DE1617775C - Verfahren zur Herstellung eines ab geschwächten Röteln Lebendvirusimpfstof fes - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines ab geschwächten Röteln Lebendvirusimpfstof fesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines abgeschwächten Röteln-Lebendvirusimpfstoffes, der fähig ist, aktive Immunität gegen Röteln zu bewitken.
Der Ausdruck »abgeschwächtes Lebendvirus«, der
in dieser Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf einen Rötelnvirus (RV) Stamm, dessen Virulenz durch
wenigstensl5 aufeinanderfolgende Passagen auf primären Kaninchennierengcwebskulturen abgeschwächt wurde.
Entsprechend dem im folgenden beschriebenen Verfahren wird ein modifiziertes Virus und damit ein
Impfstoff von hoher Antigenwirkung erhalten, der bei damit geimpften Kindern zu keiner nennenswerten
unerwünschten Reaktion führt.
Das Auftreten unerwünschter Reaktionen, darunter insbesondere die mögliche Verbreitung des Virus durch
die Geimpften, ist eines der Hauptprobleme bei der Entwicklung eines Röteln-Lebendtypimpfstoffs.
Es ist bekannt, daß neben Komplikationen wie der Enzephalitis und der thrombocytopenischen Purpura,
die ernst, aber sehr selten sind, und auch der Arthritis, die nicht ungewöhnlich, aber im allgemeinen nicht
ansteckend und von kurzer Dauer ist, die dramatischste Komplikation dieser Krankheit von teratogener Natur
ist. Röteln sind tatsächlich ein ernstes Problem für Frauen im ersten Drittel der Schwangerschaft wegen
des Vorkommens kongenitaler Mißbildungen des Fötus, Totgeburten oder Abgängen.
In dieser Hinsicht ist es wesentlich, daß ein Kind, das einen Röteln-Lebendtypimpfstoff erhält, keine potentielle
Gefahr für eine schwangere Frau darstellt, mit der es in Berührung kommt.
Bis jetzt gab es nur zwei Möglichkeiten, solche fötalen Röteln-Komplikationen zu verhüten: Entweder
verabreichte man große Dosen von Gammaglobulinen an exponierte Schwangere, oder man setzte
junge Mädchen den Röteln aus, bevor sie das gebärfähige Alter erreichten.
Die Verabreichung von Gammaglobulinen wird keinesfalls von allen Spezialisten als wirksame Behändlungsmethodc
angesehen. Aus offensichtlichen Gründen ist es auch keine annehmbare Lösung des Problems,
Jugendliche dieser Krankheit auszusetzen.
Überraschenderweise hat man jetzt gefunden, daß aufeinanderfolgende Passagen des Rötelnvirus auf
primären Kaninchennierengcwebskulturen (KN) nicht nur zu einer Abschwächuhg der Virulenz führt, sondern
auch ein Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten Röteln-Lebendimpfstoffvirus darstellt, das keine
nennenswerten unerwünschten Reaktionen verursacht.
Unter dem oben verwendeten Ausdruck »keine nennenswerten unerwünschten Reaktionen« wird nicht
nur verstanden, daß die Inokulation des erfindungsgemäßen
Impfstoffes eine Immunität bewirkt, ohne zu den üblichen pathologischen Symptomen regulärer
Röteln zu führen, sondern auch, daß bei klinischen . Untersuchungen,' die mit dem erfmdiingsgemäßen
Impfstoff durchgeführt wurden, keine serologische oder virologische Evidenz einer Infektion bei anfälligen
Kontaktpersonen beobachtet wurde. .
Das erfmdungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Röteln besteht darin, daß man
einen Rötclnvirtisstamm durch mindestens 15 aufeinanderfolgende
Passagen auf primären Kaninchen-NiureiiffcwcncMonoschichtzcllkulturciihei28
bis 36"C, vorzugsweise 34''C, alleniiiert und die geernteten
Kölclnviruii als I.chendvakziiie in bekannter Weise
konfcklionitru
Entsprechend der Erfindung wird das Rötelnvirus einer genügenden Zahl von Passagen auf primären
Kaninchennierengewebskulturen unterworfen, bis die Abschwächung eingetreten ist. Es hat sich gezeigt, daß.
die Abschwächung wenigstens 15 Passagen erfordert, vorzugsweise zwischen 20 und 60 Passagen. Diese
Passagen werden bei Temperaturen durchgeführt, die 360C nicht übersteigen.
