DE2555188A1

DE2555188A1 - Immunologische analyse

Info

Publication number: DE2555188A1
Application number: DE19752555188
Authority: DE
Inventors: William Joseph Mcaleer; William John Miller
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1974-12-09
Filing date: 1975-12-08
Publication date: 1976-06-10
Also published as: FR2294446B1; DE2555188C2; GB1508879A; DE2560402A1; NL189051B; DE2560402C2; FR2294446A1; JPS5182721A; NL189051C; NL7513817A

Description

Patentanwälte:
Dr. fng. V/,?Jior AbItZ
Dr. Diöler Γ. Wort
Dr. Hans-Α. Brauns

*. 28

15 719-Y

MERCK & CO., INC. Railway, New Jersey 07065, V.St.A.

Immunologische Analyse

Die Erfindung betrifft eine Analysenmethode auf Hepatitis A-Antikörper und -Antigen sowie γ-Globulin von bekanntem Hepatitis A-Antikörpertiter. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Immunkörperfixierungsmethode und die Anwendung einer solchen Methode auf die Herstellung von y-Globulin von bekanntem Hepatitis A-AntikÖrpertiter.

Hepatitis A ist eine Leberkrankheit, die zwar im allgemeinen nicht tödlich verläuft, aber zu einer vielwöchigen schwächenden Erkrankung führen kann. Gewöhnlich verbreitet sie sich durch direkte Berührung mit infizierten Personen oder durch infiziertes Trinkwasser oder infizierte Nahrungsmittel. Die zur Zeit bekannte Methode zum Nachweis von Hepatitis A ist zu unempfindlich, zeitraubend und kostspielig. Es gab bisher keinen empfindlichen, sowohl spezifischen als auch reproduzierbaren Test zum schnellen Nachweis, ob das Serum eines Patienten oder Blutspenders Hepatitis A-Äntikorper oder -Antigen

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enthält oder nicht. Die bisher bekannte Methode zur Bestimmung von Hepatitis A-Antikörper erfordert z.B. Neutralisationsuntersuchungen an Seidenäffchen. Dieses Verfahren dauert 8 bis 10 Wochen, und es können nur 1 oder 2 Proben je 100 Seidenäffchen untersucht werden.

Das Verfahren gemäss der Erfindung zur Behandlung von Personen, von denen anzunehmen ist, dass sie in Gefahr sind, von Hepatitis A befallen zu werden, besteht in der Darreichung von γ-Globulin. Das Prinzip dieser Behandlung beruht auf der Erwartung, dass das γ-Globulin Hepatitis A-Antkörper in genügender Menge enthält, um der behandelten Person Immunität zu verleihen. Es ist aber bekannt, dass γ-Globulin einigen damit behandelten Personen keine Immunität verleiht.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zum direkten Nachweis von Hepatitis Α-Antikörper oder -Antigen zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum schnellen und genauen Nachweis von Hepatitis Α-Antikörper im Blut oder dessen Derivaten zur. Verfügung zu stellen. Der Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur klinischen Unterscheidung zwischen Hepatitis A und Hepatitis B zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel zum Nachweis von Hepatitis Α-Antigen in Leberbiopsiegewebe zur Verfügung zu stellen. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein γ-Globulin von bekanntem Gehalt an Hepatitis A-Antikörper zur Verfügung zu stellen. Schliesslich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Verfügung zu stellen, um γ-Globulin von hohem Hepatitis A-Antikörpertiter zu gewinnen.

Zur Untersuchung einer Probe auf Hepatitis Ä-Antikörper setzt man Hepatitis Α-Antigen von bekannter Konzentration zu einer Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Probe zu. Nach der In-

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kubation, tun das Antigen mit dem Antikörper unter Bildung eines Komplexes reagieren zu lassen, setzt man Komplement zu und lässt das Komplement durch eine weitere Inkubation mit dem Komplex reagieren. Vorzugsweise setzt man auch noch einen Stoff zu, der die Agglutination irreversibel macht, und sodann setzt man vorgegebene menschliche rote Blutzellen der Gruppe zu. Wenn die Agglutination vollständig ist, wir.d das Ausmaß der Agglutination bestimmt. Der Endpunkt der Titration ist die niedrigste Konzentration, die einen vorgegebenen Agglutinationsgrad zeigt.

