J.
Immunol. (1981); 127, 2086–2088].
Eine erhöhte
Zellzykluszeit, wie in der Studie von Tice et al. postuliert, wäre eine
mögliche
Erklärung
für den
Verlust von CMI mit dem Alter [Tice RR, et al., J. Exp. Med. (1979);
149, 1029–1041].
Jedoch favorisieren nachfolgende Studien keine Veränderung
des Zellzyklus oder irgendeine Verringerung im Ausmaß der klonalen
Expansion nach Antigenstimulation [Staiano-Coico L, et al., J. Immunol.
(1984); 132, 1788–1792; Sohnie
PG, et al., Clin. Exp. Immunol. (1982); 47, 138–146]. Stattdessen zeigen DNA-Analysen
eine erhöhte Häufigkeit
von DNA-Schäden,
Schwesterchromatid-Austauschen und Zellverlust in mitogen-stimulierten
Zellen von älteren
Personen [Dutkowski RT, et al., Mutat. Res. (1985); 149, 505–512]. Verringerte
Proliferationsreaktionen auf Mitogene sind nicht notwendigerweise
von reduzierter IL2- oder IL2R-Synthese begleitet [Dutkowski RT,
et al., Mutat. Res. (1985); 149, 505–512]. Der am stärksten übereinstimmende
Defekt, der von Chopra et al. gefunden wurde, war eine erhöhte γ-Interferon-Produktion
und ein verringertes Überleben
von stimulierten Zellen, was die Verwendung eines Boosters stützt [Chopra
RK, et al., Clin. Immunol. Immunopathol. (1989); 53, 297–308].
-
Andere
Studien bei einer Population im vorgerückten Alter zeigten, daß die verringerte
VZV-spezifische Immunität,
welche das erhöhte
Auftreten von HZ bei älteren
Personen begleitet, mindestens teilweise durch eine verringerte
Häufigkeit
von VZV-spezifischen CD4+-Zellen im Blut
erklärt
wird. Diese Patienten haben jedoch normale T-Zellzahlen und ihre
NK-Zellaktivität
wird als Reaktion auf VZV-Antigen aufrechterhalten, vorausgesetzt,
daß ausreichend
IL2 vorhanden ist [Hayward AR, et al., J. Clin. Immunol. (1987);
7, 174–178]. Die
Häufigkeit
von T-Zellen, welche den Gedächtniszell-Phänotyp (CD45RO)
exprimieren, nimmt mit dem Alter von einem Mittel von 43 + 17% mit
28 Jahren auf 65 + 14% mit 70 Jahren zu, so daß die Abnahme der VZV-spezifischen
Immunität
mit dem Alter nicht auf einen selektiven Verlust dieser Untergruppe
zurückzuführen ist.
CD45RO+-Zellen bilden mehr γ-Interferon
als CD45RA–-Zellen,
was mit den Ergebnissen von Chopra und Mitarbeitern korreliert.
-
Was
immer der Mechanismus der Kontrolle oder Reaktivierung von Zoster
ist, kein medizinischer Befund hat effektiv eine Verhinderung der
Reaktivierung von Herpes zoster (Gürtelrose) oder Verringerung
der Post-Herpes-Neuralgie demonstriert. Chemotherapeutische Mittel
als Klasse waren bei der Behandlung dieses schmerzhaften Zustands äußerst unbefriedigend
[Watson, C. P. N., Neurol. Clin., 7, 231–248 (1989); Straus et al.,
Ann. Int. Med. 108, 221–237
(1988)].
-
Starr
et al., 'Immunization
of healthy seropositive middle aged and elderly adults with varicella-zoster virus
(VZV) vaccine' in ”Proqrarns
and Abstracts of the Twenty-Seventh Interscience Conference an Antimicrobial
Agents and Chemotherapy”,
New York, NY, 4.–7.
Oktober 1987, Seite 313, maßen
eine Erhöhung
des Niveaus von Antikörpern
gegen VZV bis zu vier Monate nach der Impfung. Es gibt keine Offenbarung
oder Erkenntnis, daß dies
eine Verringerung des Auftretens oder der Schwere von Post-Herpes-Neuralgie
voraussagen könnte.
-
Hayward
et al., J. Infectious Diseases, 163, 1991, 873–875, offenbaren die Messung
von Antikörperniveaus
und T-Zellreaktionen nach einer Impfung. Sie stellen fest, daß diese
Messungen nicht mit einer Verringerung der Schwere oder des Auftretens
von Post-Herpes-Neuralgie gleichzusetzen sind.
-
Diese
Erfindung ist ein Verfahren zur Verringerung von Post-Herpes-Neuralgie
und zur Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster-Reaktivierung.
Die Wirksamkeit des Verfahrens wird durch in vivo erhaltene positive
Resultate demonstriert, bei denen das Niveau der VZV-spezifischen
Lymphozyten zunimmt. Diese Erhöhung
der Häufigkeit
von Responderzellen (RZH), induziert durch Immunisierung gemäß dem Verfahren
dieser Erfindung, ergibt einen Immunstatus in vivo, welcher den
Krankheitszustand, einschließlich VZV-Reaktivierung
und Post-Herpes-Neuralgie,
widerspiegelt. Eine klinische Langzeituntersuchung auf breiter Basis
an mehreren Zentren, bei der Risikopersonen lebendes abgeschwächtes oder
abgetötetes
VZV verabreicht wird, zeigt, daß eine
Immunisierung gemäß dieser
Erfindung zu einem signifikanten Schutz gegenüber VZV-Reaktivierung führt, oder,
falls eine Reaktivierung eintritt, zu einer signifikanten Verringerung
der Dauer oder Schwere der Post-Herpes-Neuralgie.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
wird ein Verfahren zur Linderung der Post-Herpes-Neuralgie und zur
Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster-Reaktivierung
bei Risikopersonen beschrieben, bei dem eine VZV-Antigen-Stimulierung
eingesetzt wird. Das VZV-Antigen ist ein lebendes abgeschwächtes VZV-Virus
oder ein abgetötetes
vollständiges
VZV-Virus.
-
Risikopersonen
sind diejenigen, welche Varicella (Windpocken), auch nur in subklinischer
Form, hatten oder einem Varicella-Lebendvakzin ausgesetzt waren.
Ein besonderes Risiko weisen ältere
oder immungeschwächte
Personen auf. Der Risikostatus kann durch positive Anti-VZV-Serumantikörper oder
eine positive Reaktion auf einen VZV-Antigen-Hauttest bestätigt werden.
Ein besonderes Indiz eines Risikostatus ist eine VZV-Responderzellhäufigkeit
von weniger als 1 Responderzelle auf 68.000, während man einem geschützten Zustand
nahekommt, wenn die RZH näher
bei 1 Responderzelle auf 40.000 liegt.
-
Risikopersonen
wird das VZV-Antigen in einer immunologisch wirksamen Menge verabreicht
und sie werden hinsichtlich einer Rückkehr zum Risikostatus überprüft, zu welchem
Zeitpunkt eine weitere Immunisierung vorgenommen werden kann.
-
Die
Wirksamkeit des Verfahrens wird demonstriert durch positive Ergebnisse,
die in einer klinischen Langzeituntersuchung auf breiter Basis an
mehreren Zentren erhalten wurden.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
In
dem Verfahren dieser Erfindung wird eine Person, die ein Risiko
zur Entwicklung von Herpes zoster aufweist, mit einem VZV-Antigen
immunisiert, um die Erhöhung
von Anti-VZV-Immunreaktionen
zu induzieren. Diese Immunisierung verringert die Schwere einer
mit einer VZV-Reaktivierung
assoziierten Post-Herpes-Neuralgie und verringert oder verhindert
das Reaktivierungsereignis selbst.
-
Somit
stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Varicella-Zoster-Virus
(VZV), welches ein lebendes abgeschwächtes VZV-Virus oder ein abgetötetes vollständiges VZV-Virus
ist, zur Herstellung eines Vakzins zur Immunisierung einer Person
eines Alters von mehr als fünfzig,
welche Varicella oder einem Varicella-Lebendvakzin ausgesetzt war,
zur Verringerung der Dauer oder Schwere von Post-Herpes-Neuralgie
und zur Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster-Reaktivierung
bereit.