Die Dauer jeder Passage liegt vorzugsweise zwischen 3 und 6 Tagen. Ein Impfstoff wird schließlich aus einer
geeigneten Passage auf primären Kaninchennierengewebskulturen nach irgendeiner der bekannten
Techniken gewonnen.
Das Rötelnvirus, das für die Ausführung dieser Erfindung verwendet wird, wird aus einem typischen
klinischen Fall isoliert, z. B. aus einem Kehlkopfabstrich, aus Urin oder aus Gurgel wasser. Die Proben
werden entweder sofort gefroren und bei — 600C bis zur Verwendung aufbewahrt oder unmittelbar
einem geeigneten Gewebskultursystem inokuliert, z. B. primären Nieren Monoschichten von Afrikanischen
Grünen Meerkatzen (GMN), oderirgendeinemanderen f Gewebskultursystem, das üblicherweise für solche M
Isolierungen verwendet wird. Das Vorhandensein des Rötelnviriis wird geprüft, indem die Kulturen beispielsweise
mit einem Enterovirus, wie dem Echovirus 11 oder dem Coxsackievirus Λ 9, am 9. oder 10. Tag
nach der Inokulation infiziert werden.
Durch Verwendung eines spezifischen, aus Kaninchen gewonnenen Antiserums gegen einen bekannten
RV Stamm ist es möglich, das Rötelnvirus durch einen spezifischen Neutralisationstest in geeigneten Zellen,
wie den GMN Zellen, zu identifizieren. Die Abwesenheit fremder Affenviren wird in GMN Zellen nach Neutralisation
durch spezifisches RV Antiserum geprüft, das in einem anderen Zellsystem hergestellt wurde.
Die primären Kaninchennierenzellkulturen für die aufeinanderfolgenden Passagen werden vorzugsweise
aus den Nieren von höchstens 3 Wochen alten Tieren gewonnen. Ein bevorzugtes Nährmedium für primäre
Kaninchennierenkulturen ist Hank's Salzlösung, die mit inaktiviertem Kalbsserum, Lactalbuminhydrolysät
und Tryptosephosphat-Brühe ergänzt ist, aber andere /
bekannte Medien können ebenfalls verwendet werden. ν Die Inkubationstemperatur ist höchstens 360C. Die
aufeinanderfolgenden Passagen werden derart ausgeführt, daß aliquote Teile der überstehenden Flüssigkeit
dervorausgegangenen Passage Kaninchennieren-Monoschichten inokuliert werden. Das Virus wird vorzugsweise
zwischen dem 3. und 6. Tag nach der Inokulation geerntet. Die Titration des geernteten Virus kann nach
der Interferenzmethode in· GMN-Kultur-Röhrchen ausgeführt werden, unter Verwendung von beispielsweise
Echovirus 11 oder Coxsackievirus/19, wie es
oben für den Isoiationsschritt angegeben wurde.
Bei einem bestimmten Stand der Passagen, nicht vor der 15. und vorzugsweise zwischen der 20. und der 60
Passage, wird die überstehende Flüssigkeit der inokulierten Kulturen entfernt und die Monoschichten
werden mit gepufferter Salzlösung, z. B. mit Eagle's Lösung oder Hank's Lösung, gewaschen und weiter in
einem Aufbewalirungsmedium inkubiert,z'. B. in Hank's
Lösung, die mit Cnseinhydrolysat ergänzt ist. Nach einer weiteren dreitägigen Inkubation wird die überstehende
Flüssigkeit geerntet und durch Filtration oder : Zentrifugation geklärt.
Eine andere Möglichkeit, das Virus zu ernten, besteht
darin, die Kultur in dem Aufbcwahrungsmedium
10
einzufrieren, aufzutauen, zu schütteln und anschließend zu zentrifugieren oder zu filtrieren.
