DE1253488B - Serologisches Reagenz fuer Schwangerschaftsteste in vitro und Methode zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Int. Cl.:

G Ol η-33/16

DEUTSCHES

PATENTAMT

PATENTSCHRIFT

Deutsche Kl.: 421 - 3/54

Nummer:

Aktenzeichen:

Anmeldetag:

P 12 53 488.2-52 (B 63045)

27.Juni 1961

2. November 1967

6. April 1972

Auslegetag:
Ausgabetag:
Patentschrift weicht von der Auslegeschrift ab

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Serologie und befaßt sich mit der serologischen Bestimmung des menschlichen Chorion-Gonadotropins, im folgenden HCG genannt, in vitro.

Die Erfindung hat Bedeutung als ein diagnostisches Mittel für die Sero-Diagnose der Schwangerschaft in vitro.

Es ist bekannt, daß die Körperflüssigkeiten schwangerer Frauen meßbare Mengen von HCG enthalten. Dieses Hormon wird während der Schwangerschaft in der Placenta gebildet und wird in den meisten Körperflüssigkeiten gefunden, wo seine Anwesenheit insbesondere kurz nach der Empfängnis festgestellt werden kann. Das Hormon wird als ein Bestandteil in dem Urin schwangerer Frauen ausgeschieden. Da der Urin und die anderen Körperflüssigkeiten nicht schwangerer Frauen kein HCG enthalten — mit Ausnahme von Patienten, die an gewissen pathologischen Veränderungen leiden —, so ist das Vorliegen von HCG im Urin und den anderen Körperflüssigkeiten eine zuverlässige Indikation der Schwangerschaft.

Einige vorbekannte Schwangerschaftsteste sind auf biologischen In-vivo-Methoden für die Bestimmung von HCG basiert. Der wohlbekannte Aschheim-Zondek-Test ist ein Beispiel für eine biologische Methode, die auf dem Vorliegen von HCG basiert. Biologische Methoden haben jedoch Nachteile, da sie zeitraubend, mühsam und kostspielig sind. Ferner müssen die biologischen Teste von spezialgeschultem Personal durchgeführt werden. Es ist daher Zweck der Erfindung, diese Nachteile der vorbekannten Schwangerschaftsteste, die auf biologischen Methoden beruhen, durch Schaffung einer sero-diagnostischen Methode für die Feststellung der Schwangerschaft zu überwinden.

Die Erfindung stellt somit einen Fortschritt auf dem Gebiet der bisher üblichen Schwangerschaftsdiagnosen dar.

Der grundlegende Gedanke, von dem die Erfindung ausgeht, besteht in der Bestimmung von HCG in Körperflüssigkeiten durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion. Das Antigen in dieser Reaktion ist das HCG, das in der zu testenden Flüssigkeit vorhanden ist, während der Antikörper in dem erfindungsgeniüß hergestellten serologischen Reagenz enthalten ist. Wie festgestellt wurde, ist HCG befähigt, die Bildung solcher Antikörper gegen sich selber hervorzurufen. Dies wird auf diese Weise durchgeführt, daß man ein gereinigtes HCG-Präparat in eine heterologe Species. /.. B. ein Kaninchen, inoculiert. Die durchgeführten Versuche sind überwiegend mit Kaninchen vorgenommen Serologisches Reagenz für Schwangerschaftsteste in vitro und Methode zu seiner Herstellung

Patentiert für.

Sam Simon Brody,

Gunhild Carlström-Brody, Solna (Schweden)

Vertreter:

Dr.-Ing. A. v. Kreisler,

Dr.-Ing. K. Schönwald, Dr.-Ing. Th. Meyer

und Dipl.-Chcm. Dr. rer. nal. J. F. Fues,

Patentanwälte, 5000 Köln, Deichmannhaus

Als Erfinder benannt:

Sam Simon Brody,

Gunhild Carlström-Brody, Solna (Schweden)

Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 28. Juni I960 (22 610),
vom 19. Juni 1961

worden, aber es ist selbstverständlich, daß auch andere warm- oder kaltblütige Tiere verwendet werden können.

Die Reinheit der zu injizierenden HCG-Präparate ist von Bedeutung zwecks Vermeidung von Nebenreaktionen, die die Zuverlässigkeit des mit dem Reagenz durchzuführenden Testes gefährden würden. Ganz allgemein können als HCG-Antigene, die die Bildung von HCG-Antikörpern verursachen, HCG-Präparate verwendet werden, die z. B. gemäß der Methode, die von Claesson, Högbeig, Rosenberg und W e s t in a η (Ada endocr. [Kbh], 1948, Bd. 1, S. 1) beschrieben worden ist. hergestellt worden sind. Es wurde ferner gefunden, daß gewisse im Handel zugängliche gereinigte Präparate, wie z. B. dasjenige, das von A. B. Leo, Hälsingborg, Schweden, unter dem Warenzeichen »GonadcvLeo« vertrieben wird, für den vorliegenden /weck geeignet ist. Gonadex-l.co wird aus dem Harn schwängern Frauen hergestellt und besteht aus einem hoch gereinigten Präparat, dessen HCG-Gehalt etwa 6000 1. U./mg beträgt. Gonadex-l.eo ist leicht löslich in isotonischer Natriimichloridlösung, und für die I icrstcllung des Antikörper enthaltenden Serums w unk· (ionadex-I-co in isotoniscluM Nalrimnchloridlösimi¹