Zur Untersuchung einer Probe auf Hepatitis Α-Antigen setzt man Hepatitis Α-Antikörper von bekannter Konzentration zu einer Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Probe zu. Nach der Inkubation zwecks Umsetzung von Antigen und Antikörper zu einem Komplex setzt man Komplement zu und lässt dann durch weitere Inkubation das Komplement mit dem Komplex reagieren. Vorzugsweise setzt man auch noch einen Stoff zu, der die Agglutination irreversibel macht, und anschliessend setzt man vorgegebene menschliche rote Blutzellen der Gruppe 0 zu. Wenn die Agglutination vollständig ist, wird das Ausmaß der Agglutination bestimmt. Der Endpunkt der Titration ist die niedrigste Konzentration, die einen vorgegebenen Agglutinationsgrad zeigt. ,

Menschliches Immunserumglobulin (γ-Globulin) von einem bekannten erwünschten Hepatitis A-Antikörpertiter wird gewonnen, inde.m man das Plasma von Blutspendergruppen, die durch die Hepatitis A-Antikörperanalyse ausgewählt worden sind, verarbeitet, oder indem man einen unerwünscht niedrigen Hepatitis A-Antikörpertiter durch Zusatz von γ-Globulin von dem gewünschten Titer erhöht.

Bei der erfindungsgemässen Analysenmethode werden die folgenden Reagenzien verwendet:

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1. GVB.. GVB (Gelatine-Veronalpuffer) ist ein 1 % Gelatine enthaltender Veronalpuffer.

2. Testseren. Seren oder Plasmen menschlichen oder tierischen Ursprungs werden als solche ohne Vorbehandlung für die Bestimmung des Antikörpergehalts verwendet.

3. Menschliches Immunserumglobulin. Das Globulin wird im Verhältnis 1:10 mit GVB verdünnt, so dass man eine Konzentration von etwa 15 mg Protein je ml erhält. Zu 1 Raumteil verdünntem γ-Globulin setzt man 1 Raumteil 10- bis 50-prozentiges Absorptionsmittel (Gewicht/Volumen) in GVB zu. Beispiele für geeignete Absorptionsmittel sind

"ZZ'Ä5'%. Kaolin" (Gewicht/Vo^men), 25 % Fuller- ./'..."Γ." 7.'".".'Z

erde (Gewicht/Volumen) usw. Das Gemisch wird in einem mit Stopfen versehenen Gefäss 20 Minuten lang alle 5 Minuten geschüttelt und dann 10 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 1500 U/min zentrifugiert, worauf man die überstehende Flüssigkeit für die Verwendung bei der Analyse gewinnt. Die endgültige Globulinverdünnung beträgt 1:20.

4. Antigen. Das Hepatitis Α-Antigen (Antigen der infektiösen Hepatitis) wird aus der Leber eines nicht-menschlichen Primaten, z.B. eines Seidenäffchens, gewonnen, der intravenös mit Hepatitis Α-Virus nach der Methode von Mascoli und Mitarbeitern ("Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", Band 142, 1973, Seite 276) infiziert worden ist. Die Leber wird zu einem Zeitpunkt, zu dem der Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym erhöht ist, was gewöhnlich etwa 14 bis 40 Tage nach der Impfung der Fall ist, entfernt. Die Leber wird mit physiologischer Kochsalzlösung von einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,8, z.B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,005-molares Natriumphosphat und 0,143-molares Kochsalz enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, perfundiert. Dann wird die Leber zerkleinert, gemahlen und in solcher Menge zu physiologischer Kochsalzlösung zu-

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gesetzt, dass man eine 10-gewichtsprozentige Suspension in physiologischer Kochsalzlösung erhält. Das Antigen besteht aus der überstehenden Flüssigkeit, die man nach der Klärung durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit, z.B. durch kurzzeitiges, beispielsweise 5 bis 15 Minuten langes, Zentrifugieren mit 1000 bis 2000 U/min, erhält.

