DE1617775B1 - Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten R¦teln-Lebendvirusimpfstoffes - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten R¦teln-Lebendvirusimpfstoffes

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DE1617775B1 DE1967R0047176 DER0047176A DE1617775B1 DE 1617775 B1 DE1617775 B1 DE 1617775B1 DE 1967R0047176 DE1967R0047176 DE 1967R0047176 DE R0047176 A DER0047176 A DE R0047176A DE 1617775 B1 DE1617775 B1 DE 1617775B1
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RIT RECH IND THERAPEUT
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Description

ι \ ■■': 2 ■" :
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, zur Herstellung Entsprechend der Erfindung wird das Rötelnvirus
eines abgeschwächten Röteln-Lebendvirusimpfstoffes, einer genügenden Zahl von Passagen auf primären der fähig ist, aktive Immunität gegen Röteln zu be- Kaninchennierengewebskulturen unterworfen, bis die wirken. : Abschwächung eingetreten ist. Es hat sich gezeigt, daß
Der Ausdruck »abgeschwächtes Lebendvirus«, der 5 die Abschwächung wenigstens 15 Passagen erfordert, in dieser Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf vorzugsweise zwischen 20 und. 60 Passagen. Diese einen Rötelnvirus (RV) Stamm, dessen Virulenz durch Passagen werden bei Temperaturen durchgeführt, die wenigstensl5 aufeinanderfolgende Passagen auf primären 36°C nicht übersteigen.
KaninGhennierengewebskulturen abgeschwächt wurde. Die Dauer jeder Passage liegt vorzugsweise zwischen
Entsprechend dem im folgenden beschriebenen io 3 und 6 Tagen. Ein Impfstoff wird schließlich aus einer Verfahren wird ein modifiziertes Virus und damit ein geeigneten Passage auf primären Kaninchennieren-Impfstoff von hoher Antigenwirkung erhalten, der bei gewebskulturen nach irgendeiner der bekannten damit geimpften Kindern zu keiner nennenswerten Techniken gewonnen,
unerwünschten Reaktion führt. - / ■ Das Rötelnvirus, das für die Ausführung dieser
Das Auftreten unerwünschter Reaktionen, darunter 15 Erfindung verwendet wird, wird aus einem typischen insbesondere die mögliche Verbreitung des Virus durch klinischen Fall isoliert, ζ. B. aus einem Kehlkopf abdie Geimpften, ist eines der Hauptprobleme bei der strich, aus Urin oder aus Gurgelwasser. Die Proben Entwicklung eines Röteln-Lebendtypimpfstoffs. werden entweder sofort gefroren und bei —60°C
Es ist bekannt, daß neben Komplikationen wie der bis zur Verwendung aufbewahrt oder unmittelbar Enzephalitis und der thrombocytopenischen Purpura, 20 einem geeigneten Gewebskultursystem inokuliert, z. B. die ernst, aber sehr selten sind, und auch der Arthritis, primären Nieren Monoschichten von Afrikanischen die nicht ungewöhnlich, aber im allgemeinen nicht Grünen Meerkatzen (GMN), oder irgendeinem anderen M ansteckend und von kurzer Dauer ist, die dramatischste Gewebskultursystem, das üblicherweise für solche ^ Komplikation dieser Krankheit von teratogener Natur Isolierungen verwendet wird. Das Vorhandensein des ist. Röteln sind tatsächlich ein ernstes Problem für 25 Rötelnvirus wird geprüft, indem die Kulturen beispiels-Frauen im ersten Drittel der Schwangerschaft wegen weise mit einem Enterovirus, wie dem Echovirus 11 des Vorkommens kongenitaler Mißbildungen des oder dem Coxsackievirusy49, am 9. oder 10. Tag Fötus, Totgeburten oder Abgängen. " ■; nach der Inokulation infiziert werden.