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verwendet, wobei die Gonadexkonzentrationen vari- Proben von nicht schwangeren Frauen erzielt wurden,

ieren. können wahrscheinlich auf die Gegenwart von nicht

Es ist gefunden worden, daß die Bildung der spezifischen Antikörpern in dem Antiserum zurück-Antikörper durch die Vermischung der HCG-Präparate geführt werden. Diese unspezifischen Antikörper mit Adjuvantien, wie z. B. einer Paraffinölemulsion, 5 mögen die Folge gewisser Verunreinigungen sein, die die einen nichtionischen Emulgator enthält, begünstigt in dem ursprünglichen HCG-Präparat enthalten wird. Details über die bevorzugten Adjuvantien waren, das für die Herstellung der HCG-Antikörper

werden im folgenden gegeben, es sei aber hervor- verwendet worden ist.

gehoben, daß viele geeignete Adjuvantien zugänglich Eine wichtige erfindungsgemäße Maßnahme ist es,

sind. Es ist auch vorteilhaft Bakterien, wie Myco- io solche unerwünschten Komplementfixierungsreaktio-

bacterium butyricum, zu den Adjuvantien zuzusetzen. nen mit Proben von nicht schwangeren Frauen auf

Die Inoculation des HCG-Präparates in die Kanin- zuverlässige Weise zu verhindern, und zwar durch

chen oder sonstige Tiere wird unter kontrollierten Beschränkung der Komplementfixierungstendenz des

Bedingungen, die im folgenden im Detail beschrieben Reagenzes auf die für HCG spezifischen Antikörper,

werden, durchgeführt, bis eine zureichende Menge von »5 Dies kann mit Erfolg erreicht werden, indem man

Antikörpern gebildet ist. zuerst das Antiserum oder Reagenz mit einer Körper-

Dann wird den inoculierten Tieren Blut entnommen flüssigkeit, z. B. Serum eines nicht schwangeren

und nach spontaner Koagulation des Blutes und Individuums, verdünnt oder vermischt. Hierdurch

anschließender Zentrifugierung ein Serum erhalten, wird die Komplementfixierung zwischen den unspezi-

das als serologisches Reagenz für die Bestimmung des 20 fischen Antikörpern und Antigenen, die in der Körper-

HCG in den zu untersuchenden Proben dient. Das flüssigkeit eines nicht schwangeren Individuums

serologische Reagenz kann z. B. auf 56⁰CfUr 30 MinXi- anwesend sind, verhindert, während die für HCG

ten erhitzt und dann in gefrorenem Zustand bei z. B. spezifischen Antikörper nicht beeinflußt werden. Wenn

20⁰C lange Zeit aufbewahrt werden, ohne seine danach das so verdünnte Antiserum für den eigent-

Aktivität zu verlieren. 25 liehen Test verwendet wird, tritt eine Komplement-

Das Vorliegen von HCG-Antikörpern in diesem fixierung nur mit den Antikörpern, die spezifisch für

Antiserum kann demonstriert werden, z. B. mit dem HCG sind, auf, und es werden keine fehlerhaften

sogenannten Komplementfixierungstest. Ergebnisse mehr beobachtet. Es ist auch festgestellt

»Komplementfixierung wird allgemein definiert als worden, daß die Verdünnung keinen Einfluß auf die eine Bildung oder Fixierung des Komplements, 30 spezifische Reaktion zwischen HCG und den Antiinsbesondere zu der Verbindung, die aus der Ver- körpern des Antiserums hat. Es wurde gefunden, daß einigung eines Antigens und eines Antikörpers gebildet besonders hervorragende Ergebnisse erhalten wurden, wird. Wenn Komplement zu einer Mischung eines wenn die erwähnte Verdünnung in gewissen Ausmaßen Antikörpers und des Antigens, für den das letzt- vorgenommen wird. So tritt, wenn das Reagenz mit erwähnte spezifisch ist, zugegeben wird, tritt eine 35 einer Körperflüssigkeit eines nicht schwangeren Indi-Absorption des Komplements auf. Wenn das Antigen viduums in einem Verhältnis 1:1 zu 8: 1, vorzugs- und der Antikörper nicht gegenseitig spezifisch sind, weise 1:1 zu 4: 1 verdünnt wird, keine Komplementwird das Komplement nicht absorbiert. So kann ein fixierung mit unspezifischen Antigenen während des Komplementiixierungstest durch den Zusatz des eigentlichen Testes auf. Es ist also möglich, das AufKomplements zu einer Mischung aus einem bekannten 40 treten unerwünschter Nebenreaktionen zu vermeiden Antigen und dem Serum, das verdächtig ist, den wie die Komplementfixierung von unspezifischen spezifischen Antikörper für das Antigen zu enthalten, Antikörpern mit unspezifischen Antigenen, und zwar durchgeführt werden. Wenn das Komplement absor- kann dies auf verschiedene Weise geschehen, z. B. biert wird, so ist daraus zuschließen, daß der spezifische durch verschiedene Absorptionsprozesse oder durch Antikörper anwesend ist« (Webster's New International 45 eine vollständige Reinigung der HCG-Präparate.
Dictionary). Das erfindungsgemäße Reagenz ist demnach dadurch

Mit dem Antikörper enthaltenden Reagenz kann gekennzeichnet, daß es ein heterologes Serum mit