Das geklärte Antigen kann dann durch Behandeln mit Kaolin gereinigt und unmittelbar für die Analyse verwendet werden, oder es kann durch isopyknische Bandbildung (isopycnic banding) nach Dichtegradient-Zentrifugiermethoden gereinigt werden. Wenn man mit Caesiumchlorid arbeitet, entspricht das Antigen einer Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm und wird für die Verwendung bei der Hepatitis Α-Analyse abgetrennt. Die Stärke des Antigens wird nach Standardmethoden durch Blocktitration gegen Hepatitis A-Antikörper bestimmt.

Gegebenenfalls, aber vorzugsweise, kann das Antigen in an sich bekannter Weise, z.B. durch Behandeln mit Formaldehyd oder anderen bekannten Inaktivierungsmitteln, inaktiviert oder geschwächt werden, bevor es für die erfindungsgemässe Analyse verwendet wird.

Vorstehend ist eine besondere Methode zur Gewinnung von Hepatitis Α-Antigen beschrieben worden; die erfindungsgemässe Analyse ist jedoch nicht auf die Verwendung von Hepatitis A-Antigen beschränkt, das nach dieser besonderen Methode hergestellt worden ist.

5. Komplement. Serum von frisch ausgebluteten Meerschweinchen wird hergestellt und nach Entfernung der Zellen in Anteilen zu je 0,3 ml bei -70° C ausgefroren und gelagert.. Jeder Anteil wird unmittelbar vor der Verwendung aus dem Tiefkühllager entnommen und mit GVB zu einem zuvor bestimmten Grad verdünnt, der so bemessen ist, dass man den

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maximalen Agglutinationstiter ohne Störung erhält, wie es von Mayumi und Mitarbeitern in "Vox. Sang.", 20:178-181 (1971) beschrieben ist. In typischer Weise wird, diese Verdünnung auf etwa 1:50 bis etwa 1:100 durchgeführt.

6. DTT-EDTA-GVB, Eine 0,10-molare Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) wird mit 1n Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. 2 Teile EDTA werden mit 3 Teilen GVB versetzt. Zu dieser Lösung setzt man so viel festen Dithiothreit (DTT) zu, dass man eine Konzentration von 3 mg DTT/ml erhält. Anstelle von DTT kann man auch andere, eine Sulfhydrylgruppe enthaltende Reduktionsmittel, wie z.B. Mercaptoäthanol, Dithioerythrit und dergleichen, in äquivalenter Menge verwenden.

7. Rote BlutzeIlen. Citratisiertes frisches Blut (menschliche Blutgruppe 0) wird dreimal in mit Phosphat auf einen pH-Wert von 7,2 gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in einer Konzentration von 50 Volumprozent suspendiert und bei 5 C gelagert. Vor der Verwendung werden die roten Blutzellen mit GVB auf etwa 0,25 bis 2 % verdünnt. Da einige Ansätze bei diesem Test nicht agglutinieren, müssen die Zellen vor der Verwendung für die eigentliche Analyse mit bekanntem Antigen und Antikörper geprüft werden. Der Test für die Auswahl menschlicher Blutzellen der Gruppe 0 auf ihre Brauchbarkeit wird folgendermaßen durchgeführt: Die roten Blutzellen werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und unter Verwendung einer Verdünnungsreihe eines menschlichen Immunserumglobulineinsatzes von bekanntem Titer untersucht, wobei man die richtige Verdünnung des, z.B. durch isopyknische Bandbildung (isopycnic banding) nach Dichtegradienten-Zentrifugiermethoden, gereinigten Antigens verwendet. Das Hämagglutinationsergebnis wird nach der Methode von

-. Hansson und Mitarbeitern ("Vox. Sang,», 24:95-101 1973) und von Gozin und Mitarbeitern ("Vox. Sang.¹¹, 23:472-477,

- .6 . 60 9'8 24/0809.

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1972) durch die Werte O bis 4+ gekennzeichnet. Brauchbare Ansätze geben für das bekannte positive menschliche Immunserumglobulin einen Agglutinationswert von 4+. Ansätze, die einen Agglutinationswert von weniger als 4 ergeben, sind im allgemeinen weniger zufriedenstellend.