In dieser Hinsicht ist es wesentlich, daß ein Kind, das Durch Verwendung eines spezifischen, aus Kaninchen
einen Röteln-Lebendtypimpfstoff erhält, keine poten- 30 gewonnenen Antiserums gegen einen bekannten tielle Gefahr für eine schwangere Frau darstellt, mit RV Stamm ist es möglich, das Rötelnvirus durch einen der es in Berührung kommt. ..._.. spezifischen Neutralisationstest in geeigneten Zellen,
Bis jetzt gab es nur zwei Möglichkeiten, solche wie den GMN Zellen, zu identifizieren. Die Abwesenfötalen Röteln-Komplikationen zu verhüten: Ent- heit fremderAffenviren wird in GMN Zellen nach Neuweder verabreichte man große Dosen von Ganima- 35 tralisätion durch spezifisches RV Antiserum geprüft, globulinen an exponierte Schwangere, oder man setzte das in einem anderen Zellsystem hergestellt wurde,
junge Mädchen den Röteln, aus, bevor sie das gebär- Die primären Kaninchennierenzelllculturen für die
fähige Alter erreichten. aufeinanderfolgenden Passagen werden vorzugsweise
Die Verabreichung von Gammaglobulinen wird aus den Nieren von höchstens 3 Wochen alten Tieren keinesfalls von allen Spezialisten als wirksame Behänd- 40 gewonnen. Ein bevorzugtes Nährmedium für primäre lungsmethode angesehen. Aus offensichtlichen Grün- Kaninchennierenkulturen ist Hank's Salzlösung, die denist es auch keine annehmbare Lösung des Problems, mit inaktiviertem Kalbsserum, Lactalbuminhydrolysat Jugendliche dieser Krankheit auszusetzen. und Tryptosephosphat-Brühe ergänzt ist, aber andere Λ
Überraschenderweise hat man jetzt gefunden, daß bekannte Medien können ebenfalls verwendet werden. \ aufeinanderfolgende Passagen des Rötelnvirus auf 45 Die Inkubationstemperatur ist höchstens 36° C. Die primären Kaninchennierengewebskulturen (KN) nicht : - aufeinanderfolgenden Passagen werden derart ausgenur zu einer Abschwächung der Virulenz führt, sondern führt, daß aliquote Teile der überstehenden Flüssigkeit auch ein Verfahren zur Herstellung eines atigeschwäeh- der VorausgegangenenPassageKaninchennieren-Monoten Röteln-Lebendimpfstoff virus darstellt, das keine schichten inokuliert werden. Das Virus wird vorzugsnennenswerten unerwünschten Reaktionen verursacht, so weise zwischen dem 3. und 6. Tag nach der Inolculation
Unter dem oben verwendeten Ausdruck »keine geerntet. Die Titration des geernteten Virus kann nach nennenswerten unerwünschten Reaktionen« wird nicht der Interferenzmethode in GMN-Kultur-Röhrchen nur verstanden, daß die Inokulation des erfindungs- ausgeführt werden, unter Verwendung von beispielsgemäßen Impfstoffes eine Immunität bewirkt, ohne weise Echovirus 11 oder Coxsackievirus^9, wie es zu den üblichen pathologischen Symptomen regulärer 55 oben für den Isolationsschritt angegeben wurde.