HCG in dem Serum ebenso wie in dem Urin schwan- durch Injektion eines hochgereinigten HCG-Präpara-

gerer Frauen mit Hilfe eines serologischen Testes tes von etwa 60001. U./mg gebildeten Antikörpern

bestimmt werden. 50 gegen HCG und gegebenenfalls das Serum eines

Zwecks Ermittlung der Anwendbarkeit des erfin- homologen, nicht schwangeren Individuums enthält,

dungsgemäßen Reagenzes für die Bestimmung der wobei das Verhältnis des heterologen Serums zu dem

Schwangerschaft von Frauen wurden Serum und homologen Serum vorzugsweise zwischen 1: 1 und

Urinproben von schwangeren Frauen ebenso wie von 8 : 1 und am vorteilhaftesten zwischen 1: 1 und 4: 1

nicht schwangeren Frauen untersucht. Alle Proben 55 liegt.

wurden auf 56" C während 30 bis 60 Minuten erhitzt. Die Erfindung wird jetzt in Detail im Zusammenhang

Die ' Proben wurden auf das Vorhandensein von mit ausführlich durchgeführten Experimenten be-

Antigen, d. h. HCG mit dem Antiserum, das in der schrieben.

oben beschriebenen Weise erhalten worden ist, ,. ... .,,..

getestet. Dies wurde mit der sogenannten »Box«- oder 60 Materialien und Methoden

»Schachbrett«-Titration ausgeführt. Während gefunden Antigene

wurde, daß die Körperflüssigkeiten von schwangeren Als Antigen wurde ein käufliches HCG-Präparat

Frauen ohne Ausnahme positive Ergebnisse gaben, verwendet, das von A. B. Leo, Hälsingborg,

wurde festgestellt, daß auch einige der Proben von Schweden, hergestellt worden ist und unter dem

nicht schwangeren Frauen eine Komplementfixierung 65 Warenzeichen »Gonadex-Leo« vertrieben wird. Es wird

ergaben. Dies ist selbstverständlich in hohem Grad als weitgehend gereinigte Substanz bezeichnet, deren

unerwünscht, weil es die Zuverlässigkeit des Testes HCG-Gehalt etwa 6000 T. U./mg beträgt. Dieses

beeinträchtigt. Die positiven Ergebnisse, die mit Präparat wurde sowohl für die Herstellung det

HCG-Antisera als auch für das Testen mit diesen verwendet. In dem Komplementfixierungstest wurde es gegen das lnternationale-Standard-HCG-Präparat getestet.

Herstellung von Antisera

Für die Inoculation der Kaninchen wurde HCG entweder in physiologischer Kochsalzlösung gelöst oder in einem Adjuvant einverleibt benutzt. Die Antigen-Adjuvant-Mischung wurde aus 8,5 Teilen Paraffinöl (paraffinum liquidum der schwedischen Pharmacopeia), 1,5 Teilen Mannidmonooleat, das unter dem Handelsnamen »Arlacel A« bekannt ist, und 10 Teilen einer physiologischen Kochsalzlösung, die das Hormon enthielt, hergestellt. »Arlacel A« (vgl. H. B e η η e t, Concise Chemical and Technical Dictionary, New York 1947, Chemical Publishing Company, Inc., Brooklyn-New York, S. 73) ist ein Emulgator, der aus einem partiellen Ester einer Fettsäure und einem Anhydrid eines polyvalenten Alkohols besteht. Das Öl und der Emulgator wurden zuerst gemischt, worauf die Hormonlösung in kleinen Portionen zugemischt wurde, und die gebildete Mischung wurde geschüttelt, bis man eine pastenförmige Emulsion erhielt. Für einen Teil der Inoculationen wurde Mycobacterium butyricum dem Adjuvant zugeführt. Die Bakterien wurden hitzeinaktiviert und in das Öl vor dem Zusatz des Emulgators und der Hormonlösung eingemischt. Die Konzentration war 0,1 mg an Mycobacterien pro Millimeter Adjuvant.

Männliche und weibliche erwachsene Kaninchen wurden für die Inoculation verwendet. Vier verschiedene Immunisationsschemata wurden versucht.

Gruppe 1. Vier Tiere erhielten 4 ml HCG in Kochsalzlösung (120001. U.) in den Fußballen injiziert. Daraufhin wurde 1 ml HCG in Kochsalzlösung (30001. U.) auf dieselbe Weise einmal wöchentlich während 3 Wochen gegeben. Blut wurde durch Herzpunktierung 8 Tage nach der letzten Injektion entnommen.

Gruppe 2. Vier Tiere erhielten zuerst 1 ml HCG in Kochsalzlösung (3000 I.U.) in den einen Fußballen injiziert und gleichzeitig 4 ml der HCG-Adjuvant-Mischung (6000 I. U.) ohne Mycobacterien subcutan injiziert. Daraufhin erhielten diese Kaninchen acht Fußballeninjektionen von 1 ml HCG in Kochsalzlösung (3000 I. U.) jeden zweiten Tag und eine zusätzliche ähnliche Fußballeninoculation nach einer Woche. Das Blut wurde nach 8 Tagen entnommen.

Gruppe 3. Vier Kaninchen erhielten 1 ml HCG in Kochsalzlösung (6000 I. U.) intraperitonal; gleichzeitig und an fünf späteren Zeitpunkten in Abständen von 1 bis 2 Monaten wurden 2 ml der HCG-Adjuvant-Mischung ohne Mycobacterien subcutan gegeben. Der HCG-Gehalt der Inoculierungen war 600 I. U. bei den drei ersten Inoculierungen, darauf 1200, 6000 und 9000 I.D., bzw. Blut wurde in verschiedenen Abständen während dieser Periode entnommen, üblicherweise 1 bis 3 Wochen nach jeder Injektion.