Analysenmethode auf Antikörper

Die Vertiefungen 1 der Reihe A (Kontrolle) und der Reihe B (Analyse) einer geeigneten U-Boden-Mikrotiterplatte, wie sie z.B. von Canalco, Cooke, Linbro usw. hergestellt wird, werden mit je 0,05 ml der auf Antikörper zu untersuchenden Probe beschickt. Die Vertiefung 1 der Reihe C (Antigenkontrolle) wird mit 0,05 ml GVB beschickt. Die Vertiefungen 2 bis 11 der Reihen A, B und C werden mit Hilfe einer 0,025 ml fassenden Pipettenspitze mit je 0,025 ml GVB beschickt. Dann wird eine Verdünnungsreihe mit jeweils doppelter Verdünnung von der Vertiefung 1 zu der Vertiefung 11 der Reihen A, B und C mit Hilfe von von Hand betätigten oder automatischen Tulpenverdünnern (tulip diluters) durchgeführt. Wenn die Verdünnung vollständig ist, setzt man zu allen Vertiefungen der Reihe A 0,025 ml GVB und zu allen Vertiefungen der Reihen B und C 0,025 ml Antigen zu. Die Platte wird bedeckt, einige Minuten, z.B. 2 Minuten, von einer vibrierenden Schüttelmaschine in Schwingungen versetzt, um den Inhalt der Vertiefungen gut zu mischen, und inkubiert, um Antigen und Antikörper unter Bildung eines Komplexes reagieren zu lassen. Diese Inkubation erfolgt bei etwa 25 bis 60° C, vorzugsweise bei etwa 37° C, für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 48 Stunden, vorzugsweise von etwa 1 bis 18 Stunden.

Die Mikrotiterplatte wird dann aus dem Inkubator entfernt, worauf man zu jeder Vertiefung 0,025 ml Komplement zusetzt. Die Mikrotiterplatte wird wieder bedeckt, einige Minuten, z.B. 2 Minuten, auf eine Vibrierschüttelmaschine gesetzt, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen, und dann inkubiert,

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um das Komplement mit dem Komplex reagieren zu lassen. Diese Inkubation erfolgt bei etwa 25 bis 45 C, vorzugsweise bei etwa 37° C, für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 24 Stunden, vorzugsweise etwa 40 Minuten.

Die Platte wird aus dem Inkubator entfernt, worauf man zu jeder Vertiefung 0,025 ml DTT-EDTA-GVB zusetzt und dann einige Minuten, z.B. 2 Minuten, auf der Vibrierschüttelmaschine mischt. Sofort danach werden zu jeder Vertiefung unter Mischen 0,025 ml etwa 0,25- bis 2-prozentige, vorzugsweise 1-prozentige, menschliche rote Blutzellen der Gruppe 0 zugesetzt. Nach mindestens 2-stündigem bis mehrtägigem Stehenlassen bei Raumtemperatur werden die Vertiefungen auf Agglutination untersucht. Das Hämagglutinationsergebnis wird durch die Werte 0 bis 4+ gekennzeichnet. Infolge des Zusatzes von DTT ist die Agglutination irreversibel geworden. Der Endpunkt der Titration ist die letzte Vertiefung, die einen Agglutinationswert von 4+ zeigt.

Analysenmethode auf Antigen

Die Vertiefungen 1 der Reihe A (Kontrolle) und der Reihe B (Analyse) einer geeigneten U-Boden-Mikrotiterplatte, wie sie von Canalco, Cooke, Linbro usw. hergestellt wird, werden mit je 0,025 ml der auf Antigen zu untersuchenden Probe beschickt. Die Vertiefung 1 der Reihe C (Antikörperkontrolle) wird mit 0,05 ml GVB beschickt.' Die Vertiefungen 2 bis 11 der Reihen A, B und C werden mit Hilfe einer 0,025 ml fassenden Pipettenspitze mit je 0,025 ml GVB beschickt. Dann wird eine Verdünnungsreihe mit jeweils doppelter Verdünnung von der Vertiefung 1 zu der Vertiefung 11 der Reihen A, B und C mit Hilfe von von Hand betätigten oder automatischen Tulpenverdünnern (tulip diluters) durchgeführt. Wenn die Verdünnung vollständig ist, setzt man zu allen Vertiefungen der Reihe A 0,025 ml GVB und zu allen Vertiefungen der Reihen B und C 0,025 ml Antikörper zu. Die Platte wird bedeckt, einige Minuten, z.B. 2 Minuten,

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von einer vibrierenden Schüttelmaschine in Schwingungen versetzt, um den Inhalt der Vertiefungen gut zu mischen, und inkubiert, um Antigen und Antikörper unter Bildung eines Komplexes reagieren zu lassen. Diese Inkubation erfolgt bei etwa 25 bis 60° C, vorzugsweise bei etwa 37° C, für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 48 Stunden, vorzugsweise von etwa 1 bis 18 Stunden.