Das geerntete Rötelnviriis mit oder ohne stabilisierenden
Zusatz kann entweder in gefrorenem Zustand, z. B. bei etwa —600C, oder im gefriergetrockneten
Zustand aufbewahrt werden. Der erhaltene Impfstoff wird subkutan oder intramuskulär verabreicht,
wenn nötig nach Wiederauflösung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Ein 3 Wochen altes Kaninchen aus einer Zuchtkolonie wird auf die Abwesenheit von pathologischen
Anzeichen hin untersucht und geschlachtet. Beide Nieren werden aseptisch entfernt und in kleine Stücke
geschnitten, die in trypsinhaltigcr (2,5 g/l) gepufferter Salzlösung 10 Minuten bei einer Temperatur von 37° C
ständig gerührt werden. Die Flüssigkeit wird abgegossen und durch das gleiche Volumen frischer Trypsin-Iösung
ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird bis zur völligen Auslaugung des Gewebes fortgesetzt, während
die Flüssigkeit von Zeit zu Zeit abgetrennt unddiedarin suspendierten Zellen zentrifugiert werden.
Der Zellniederschlag wird in Hank's Lösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser letzte Schritt
wird zweimal wiederholt, und der schließlich erhaltene Zellniederschlag wird mit einer Konzentration von
etwa 105 Zellen pro ml in einem Nährmedium suspendiert,
das aus Hank's Salzlösung und zugesetztem inaktiviertem Kalbsserum (10%), Lactalbuminhydrolysat
(0,5%) und Tryptose-Phosphat-Brühe (0,1%) besteht.
Aliquote Teile (1 ml) der erhaltenen Zellsuspension mitetwal0äZcllenwerdeninl0 Kulturröhrchen (12mm
Durchmesser) gegossen, die leicht schräg gestellt 4 Tage bei 37°C inkubiert werden. Nach dieser Inkubationsperiode
hat sich eine vollständige Monoschicht gebildet.· Unmittelbar vor der Virusinokulation wird
das Nährmedium durch das gleiche Volumen eines frischen Nährmediums ersetzt.
Das gleiche Nährmedium wird vor und nach der Virusinokulation verwendet, und jede primäre Kaninchennieren
(KN)-Zellkultur dieses Beispiels wird nach der hier beschriebenen Technik bereitet.
Aliquote Teile (0,1 ml)eines Rötelnvirusstammes,der in primären GMN Kulturen gezüchtet wurde und drei
Passagen in diesem System durchlaufen hat, werden zur weiteren Charakterisierung in primäre KN Kultur-Röhrchen
inokuliert, die in schräger Position bei 340C inkubiert werden.
Am 6. Tag nach der Inokulation wird die überstehende Flüssigkeit geerntet und das geerntete Virus
nach der oben beschriebenen Interferenzmethode identifiziert und titriert.
Der Titer in GMN Zellen nach dieser ersten Passage auf KN Zellen ist ΙΟ2·83 InD30 pro ml.
Aliquote Teile der vereinigten überstehenden Flüssigkeiten der ersten Passage werden in andere primäre
KN Kultur-Röhrchen inokuliert, die bei 34°C inkubiert werden.
Am 6. Tag nach der Inokulation wird die überstehende Flüssigkeit geerntet. Das Virus wird titriert,
wie es beim Ende der ersten Passage angegeben wurde. Dieses Verfahren wird bis zur 20. Passage wiederholt,
die Inkubationsdauer jeder einzelnen Passage beträgt 3 bis 5 Tage. . ,
Von der 9. Passage an beobachtet man einen zellschädigenden
Effekt in den primären KN Zellen.
Für die 21. Passage in KN Zellen werden primäre
KN Zellkulturen in 500 cm2 Roux-Flaschen hergestellt,
wobei die oben beschriebene Technik verwendet wird.
Nach einer Inkubationsdauer von 3 Tagen bei 35°.C
erhält man eine vollständige Monoschicht. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und durch das
gleiche Volumen des gleichen Nährmediums ersetzt. Mit aliquoten Teilen des Virenmaterials aus der 20.
Passage wird inokuliert.