Gruppe 4. Zwölf Kaninchen wurden mit 20 ml HCG-Adjuvant-Mischung (125001. U.), die Mycobacterien enthielt (10 Teile des Hormons in Kochsalzlösung, 8,5 Teile Paraffinöl und 1,5 Teile Arlacel A, wobei die Mischung 10 mg von feingepulvertem Mycobacterium butyricum pro 100 ml enthielt), immunisiert. Die Mischung wurde an vier Stellen subcutan und intramuskulär gegeben. Dies wurde zweimal in Abständen von 3 Wochen wiederholt.

Eine Verstärkungs-(Booster-)Injektion von HCCi in Kochsalzlösung (3000 I. U.) wurde intravenös 4 bis 6 Wochen nach der letzten Inoculation gegeben. Blut wurde durch Herzpunktierung 1 Woche nach der i)Booster«-Injektion entnommen. Bei einigen Tieren wurde eine ähnliche »Booster«-Injektion nach weiteren 4 bis 6 Wochen gegeben, und Blut wurde nach einer weiteren Woche entnommen.

Das Blut wurde unter sterilen Bedingungen mit

ίο trockenen Nadeln und Spritzen eingesammelt und in Zentrifugenrohre, die mit Gummikappen versehen waren, übergeführt. Man ließ das Blut bei Zimmertemperatur 3 bis 5 Stunden stehen, worauf das Serum durch Zentrifugieren abgetrennt, auf 56° C während 30 Minuten erhitzt und ohne Konservierungsmittel bei — 20° C aufbewahrt wurde, bis es benutzt wurde.

Verdünnungsmittel

Ein Veronalpuffer wurde für die Verdünnung benutzt. Eine Grundlösung wurde durch Auflösen von 25,5 g Natrium-5,5-diäthylbarbiturat in 21 in Glas destilliertem Wasser hergestellt. Diese Lösung wurde mit einer Lösung, die 210 g Kochsalz in demselben Medium enthielt, gemischt. Hierzu wurden 4,20 g a₅ MgCl₂-OH₂O, 0,93 g CaCl₂ -2H₂O und 78,2 ml 1 n-HCl zugefügt. Die Lösung wurde auf 5 1 verdünnt und der pH-Wert durch Zusatz von 1 n-HCl oder NaOH auf 7,4 bis 7,5 gebracht. Die Lösung wurde dann sterilisiert, der pH-Wert geprüft und der Puffer bei Raumtemperatur aufbewahrt. Zur weiteren Benutzung wurde die Grundlösung im Verhältnis I : 5 verdünnt und bei 4° C aufbewahrt.

Hämolytisches System

Schafsblut wurde unter sterilen Bedingungen entnommen, mit einem gleichen Volumen Alsevers Lösung (bestehend aus 4,10 g Glukose, 1,60 g Natriumcitrat, 0,84 g NaCl und 0,11 g Zitronensäure pro 200 ml der Lösung und durch ein Jenaer Glasfilter Nr. G 5 filtriert) vermischt und in abgemessenen Portionen bei 4° C aufbewahrt. Unmittelbar vor der Benutzung wurde die Schafblutsuspension unter 1200 U/min während 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Lösung wurde abgezogen und die roten Blutzellen drei- bis viermal mit gekühltem Veronalpuffer (vgl. oben) gewaschen. Eine abgemessene Menge der leidht gepackten Zellensuspension wurde im Verhältnis 1: 50 mit gekühltem Veronalpuffer verdünnt. Nach sorgfältigem Vermischen wurde eine 1-ml-Probe genommen und auf 10 ml mit Wasser verdünnt, was zur Auflösung der Erythrocyten führte. Die optische Dichte (O. D.) des Hämolysatzes wurde bei der Wellenlänge 560 ηιμ mit Hilfe eines Zeiss-Spektrophotometers und quadratischen Glascuvetten, die einen 1 cm langen Lichtweg hatten, bestimmt, wobei Wasser als Nullwert angewandt wurde. Der erhaltene O. D.-Wert wurde zur Errechnung der Menge Veronalpuffer verwendet, die benötigt wurde, um die Rote-Blutzellen-Suspension auf die gewünschte Konzentration einzustellen. Die Standard - Rote - Blutzellen - Suspension hatte einen O. D.-Wert von 0,740, was ungefähr einer O,4°/oigen Blutsuspension entsprach.

Das Antischaferythrocyten-Kaninchenserum (erhalten vom Staatlichen Bacteriologischen Laboratorium in Stockholm) wurde mit einer gleichen Menge sterilem Glycerin vermischt. Es wurde bei —10° C aufgehoben. Sechs minimumhämolytische Dosen vom Amboceptor wurden benutzt.

Als Komplement wurde während der ganzen Untersuchung das gleiche Produkt aus gemischten Meerschweinchenserum verwendet. Es wurde in versiegelten Ampullen bei — 70⁰C aufbewahrt. Zwei Komplementeinheiten wurden in den Testen verwandt.

Auf HCG zu untersuchende Proben

Mlut und Urin von schwangeren und nicht schwangeren Frauen wurde untersucht. Die Blutproben wurden unter sterilen Bedingungen aufgesammelt.