Die Mikrotiterplatte wird dann aus dem Inkubator entfernt, worauf man zu ^eder Vertiefung 0,025 ml Komplement zusetzt. Die Mikrotiterplatte wird wieder bedeckt, einige Minuten, z.B. 2 Minuten, auf eine Vibrierschüttelmaschine gesetzt, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen, und dann inkubiert, um das. Komplement mit dem Komplex reagieren zu lassen. Diese Inkubation erfolgt bei etwa 25 bis 45° C, vorzugsweise bei etwa 37 C, für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 24 Stunden, vorzugsweise von etwa 40 Minuten.

Die Platte wird aus dem Inkubator entfernt, worauf man zu ^eder Vertiefung 0,025 ml DTT-EDTA-GVB zusetzt und dann einige Minuten, z.B. 2 Minuten, auf der Vibrierschüttelmaschine mischt. Sofort danach werden zu jeder Vertiefung unter Mischen 0,025 ml etwa 0,25- bis 2-prozentige, vorzugsweise 1-prozentige, menschliche rote Blutzellen der Gruppe 0 zugesetzt. Nach mindestens 2-stündigem bis mehrtägigem Stehenlassen bei Raumtemperatur werden die Vertiefungen auf Agglutination untersicht. Das Hämagglutinationsergebnis wird durch die Werte 0 bis 4+ gekennzeichnet. Infolge des Zusatzes von DTT ist die Agglutination irreversibel geworden. Der Endpunkt der Titration ist die letzte Vertiefung, die einen Agglutinationswert von 4+ zeigt.

Das für die Analyse gemäss der Erfindung verwendete Antigen ist im einzelnen in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung (15 716), betitelt "Hepatitis-Antigen" beschrieben.

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Die immunologische Analysenmethode gemäss der Erfindung ist weitreichend anwendbar für den Nachweis und die Behandlung von Hepatitis A. Die Analyse kann angewandt werden, um Hepatitis A-Antigen oder -Antikörper bei Menschen und Tieren nachzuweisen. Sie kann von Krankenhäusern, Ärzten oder medizinischen Laboratorien angewandt werden. Sie kann verwendet werden, um die Menge von Hepatitis Α-Antikörper in menschlichem Immunserum- " globulin zu bestimmen, das aus Plasma von Blutspendern gewonnen worden ist. Die Blutspender können in drei bestimmte Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe von Blutspendern besteht aus demjenigen Teil der allgemeinen Bevölkerung, der Blut durch das Rote Kreuz spendet. Die zweite Gruppe von Blutspendern sind Personen, die ihr Blut an kommerzielle Blutbanken verkaufen. Die dritte Gruppe von Blutspendern sind Gefangene. Obwohl in neuerer Zeit vorgeschlagen worden ist, bei der Verarbeitung vom Plasma zu γ-Globulin das Plasma von kommerziellen Blutbanken und Gefangenen nicht zu verwenden, weil angenommen wurde, dass dieses Plasma unerwünschte Bestandteile enthält, geht die allgemein geübte Praxis dahin, zwischen der Herkunft des Plasmas keinen Unterschied zu machen und Plasma aus allen drei Quellen ohne Unterschied zu kombinieren.