Röteln zu führen, sondern auch, daß bei klinischen Bei einem bestimmten Stand der Passagen, nicht vor
Untersuchungen, die mit dem erfindungsgemäßen der 15. und vorzugsweise zwischen der 20. und der 60 Impfstoff durchgeführt wurden, keine serologische Passage, wird die überstehende Flüssigkeit der ino- oder virologische Evidenz einer Infektion bei anfälligen kulierten Kulturen entfernt und die Monoschichten Kontaktpersonen beobachtet wurde. 60 werden mit gepufferter Salzlösung, z. B. mit Eagle's
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung Lösung oder Hank's Lösung, gewaschen und weiter in eines Impfstoffes gegen Röteln besteht darin, daß man einem Auf bewahrungsmedium inkubiert, z. B. inHank's einen Rötelnvirusstamm durch mindestens 15 aufein- Lösung, die mit Cäseinhydrolysat ergänzt ist. Nach anderfolgende Passagen auf primären Kaninchen- einer weiteren dreitägigen Inkubation wird die über-NierengewebeMonoschichtzellkulturenbei28 bis 36° C, 65 stehende Flüssigkeit geerntet und durch Filtration oder vorzugsweise 34° C, attenuiert und die geernteten Zentrifugation geklärt,
Rötelnviren als Lebendvakzine in bekannter Weise Eine andere Möglichkeit, das Virus zu ernten, bekonfektioniert, steht darin, die Kultur in dem Aufbewahrungsmedium
einzufrieren, aufzutauen, zu schütteln und anschließend zu zentrifugieren oder zu filtrieren.
Das geerntete Rötelnvirus mit oder ohne stabilisierenden Zusatz kann entweder in gefrorenem Zustand, z. B. bei etwa —60°C, oder im gefriergetrockneten Zustand aufbewahrt werden. Der erhaltene Impfstoff wird subkutan oder intramuskulär verabreicht, wenn nötig nach Wiederauf lösung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Ein 3 Wochen altes Kaninchen aus einer Zuchtkolonie wird auf die Abwesenheit von pathologischen Anzeichen hin untersucht und geschlachtet. Beide Nieren werden aseptisch entfernt und in kleine Stücke geschnitten, die in trypsinhaltiger (2,5 g/l) gepufferter Salzlösung 10 Minuten bei einer Temperatur von 37°C ständig gerührt werden. Die Flüssigkeit wird abgegossen und durch das gleiche Volumen frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird bis zur völligen Auslaugung des Gewebes fortgesetzt, während die Flüssigkeit von Zeit zu Zeit abgetrennt und die darin suspendierten Zellen zentrifugiert werden.
Der Zellniederschlag wird in Flank's Lösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser letzte Schritt wird zweimal wiederholt, und der schließlich erhaltene Zellniederschlag wird mit einer Konzentration von etwa 105 Zellen pro ml in einem Nährmedium suspendiert, das aus Hank's Salzlösung und zugesetztem inaktiviertem Kalbsserum (10%), Lactalbuminhydrolysat (0,5 7o) und Tryptose-Phosphat-Brühe (0,1 %) besteht.
Aliquote Teile (1 ml) der erhaltenen Zellsuspension mitetwal06Zellenwerdeninl0 Kulturröhrchen (12mm Durchmesser) gegossen, die leicht schräg gestellt 4 Tage bei 37° C inkubiert werden. Nach dieser Inkubationsperiode hat sich eine vollständige Monoschicht gebildet. Unmittelbar vor der Virusinokulation wird das Nährmedium durch das gleiche Volumen eines frischen Nährmediums ersetzt.
Das gleiche Nährmedium wird vor und nach der Virusinokulation verwendet, und jede primäre Kaninchennieren (KN)-Zellkultur dieses Beispiels wird nach der hier beschriebenen Technik bereitet.
Aliquote Teile (0,1 ml) eines Rötelnvirusstammes, der in primären GMN Kulturen gezüchtet wurde und drei Passagen in diesem System durchlaufen hat, werden zur weiteren Charakterisierung in primäre KN Kultur-Röhrchen inokuliert, die in schräger Position bei 340C inkubiert werden.
Am 6. Tag nach der Inokulation wird die überstehende Flüssigkeit geerntet und das geerntete Virus nach der oben beschriebenen Interferenzmethode identifiziert und titriert.
Der Titer in GMN Zellen nach dieser ersten Passage auf KN Zellen ist ΙΟ2-83 InD50 pro ml.