Das Serum wurde durch Zentrifugierung nach 1 bis 24 Stunden abgetrennt und bei 56°C während 30 Minuten inaktiviert. Morgenurinproben wurden in sorgfältig gewaschenen Behälter gesammelt, zentrifugiert und inaktiviert. Alle Proben wurden bei — 20⁰C aufbewahrt.

Komplementfixierungstest

Die Plattentechnik von Fulton und D u m b e 11 (F. Fulton und J. R. D u m b e 11, The serological comparison of strains of influenza virus. J. gen. Microbiol., 3, S. 97, 1949) in der modifizierten Form von Svedmyr, Enders und H ο 11 ο w a y (A S ν ρ H m y r , J F. E η d e r s und A. Hollow a y , Complement fixation with Brunhilde and Lansing poliomyelitis viruses propagated in tissue culture, Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.), 79, S. 296, 1952) wurde verwendet. Antigen (Gonadex-Leo, Internationale-H CG-Standard-Präparate oder auf HCG zu untersuchende Proben), Antiserum und Komplement wurden für ungefähr 18 Stunden bei 4°C ineubiert. Das Gonadex-Leo-Präparat und das Internationale-HCG-Standard-Präparat wurden in dem Veronalpuffer oder in Sera von nicht schwangeren Frauen aufgelöst. Die sensitisierten Schafzellen wurden dann zugefügt, und Ablesungen wurden nach Incubation während 2 Stunden bei 37° C vorgenommen. Um die antikomplementen Effekte zu beurteilen, wurde jede Komponente der Teste (Antigen, Antiserum und Verdünnungsmittel) durch Komplementtitration getestet. Proben, die antikomplemente Effekte zeigten, wurden gemäß T a r a η (A. T a r a n , Simple method for performing Wassermann test on anticomplementary serum. J. Lab. elin. Med., 31, S. 1037, 1946) behandelt und verworfen, wenn die Behandlung erfolglos war.

Statistische Methoden

Die statistische Analyse der Genauigkeit der quantitativen serologischen Bestimmung von HCG wurde in üblicher Weise vorgenommen (G. W. Snedecor, Statistical Methods. The Iowa State College Press, Arnes, Iowa, 1957).

Ergebnisse

Vergleich zwischen den Wirkungen verschiedener Immunisationstechniken

Dm das Vorliegen von komplementfixierenden Antikörpern in den Kaninchensera festzustellen, Λΐιπίυη diese in zweidimensionalen Titrationen mit ι liier Standardlösung von HCG, das in VeronalpufTer gelöst war und 1500 LU. des Hormons pro Milliliter endlich, getestet. Die Antikörperliter sind als Reziproke iler größten Verdünnung des Anliserums, das viii·,l.mdifz die Hiimolysc bei optimaler Antigenvei hindert, angegeben.

Sera von Tieren aus den Gruppen 1 und 2 enthielten keine meßbaren Mengen an komplementfixierenden Antikörpern.

Antisera mit verhältnismäßig niedrigem Titer wurden von den Tieren der Gruppe 3 erhalten. Diese Kaninchen waren bis zu 9 Monate immunisiert. Trotz wiederholten Inoculationen wurde jedoch kein Anstieg des Antikörpertiters nach dem 4. Monat beobachtet. Die Antikörpertiter dieser Gruppe variierten zwischen ίο 16 und 64.

Tiere der Gruppe 4 geben Sera mit hohem Antikörpertiter. Eine zusätzliche intravenöse »Booster«- Injektion 4 bis 6 Wochen nach der ersten »Booster«- Injektion verursachte keine Änderung des Titers. Die Antikörpertiter variierten zwischen 64 und 2048, und die meisten von ihnen lagen bei 256 oder 512.

Kaninchensera, die vor der Immunisation erhalten worden sind, enthielten keine komplementfixierenden Antikörper gegen HCG.

Diese Resultate zeigen, daß die Immunisation gemäß dem Schema 4 vorzuziehen ist. In den Experimenten, über die im folgenden berichtet wird, wurden Antisera verwendet, die gemäß dieser Methode hergestellt worden waren.

Reaktionen zwischen HCG-Antisera
und Proben von nicht schwangeren Frauen

(Im folgenden werden Proben von nicht schwangeren Frauen als »negativ« bezeichnet, während Proben von schwangeren Frauen als »positiv« bezeichnet werden.)

Einige Antisera ergaben Komplementfixierungen unter Verwendung von negativen Sera oder Urinproben. Mit Serumproben traten diese Reaktionen in einer charakteristischen Zone der Serumverdünnung und bei niedrigen Antiserumverdünnungen auf. F i g. 1 zeigt eine zweidimensionale Titration mit negativem Serum, die diese Beobachtungen wiedergibt. Wie leicht festzustellen ist, liegen keine positiven Reaktionen in dem Gebiet der niedrigen Serumverdünnung vor.