-
Vorzugsweise
ist das VZV der abgeschwächte
Oka-Stamm.
-
Vorzugsweise
erfolgt die Immunisierung subkutan. Vorzugsweise werden mindestens
1.000 plaquebildende Einheiten (PFU) zur Immunisierung eingesetzt.
-
Vorzugsweise
ist der abgeschwächte
Oka-Stamm des Varicella-Zoster-Virus vor der Immunisierung in einem
lyophilisierten Zustand gelagert. Noch bevorzugter wird er vor der
Immunisierung mit destilliertem Wasser aus dem lyophilisierten Zustand
rekonstituiert.
-
Eine
Risikoperson schließen
jede Person über
fünfzig
ein, welche Windpocken, auch von subklinischer Schwere, erlebt hat,
und jede, die eine Impfung mit lebendem Varicella-Zoster-Virus erhalten hat.
Diejenigen aus dieser Klasse, welche ein besonderes Risiko aufweisen,
sind Leute, welche aus diesem oder jenem Grunde immungeschwächt sind.
Dies kann auf die Entwicklung einer erworbenen Immunschwächeerkrankung (z.
B. AIDS, ARC) oder auf eine Chemotherapie oder andere immunsuppressive
Therapie (z. B. Transplantatabstoßungs-Immunsuppression) zurückzuführen sein.
Darüber
hinaus nimmt das Auftreten von Zoster mit dem Alter zu. Bei Risikopersonen über 50 ist
die Häufigkeit
2,5–5,0
Fälle/1000
Personen/Jahr. Im Alter von 80 steigt die Häufigkeit auf 5–10 Fälle/1000
Personen/Jahr. Dieses erhöhte
Risiko korreliert mit abnehmender zellvermittelter Immunität gegenüber VZV.
-
Zur
Feststellung, ob jemand eine Risikoperson ist, ohne sich auf persönliche Akten
oder die Erinnerung zu stützen,
kann ein einfacher Hauttest wie im folgenden Beispielsabschnitt
beschrieben durchgeführt werden.
Ein weiteres Verfahren zur Feststellung eines Risikostatus beinhaltet
eine serologische Beurteilung, beispielsweise durch einen Anti-VZV-Antikörper-ELISA-Assay. Ein noch weiteres
Verfahren ist die Messung der VZV-spezifischen Responderzellhäufigkeit
(RZH) und falls sie als etwa 1 auf 68.000 befunden wird, weist die
Person mutmaßlich
ein Risiko auf. Für
die Zwecke dieser Erfindung kann jedoch jede beliebige Person in der
Population als risikobehaftet betrachtet werden, nachdem es keine
bekannten Nebenwirkungen irgendwelcher Bedeutung gibt, die mit einer
erfindungsgemäßen breiten
Immunisierung verbunden sind, vorausgesetzt, daß schwer immungeschwächte Personen,
wie z. B. diejenigen, welche mit dem Human-Immunschwäche-Virus
(HIV) infiziert sind oder ein erworbenes Immunschwächesyndrom
(AIDS) im Vollbild aufweisen, nicht mit einem lebenden VZV-Antigen
immunisiert werden.
-
Das
VZV-Antigen kann ein lebendes abgeschwächtes VZV sein, das nach dem
in
US-Patent 3,985,615 (Takahashi)
offenbarten Verfahren oder wie in den folgenden Beispielen offenbart
hergestellt wurde. Die Lebensfähigkeit
von lebendem abgeschwächtem
Varicella kann in irgendeiner von einer Reihe bekannter Stabilisierungsformulierungen
aufrechterhalten werden. Das abgeschwächte Oka-VZV ist bei der ATCC
(Hinterlegungsnummer VR-795) hinterlegt und ist auch im Handel als
VARIVAX
®,
von Merck & Co.,
Inc., vertrieben, im Handel erhältlich.
Andere Stämme
von VZV können
eingesetzt werden, falls sie ausreichend abgeschwächt sind,
um keine natürliche
Erkrankung bei Personen zu verursachen, welche sich zum ersten Mal
einer Impfung unterziehen mögen,
oder können
zur Produktion von Tod-VZV-Antigenen eingesetzt werden.
-
Das
VZV-Antigen kann ein inaktiviertes Virus sein. Dieses Material kann
einfach nach einem so wenig subtilen Verfahren wie der Erhitzung
eines Aliquots von lebendem VZV und Überprüfung der Anzahl der restlichen
plaquebildenden Einheiten (PFU) durch einen geeigneten Assay hergestellt
werden oder kann durch verfeinertere Techniken, wie z. B. Gammabestrahlung
für bekannte
Zeitspannen und Intensität,
inaktiviert werden. Ein abgetötetes
vollständiges
Virus ist in der vorliegenden Erfindung als ebenso wirksam wie ein
lebendes VZV nachweisbar und kann auf irgendeine geeignete Weise
hergestellt werden, so lange die VZV-Antigen-Integrität aufrechterhalten
wird. Die Erhöhungen
der Anti-VZV-Responderzellhäufigkeiten
sind gleich, wenn hitzeabgetötetes
VZV in einer Dosis von etwa 10 μg
oder mehr eingesetzt wird oder wenn etwa 1000 PFU von lebendem Virus
verabreicht werden. Die Verwendung eines abgetöteten vollständigen VZV
ist bevorzugt, insbesondere wenn der Empfänger stark immungeschwächt ist.
-
Bei
dem Verfahren dieser Erfindung sind, welches Antigen auch immer
gewählt
wird, lebendes abgeschwächtes
VZV oder inaktiviertes Virus, die folgenden Anzeichen einer immunologisch
wirksamen Dosis und Wirksamkeit des Verfahrens von Nutzen:
- 1. Erhöhung
der VZV-spezifischen Responderzellhäufigkeit um etwa 30% (RZH,
siehe Beispiel unten).
- 2. Erhöhung
der zytotoxischen Anti-VZV-T-Zellen (CTI), wie gemessen durch eine
Erhöhung
der VZV-spezifischen CD8+-Zellen (Killerzellen,
siehe Beispiel unten).
- 3. Erhöhung
der Anti-VZV-Helfer-T-Zellen, wie gemessen durch eine Erhöhung der
VZV-spezifischen CD4+-Zellen (siehe Beispiel
unten).
- 4. Erhöhung
des Niveaus an Anti-VZV-spezifischen Antikörpern.
- 5. Erhöhung
des Niveaus an Lymphokinen, wie z. B. Interferon oder Interleukin.
- 6. Verringerung der Dauer oder Schwere von Post-Herpes-Neuralgie
bei einem Individuum für
einen Zeitraum von weniger als einen Monat nach Entwicklung von
Zoster.
- 7. Verringerung des Auftretens von Zoster auf ein statistisches
Niveau, unterhalb des bei der allgemeinen Population von Individuen,
die ein ähnliches
Risiko aufweisen, festgestellten Auftretens.
-
Es
gibt kein allgemein akzeptiertes in vitro-Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von zellvermittelten Immunreaktionen beim Menschen. Wir
wählten
Grenzverdünnungskulturen
mit RZH-Analyse für
diese Studie, da wir erwarteten, daß diese Vorgehensweise genauer
als eine SI-Messung
sein würde.
Beide Analyseverfahren zeigten eine signifikante Stimulation der
VZV-spezifischen
Immunität
nach der Immunisierung. Unsere Bevorzugung der RZH-Ergebnisse basiert
auf der Beobachtung niedrigerer Standardabweichungen vom Mittel
bei diesen Ergebnissen im Vergleich zu den SI-Ergebnissen. Dies
könnte
teilweise die Tatsache reflektieren, daß 196 Gewebekulturmulden analysiert
werden, um eine RZH-Schätzung
zu erhalten, im Vergleich zu den 6–8 Kulturmulden, die im allgemeinen
zur Berechnung des SI-Werts eingesetzt werden. Nichtsdestoweniger
können
die Grenzverdünnungskulturen,
die wir einsetzten, nur eine indirekte Abschätzung der Häufigkeit von Respondern ergeben.