Es wurde nun durch die Antikörperanalyse gemäss der Erfindung gefunden, dass einige Ansätze von y-Globulin entweder überhaupt keinen Hepatitis A-Antikörper oder nur eine so geringe Konzentration davon enthalten, dass es unwahrscheinlich ist, dass damit ein Immunisierungseffekt erzielt werden kann. Dies erklärt die bekannte Tatsache, dass in einigen Fällen mit y-Globulin behandelte Personen nicht immunisiert werden. Wenn keine zuverlässige Analysenmethode auf Hepatitis A-Antikörper zur Verfügung steht, ist die Darreichung von y-Globulin gewissermaßen ein Glücksspiel. Wenn das y-Globulin Hepatitis A-Antikörper in ausreichender Konzentration enthält, wird die betreffende Person gegen Ansteckung ,mit Hepatitis A geschützt. Wenn das y-Globulin andererseits keinen Hepatitis A-Antikörper

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oder eine zu geringe Konzentration davon, d.h. weniger als etwa 4000 Einheiten/ml, enthält, ist es wahrscheinlich, dass damit behandelte Personen nicht gegen die Krankheit immunisiert werden, es sei denn, dass sie bereits eigenen Hepatitis A-Antikörper besitzen.

Es wurde ferner gefunden, dass die von jeder dieser drei Gruppen von Blutspendern gewonnenen γ-Globuline sich erheblich in ihrem Gehalt an Hepatitis A-Antikörper unterscheiden. y-Globulin aus Plasma, das von der allgemeinen Bevölkerung stammt, enthält keinen Hepatitis Α-Antikörper oder eine zu geringe Konzentration daran. Andererseits enthält γ-Globulin aus Plasma von kommerziellen Blutbanken eine hohe Konzentration an Hepatitis A-Antikörper, während γ-Globulin aus Plasma von Gefangenen eine noch höhere Konzentration an Hepatitis A-Antikörper enthält. Durch die NichtVerwendung von Plasma solchen Ursprungs wird also, entgegen der bestehenden Absicht, ein Immunisierung seffekt nicht erzielt.

Es wurde ferner gefunden, dass γ-Globulin mit einer hinreichend hohen Konzentration an Hepatitis Α-Antikörper, d.h. etwa 4000 Einheiten/ml oder mehr, dadurch erhalten wird, dass man von kommerziellen Blutbanken und von Gefangenen stammendes Plasma gesondert von dem von Blutspendern aus der allgemeinen Bevölkerung stammenden Plasma verarbeitet. Das so erhaltene y-Globulin hat im allgemeinen einen Hepatitis A-Antikörpertiter von 4000 Einheiten/ml oder mehr und kann als solches verwendet oder in berechneten Mengen mit einer vorgegebenen Menge eines γ-Globulins vereinigt werden, das aus Plasma von Blutspendern aus der allgemeinen Bevölkerung gewonnen worden ist und einen Titer von weniger als 4000 Einheiten/ml aufweist, so dass man ein Produkt mit einem Titer von mindestens etwa 4000 Einheiten/ml erhält.

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¹⁵⁷¹⁹-^γ . -η.

Beispiel 1

Proben menschlichen Immunserumglobulins aus 26 kommerziellen Ansätzen werden, wie oben für menschliches Immunserumglobulin (Reagenz Nr. 3) beschrieben, unter Verwendung von 25% Kaolin als Absorptionsmittel für die Analyse hergestellt. Dann wird der Hepatitis A-Antikörpertiter der Proben nach der oben beschriebenen Methode bestimmt; die Ergebnisse sind die folgenden:

Hepatitis A-Immunoanalysentiter . Ansätze

1:100 - 5

1:200 0

1:400 0

1:800 - 1

1:1600 4

1:3200 11

1:6400 4

1:12 800 0

1:25 600 1

Bei 21 von 26 Ansätzen wird eine positive Antikörperreaktion (Grenzwert 1:800) festgestellt. Fünf der Ansätze haben jedoch Titer von 1:100 und enthalten daher praktisch keinen Antikörper. Diese fünf Ansätze würden eine schlechte Wirksamkeit für die Immunisierung von Personen gegen Hepatitis Α-Virus haben.