Unter der Annahme, daß diese unerwünschte Komplementfixierung auf eine Antigen-Antikörper-Reaktion zurückzuführen ist, zeigt die ausgesprochene Pro-Zone das Vorhandensein eines Antigenüberschusses bei den niedrigen Verdünnungen der Serumproben an. Es wurde angenommen, daß dies eine Basis für die Ausschaltung dieser Reaktionen darstellt. Da diese unerwünschten Reaktionen kaum stattfanden bei Serum-Antiserum-Konzentrationsverhältnissen, die 1:2 überstiegen, wurde angenommen, daß die Zumischung einer gleichen Menge eines negativen Serums zu dem HCG-Antiserum vielleicht diese Reaktionen zum Verschwinden bringt, und zwar als Folge der Überführung in das System eines Zustandes von Antigenüberschuß zu einem Punkt der vollständigen Verhinderung dieser Antigen-Antikörper-Reaktion. (Der Ausdruck »Antigenüberschuß« bedeutet in diesem Zusammenhang: Verdünnung geringer als die optimale Antigenverdünnung, während der Ausdruck »Antigendefizit« Verdünnungen im Überschuß über die optimale Antigenverdünnung bedeutet.) Um diese Hypothesen zu prüfen, wurde eine Serie von zweidimensionalen Titrationen von HCG und Antiserum mit einem negativen Serum durchgeführt. Das Antiserum war mit verschiedenen Mengen negativem Serum (von einem anderen Patienten) vorgemischt worden, wobei das Verhältnis Serum zu

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Antiseru m zwischen 1:8 und 1:1 variierte. Eine mit dem homologen Antigen (HCG) ergeben, ist die

erhebliche Reduktion der Komplementfixierungsreak- Abnahme der HMG-Konzentration von einer eher

tionen wurde schon bei dem Verhältnis 1:8 beobach- geringen Abnahme des Antiserumtiters begleitet,

tet, und die in Frage stehenden Reaktionen wurden Trächtiges-Stutenserum-Gonadotropin (Gestyl,

vollständig bei einem Serum-Antiserum-Verhältnis 5 N. V. Organon, Holland) wurde auch mit HCG-

von 1:4 ausgeschaltet (vgl. Tabelle II). Titrationen Antiserum getestet, aber keine positiven Reaktionen

von Antisera, die mit einer gleichen Menge von traten mit diesen Hormonen in einer Konzentration

negativem Serum gesättigt worden waren, gaben in von 400 I. U./ml oder weniger auf.

keinem Fall positive Reaktionen mit negativen Sera. _ .... ,,~~ _Λ ·

Die Zumischung von negativem Serum zu HCG- io Standardisierung von HCG-Antisera Antiserum kann unmittelbar vor Benutzung des Anti- ^fur Rout.neanalysen von HCG serums erfolgen. Eine Verringerung des Effektes der Die Aufnahme von HCG-Antiserum in ein Routine-Eliminierung der Komplementfixierungsreaktionen mit verfahren für die quantitative Bestimmung von. HCG negativen Sera wurde in saturierten Antisera, die für macht die Auswahl einer geeigneten Antiserum-3 bis 4 Wochen oder mehr aufbewahrt worden waren, 15 Verdünnung notwendig, da eine solche Routinenicht beobachtet. Es ist in diesem Zusammenhang zu prozedur vorzugsweise als eine eindimensionale Titraerwähnen, daß die Sättigungs- oder Verdünnungs- tion nur mit Serienverdünnung der Testprobe durchmaßnahmen keinen irgendwie gearteten Einfluß auf geführt wird. Für die Standardisierung eines Antidie spezifische Reaktion zwischen HCG der Test- serums wird eine zweidimensionale Titration mit proben und dem Antiserum hatten. Keine Verände- ao einem negativen Serum durchgeführt. Wenn eine rung des Antikörpertiters wurde beobachtet, und es Komplementfixierung auftritt, so wird das Antiserum lag auch keine Verringerung der Sensitivität des Ver- mit einem gleichen Volumen negativen Serums gefahrens, ausgedrückt in der maximalen Antigen- sättigt und erneut getestet, um die Wirkung zu überverdünnung, die eine vollständige Verhinderung der prüfen. Daraufhin wird dann eine zweidimensionale Hämolyse zustande bringt, vor. as Titration mit HCG in einer Menge von 1500 I. U., „ , . . , ,,„„ . - gelöst in 1 ml negativen Serums, ausgeführt. Eine geReaktionen zwischen HCG-Antisera _{ei te} Antiserumverdünnung für die Routineanalyse und Proben von schwangeren Frauen wird dann gewählt. Vorzugsweise werden 4 bis 8 Anti-Zweidimensionale Titrationen von HCG-Antisera serumeinheiten benutzt. Eine Antiserumeinheit wird mit positiven Sera oder Urinproben zeigten ein im 30 hier als die höchste Antiserumverdünnung bezeichnet, wesentlichen gleichförmiges Aussehen. Ein typisches die vollständig die Hämolyse bei optimaler Antigen-Beispiel ist in der F i g. 2 gezeigt. Die Abhängigkeit Verdünnung verhindert, des Antiserumtiters von der HCG-Konzentration ist ,_ . . klar demonstriert. Verhältnismäßig geringe Antiserum- ^Q"^a"^^tatlv^ ^Bestimmunß . titer wurden in dem Gebiet des Antigenüberschusses 35 ^{VOn HCG im SerUm} °^{der Urm} gefunden. Eine im wesentlichen ausgeprägte Zone der Die auf das Vorhandensein von HCG zu unteroptimalen Antigenverdünnung wurde festgestellt. In suchende Probe wird in Serie mit Veronalpuffer verder Zone des Antigendefizits liegt eine recht plötzliche dünnt, wobei die anfängliche Verdünnung 1:2 ist. Abnahme des Antiserumtiters vor. Die Kurve ist Der Test wurde mit Antiserum, das wie oben bedaher nicht symmetrisch. 40 schrieben standardisiert worden ist, durchgeführt. Eine typische »Schachbrette-Titration ist in der Gleichzeitig wurde ein HCG-Bezugsstandard getestet. Tabelle I gezeigt. Die Hormonlösung, die 1 : 6400 Als Bezugsstandard für Serumproben wurde entweder verdünnt war, gab noch immer positive Reaktionen, ein positives Serum oder HCG, gelöst in einem negawas bedeutet, daß mit diesem Antiserum 0,25 I. U. tiven Serum, verwendet. Für Urinproben wurde HCG, des HCG pro Milliliter festgestellt werden kann. Die 45 das in Veronalpuffer gelöst worden war, als Referenz maximalen Titer der Hormonlösung variierten von benutzt. Die Erwärmung der HCG-Lösung auf 56 C 3200 bis 12800. Aus der Tabelle I ist offensichtlich, für 30 bis 60 Minuten hatte keinen zerstörenden Effekt daß Antiserum, das 1:32 verdünnt ist, geeignet ist für auf den HCG-Gehalt, und dieser wurde auch nicht die Ausführung quantitativer Bestimmungen des durch Aufbewahrung bei - 20⁰C während mehr als Hormons in einem Routineverfahren. Dies ist auch 50 6 Monaten oder durch wiederholtes Gefrieren und durch die »Schachbrett«-Titrationen mit Proben von Tauen beeinträchtigt. Keine Zerstörung der Antisera, schwangeren Frauen bestätigt worden. die wiederholtem Gefrieren und Tauen unterworfen