Der bei dieser Studie verwendete Nenner ist die Anzahl der aus einem
Ficoll-Gradienten gewonnenen Zellen; von diesen gehört nur ein
Viertel zu der CD4+-CD45RO+-Population,
welche der Gedächtnis-Phänotyp ist,
von dem die VZV-spezifisch reagierenden T-Zellen genommen werden
[Beverly PCL, Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1990); 159, 111–112; Hayward
A, Giller R, Levin M, Viral Immunol. (1989); 2, 175]. Es ist deshalb
wahrscheinlich, daß unsere
RZH-Abschätzung
die Reaktion auf die Impfung unterschätzt. Nichtsdestoweniger ist
der nach der Impfung erhaltene mittlere RZH-Wert (1/40.000) von
derselben Größenordnung
wie der nach HZ erreichte [Hayward A, Kevin M, Wolf W, Angelova
G., J. Infect. Dis. (1991); 163, 873–875], wobei der Eintrag von
endogen produziertem VZV-Antigen wahrscheinlich groß ist. Dieses nach
Impfung erreichte Immunitätsniveau
ist auch vergleichbar mit demjenigen von Personen eines Alters von 35
bis 45 Jahren ohne Symptome. Die Stimulation der Immunreaktion bei
der vorliegenden Studie wurde 24 Monate lang mit einer vorausgesagten
Halbwertszeit von 56 Monaten aufrechterhalten und war keine Funktion des
Alters. Diese letztere Eigenschaft ist von Bedeutung, da die ältesten
Personen am wahrscheinlichsten HZ entwickeln werden und dadurch
die Hauptziele einer präventiven
Vakzinstrategie wären.
-
Die
RZH-Reaktion nach der Impfung korrelierte nicht mit der gegebenen
Vakzindosis, die von 1.000–12.000
PFU variierte. Darüber
hinaus wird die Anzahl der reagierenden Versuchspersonen durch die Gabe
höherer
Vakzindosen nicht erhöht.
Dies könnten
Hinweise auf eine Replikation des Vakzin-Virus in den Empfängern darstellen,
so daß selbst
die geringste verabreichte Dosis zu ausreichend VZV-Antigen für eine maximale
Auswirkung auf die RZH führt.
Alternativ kann der relativ große
VZV-Antigengehalt der niedrigeren Dosen (1.000 PFU enthalten beispielsweise
etwa 2 Einheiten VZV-Antigen) für
eine maximale Immunisierung ausreichend sein. Nur γ-Interferon-Reaktionen von kultivierten
Zellen korrelierten mit höherer
Dosis oder einem geringeren Alter.
-
Die
VZV-Vakzin-Wirkungen auf VZV-Antikörper waren von geringerer Größe und kürzerer Dauer
als die Auswirkungen auf CMI. Dies ist wahrscheinlich für das Langzeitziel
der Verhütung
von HZ nicht kritisch, nachdem die Titer bekanntermaßen in 1
bis 2 Jahren nach HZ auf Grundlinienniveaus abnehmen [Hayward A, Kevin
M, Wolf W, Angelova G, J. Infect. Dis. (1991); 163, 873–875] und
die VZV-Antikörperniveaus
nicht signifikant mit dem Alter abnehmen [Miller AE, Neurology.
(1980); 30, 582–587;
Gershon AA, Steinberg SP, Am. J. Med. Sci. (1981); 282(1), 12–17]. Die
mittleren Vor-Vakzin-VZV-Antikörperniveaus
in unseren Versuchspersonen der Studie, wie durch ELISA gemessen,
waren vergleichbar mit denjenigen viel jüngerer erwachsener Kontrollen.
-
Die
Post-Vakzin-Beurteilung der Immunreaktion beinhaltete eine Messung
der γ-Interferonfreisetzung durch
MNC, die VZV-Antigenen ausgesetzt waren. Diese wurde aufgrund des
in-vitro-Befunds,
daß γ-Interferon
durch natürliche
Killerzellen sowie durch Antigen-spezifische T-Zellen gebildet wird
[Hayward AR, et al., Pediatr. Res. (1986); 20, 398–401], als
potentiell unabhängige
Variable beurteilt. Natürliche
Killerzellen und γ-Interferon
tragen beide zur Einschränkung
der Herpes-Virus-Replikation in vitro bei [Leibson PJ, et al., J.
Virol. (1986); 57, 976–982].
Obwohl eine statistisch signifikante Erhöhung von in-vitro-γ-Interferon
3 Monate nach der Immunisierung beobachtet wurde, waren die Standardfehler
sehr groß.
Eine γ-Interferon-Messung
ist deshalb kein starkes Indiz für
das Ergebnis der VZV-Immunisierung.
-
Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
-
BEISPIEL 1
-
Herstellung von abgeschwächtem VZV-Lebendvakzin
-
A. VZV-PRODUKTION:
-
Lebendes,
abgeschwächtes
Varicella-Zoster-Virus kann nach der Offenbarung des
US-Patents 3,985,615 oder
nach irgendeinem der anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren
hergestellt werden.
-
B. ASSAY FÜR DIE BESTIMMUNG DER VZV-AUSBEUTE:
-
Die
Infektivitätstiter
von Varicella-Zoster-Virus (VZV)-Präparationen wurden unter Anwendung
des von Krah et al., [J. Virol. Methods, 1990, 27: 319–326] oder
von Takahashi et al., (Postgrad Med. J. 61 (Suppl. 4) 736–741, (1985)]
beschriebenen Agarose-Überschichtungs-
oder Flüssigkeits-Überschichtungsverfahren
abgeschätzt.
Der Assay wird folgendermaßen
durchgeführt:
MRC-5-Zellen
werden in 60-mm-Gewebekulturplatten mit 6 × 105 Zellen
in 5-ml-Volumina BME (Basal Medium Eagle mit Hank's ausgewogener Salzlösung) mit
100 mg/l Galactose, 50 μg/ml
Neomycin, 2 mM L-Glutamin ausgesät
und in einer 5%igen CO2-Atmosphäre bei 35°C inkubiert.
Nach Inkubation für
24–48
Stunden erreichen die Zellen 50–80%
Konfluenz. Das Wachstumsmedium wird durch Absaugen entfernt und
die Zellen werden mit 100 μl
VZV-Lösung,
verdünnt
in einem geeigneten Virus-Verdünnungsmittel,
wie z. B. SPGA-Puffer oder flüssigem
Erhaltungsmedium (LMM), infiziert. SPGA-Puffer enthält 7,5%
(Gew./Vol.) Sucrose, 11 mM Kaliumphosphat, 0,1% (Gew./Vol.) Natriumglutamat
und 1% Humanserumalbumin. Dem Virus wird die Anheftung für ≥ 1 Stunde
bei 35°C
in einer 5%igen CO2-Atmosphäre gestattet.
Die VZV-infizierten
Zellkulturen werden dann mit 5 ml Agarose-Überschichtungsmedium (AOM)
oder flüssigem
Erhaltungsmedium (LMM) überschichtet.
Agarose-Überschichtungsmedium
ist eine Mischung von zwei Lösungen,
flüssigem Überschichtungsmedium
(LOM) und Agaroselösung.
LOM enthält
Minimal Essential Medium mit Earle's Salzen (MEM), 2% hitzeinaktiviertem
fötalem
Kalbsserum, 50 μg/ml
Neomycinsulfat und 2 mM L-Glutamin. Agaroselösung wird hergestellt, indem
4,5 g Agarose niedriger Gelbildungstemperatur in 100 ml MEM für 15 Min.
bei 121°C
erhitzt werden und der Lösung
gestattet wird, auf 45°C
abzukühlen.
AOM wird hergestellt durch Mischen eines Volumens Agaroselösung mit
4 Volumina eines 1,25 × Konzentrats
von LOM bei 45°C.
Die Platten werden auf 23–25°C abgekühlt, um
dem AOM die Verfestigung zu gestatten. Die Kulturen werden inkubiert,
um die Plaqueentwicklung zu erlauben. Nach 6–7 Tagen werden die Platten,
die LOM erhielten, mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) überschichtet
und mit einer gläsernen
Pasteurpipette eingeritzt, um die Agarose zu lockern und zu entfernen.