Nach einer weiteren 6 tägigen Inkubation bei 340C
wird die überstehende Flüssigkeit abgegossen und durch das gleiche Volumen an Aufbewahrt! ngs:nedi um
ersetzt, das aus Hank's Lösung besteht, die mit 0,3% Caseinhydrolysat ergänzt ist. Nach weiterer 3tägiger
Inkubation bei 34°C wird die überstehende Flüssigkeit geerntet und durch Zentrifugation geklärt.
Proben werden zur Titration, zur Identifizierung und
für Sicherheitsteste genommen. Das Virus wird bei — 60°C gelagert.
Der Virustiter ist 105 InD50 pro ml nach Bestimmung
in primären GMN Zellen mittels der Interferenzmethode.
Dieses Virenmaterial wird dann Sicherheitsuntersuclningen
unterworfen, zu denen die Prüfung auf Abwesenheit von Bakterien und Fremdstoffen gehört.
Hierzu wird es Kaninchen, Hamstern, Meerschweinchen, Mäusen und Affen inokuliert.
Zusätzliche Sicherheitsuntersuchungen werden in verschiedenen Gewebskultursystemen durchgeführt.
Die vorläufige Bestimmung der Wirksamkeit wird durch Inokulation von 103·5 InD50 in Kaninchen und
Affen ausgeführt. Die Serumneutralisations(SN)-testc werden in GMN Zellen durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen I und II angegeben.
Antikörperbildung in Affen nach intramuskulärer Inokulation von 103·5 InD50
| Serumprobe | Resultate des | gegen 30 | S N-Testes | 32* | 45* | |
| Affen | vor Inokulation | InD,,, | 7,r, | 7,6 | ||
| in GMN-Zellen | V.r. | V35 | ||||
| η | 1U | 14* | 25* | NB | V=B | |
| .225 | 1U | NB | i V8 | NB | '/:,·> | |
| 509 | 7. | NB | I Vl . | NB | Vl. | |
| 611. | 1Z, | Vl | i V8 | NB | Via | |
| 831 | .Vl | Vl | 1 Vm i | NB | V« | |
| 619 | V, | Vl | i V3 : | NB |
I ;'
/MS' |
|
| 857 | Vl | Vl | ■ Vs : | NB | V8 | |
| 1064 | ■V. | NB | V32 | |||
| 953 | 7, | NB | , Vie | |||
| 1053 | NB | i Vl : | ||||
NB = Nicht bestimmt * Tage nach Inokulation
Antikörperbildung in Kaninchen nach
subkutaner Inokulation von 1();1·5
subkutaner Inokulation von 1();1·5
| Seriiinprohe | Resultate des SN-Testes | |
| K a η i li ehen |
vor Inokulation | gown M) 111IV1., |
| η | in GMN-Zeilen | |
| ί | 24 Tage nach Inokulation | |
| 2 | ■ ' ■ 1 - ' ■ ■ / s | |
| 3 | ■ ■ i Λ ■ | |
| 4 | '<■'."' | |
| 5 | :' '·■ ■ 'iV·' | |
| 6 | . ■■ . I ' -1 ■ /s ■ |
|
| 7 | /ι v | Ii . .·ιι; v ... |
| 8 | ί ι | ι: • 11; |
| /ι ■ | Vh ■ ■ | |
| I | ||
|
l ι
ι I |
||
|
11
ι i |
||
| Vl |
Das Viruspräparat wird in Glasnaschchen verteilt,
von denen jedes 1 ml Flüssigkeit enthält.
Die Fläschchcn werden gefriergetrocknet und zugeschmolzen.
Nach Wicdcraiiflösung durch Zusatz von einem ml
destilliertem Wasser wird der Impfstoff subkutan anfälligen Personen inokuliert,die Einzeldosen betragen
dabei etwa 125 InD50.
Resultate einer serologischen Untersuchung an einer Gruppe von 25 scroncgativen Kindern (15 wurden
geimpft und 10 Kontrollpcrsoncn lebten in engem Kontakt mit ihnen) sind in Tabelle III gegeben.