Aliquote Teile der vereinigten überstehenden Flüssigkeiten der ersten Passage werden in andere primäre KN Kultur-Röhrehen inokuliert, die bei 34° C inkubiert werden. _
Am 6. Tag nach der Inokulation wird die überstehende Flüssigkeit geerntet. Das Virus wird titriert, wie es beim Ende der ersten Passage angegeben wurde, Dieses Verfahren wird bis zur 20. Passage wiederholt, die Inkubationsdauer jeder einzelnen Passage beträgt 3 bis 5 Tage.
Von der 9. Passage an beobachtet man einen zellschädigenden Effekt in den primären KN Zellen.
Für die 21. Passage in KN Zellen werden primäre KN Zellkulturen in 500 cm2 Roux-Flaschen hergestellt, wobei die oben beschriebene Technik verwendet wird.
Nach einer Inkubationsdauer von 3 Tagen bei 360C erhält man eine vollständige Monoschicht. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und durch das gleiche Volumen des gleichen Nährmediums ersetzt. Mit aliquoten Teilen des Virenmaterials aus der 20. Passage wird inokuliert.
Nach einer weiteren 6 tägigen Inkubation bei 34° C
ίο wird die überstehende Flüssigkeit abgegossen und durch das gleiche Volumen an Aufbewahrungsmedium ersetzt, das aus Hank's Lösung besteht, die mit 0,3 % Caseinhydrolysat ergänzt ist. Nach weiterer 3tägiger Inkubation bei 34° C wird die überstehende Flüssigkeit geerntet und durch Zentrifugation geklärt.
Proben werden zur Titration, zur Identifizierung und für Sicherheitsteste genommen. Das Virus wird bei -6O0C gelagert.
Der Virustiter ist 105 InD50 pro ml nach Bestimmung in primären GMN Zellen mittels der Interferenzmethode.
Dieses Virenmaterial wird dann Sicherheitsuntersuchungen unterworfen, zu denen die Prüfung auf Abwesenheit von Bakterien und Fremdstoffen gehört. Hierzu wird es Kaninchen, Hamstern, Meerschweinchen, Mäusen und Affen inokuliert.
Zusätzliche Sicherheitsuntersuchungen werden in verschiedenen Gewebskultursystemen durchgeführt.
Die vorläufige Bestimmung der Wirksamkeit wird durch Inokulation von 103·5 InD50 in Kaninchen und Affen ausgeführt. Die Serumneutralisations(SN)-teste werden in GMN Zellen durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen I und II angegeben.
Tabelle I
Antikörperbildung in Affen nach intramuskulärer Inokulation von 103-5 InD50
Serumprobe Resultate des SN-Testes - 14* gegen 30 InD50 32* 45*
Affen vor Inokulation NB λ GMN-Zellen V16 Vie
: NB 25* 1Ae / 33
η V4 V4 Vs NB . V33
225 V4 1U V4 NB V32
509 V4 1U Vs NB ■7ie
611 1U % /32 NB Vie
831 1U NB Vs. NB Ve4
619 1U NB Vs NB /32
857 V1 NB V32 NB Vs
1064 V4 Vie
953 V4
1053
NB = Nicht bestimmt * Tage nach Inokulation
Tabellen
Antikörperbildung in Kaninchen nach
subkutaner Inokulation von 103>5 InD50
Kanin- Serumprobe Resultate des SN-Testes
ciic η vor Inokulation gegen 30 InD50
6o η in GMN-Zellen
1 V4 24 Tage nach Inokulation
2 V4 Vs
3 V4 Vs
4 V4 Vie
5 V4 Vs
6 V4 Vs -
7 V4 Vie
8 V4. Vie
Vs
Das Viruspräparat wird in Glasfläschchen verteilt, von denen jedes 1 ml Flüssigkeit enthält.
Die Fläschchen werden gefriergetrocknet und zugeschmolzen.
Nach Wiederauflösung durch. Zusatz von einem ml destilliertem Wasser wird der Impfstoff subkutan anfälligen Personeninokuliert, dieEinzeldosenbetragen dabei etwa 125 InD50.