Medium wird von den Platten, die LMM erhielten, abgesaugt und die
Platten werden durch Anfärbung
der Zellen mit einer Lösung
von 0,2% (Gew./Vol.) Coomassie Blue R-250 in Ethanol-1% Essigsäure sichtbar
gemacht. Die Plattenzahlen sind das Mittel von 4–5 Replikat-Platten und als
plaquebildende Einheiten pro ml (PFU/ml) ausgedrückt.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung eines Vakzins von inaktiviertem
VZV
-
Lebendes
VZV, nach dem Verfahren von Beispiel 1 oder irgendeinem anderen
Verfahren hergestellt, kann durch Inkubation eines Aliquots des
Virus bei etwa 50°C
für etwa
5–15 Tage
inaktiviert werden. Alternativ kann lebendes VZV inaktiviert werden
durch Exposition gegenüber
Gamma-Strahlung oder irgendein anderes Mittel zur Inaktivierung
des Virus, solange die antigene Integrität des Virus nicht beeinträchtigt wird.
-
In
einem Versuch wurde lebendes abgeschwächtes CR453 VARIVAX® wie
folgt inaktiviert:
Hitzeinaktivierungsverfahren: 500 Gefäße von Vakzin
Lot CR 453 wurden als unrekonstituierte intakte Gefäße 12 Tage
lang in einem Inkubator bei 50°C
erhitzt. Nach der Hitzebehandlung wurden alle 500 erhitzten Gefäße mit auffallenden,
unauslöschbaren
Dreiecken in roter Tinte in der Mitte eines jeden Gefäßetiketts
markiert und bei –20°C gelagert.
-
Analyse:
-
Restgehalt
an infektiösem
Varicella-Virus in erhitztem Vakzin: Die Bestimmung der Anzahl plaquebildender
Einheiten wurde durchgeführt
wie in Takahashi et al., Postgrad Med. J. 61 (Suppl. 4) 736–741 (1985), beschrieben.
Insgesamt 5 ml rekonstituiertes Material aus 10 Gefäßen von
erhitztem Vakzin wurden einem Assay unterworfen. Ein Wert von 2,4
plaquebildenden Einheiten pro ml wurde erhalten. Ein Standard-Assay
von nicht erhitztem Vakzin ergab einen Wert von 3830 plaquebildenden
Einheiten pro ml.
-
Varicella-Virus-Antigen
gemäß Dot-Blot-Assay:
Die Bestimmung der Virusantigenmenge wird durch Dot-Blot-Analyse
oder wie in Beispiel 9 unten beschrieben durchgeführt. Das
erhitzte Produkt wurde mittels Dot-Blot-Analyse abgeschätzt, 9,8
Einheiten Antigen pro ml zu enthalten. Das nicht erhitzte Standard-Vakzin, das
gleichzeitig einem Assay unterworfen worden war, wurde abgeschätzt, 9,4
Einheiten Antigen pro ml zu enthalten.
-
Antigen-Analyse
mittels Immunoblots: Ein experimentelles Western-Blot-Verfahren,
nach Verfahren gestaltet, die für
andere Agenzien eingesetzt worden waren, wurde dazu verwendet, die
Antigene in erhitzten und normalen Vakzinen zu vergleichen. Die
beiden Produkte schienen einander innerhalb der Grenzen der visuellen
Betrachtung von Immunblots, die entweder mit einem humanen polyklonalen
Antiserum oder einem monoklonalen Antikörper gegen virales Glycoprotein
I reagiert hatten, sehr ähnlich
zu sein.
-
Proben
von vollständigem
VZV, wie oben beschrieben inaktiviert, wurden als Immunogen eingesetzt, um
zellvermittelte Immunreaktionen gegen Herpes zoster zu aktivieren.
Gleiche Dosen, die etwa 10.000 PFU an lebendem oder abgetötetem VZV äquivalent
waren, wurden Personen mit einem Risiko zur Entwicklung von Herpes
zoster verabreicht. Die Antikörperreaktion
(Ab) und die VZV-Responderzellhäufigkeit
(RZH) vor und 3 Monate nach der Immunisierung ist im folgenden zusammengefaßt:
Vakzin | Inaktiviert | Lebend |
Anzahl
der Empfänger | 33 | 33 |
Alter
der Empfänger | 67 ± 7 | 64 ± 6 |
Ab-Anfangstiter | 37,4
(15–91) | 51
(21–123) |
Ab-Titer
nach 3 Mon. | 98,7
(42–227) | 124,5
(58–226) |
Anfangs-RZH | 1/63.000
(1/31.000–1/126.000) | 1/71.000
(1/40.000–1/127.000) |
RZH
nach 3 Mon. | 1/23.980
(1/8.275–1/69.484) | 1/27.400
(1/11.388–1/66.436) |
-
Diese
Daten zeigen an, daß eine
substantielle Erhöhung
der Anti-VZV-Immunreaktionen erzielt wird, sei es, daß die Immunisierung
mit lebenden oder abgetöteten
VZV durchgeführt
wird.
-
BEISPIEL 3
-
Anti-VZV-Hauttest
-
Ein
Varicella-Hauttest wird durchgeführt
durch subkutane Einführung
eines VZV-Antigens oder Kontrollantigens, gefolgt von der Feststellung
erythematöser
Veränderungen
etwa 48 Stunden nach der Einführung
des Antigens. Dementsprechend kann das Verfahren von Kamiga et al.
[J. Inf. Dis. 136, 784–788
(1977)], Babu et al. [J. Clin. Microbiol. 25, 2193–496, (1987)]
oder Lafussa et al. [J. Inf. Dis. 152, 869–875 (1985)] eingesetzt werden,
um den Hauttest durchzuführen.
Alternativ könnte
das inaktivierte Antigen, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben,
oder das gereinigte Antigen von Beispiel 3 eingesetzt werden, um
das VZV-Antigen bereitzustellen. Auf jeden Fall wurde von Takahashi
[Adv. Virus. Res. 28, 285–356
(1987)] gezeigt, daß ein
negativer Hauttest-Antigen-Assay
eng mit der Anfälligkeit
für eine
Varicella-Infektion korreliert. Diesbezüglich sind VZV-Glycoproteine
mit Molekulargewichten von 15.000 und 45.000, die mit zellvermittelter Immunität eng assoziiert
sind, als Indikatoren der Anfälligkeit
für eine
Zoster-Reaktivierung bevorzugt.
-
BEISPIEL 4
-
Assay hinsichtlich der VZV-Responderzellhäufigkeit
-
VZV-Responderzellhäufigkeiten
können
nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gemessen werden, beispielsweise
wird eine Grenzverdünnungsanalyse
von M. Zauderer [Handbook of Experimental Immunology, Band 2 – Cellular
Immunology, Blackwell Scientific Publications, D. M. Weir et al. – Herausgeber, (1986) – Kapitel
65] beschrieben. Siehe auch die Offenbarung in Beispiel 7 unten,
Abschnitt 5: ”Bestimmung der
Häufigkeit
von mononuklearen Blutzellen (MNc), welche als Reaktion auf VZV-Antigen
proliferieren”.
-
Nach
dem Verfahren dieser Erfindung werden Niveaus von Responderzellen
erzielt, die etwa 1 Responderzelle auf 40.000 nahekommen, welches
dasselbe RZH-Niveau ist, wie es bei Personen nach Zoster gefunden
wird.
-
BEISPIEL 5
-
Assay hinsichtlich des Niveaus an zytotoxischen
Anti-VZV-T-Zellen
-
VZV-Zytotoxizitäts-Assay:
Periphere Blutmonozyten (PBMN) werden abgetrennt und mit lebenden VZV
in Mikromulden bei 104 Zellen/Mulde kultiviert.
Nach 7 Tagen wird 1 Einheit IL2 jeder Mulde zugegeben und die Kultur
10 Tage lang fortgesetzt, zu welchem Zeitpunkt die Platten mit dem
Auge überprüft werden,
um Mulden mit Wachstum nachzuweisen. Blast-Zellen werden aus diesen
Mulden gewonnen und mit dem homologen Antigen und autologen EBV-Zellen
(mit 5000 r bestrahlt) und mit 10 E/ml IL2 für eine Woche klonaler Expansion
erneut stimuliert. Die Verwendung von lebenden VZV, um in diesem
Kontext zu stimulieren, beruht auf Befunden von Braciale und Mitarbeitern
[Immunol. Rev., 98, 95 (1987)], daß ein Stimulus mit lebendem Virus
erforderlich ist, um auf Klasse I beschränkte Reaktionen auszulösen, und
von Daten [Arbeit et al., Intervirology 18, 56 (1982)], daß Monozyten
durch VZV infizierbar sind, und dem Bedarf an autologen Zellen,
die sowohl Klasse I als auch Klasse II für die Antigenpräsentation
tragen.
