DE2334344A1 - Antiserum fuer radioimmuntests, verfahren zur gewinnung desselben sowie radioimmunologisches verfahren - Google Patents
Antiserum fuer radioimmuntests, verfahren zur gewinnung desselben sowie radioimmunologisches verfahrenInfo
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Description
Unsere Nr. 18 758
Istituto Parmacologico Serono S.p.A. Rom / Italien
Antiserum für Radioimmuntests, Verfahren zur Gewinnung
desselben sowie radioimmunologisches Verfahren ■
Immunologische Hormontestverfahren beruhen auf der Fähigkeit eines gegebenen Hormons, in! einer gegebenen Immunitätsreaktion als Antigen zu wirken.
Auf der Grundlage dieses Prinzips wurden in letzter Zeit
Kadioimmuntestverfahren entwickelt, bei denen eine unbekannte Menge eines au bestimmenden nicht markierten (kalten)
Hormons - in Gegenwart einer bekannten Menge des gleichen markierten Hormons - mit einer geeigneten Menge eines ·*
spezifischen Antiserums inkubiert wird. Eine unbekannte Menge eines Hormons kann daher ohne weiteres aus der
Radioaktivitätsmessung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch Vergleich mit einer zuvor angefertigten Standardkurve bestimmt werden, wobei bekannte Mengen des spezifischen
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Antiserums, des kalten Hormonsund des markierten Hormons
verwendet werden und wobei das kalte und das markierte Hormon bei der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes
proportional - d.h. im Verhältnis zu ihrer jeweiligen Menge - zusammenwirken. Die Radioaktivitätszahl dieses
Antigen-Antikörper-Komplexes ist offensichtlich der Menge des dem Reaktionsgemisch zugesetzten kalten Hormons
umgekehrt proportional, wobei die Mengen des Antiserums und des markierten Hormons unverändert bleiben.
Die Radioimmuntestverfahren konnten jedoch bisher nicht zur Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropins (HCG)
in Gegenwart vergleichbarer Mengen des luteinisierenden Hormons (LH) angewendet werden, da es außerordentlich
schwierig ist, ein spezifisches Antiserura für diese Hormone zu erhalten.
Andererseits hat man die Notwendigkeit von zuverlässigen Mitteln zur Durchführung dieser Bestimmung auf diesem
Gebiet erkannt. Es ist bekannt, daß solche zuverlässigen Mittel es unter anderem ermöglichen, eine Schwangerschaft
schnell (innerhalb weniger Tage nach Empfängnis) festzustellen, und Chorionkarzinome sowie alle HCG-produzierenden
Tumore zu entdecken und zu bekämpfen.
Die weitreichende klinische Verwendbarkeit eines solchen spezifischen Antiserums für die Diagnostizierung und Bekämpfung
dieser Tumore und zur Peststellung einer Schwangerschaft im Frühstadium ist daher klar ersichtlich.
In jüngster Zeit haben Ross und Mitarb. Antisera gegen
α- und ß-Untereinheiten von HCG (im folgenden HCG-a bzw.
HCG-ß genannt) in radioimmunologischen Reaktionen getestet und festgestellt, daß das Antiserum gegen HCG-ß eine höhere
Spezifität aufweist (vergl. "Structure-activity relationships
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of protein and polypeptide hormones", Tei1. 1 -'Reports-Proceedings
of the Second International Symposion Liege, September 28 - October 1, 1971, Seiten 153-157, veröffentlicht
von Excerpta Medica (1971)).
Aus einer graphischen Darstellung, in der unter anderem
zwei Inhibitionskurven der ra.dioimmunologischen Reaktion
zwischen Anti-HCG-ß-Serum und markiertem HCG-ß aufgezeichnet sind, die unter Verwendung von HCG bzw. menschlichem
Hypophysen-LH erhalten wurden, ist ersichtlich, daß die beiden Inhibitionskurven eine unterschiedliche Neigung
aufweisen.
Hinsichtlich der Menge sind die beiden Kurven jedoch fast übereinstimmend, zumindest soweit die Anteile betroffen
sind, die den niedrigen Mengen an kaltem Hormon entsprechen (d.h. bis zu etwa 25O-3OO m I.U./ml).