Resultate einer serologischen Untersuchung an einer Gruppe von 25 seronegativen Kindern (15 wurden geimpft und 10 Kontrollpersonen lebten in engem Kontakt mit ihnen) sind in Tabelle ΙΠ gegeben.
Von 15 geimpften Kindern hatten 13 einen Anstieg der Antikörper bis auf V32 °der mehr (2 Proben — bezeichnet mit NB —waren zur Zeit des Testes nicht verfügbar). Keines zeigte klinische Zeichen einer Infektion. Alle 10 Kontaktpersonen blieben serologisch negativ.
Tabelle IV
Antikörperbildung in Affen nach
intramuskulärer Inokulation von 102·5 InD50
Affen
η 		Serumprobe
vor Inokulation		 Resultate des SN-Testes
gegen 10 InD50
in GMN-Zellen		 39*
25* NB
1098 < 1Ii - Vs NB
1091 <7* Vs Vs
919 <% Vs Vie
943 ■ < 1U Vie
Tage nach Inokulation
Beispiel 3
Tabelle ΠΙ
Serologische Untersuchung, ausgedrückt durch seroneutralisierenden Antikörper
Personen Alter
(Jahre)		 Prohe
vor Impfung		 Status 56 Tage
■ nach
Impfung
S. M. 2V2 <4 V 32
V. S. 2 <4 V >32
M. L 2 <4 V >32
N. R. 2 <4 V 32
H.A. 1 <4 V >32
DB. G. 2 <4 C <4
VN. L. 2 <4 C <4
R. F. 2 <4 V > 32
B. D. 2 <4 C <4
LA. IV. <4 C <4
V.M. 1 <4 V >32
E. P. 1 <4 V >32
L. T. 1 <4 C <4
CC. 1 <4 V >32
A. M. 1 <4 V >32
R. O. 1 <4. C <4
L. A. 2 <4 V NB
D. A. 2 <4 C <4
G. O. 2x/2 <4 C <4
M. A. 2V2 <4 V NB
LA. 1 <4 C <4
P.A. 2V2 <4 V >32
D.B. 3V2 <4 V 32
GB. K. 5 <4 V 8
GB. F, 4 <4 C <4
V = Geim Dft C = : Kontakt
Ausgehend von dem Virenmaterial der 21. Passage bei 34° C (Beispiel I)- werden 9 weitere aufeinanderfolgende Passagen in primären KN Zellkulturen bei 28° C ausgeführt, einschließlich des letzten Schrittes der Impf stoff bereitung.
Der erhaltene Impfstoff wird Sicherheitstesten unterworfen und zur Wirksamkeitsbestimmung Affen und Kaninchen inokuliert.
Resultate sind in den folgenden Tabellen V und VI wiedergegeben.
Tabelle V
Antikörperbildung in Affen nach
intramuskulärer Inokulation von IO2·0 InD50
Affen
η 		Serumprobe
vor Inokulation		 Resultate des SN-Testes
gegen 10 InD50
in GMN-Zellen		 39*
Vie
Vs
35
1003
977		 < 1U ■ 25*
Vs
8
40
45
Tabelle VI
Antikörper in Kaninchen nach
intramuskulärer Inokulation von 10?<° InD50
Kanin
chen
η 		Serumprobe
vor Inokulation		 Resultate des SN-Testes
gegen 10InD50
in GMN-Zellen
29
30
31
32
33		 <v4
<V4
<V4
<7*
<V4 		26*
7s
7*
7ie
7s
7*
55 Tage nach Inokulation
B e i s p i e 1 4
Es wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen, die Passagen^WefSen jedoch bis zur 51. Passage in
Es wurde,wie in Beispiel !beschrieben, vorgegangen, 60 primären "KN Zellkulturen fortgesetzt. Das letzte die Passagen werden jedoch bis zur 30. Passage in Aufbewährungsmedium besteht aus Hank's Lösung,
B e i s ρ i e 1 2
primären KN Zellkulturen fortgesetzt.