-
Die
Zellen aus Responder-Mulden werden auf MHC-Beschränkung getestet,
hauptsächlich
durch Inhibierung der Zytotoxizität [Gaston et al., Immunogenetics
19, 475–486
(1984)]. T-Zellen werden mit 106/ml suspendiert
und 105 Zellen werden 5 × 103 autologen
oder nichtverwandten Zielen, vorinkubiert mit VZV, zugegeben. Die
MHC-Beschränkung
wird bestimmt durch (1) Phänotypenbestimmung
eines Aliquots der Effektorzellen für CD4 und CD8 und (2) Zugabe
von 1 μg/ml
W6/32 (ATCC Hybridoma Bank HB 95, Antiklasse I) oder HB 55 (ATCC,
Antiklasse II) zu den Zytotoxizitäts-Assays. Diese Antikörper sind
geeignet, da sie die Entwicklung von auf Klasse I bzw. Klasse II
beschränkten
zytotoxischen Zellen in gemischter Lymphozytenkultur unterdrücken. 51Cr-Freisetzung
aus den Zielzellen wird nach 6 Stunden Inkubation gemessen.
-
Klasse
I-MHC-beschränkte
zytotoxische Zellen werden als durch W6/32 inhibierbar und CD8-Phänotyp identifiziert.
Auf Klasse II beschränkte
zytotoxische Zellen werden durch HB55 inhibiert und die Effektoren sind
CD4. Die Ergebnisse von PBMN, die in unterschiedlichen Intervallen
nach akuter VZV bei jungen Erwachsenen erhalten wurden, und vor
und nach der OKA-Booster-Immunisierung
werden verglichen.
-
BEISPIEL 6
-
Immunisierung von Erwachsenen mit einem
Risiko zur Entwicklung von Herpes zoster
-
1. Population
-
Personen
eines Alters von 55 bis 87 Jahren wurden geimpft, wenn sie eine
Krankengeschichte von früherer
Varicella besaßen,
jedoch niemals HZ hatten. Ausgeschlossen waren diejenigen mit einer
schwächenden
oder immunsuppressiven Krankheit und diejenigen, welche eine immunsuppressive
Therapie erhielten. Wir schlossen auch jeden aus, der ein anderes
Vakzin innerhalb eines Monats vor der VZV-Impfung erhielt oder der
erwartete, ein anderes Vakzin in dem Monat nach der VZV-Impfung
zu erhalten, und Personen, welche eine Gammaglobulin-Therapie innerhalb
von drei Monaten vor der VZV-Impfung erhielten.
-
2. Vakzin
-
Abgeschwächtes Lebendvakzin
(Oka/Merck-Stamm) wurde bei –20°C in lyophilisiertem
Zustand gelagert und mit destilliertem Wasser auf einen Infektivitätstiter
von 1140 pfu/0,5 ml (Lot CR 452) oder 3010 pfu/0,5 ml (Lot CR 320)
rekonstituiert. Andere lebende abgeschwächte Varicella-Zoster-Viren
können
ebenfalls eingesetzt werden. Der bevorzugte Oka-Virus kann nach
der Offenbarung von
US-Patent
3,985,615 hergestellt werden.
-
3. Versuchsaufbau
-
Potentielle
Impflinge wurden nach dem Alter in Gruppen eingeteilt (55–59; 60–64; 65–69; 70–79; ≥ 80 Jahre
alt). Die Personen in jeder Altersgruppe wurden zufällig eingeteilt,
um eine von vier Vakzindosen subkutan zu erhalten: 3010 pfu, 6020
pfu, 12 040 pfu oder 3010 pfu mit einer Booster-Dosis von 3010 pfu
3 Monate nach der ersten Dosis. Zusätzliche Personen eines Alters
von 55–59
Jahren wurden zufällig
ausgewählt,
um 1140 pfu zu erhalten.
-
Blut
wurde von den Impflingen zur immunologischen Beurteilung unmittelbar
vor der Immunisierung und 3, 12 und 24 Monate nach der Immunisierung
erhalten. Blut wurde auch drei Monate nach der Booster-Dosis erhalten.
-
Die
Impflinge wurden bezüglich
Vakzinreaktionen 42 Tage lang mit zweiwöchentlichen Telefonanrufen begleitet.
Die Impflinge registrierten auch Zeichen und Symptome auf einer
Impfberichtkarte. Sie maßen
ihre Temperatur für
5 Tage nach der Impfung täglich
und danach nur, wenn sie sich fiebrig fühlten. Diejenigen mit ungewöhnlichen
Reaktionen wurden individuell beurteilt. Hautläsionen wurden hinsichtlich
VZV kultiviert. Die Patienten wurden instruiert, anzurufen, wann
immer sie annahmen, sie hätten
HZ entwickelt. Darüber
hinaus wurden sie während
des ersten Jahres monatlich angerufen, um hinsichtlich HZ befragt
zu werden, und sie wurden gleichermaßen am Ende des zweiten Jahres
befragt. Hautläsionen
oder Paarsyndrome, von denen angenommen wurde, daß sie HZ
repräsentierten,
wurden durch körperliche
Untersuchung, Kultur von Läsionen hinsichtlich
VZV und akute und konvaleszente (4–6 Wochen nach vermuteter HZ)
VZV-spezifische immunologische Beurteilung untersucht.
-
4. Nachweis von IgG-Antikörper gegen
VZV-Antigen durch enzymgekoppelten Immunadsorptions-Assay (ELISA)
-
Die
Reihen Abis D von IMMULON® 11-Platten (Dynatech,
Alexandria, VA; Katalog-Nr. 011-010-3450) wurden
mit 0,1 ml VZV-Antigen und die Reihen E bis H mit Kontrollantigen
(M. A. Bioproducts, Walkerville, MD; Katalog-Nr. 30–149 J für VZV-Antigen;
30–150
J für Kontrolle),
1:20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 0,15 M, pH 7) über Nacht
bei 4°C
verdünnt,
beschichtet. Die Platten wurden in PBS gespült und mit 1 mg/ml Gelatine
in PBS über
Nacht blockiert. Patientenseren und positive Kontrollseren wurden
Antigen- und Kontrollmulden in vierfachen Verdünnungen (beginnend mit 1:50)
zugegeben und über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Nachfolgende Inkubationen erfolgten mit Peroxidase-konjugiertem
affinitätsgereinigtem
Anti-Human-Ziegen-IgG (Tago, Burlingame, CA; Katalog-Nr. 2390),
1:2000 in PBS verdünnt,
und mit ABTS-Substrat (Sigma, St. Louis, MO). Farbe wurde 30–60 Min.
lang entwickelt und die OD auf einem DYNATECH-Plattenlesegerät mit ELISACALC-Software
abgelesen. Die optischen Dichten der Kontrollmulden wurden von den
VZV-Mulden subtrahiert. Ein Aliquot eines einzelnen positiven Referenzserums
wurde in allen Platten laufen gelassen und eine Regressionslinie
für log
(Verdünnung)
gegen log (OD) berechnet. Der VZV-Antikörper in den Untersuchungsproben
wurde als Prozentsatz des Referenzserums ausgedrückt.