„ . . . „„„ . . waren, wurden beobachtet.

Heterologe Reaktionen mit HCG-Antisera _{Die Konzentration dcs} Hormons an dem end-

F i g. 3 zeigt eine zweidimensionale Titration des 55 gültigen Antigenendpunkt gibt die Empfindlichkeit

HCG-Antiserums mit einem Gonadotropin (HMG- dieses Verfahrens an. Mit den verschiedenen Antisera,

Präparat) aus dem Urin einer Frau in der Menopause. die gemäß dem Schema 4 hergestellt worden waren,

Seine Potenz, bestimmt durch den Mäuseuterustest, ist es möglich, 0,10 bis 0,50 I. U. des Hormons pro

überschritt diejenige eines von der Firma Organon Milliliter zu bestimmen,

hergestellten Referenzpräparates mit der Bezeichnung 60 .,,..,-. . . ... .

HMG-20 A um das 22,5fache. Das Präparat wurde in Klinische Anwendung des serologischen Verfahrens

gleichen Mengen Veronalpuffer und negativem Serum ^der "CG-Bestimmung

gelöst, wobei die Konzentration 1,46 mg/ml war. Es Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde für

ergibt sich, daß das HCG-Antiserum die Fähigkeit die Bestimmung yon HCG in mehr als 300 Urinen besitzt, durch Komplementfixierung mit HMG zu 65 und Serumproben von 248 schwangeren und 56 nicht

reagieren, welche Kreuzreaktion jedoch nur bei sehr schwangeren Frauen einschließlich von Frauen in der

hohen Konzentrationen von HMG auftritt. Im Gegen- Menopause angewandt. In zwei Fällen lagen Proben

satz zu den Bedingungen, die sich aus den Titrationen vor, die aus der ersten Woche nach der unterbliebenen

Periode stammten. Die übrigen Proben wurden von Patienten während der ganzen Schwangerschaft genommen. Die höchsten HCG-Konzentrationen wurden während der ersten 3 Monate der Schwangerschaft gefunden, und eine relativ langsame Abnahme wurde in den späteren Stadien beobachtet.

Die Schwangerschaftsdiagnose wurde durch gynäkologische Untersuchung bestätigt und in frühen Fällen durch biologische Schwangerschaftsteste. Alle frühen Fälle wurden später durch klinische Nachuntersuchungen überprüft. Keine falsche positive Reaktion wurde festgestellt. In acht Fällen wurden antikomplemente Effekte beobachtet, doch konnten diese durch die Behandlung gemäß T a r a n (A. Ta r a η, Simple method for performing Wassermann test on anticomplementary serum. J. Lab. elin. Med., 31, S. 1037, 1946) ausgeschaltet werden.

Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß zwei Bedingungen bei einer in vitro serologischen Methode für die Bestimmung von HCG unter klinischen Bedingungen, wie z. B. bei der Diagnose der Schwangerschaft, erfüllt sein müssen.

Das eine Erfordernis betrifft die Spezifität, d. h. das Vermögen des Antiserums mit HCG in Körperflüssigkeiten ohne Störung durch andere Substanzen zu reagieren.

Die andere Forderung, die erfüllt sein muß, betrifft die Empfindlichkeit der Methode, ausgedrückt in der HCG-Konzentration bei dem endgültigen Antigenendpunkt.

Was die Spezifität betrifft, ist es offensichtlich, daß Versuche, HCG-spezifische hyperimmune Sera herzustellen, bisher nicht erfolgreich waren.

Die Reinheit des Antigens spielt eine entscheidende Rolle bei der Erzielung der Spezifität des Antiserums. Es ist äußerst wahrscheinlich, daß eine Abnahme in der Antigenizität eines Hormonpräparates als ein Ergebnis des Reinigungsprozesses auftreten wird. Durch Mischung des Antigens mit einem Adjuvant wird jedoch die Antikörper hervorrufende Kapazität einer Substanz mit relativ geringer Antigenizität bedeutend vergrößert. Die HCG-Präparate, die in diesen Versuchen verwandt worden sind, sind hochgereinigte Verbindungen, die 6000 I. U. des Hormons pro Milligramm enthalten. Das angegebene Molekulargewicht des HCG ist 100 000 (S. G u r i n, C. B a c h m a n und D. V. Wilson, Gonadotrophic hormone of urine of pregnancy. Chemical studies of preparations having high biological activity. J. Biol. ehem., 133, S. 467, 1940), und die Einverleibung dieser Substanz in ein Adjuvant dürfte geeignete Bedingungen für die Antikörperbildung schaffen.