Hieraus wird ein Impfstoff hergestellt, der den in Beispiel 1 beschiiebenen Sicherheitstesten unterworfen wird.
Die Wirksamkeit des Präparates wird an Tieren (Affen) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV wiedergegeben.
die mit 0,3 °/0 Caseinhydrolysat ergänzt ist und 50 meg Chloramphenicol pro ml enthält.
Nach 9tägiger Inkubation bei 34° C wird die überstehende Flüssigkeit geerntet, durch Zentrifugation geklärt und mit dem gleichen Volumen einer stabilisierenden Lösung vermischt, die pro Liter destillierten Wassers 30 g Kaliumglutamat, 200 g Saccharose und
ϊ 617
50 mg Chloramphenicol enthält. Die Mischung wird in Portionen von je 1 ml in Glasflaschen verteilt.
Die Flaschen werden anschließend gefriergetrocknet und zugeschmolzen.
Nach Wiederauflösung mittels Zusatz von 1 ml destilliertem Wasser wird der Impfstoff subkutan 65 seronegativen Personen inokuliert. Die Titration der Einzeldosen reicht dabei bis etwa 102·6 InD50 in GMN Zellen oder 103·7 PBU (Plaquebildende Einheiten) in KN13 Zellen. Eine Gruppe von 30 seronegativen j ο Kindern wurde 6 Wochen lang in engem Kontakt mit den geimpften gehalten.
Eine serologische Untersuchung der Gruppe der 65 geimpften Personen ergab, daß alle bis auf einen mit einem mittleren Antikörper-Titer von 1I128I) bestimmt im HAH (Haemagglutinationshemmung) Test, auf den Impfstoff reagiert hatten. Keine der Personen zeigte klinische Zeichen einer Infektion. Alle 30 Kontaktpersonen blieben serologisch negativ.
20
Beispiel 5
Es wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen, die Passagen werden jedoch bis zur 61. Passage in primären KN Zellkulturen fortgesetzt. Das letzte Aufbewahrungsmedium besteht dabei aus Hank's Lösung, die mit 0,3 % Caseinhydrolysat ergänzt ist und pro ml 50 meg Chloramphenicol enthält.
Nach 9tägiger Inkubation bei 34° C wird die überstehende Flüssigkeit geerntet, durch Zentrifugation geklärt und mit dem gleichen Volumen einer stabilisierenden Lösung vermischt, die 30 g Kaliumglutamat, g Saccharose und 50 mg Chloramphenicol pro Liter destillierten Wassers enthält. Die Mischung wird in Portionen von je 1 ml in Glasflaschen verteilt.
Die Flaschen werden gefriergetrocknet und zugeschmolzen. Nach Wiederauflösung mittels Zugabe von ml destilliertem Wasser wird der Impfstoff seronegativen Personen subkutan inokuliert. Die Titration der Einzeldosen reicht dabei bis etwa 102>83 InD50 in GMN Zellen oder 103-9 BPBU in KN 13 Zellen.
Eine serologische Untersuchung einer Gruppe von 7 seronegativen Personen ergab, daß alle mit einem mittleren Titer von 1J'64 nach dem HAH Test auf den Impfstoff reagiert hatten.
Niemand zeigte klinische Zeichen einer Infektion.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Röteln, dadurch,, .gekennzeichnet, daß man einen Rötelnvirusstamm durch mindestens 15 aufeinanderfolgende Passagen auf primären Kaninchen-Nierengewebe Monoschichtzellkulturen bei 28 bis 36° C, vorzugsweise bei 34° C, attenuiert und die geernteten Rötehiviren als Lebendvakzine in bekannter Weise konfektioniert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zahl der aufeinanderfolgenden Passagen auf primären Kaninchen-Nierengewebekulturen zwischen etwa 20 und etwa 60 liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer jeder der aufeinanderfolgenden Passagen 5 Tage nicht übersteigt.
009543/326
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