-
5. Bestimmung der Häufigkeit von mononukleären Blutzellen
(MNC), welche als Reaktion auf VZV-Antigen proliferieren
-
MNC
wurden von heparinbehandeltem Blut durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation
abgetrennt, in Hanks ausgewogener Salzlösung gewaschen und in RPMI
1640-Medium, ergänzt
mit Antikörpern
und 10% autologem Serum, kultiviert. Details der Grenzverdünnungskulturen,
welche zur Bestimmung der Responderzellhäufigkeit (RZH) verwendet wurden,
sind veröffentlicht
[Feldman S, et al., Am. J. Dis. Child. 126, 178–184 (1973)]. In Kürze, 24
Replikat-Kulturen, enthaltend 100.000, 50.000, 25.000 und 12.500
MNC pro Mulde, wurden mit einer 1:200-Verdünnung
von zellfreiem VZV-Antigen 10 Tage lang kultiviert und dann einem
8stündigen
Puls mit 0,25 μCi
[3H]-Thymidin (TRK 61, Radiochemical Centre,
Amersham; 5 Ci/mMol) pro Mulde unterworfen. Parallele Kontrollkulturen
waren identisch, mit der Ausnahme, daß sie mit einem verdünnten Kontrollantigen, hergestellt
aus nichtinfizierten Zellen, stimuliert wurden. Responder-Mulden wurden definiert
als diejenigen, welche mehr als den Mittelwert plus 3 Standardabweichungen
der CpM der 24 parallelen Replikat-Kontrollkulturen aufwiesen. Die
RZH wurde in einer Auftragung des Logarithmus des Prozentsatzes
von Nicht-Responder-Mulden gegen die Zellzahl pro Mulde als derjenige
Punkt interpoliert, an dem 37% der VZV-Antigen-stimulierten Mulden
Nicht-Responder waren [Henry C, et al. in Mishell BB, Shiigi SM,
Hrsg., Selected Methods in Cellular Immunology. San Francisco: Freeman
Press, (1980)]. Die RZH wird ausgedrückt als die mittlere Anzahl
der MNC, welche benötigt
werden, um eine VZV-spezifische proliferierende Zelle nachzuweisen.
-
Bei
2% der Versuchspersonen erhöhte
der CpM-Mittelwert in den unstimulierten Mulden, die 105 Zellen
enthielten, fälschlich
den Prozentsatz der Nicht-Responder-Mulden. Wir berechneten deshalb
die RZH in dieser Untergruppe von Versuchspersonen aus den Datenpunkten
bei 12.500, 25.000 und 50.000 Zellen pro Mulde. Das größere Vertrauen,
welches auf Datenpunkte von niedrigeren Zellzahlen bei diesen Versuchspersonen
gesetzt wurde, wird durch die größere Linearität der Datenpunkte
gerechtfertigt.
-
Um
einen Stimulationsindex von diesen Kulturen zu erhalten, wurde das
arithmetische Mittel für
die stimulierten und unstimulierten Mulden bestimmt und als stimulierte
CpM/unstimulierte CpM ausgedrückt.
-
6. γ-Interferon-Produktion in VZV-stimulierten
MNC-Kulturen
-
Kulturen
von 5 × 105 MNC in 0,5 ml wurden mit einer 1:20-Verdünnung von
Kontroll- oder VZV-Antigen inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die Überstände einem
ELISA-Assay (Amgen, ABC 3.000; Thousand Oaks, CA) hinsichtlich γ-Interferon
unterworfen. Die Ergebnisse sind als internationale Einheiten (IE)/ml
ausgedrückt.
-
7. VZV-Isolierung
-
Die
Isolierung von VZV aus Hautläsionen
wurde durch Kultur in Humanembryo-Lungenfibroblasten (lokal abgeleitet;
Passage 10 bis 20) nach Abkratzen von Papeln oder Vesikeln und intensivem
Abtupfen der Basisfläche
versucht. VZV wurde durch spezifische Immunfluoreszenz identifiziert.
-
8. Statistik
-
Einfache
Vergleiche wurden mit Students-t-Tests bei einem Signifikanzniveau
von 0,05 mit Bonferroni-Anpassung, wo dies angebracht war, durchgeführt. Die
Auswirkungen von Geschlecht, Alter, Vakzindosis und Anzahl der Monate
nach einer Immunisierung wurden durch Analyse wiederholter Messungen
festgestellt [Laird NM, Ware JH, Biometrics (1982); 38, 963–974; Jennrich
R, Schluchter MD, Biometrics (1986); 42, 805–820]. Zur Untersuchung der
Dauer der Immunität
wurden inverse polynome Modelle mit Hilfe eines nichtlinearen Analogons
des Modells von Laird und Ware [Neider JA, Biometrics (1966): 22;
128141; Hirst K, et al., Commun. Stat. (1991): B20] angepaßt.
-
ERGEBNISSE
-
Insgesamt
202 Personen wurden immunisiert. Das mittlere Alter der 138 weiblichen
Impflinge betrug 65,8 ± 7,3;
das mittlere Alter der 64 männlichen
Impflinge betrug 67,7 ± 6,5
Jahre. 8 bis 15 Versuchspersonen in allen Dosiskategorien hatten
ein Alter von ≥ 80
Jahren.
-
Das
Vakzin wurde im allgemeinen gut vertragen. Weniger als 25% der Impflinge
wiesen lokale Reaktionen auf. Tabelle 1.
Lokale Reaktionen
auf das Varicella-Vakzin bei älteren
immunen Personen |
Reaktionen |
Art | Erste
Injektion1 (%) | Booster-Injektion2 (%) |
Erythem | 47(23) | 3(7) |
Schwellung | 30(15) | 2(5) |
Empfindlichkeit | 22(11) | 0 |
Erythem/Schwellung | 29(14) | 0 |
Erythem/Schwellung/Empfindlichkeit | 13(6) | 0 |
-
Diese
bestanden aus Erythemen, Schwellungen und/oder Empfindlichkeit.
Die mittlere Dauer lokaler Reaktionen betrug 2,9 Tage für Erytheme,
2,9 Tage für
Schwellungen und 3,6 Tage für
die Empfindlichkeit. Diese Reaktionen waren weder häufiger noch
schwerer bei Impflingen, die Booster-Dosen erhielten. Temperaturen
von mehr als (100°F)
37°C traten
bei < 1% der Impflinge
auf. Tabelle 2.
Beschwerden
in den 6 Wochen nach dem Varicella-Vakzin bei älteren immunen Personen |
Häufigkeit | Art |
4% | Kopfschmerzen |
< 3% | Entzündete Augen,
steifer Nacken, Myalgie-Anfall |
< 2% | Arthralgie,
Bauchschmerzen |
< 1% | Entzündeter Hals,
Ohrschmerzen, geschwollene Drüsen, Übelkeit, Husten,
Durchfall, Fieber (> 100°F) (> 37°C). |
-
Eine
Vielfalt anderer milder Symptome trat bei ≤ 4% der Impflinge auf.
-
Elf
Patienten beklagten sich über
einen Hautauschlag innerhalb von 40 Tagen nach der Impfung. Tabelle 3.
Hautauschlag
nach Varicella-Vakzin für ältere immune
Personen |
– Früher Hautauschlag
(< 40 Tage) – |
| | VZV |
Art | Patienten1 | Tag
des Beginns | Isolierte |
Papeln
(1–10)2 | 4 | 3,
7, 8, 14 | 0/4 |
Flecken
(4; ?) | 2 | 5,
15 | 1/1 |
Deutliches
Erythem/Verhärtung
an der Injektionsstelle | 2 | 3,
3 | ND3 |
Andere
(Bluterguß,
Kontaktdermatitis, trockene Haut) | 3 | - | ND |
- 1 Gesamtzahl der
Injektionen = 245
- 2 Zahlen in Klammern zeigen den Bereich
der Anzahl der Läsionen
an; unbekannt für
einen Impfling
- 3 ND = nicht durchgeführt
-
Zwei
von diesen Personen wurden befunden, nur lokale erythematöse Reaktionen
auf das Vakzin aufzuweisen. Sechs Personen hatten makulopapulöse Ausschläge, umfassend
1 bis 10 Läsionen,
welche 3 bis 15 Tage nach der Immunisierung erschienen. VZV wurde
von nur einem der fünf
Patienten isoliert, deren Läsionen
untersucht wurden. Dieses VZV erwies sich bei einer Restriktionsenzym-Analyse
als Wildtyp.
-
Die
Antikörperniveaus
bei älteren
Versuchspersonen lagen bei 85% eines Kontroll-Standardreferenzserums vor der Immunisierung.