Beispiel 2

Die Hepatitis· A-Antikörpertiter werden an einer Gruppe von drei Patienten festgestellt, die einer Diagnose zufolge durch Nachweis von HB₃Ag (Australia-Antigen) in ihrem Serum an Hepatitis B leiden, und mit Sera der gleichen Patienten verglichen, die vor dem Beginn der Hepatitis B entnommen worden sind:

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Tag der Probenahme (der klinische Beginn

der Hepatitis B wird Immunoanalysentiter Patient als Tag Null bezeichnet) auf Hepatitis A

1 108 5

+ 10 5

+149 5

2 27 2560

7 5120

+192 . 2560

3 - 4 640

+ 8 640

+ 190 640

Keiner der drei Patienten zeigt im Verlaufe der Krankheit eine wesentliche Änderung in der Entwicklung von Hepatitis A-Antikörper, woraus zu schliessen ist, dass die Analyse für Hepatitis Α-Antikörper spezifisch ist. Diese Prüfergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Komplementfixierungstests. ·

Beispiel 3

Eine Probe von Antigen, die nach der obigen Vorschrift für das Reagenz Nr. 4 hergestellt worden ist, wird mit Antikörper nach

der oben beschriebenen Antigenanalysenmethode mit den folgenden Ergebnissen untersuchtt

Vertiefung	Verdünnung	Agglutination
1	1:1	4+
2	1:2	4+
3	1:4	4+
4	1:8	4+
5	1:16	4+
6	1:32	2+

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Beispiel 4

300 1 Plasma, die regellos in Form einzelner Ansätze zu je 400 ml von kommerziellen Blutbanken ausgewählt worden sind, werden vereinigt und nach der herkömmlichen Cohn*sehen Alkoholfällungsmethode auf y-Globulin aufgearbeitet. Das so erhaltene Pulver (13,8 kg) wird in 63 1 steriler, pyrogenfreier Kochsalzlösung aufgenommen. Bei der Untersuchung nach der immunologischen Analysenmethode gemäss der Erfindung zeigt der Ansatz einen mittleren Titer von 5000 Einheiten/ml.

Beispiel 5

Die einzelnen Plasmaphoreseeinheiten von kommerziellen Blutbanken werden nach der immunologischen Analysenmethode gemäss der Erfindung untersucht. Von 59 Einheiten (je etwa 400 ml) haben 7 Titer von 1:2560 oder mehr. Die darauffolgenden Einheiten von diesen Blutspendern werden gesondert aufgefangen, bis ungefähr 100 1 zur Verfügung stehen. Diese 100 1 werden nach der Cohen'sehen Alkoholfällungsmethode zu 0,5 kg Pulver verarbeitet. Das Pulver wird in 2,1 1 steriler, pyrogenfreier Kochsalzlösung aufgenommen. Bei der Analyse nach der immunologischen Analysenmethode gemäss der Erfindung zeigt der Ansatz einen mittleren Titer von 25 000 Einheiten/ml.

Beispiel 6

1429 1 Plasma werden nach der herkömmlichen Cohn*sehen Alkoholfällungsmethode zu 30 000 ml γ-Globulin verarbeitet. Das γ-Globulin wird nach der immunologischen Analysenmethode gemäss der Erfindung untersucht und zeigt einen Hepatitis A-Antikörpertlter von 1800 Einheiten/ml.. Dieser niedrige Hepatitis A-Antikörpertiter würde einen mit dem y-Globulin behandelten Patienten nicht mit Sicherheit gegen Hepatitis A schützen.

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Beispiel 7

Ein Ansatz von γ-Globulin aus dem von einer kommerziellen Blutbank gewonnenen Plasma wird nach der immunologischen Analysenmethode gemäss der Erfindung untersucht. Es wird ein Hepatitis A-Antikörpertiter von 4000 Einheiten/ml festgestellt. Ein zweiter Ansatz von γ-Globulin aus dem von Gefangenen eines Staatsgefängnisses gewonnenen Plasma wird ebenfalls nach der immunologischen Analysenmethode gemäss der Erfindung untersucht, wobei ein Hepatitis A-Antikörpertiter von 6400 Einheiten/ml festgestellt wird. Beide Ansätze haben also einen ausreichenden Hepatitis A-Antikörpertiter.

Beispiel 8

Um die nach Beispiel 6 hergestellten 30 000 ml γ-Globulin verwenden zu können, muss ihr Hepatitis A-Antikörpertiter auf 4000 Einheiten/ml erhöht werden. Da ein kommerzieller Ansatz 63 000 ml enthält, geschieht dies durch Zusatz von 5500 ml des 7-Globulins mit einem Titer von 4000 und 27 500 ml des y-Globulins mit einem Titer von 6400 gemäss Beispiel 7. Diese Mengen werden folgendermassen bestimmt: Wenn die in den Beispielen 6 und^.7 gewonnenen Raumteile γ-Globulin mit X, Y bzw. Z bezeichnet werden, beträgt das Gesamtvolumen X + Y + Z = 63 000 ml oder

1) -30 000 + Y + Z = 63 000 ml.