Von 15 geimpften Kindern hatten 13 einen Anstieg der Antikörper bis auf Vm °dcr mehr (2 Proben —
bezeichnet mit NB — waren zur Zeit des Testes nicht verfügbar). Keines zeigte klinische Zeichen einer
Infektion. Alle 10 Kontaktpersonen blieben serologisch negativ.
Serologische Untersuchung, ausgedrückt durch scroncutialisierenden Antikörper
Anlikörperbildung in Affen nach
intramuskulärer Inokulation von 102·5 InD50
intramuskulärer Inokulation von 102·5 InD50
|
Affen
η |
Senimprobc
vor Inokulation |
Resultate des SN-Testes gegen 10 InD50- in GMN-Zellen |
39* |
| 25* | NB | ||
| 1098 | < 1U | Vs | NB |
| 1091 | Vs | Vs | |
| 919 | Ve | Vie | |
| 943 | < 1U | Vie | |
| Personen |
Alter
(Jahre) |
Probe
vor Impfung |
Status |
56 Tage
nach Impfung |
| S. M. | 2V2 | <4 | V | 32 |
| V. S. | 2 | <4 | V | >32 |
| M. J. | 2 ' | <4 | V | >32 |
| N. R. | 2 | <4 | V | 32 |
| H.A. | . 1 | <4 | V | >32 |
| DB. G. | 2 | <4 | C | <4 |
| VN. L. | 2 | <4 | C | <4 |
| R. F. | 2 | <4 | V | > 32 |
| B. D. | 2 | <4 | C | <4 |
| J. A. | <4 | C | <4 | |
| V.M. | 1 | <4 | V | >32 |
| E. P. | 1 | <4 | V | >32 |
| L. T. | 1 | <4 | C | <4 |
| CC. | 1 | <4 | V | >32 |
| A. M. | 1 | <4 | V | >32. |
| R. O. | 1 | <4 | C | <4 |
| L. A. | 2 | <4 | V | NB |
| D. A. | 2 | <4 | C | <4 |
| G. O. | 2VS | <4 | C | <4 |
| M. A. | 2V2 | <4 | V | NB |
| J. A. | 1 | <4 | C | <4 |
| P.A. | 21/= | <4 | V | >32 |
| D.B. | 3V* | <4 | ν | 32 |
| GB. K. | 5 | <4 | V | 8 |
| GB. F. | 4 | <4 | C | <4 |
* Tage nach Inokulation
Ausgehend von dem Virenmaterial der 21. Passage bei 34°C (Beispiel 1) werden 9 weitere aufeinanderfolgende
Passagen in primären KN Zellkulturen bei 28°C ausgeführt, einschließlich des letzten Schrittes
der Impf stoff bereitung.
Der erhaltene Impfstoff wird Sicherheitstesten unterworfen und zur Wirksamkeitsbestimmung Affen und
Kaninchen inokuliert.
Resultate sind in den folgenden Tabellen V und VI wiedergegeben.
Tabelle V
Antikörperbildung in Affen nach
Antikörperbildung in Affen nach
| intramuskulärer Inokulation von 102 |
Serumprobe
vor Inokulation |
•° InD50 | 39* Vl. Ve |
| Affen η |
<V,
<V« |
Resultate des SN-Testes gegen 10 InD50 in GMN-Zellcn |
|
| 35 1003 977 |
25* Ve 8 |
40
45
Antikörper in Kaninchen nach
intramuskulärer Inokulation von 102·0 InD50
intramuskulärer Inokulation von 102·0 InD50
| Kanin chen η |
Senimprobe
vor Inokulation |
Resultate des SN-Tcstes gegen 10 InD40 in GMN-Zellen |
| 29 30 31 32 33 |
<v«
<v* <v« <v« <v« |
26* Ve V4 Vl. Ve ' V4 |
55 C <4
' V = Geimpft C = Kontakt
Es wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen, die Passagen werden jedoch bis zur 30. Passage in
primären KN Zcllkulturcn fortgesetzt.
Hieraus wird ein Impfstoff hergestellt, der den in Beispiel 1 bcschi iebenen Sichcrhcitstcstcn unterworfen
wird. " '
Die Wirksamkeit des Präparates wird an Tieren (Affen) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV
wiedergegeben.