Nach der Verabreichung des Varicella-Vakzins waren die Antikörperniveaus
12 Monate lang signifikant höher
(p < 0,001), nicht
jedoch 24 Monate nach der Impfung (p = 0,100). Dosis, Geschlecht
und Alter beeinflußten
diese Reaktion nicht. Die in vitro-Produktion von γ-Interferon
durch VZV-stimulierte T-Zellen war 3 und 6 Monate nach der Immunisierung
ebenfalls signifikant höher
(p < 0,001) (2), diese Wirkung ging jedoch nach 12
Monaten verloren. Höhere
Vakzindosen (p = 0,037) und jüngeres
Alter (p = 0,023) waren mit höheren γ-Interferonreaktionen
assoziiert.
-
Zellvermittelte Immunität
-
Zur
Messung der zellvermittelten Immunität gegenüber VZV-Antigen nach einer
Booster-Immunisierung
wurden die MNC der Versuchspersonen unter Einsatz verschiedener
Zellzahlen pro Mulde kultiviert. Diese Kulturen wurden als Grenzverdünnungskulturen
analysiert, um eine Abschätzung
der Häufigkeit
von VZV-spezifischen T-Zellen im Blut (RZH) zu erhalten. Wir bedienten
uns dieser Vorgehensweise, da wir erwarteten, es würde leichter
sein, Datenpunkte über
mehrere Jahre der Studie quantitativ zu bestimmen und zu vergleichen.
Vor dem Erhalt des Vakzins hatten die Versuchspersonen einen mittleren
RZH-Wert von 1:68.000 (d. h., eine VZV-spezifische proliferierende Zelle auf
68.000 periphere Blut-MNC). Dieser erhöhte sich auf 1:40.000 sechs
Monate nach der Impfung und blieb für 24 Monate signifikant über den
Vorimmunisierungsniveaus (3) (p = < 0,001). Die Größe der mittleren
Verbesserung der RZH ist wahrscheinlich eine Unterschätzung, da
33% der Impflinge, die weniger als eine Responderzelle auf 100.000
MNC vor der Impfung aufwiesen, in unserer Analyse als eine Responderzelle
aufweisend eingeschlossen sind. Der Absolutwert der RZH 12 oder
24 Monate nach der Impfung war keine Funktion des Geschlechts, der
verabreichten Dosis oder des Alters des Impflings. Jedoch war die
inkrementale Verbesserung der RZH (d. h., die RZH nach 12 oder 24 Monaten
minus der RZH vor der Impfung) bei älteren Personen größer (p < 0,05), was die
relativ schlechten CMI-Werte (d. h., eine niedrigere RZH) bei älteren Personen
vor der Immunisierung und die Tatsache, daß alle reagierenden Impflinge – unabhängig vom
Alter – ähnliche
Post-Vakzin-Niveaus erreichten, widerspiegelt. Ein invers polynomes
Modell der Daten sagte voraus, daß die maximale RZH nach 6,34
Monaten erzielt wird, wobei die Hälfte dieser Wirkung 55,9 Monate
anhält.
Die Post-Vakzin-Immunität wurde
mit der Rate von 309 ± 364
Zellen/Responderzelle/Monat verloren (95% Konfidenzintervall = 0–1047 Zellen).
Die RZH korrelierte schlecht mit Antikörper- oder γ-Interferonreaktionen.
-
Es
wurde festgestellt, daß eine
Gruppe der Impflinge zu keiner Zeit nach der Impfung mehr als 1 RZH/105 MNC aufweisen konnte. Diese Nicht-Responder-Gruppe
war bei allen Altersgrup pen, mit Ausnahme von Impflingen eines Alters
von mehr als 80 Jahren, von denen 5 aus 8 Nicht-Responder waren, ähnlich (8–20%). Es gab weder eine statistisch
signifikante Korrelation zwischen dem Alter und einer Nicht-Reaktion, noch
korrelierte die Nicht-Reaktion mit der Dosis des verabreichten Vakzins.
-
Die
Erhöhung
der VZV-Immunität
wurde auch nachgewiesen, wenn die Daten als Stimulationsindex ausgedrückt wurden.
Diese Ergebnisse wurden zur Analyse logarithmisch transformiert,
da sie logarithmisch verteilt waren. Zu Beginn betrug der mittlere
Stimulationsindex 3,44 (1 Standardabweichungsbereich 1,2–9,9); nach
3 Monaten 4,57 (1,6–12,8);
nach 1 Jahr 4,85 (1,81–13,5)
und nach 2 Jahren 4,58 (1,7–17,1).
-
Schutz vor HZ
-
Sieben
Patienten wurden auf mögliche
Herpes zoster (Tabelle 4) über
zwei Jahre (entsprechend 400 Patientenjahre der Beobachtung) untersucht.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt: Tabelle 4:
Ausschlag
und/oder Schmerz nach Varicella-Vakzin für ältere immune Personen |
Art | Alter | Beginn1 (Monate) | Isolierte VZV | RZH (Akut/ Konvaleszent) | Ursache2 | Dauer
des Schmerzes |
Thorax-Dermatom,
Ulcera | 78 | 1,3 | 0 | ND3/1:19.000 | lokales Trauma | 0 |
Unilateraler
harter | 69 | 3,5 | 0 | 1:100.000/ | wahrscheinlich | 0 |
Gaumen | | | | 1:17.000 | HZ | |
Ulcera/lokale
Dysästhesie
Dermatomal, vesikulopustuläre
linke Kopfhaut | 70 | 17 | + | 1:26.000/ 1:30.000 | HZ | mild
(4 Tage) |
Schmerz
im rechten Ohr; stechend | 78 | 7 | keine
Läsionen | 1:100.000/ 1:40.000 | möglicherweise
HZ | mild
(4 Tage) |
Q
5–10 Min.; ± Erleichterung
mit Aspirin Gesäßbacken-Vesikel | 81 | 2 | HSV
II isoliert | ND3 | HSV
II-Reaktivierung | 0 |
Disseminierte
Vesikel (2 Patienten); nicht-dermatomal | 64/65 | 10 | ND | ND | Katzenmilben | 0 |
- 1 Monate nach der
ersten Immunisierung
- 2 zugeordnete Ursache auf Basis von
klinischen, virologischen und immunologischen Daten
- 3 ND = nicht durchgeführt
-
Ein
Patient ergab VZV in Kultur aus Hautläsionen. Drei andere hatten
kompatible klinische Präsentationen,
von denen zwei eine Verbesserung der konvaleszenten RZH aufwiesen,
was eine kürzliche
VZV-Infektion nahelegt. Ein Patient hatte eine vollständige immunologische
Beurteilung und drei andere hatten keine immunologische Beurteilung,
da deren Läsionen
nicht auf VZV zurückzuführen waren.
Nur zwei Verdachtsfälle hatten
akute Schmerzen (jeweils vier Tage Dauer) und keiner hatte Schmerzen
nach Heilung der Läsionen (Post-Herpes-Neuralgie).
-
BEISPIEL 7
-
KONKURRENZ-ELISA ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG
VON VZV-ANTIGEN:
-
Nachdem
der VZV-Plaque-Assay zeitraubend ist, ist er für eine verfahrensbegleitende
Kontrolle nicht besonders geeignet. Ein schneller VZV-Antigen-ELISA
erlaubt die Messung von VZV-Antigenmengen, um eine Überwachung
des Viruswachstums während
der Herstellung von Varicella-Lebendvakzin zu ermöglichen.
Darüber
hinaus kann dieser Test eingesetzt werden, um VZV-Antigenmengen
in geklärten,
beschallten Vakzin-Volumina abzuschätzen, und potentiell, um Antigen
in abgefüllten
Gefäßen mit
lyophilisiertem Vakzin zu messen. In Kürze, dieser Assay wird durch
Inkubation von VZV-Antigen aus Testproben mit Anti-VZV-Serum in
Lösung durchgeführt. Dem
verbleibenden freien Antikörper
wird erlaubt, an VZV-Antigen zu binden, das auf ELISA-Mikrotiterplatten
immobilisiert ist. Die Menge an Antikörper, welche zur Bindung an
die Platten imstande ist, ist umgekehrt proportional zur Menge an
Antigen in der Testprobe. Die Antikörperbindung an die Platten
wird quantitativ bestimmt durch Reaktion mit einem enzymgekoppelten
Anti-Human-Antikörper und
einem geeigneten Substrat, um ein gefärbtes Produkt zu ergeben, welches
spektralphotometrisch quantitativ bestimmt wird.