Da jeder Milliliter 4000 Einheiten Hepatitis Α-Antikörper enthalten soll, ergibt sich

2) 30 000 . (1800) + Y · (4Ö00) + Z · (6400) = 252 000 000. Wenn man die Gleichung 1 mit 4000 multipliziert und die auf diese Weise erhaltene Gleichung 1a von Gleichung 2 abzieht, erhält man

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15 719-Y * 4^

2) 54 000 000 + Y . (4000) + Z · (6400) = 252 000 000 1a) -120 000 000 - Y . (4000) - Z · (4000) = 252 000 000

' - 66 000 000 + Z (2400) = 0

2400 Z = 66 000 000

Z ο 27 500 ml

Das Volumen von Y wird durch Differenz zu 5500 ml ermittelt.

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Claims

Merck & Co., Inc.

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Patentansprüche

1,) Verfahren zum Nachweis von Antigen oder Antikörper von in- - fektiöser Hepatitis A in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man gereinigtes Hepatitis Α-Antigen in ausrei- ■ chender Konzentration, um in der Probe einen Komplex mit dem Antikörper zu bilden, bzw. Hepatitis A-An.tikörper in ausreichender Konzentration, um in der Probe einen Komplex mit dem Antigen zu bilden, zu einer Verdünnungsreihe der Probe zusetzt, so dass man eine Reihe von Gemischen von Antigen bzw. Antikörper mit der Verdünnungsreihe der Probe erhält, durch Inkubieren der Gemische Antigen und Antikörper unter Bildung eines Komplexes miteinander reagieren lässt, zu jedem Gemisch Komplement zusetzt, durch Inkubieren der Gemische das Komplement mit dem Komplex reagieren lässt, zu den Gemischen menschliche rote Blutzellen der Gruppe 0 in ausreichender Menge zusetzt, um eine Agglutination mit dem Komplex herbeizuführen, und die Agglutination in den Gemischen misst.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stoff zusetzt, der die Agglutination irreversibel macht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Serum- oder Plasmaprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs auf Hepatitis Α-Antikörper untersucht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Probe menschliches Immunserumglobulin verwendet.

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5» Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von Antigen von infektiöser Hepatitis A in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man Hepatitis Α-Antikörper von bekannter Stärke zu einer Reihe von vorgegebenen, fortschreitend geringeren Konzentrationen der Probe zusetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Probe Lebergewebe verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation zur Erzeugung des Komplexes bei einer Temperatur von etwa 25 bis 60° C im Verlaufe von etwa 0,25 bis 48 Stunden durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation bei e-

1 Stunde durchführt.

die Inkubation bei etwa 37° C für einen Zeitraum von etwa
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation zwecks Umsetzung des Komplements mit dem Komplex bei einer Temperatur von etwa 25 bis 45° C für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 24 Stunden durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die. Inkubation bei etw:
40 Minuten durchführt.

die. Inkubation bei etwa 37° C für einen Zeitraum von etwa
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antigen durch Zerkleinern von mit Hepatitis A infizierten Leberzellen eines nicht-menschlichen Primaten, Zusatz der zerkleinerten Leberzellen zu physiologischer Kochsalzlösung, Klären der entstehenden Suspension und Reinigen der überstehenden Flüssigkeit herstellt.

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719-Y * Λ$,
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die überstehende Flüssigkeit mit Kaolin reinigt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die überstehende Flüssigkeit nach der Dichtegradienten-Zentrifugiermethode reinigt.
14. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von Antikörper von infektiöser Hepatitis A in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man Hepatitis Α-Antigen von bekannter Stärke zu einer Reihe von vorgegebenen, fortschreitend niedrigeren Konzentrationen der Probe·zusetzt.
15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man als Probe menschliches Blutplasma verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man als Probe menschliches Immunserumglobulin verwendet.
17. Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1 auf die Bestimmung des Hepatitis A-Antikörpertiters in einer Probe menschlichen Immunserumglobulins.

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