Es ist ferner gezeigt worden, daß einige HCG-Antisera in dem Komplementfixierungstest mit negativen Sera reagieren. Diese Reaktionen sind ähnliche wie diejenigen, die E. Witebsky, N. R. Rose und S. Shulman, (Studies on organ specificity. I. The serological specificity of thyroid extracts.

J. Immunol., 75, S. 269, 1955) zwischen Schweinethyroid-Antiserum und Schweineserum feststellte. Diese Autoren interpretieren ihre Reaktionen als auf Speciesspezifische Antikörper zurückzuführen. Bezüglich der Reaktionen, die im vorliegenden System

»ο festgestellt worden sind, ist vorstellbar, daß sie auf solche Speciesspezifischen Antikörper zurückzuführen sind, aber es kann nicht ausgeschlossen werden, daß sie durch antigenisch aktive Verunreinigungen des Antigens, das für die Immunisation verwendet worden ist, oder durch Kreuzreaktionen mit Substanzen, die antigenisch mit HCG verwandt sind, verursacht werden.

Die vorliegenden Ergebnisse zusammen mit dem Nachweis der vollständigen Eliminierung der Komplementfixierungsreaktionen mit dem negativen Serum durch das angegebene einfache Absorptionsverfahren dürfte darauf hinweisen, daß die Reaktionen bezüglich negativen Sera und HCG-Antisera wahrscheinlich auf antigenisch reaktive Verunreinigungen der HCG-Präparate zurückzuführen sind.

Der Komplementfixierungstest ist einige Zeit als Routineverfahren für die Bestimmung von HCG in Urin und Serum benutzt worden. Bei schwangeren Frauen wurden positive Ergebnisse schon in den ersten Wochen nach der unterbliebenen Periode festgestellt. Die höchsten HCG-Konzentrationen wurden in den ersten 3 Monaten mit einer langsamen Abnahme während der folgenden Stadien der Schwangerschaft beobachtet.

Tabelle 1
Zweidimensionale Titration von HCG-Antiserum und HCG

	Verdünnung	8	16	Verdünnung des Antiserums	64	128	256	512
Antigen	des Antigens	•1-	-I	32	+
	50	+	+	+	+	+	—	—
	100		+	+	+	I	+	—
	200		-}-	+	+	-}	+	—
HCG, gelöst in Ve-	400	+	■t	+	+	+	+	—
ronaipuffer,	800	r	+	+	+	+	+	—
1500I.U./ml	1600	—	-+	+	+	+	+	—
	3 200	—	—	+	+	—	—
	6400	...	—	+		—	—	—
	12 800		—

f- bedeutet keine Hämolyse,
- bedeutet vollständige Hämolyse.

In dem engen Bereich zwischen vollständiger und keiner Hämolyse ist

(· der Einfachheit halber benutzt, um weniger als 5O°/oige Hämolyse, um mehr als 50°/₀ige Hämolyse anzugeben.

13 14

Tabelle II Zweidimensionale Titrationen von unabsorbiertem und absorbiertem HCG-Antiserum und negativem Serum

Verdünnung	Serum-Antiserum- Verhältnis	O Verdünnung des Antiserums	_	32	64	O	_	i : s Verdünnung des Antiserums	_.	32 : 64	—	1 :4 Verdünnung des Antiserums	16	32 64	-	ι	—	-
des negativen Serums	8 ! 16	—		- C		—	8 : 16	—	...	—	8	_	_			—
	_	—	_	—	—	_	—		—	_	—	— i
4	—	—	_.	-	—	—	--	—	—	—
8	—	-j.	—	—	—	—	—		—	—		—
16	-|-	4	■ —				—	—	—	—
32		4-		—	—	—	—	—	—
64	+	+	-t-	4-	4	—	—	—	—
128	-[-			4	4	—		—	_.
256	4	—	_	-\	4	—		—	—
512	4	--	4-	-	—	_.
1024	—	4-		—
2048

bedeutet keine Hämolyse,
bedeutet vollständige Hämolyse.

In dem engen Bereich zwischen vollständiger und keiner Hämolyse ist

I der Einfachheit halber benutzt, um weniger als 50⁰/_Oige Hämolyse, um mehr als 50°/_oige Hämolyse anzugeben.

Claims (1)

1. Patentanspruch: -

   Ein serodiagnostisches Reagenz für immunologische Schwangerschaftsteste in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß es ein heterologes Serum mit durch Injektion eines hochgereinigten HCG-Präparates von etwa 6000 I.U./mg gebildeten Antikörpern gegen HCG und gegebenenfalls das Serum eines homologen, nicht schwangeren Individuums enthält, wobei das Verhältnis des

   heterologen Serums zu dem homologen Serum vorzugsweise zwischen 1:1 und 8:1 und am vorteilhaftesten zwischen 1:1 und 4:1 liegt.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Experientia, Vol. XV/12, 1959, S. 480 und 481;
   E. A. K ab at und M. M. Mayer, Experimental

   Immunochemistry, 1. Auflage, Springfield, Illinois,

   1948, S.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   709 610/185 10.67 O Bundesdruckerei Berlin