-
Die
VZV-Antigen-ELISA- und die VZV-Plaque-Assays sollten im allgemeinen
korrelierende Daten liefern, es sollte jedoch berücksichtigt
werden, daß der
VZV-Antigen-Assay sowohl lebendes als auch nicht-lebendes VZV nachweist.
Der Antigen-Assay ist auch insofern wertvoll, als er eine Bestimmung
der gesamten Antigenfracht, die einem VZV-Vakzin Empfänger verabreicht
wird, ergibt.
-
Testverfahren:
-
- 1. ELISA-Platten werden mit Glycoproteinen
(gps) aus VZV-infizierten oder nichtinfizierten MRC-5-Zellen beschichtet
(Beispiel 3) und werden mit 1%igem Rinderserumalbumin ([Fraktion
V, #A-9647, Sigma], 0,1% NaN3) überschichtet,
um die unspezifische Adsorption von Antikörpern an die Platten zu verringern.
Alternierende Reihen werden mit VZV o der Kontrollantigen beschichtet
(d. h., die Reihen A, C, E und G erhalten VZV-gp und die Reihen
B, D, F und H erhalten gp-Antigen von nicht-infizierten MRC-5).
- 2. Geklärtes
(3250 g-Min.) Testantigen wird in Stabilisator in 12 × 75-mm-Röhrchen oder
Mikroröhrchen
verdünnt.
Eine Virus-Antigen-Standardpräparation
(26 Einheiten/ml VZV-Antigen
gemäß Dot-Blot-Assay)
wird 1:10 verdünnt
und dann in Reihe 1:1,25-fach verdünnt, um Antigenkonzentrationen
von 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1, 0,9 Einheiten/ml zu ergeben. Weitere
Verdünnungen
können
eingeschlossen werden, um 0,7 und 0,5 Einheiten/ml Antigen zu ergeben.
Diese Verdünnungsreihe
wird eingesetzt, um eine Standardkurve für die Messung von Antigenmengen
in Testproben zu erstellen.
- 3. Ein Human-Anti-VZV-Serum wird in Stabilisator auf das Doppelte
der gewünschten
Endverdünnung
verdünnt.
- 4. 300-μl-Volumina
von verdünntem
Antigen werden in Mikroröhrchen
abgefüllt,
mit 300 μl
verdünntem
Anti-VZV-Serum gemischt und bei 35°C 15–22 Min. lang inkubiert. Eine
Kontrolle schließt
Human-Anti-VZV und Verdünnungsmittel
(kein Antigen) ein.
- 5. Aliquote von 100 μl
aus jeder Serum-Antigen-Mischung werden 2 Replikaten von mit VZV-Glycoprotein (VZV-gp)
beschichteten Mulden und 2 mit MRC-5-gp beschichteten Mulden (4
Mulden pro Probe) zugegeben (z. B.: Probe 1 in Spalte 1, Reihen
A, B, C und D; Probe 2 in Spalte 2, Reihen A, B, C und D; etc.).
- 6. Die Platten werden für
15 ± 1
Minute(n) bei 35°C
inkubiert, um freiem Antikörper
(nicht mit Antigen in Lösung
komplexiert) die Bindung an Virus-Antigen, das auf den Platten immobilisiert
ist, zu ermöglichen.
- 7. Ungebundener Antikörper
wird durch Waschen entfernt und die Mulden erhalten einen mit alkalischer Phosphatase
konjugierten Anti-Human-Ziegen-IgG, um gebundenen Human-Antikörper nachzuweisen.
- 8. Nach Inkubation für
15 ± 1
Minute(n) bei 35°C
wird ungebundenes Konjugat durch Waschen entfernt. Gebundenes Konjugat
wird durch Inkubation für
15 Min. bei 35°C
mit p-Nitrophenylphosphat-Substrat,
gelöst
in Diethanolamin-Puffer, nachgewiesen.
- 9. Nach Beendigung der Substratreaktion durch Zugabe von 50 μl/Mulde 3
M NaOH wird die Farbentwicklung (OD bei 405 nm) quantitativ mit
Hilfe eines Mikroplatten-Spektralphotometers
bestimmt.
-
Testberechnungen und Interpretation:
-
- 1. Die jeweiligen Replikat-OD-Werte für die mit
VZV und MRC-5 beschichteten Replikat-Mulden werden gemittelt. Die Erfahrung
hat gezeigt, daß die
MRC-5-OD zwischen verschiedenen Proben und Verdünnungen konsistent ist. Deshalb
werden die MRC-5-Werte für
die gesamte Platte gemittelt und verwendet, um die Korrektur bezüglich der
unspezifischen Bindung des primären
Antikörpers
oder Konjugats an nicht-infizierte Zellextrakte vorzunehmen. Die
gemittelte MRC-5-OD wird von den jeweiligen gemittelten VZV-OD-Werten abgezogen,
um VZV-spezifische OD (ΔOD)-Werte
zu ergeben.
- 2. Erstellung einer Standardkurve zur Messung von Antigenmengen:
Die ΔOD-Werte
der Standardkurve werden gegen die bekannten Antigenkonzentrationen
aufgetragen (Einheiten VZV/ml). Die Daten werden in ein geeignetes
Graphikprogramm (z. B. Cricket Graph Version 1.3, Cricket Software,
Malvern, PA) eingegeben, der lineare Anteil der Kurve wird identifiziert
(muß mindestens 4
Punkte einschließen)
und die Kurvenanpassungsformel (”line fit formula”) (y =
a + bx) wird erhalten.
- 3. Berechnung von Antigenmengen aus Testproben:
Die Werte
für a und
b sind durch die Kurvenanpassungsformel gegeben und y (ΔOD) ist bekannt.
Die verbleibende Unbekannte, x, repräsentierend die Einheiten/ml
Antigen, kann dann berechnet und um die Probenverdünnung korrigiert
werden, um die Antigenkonzentration der unverdünnten Probe zu erhalten. Eine allgemeine
Probenberechnung folgt:
-
Probe
A |
Verdünnung 1:2 |
ΔOD Y |
Einheiten/ml
Antigen aus der Kurvenanpassungsformel X = (y – a)/b |
Einheiten/ml
Antigen korrigiert um die Verdünnung (x)*
(Verd.-Faktor) |
-
Die
angegebene Antigenkonzentration ist diejenige, welche mit der am
wenigsten verdünnten
Probe, die einen ΔOD-Wert
innerhalb des linearen Anteils der Standardkurve ergibt, erhalten
wird.
-
BEISPIEL 8
-
Klinische Studien:
-
Das
Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Anti-Zoster-Vakzins ist
wie folgt:
- a. Ein Vorimpfungswert der VZV-Responderzellhäufigkeit,
Anti-VZV-Antikörper-
und VZV-spezifischen
zytotoxischen T-Zell-Niveaus aus einer Population von für Zoster
anfälligen
Erwachsenen wird erhalten;
- b. Eine erste ausreichend große Population von für VZV anfälligen Erwachsenen
wird mit einem lebenden oder inaktiviertem VZV-Vakzin geimpft und
eine zweite ausreichend große
Population (Kontrolle) ähnlicher Erwachsener
wird mit dem VZV-Vakzin-Verdünnungsmittel
minus lebendem oder inaktiviertem VZV geimpft;
- c. Ein Nachimpfungswert für
die Responderzellhäufigkeit,
Anti-VZV-Antikörper
und VZV-spezifischen
zytotoxischen T-Zellen wird erhalten;
- d. Die in (c) erhaltenen Werte werden mit den in (a) erhaltenen
Werten verglichen, so daß eine
etwa 30%ige Erhöhung
der VZV-Responderzellhäufigkeit,
eine Erhöhung
der VZV-spezifischen
Antikörper
und eine Erhöhung
der VZV-spezifischen T-Zellen innerhalb von 3 Monaten nach der Impfung
eine Wirksamkeit als Anti-VZV-Vakzin anzeigt.