* Tage nach Inokulation
Bei spiel 4
■ Es wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen,
die Passagen werden jedoch bis zur 51. Passage in primären KN Zellkulturen ' fortgesetzt. Das letzte
Aufbewahrungsmedium besteht aus Hank's Lösung, die mit 0,3 °/o Caseinhydrolysat ergänzt ist und" 50 meg
Chloramphenicol pro ml enthält.
Nach 9tägiger Inkubation bei 34° C wird die überstehende
Flüssigkeit geerntet, durch Zentrifugatipn geklärt und mit dem gleichen Volumen einer stabilisierenden
Lösung vermischt, die pro Liter destillierten Wassers 30 g, Kaliumglutamat, 200 g Saccharose und
50 mg Chloramphenicol enthält. Die Mischung wird in Portionen von je 1 ml in Glasflaschen verteilt.
Die Flaschen werden anschließend gefriergetrocknet und zugeschmolzen.
Nach Wiederauflösung mittels Zusatz von 1 ml destilliertem Wasser wird der Impfstoff subkutan 65
seronegativen Personen inokuliert. Die Titration der Einzeldosen reicht dabei bis etwa 102|β InD50 in GMN
Zellen oder 103-7 PBU (Plaquebildende Einheiten) in
KN13 Zellen. Eine Gruppe von 30 seronegativen
Kindern wurde 6 Wochen lang in engem Kontakt mit den geimpften gehalten.
Eine serologische Untersuchung der Gruppe der 65 geimpften Personen ergab, daß alle bis auf einen mit
einem mittleren Antikörper-Titer von 1I128 1, bestimmt
im HAH (Haemagglutinationshemmung) Test, auf den Impfstoff reagiert hatten. Keine der Personen zeigte
klinische Zeichen einer Infektion. Alle 30 Kontaktpersonen blieben serologisch negativ.
B ei s ρ i el 5
Es wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen, die Passagen werden jedoch bis zur 61. Passage in
primären KN Zellkulturen fortgesetzt. Das letzte Aufbewahrungsmedium besteht dabei aus Hank's
Lösung, die mit 0,3 % Caseinhydrolysat ergänzt ist und pro ml 50 meg Chloramphenicol enthält.
Nach 9tägiger Inkubation bei 34° C wird die überstehende
Flüssigkeit geerntet, durch Zentrifugation geklärt und mit dem gleichen Volumen einer stabilisierenden
Lösung vermischt, die 30 g Kaliumglutamat, g Saccharose und 50 mg Chloramphenicol pro
Liter destillierten Wassers enthält. Die Mischung wird in Portionen von je 1 ml'in Gläsflaschen verteilt.
Die Flaschen werden gefriergetrocknet und zugeschmolzen. Nach Wiederauflösung mittels Zugabe von
ml destilliertem Wasser wird der Impfstoff seronegativen Personen subkutan inokuliert. Die Titration der
Einzeldosen reicht dabei bis etwa 102-83 InD50 in
GMN Zellen oder 103-9 BPBU in KN 13 Zellen,
ίο Eine serologische Untersuchung einer Gruppe von 7 seronegativen Personen ergab, daß alle mit einem mittleren Titer von V64 nach dem HAH Test auf den Impfstoff reagiert hatten.
ίο Eine serologische Untersuchung einer Gruppe von 7 seronegativen Personen ergab, daß alle mit einem mittleren Titer von V64 nach dem HAH Test auf den Impfstoff reagiert hatten.
Niemand zeigte klinische Zeichen einer Infektion.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Röteln, dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Rötelnvirusstamm durch mindestens 15 aufeinanderfolgende Passagen auf
primären Kaninchen-Nierengewebe Monoschichtzellkulturen bei 28 bis 36° C, vorzugsweise bei 340C,
attenuiert und die geernteten Rötelnviren als Lebendvakzine in bekannter Weise konfektioniert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zahl der aufeinanderfolgenden
Passagen auf primären Kaninchen-Nierengewebekulturen zwischen etwa 20 und etwa 60 liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer jeder der aufeinanderfolgenden
Passagen 5 Tage nicht übersteigt.
109 623 178
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