In diesem Zusammenhang sei darauf verwiesen, daß die
vorstehend erwähnten niedrigen Hormonmengen genau den Mengen entsprechen, bei denen eine Unterscheidung des
HCG-Hormons von dem LH erforderlich ist, da die physiologischen Mengen LH im Urin höchstens I50 m I.U./ml·
betragen. Demnach kann das von Ross und Mitarb, entwickelte Verfahren nicht als Standard-Testverfahren zur Bestimmung
von HCG'in Gegenwart vergleichbarer Mengen von LH ver- ·
v/endet werden.
Die hier verwendete Bezeichnung " m I.U." 'bedeutet den
tausendsten Teil der Internationalen Einheit, die die Weltgesundheitsorganisation auf der Basis des relevanten
Besugspräparats eingeführt hat; im Falle vonHCG ist es
der "Second International Standard for HCG" und im Falle von LH das "Second International Reference Preparation -HMG",
Beide Bezugspräparate sind bei dem Biological Standard
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Department der Vieltgesundheitsorganisation in England erhältlich.
Der Ausdruck "vergleichbare Mengen LH" bedeutet diejenigen Mengen dieses Hormons (ausgedrückt in m I.U./ml), die bis
zu etwa das lOfaehe der Mengen.an HCG ausmachen.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß die bei Verwendung eines Anti-HCG-ß-Serums, das zuvor an HCG-a absorbiert
wurde, erhaltenen Inhibitionskurven hinsichtlich von HCG und LH so beschaffen sind, daß die zur Erzielung eines
äquivalenten Inhibitionsgrades in der radioimmunologischen
Reaktion erforderlichen Mengen LH mindestens lOmal so hoch
sind wie die HCG-Mengen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues hoch spezifisches Antiserum für Radiojimmuntests, das durch Absorption von
Anti-HCG-ß-Serum an der HCG-a-Untereinheit erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren
für den Rädioimmuntest von HCG in Gegenwart vergleichbarer
Mengen von LH, bei dem ein System aus einem an HCG-a absorbierten Anti-HCG-ß-Serum und einem markierten HCG-ß
verwendet wird, um HCG von LH zu unterscheiden. Dieses
Verfahren ist besonders zur Peststellung einer Schwangerschaft im Frühstadium geeignet. _ - '
Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt, kann das^ auf
der Verwendung des erfindungsgemäßen spezifischen Antiserums beruhende Verfahren für den Rädioimmuntest von HCG
in Gegenwart von LH nicht nur in einer gepufferten Lösung, z.B. einer durch Phosphat gepufferten Lösung der Hormone,
sondern sogar direkt in einer Probe des menschlichen Urins durchgeführt.werden.
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Das Anti-HCG-ß-Serum, aus dem das erfindungsgemäße hoch
spezifische Antiserum erhalten wird, kann wie üblich durch Injektion von menschlichem HGG-ß in heterologe Tiere wie
Kaninchen, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen und dergleichen hergestellt werden.
Zweckmäßigerweise wird ein übliches Labortier, insbesondere
das Kaninchen, bevorzugt.
Es wurde ein Immunisierungsprogramm verwendet, das dem von Ross vorgeschlagenen entspricht. Die vorliegende Er-*
findung ist jedoch selbstverständlich nicht auf dieses bestimmte Immunisierungsprogramm beschränkt, da dieses je
nach dem Tier, den verwendeten besonderen Adjuvantien usw. geändert werden kann.
Im allgemeinen erfolgt die Absorption des Anti-HCG-ß-Serums dadurch, daß solche Mengen von HCG-a verwendet werden, daß
schließlich die höchste Spez-ifität im Antiserum erreicht wird. Diese Mengen können je nach dem verwendeten besonderen
Antiserum variieren. Erfindungsgemäß liegen sie gewöhnlich zwischen 0,05 und 5 mg, vorzugsweise zwischen 0,1 und
2 mg und insbesondere zwischen 0,1 und 0,4 mg HCG-a pro ml
des Anti-HCG-ß-Serums.
Der hier verwendete Begriff "Absorption" hat eine allgemein geltende Bedeutung in der Immunologie, d.h. er bezieht sich
auf das Verfahren der*1 Reaktion eines Antiserums mit einem
gegebenen Antigen, um den Antikörper, der spezifisch mit dem Antigen reagiert, aus dem Antiserum zu entfernen. Die
Zeit- und Temperaturbedingungen einer solchen immunologischen Reaktion sind nicht kritisch. Die Reaktion führt zu einem
unlöslichen Antigen-Antikörper-Komplex, der zentrifugiert
und verworfen wird, wobei als überstand ein "absorbiertes" ■
(gereinigtes) Antiserum erhalten wird.
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Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der
Erfindung.
Jedem einer Gruppe von Kaninchen wurde durch intradermale Injektion an mehreren Körperstellen ein durch Ultraschall
homogenisiertes Gemisch von 50 γ (Mikrogramm) HCG-ß, gelöst
in 1 ml pysiologischer Salzlösung, 1 m Freundsches Adjuvans (DIPCO) und 5 mg trockenen Tuberkelmycobakterien (H37RA DIPCO'
verabreicht.
An einer anderen Körperstelle wurde jedem Kaninchen subkutan 0,5 ml Pertussisvaccine verabreicht.
Einen Monat später wurde ein Gemisch, das aus 50 γ HCG-ß,
gelöst in 1 ml physiologischer Salzlösung, und 1 m Freundsches
Adjuvans bestand, intradermal injiziert.
Eine Woche nach der letztgenannten Injektion wurde den Tieren durch Einstich in die Ohrrandvene (marginal ear vein)
Blut entnommen. Das in einem Erlenmeyerkolben gesammelte Blut ließ man gerinnen, indem der Kolben etwa h Stunden
bei Raumtemperatur geneigt gehalten und anschließend über Nacht bei 4 C stehengelassen wurde. Das koagulierte Blut
wurde am nächsten Morgen zentrifugiert, um das Serum abzutrennen, dem Natriumazid (1 zu 10 000 Gew.7 Vol.) zugesetzt
wurde. In diesem- Zusammenhang stehen Gewichtsteile und Voluraenteile im gleichen Verhältnis wie Milligramm
und Milliliter.
Anschließend wurde den Tieren wöchentlich Blut entnommen. V/enn der Antiserumtiter abzunehmen begann, wurde den Tieren
subkutan eine zusätzliche Injektion von 50 γ HCG-ß, gelöst
in 1 ml physiologischer Salzlösung, verabreicht..
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Absorption von Anti-HCG-ß-Serum an HCG-α
1 ml Anti-HCG-ß-Serum wurden 0,2 mg HCG-α zugesetzt. Das
Gemisch wurde 2 Stunden bei 37 C in einem Thermostat und anschließend 2*1 Stunden bei 4° C gehalten.
Der gebildete Niederschlag wurde zentrifugiert und verworfen.
Es wurde festgestellt, daß das überstehende absorbierte Antiserum hinsichtlich des HCG in Gegenwart von vergleichbaren
Mengen LH hoch spezifisch war.
In den nachstehenden Beispielen wird gezeigt, daß das erfindungsgemäße
Antiserum in der Lage ist, zwischen HCG und LH zu unterscheiden.
Ein Anti-HCG-ß-Serum, das erfindungsgemäß an HCG-α absorbiert
war, wurde im Verhältnis 1 zu 2000 mit einem 0,01 M Phosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7»5» der normales Kaninchenserum (1:1000), Tetranatriumäthylendiamintetraacetat (0,014 M)
und Rinderserumalbumin (0,25 %) enthielt, verdünnt.
Unter Verwendung des gleichen Puffers, der jedoch kein Kaninchenserum enthielt, wurden zwei Serien von Lösungen
mit graduell variierenden Konzentrationen hergestellt, die ein handelsübliches HCG-Präparat (Roussel, 3200 I.U./mg)
bzw. ein Urin-LH-Präparat (100 I.U./mg) enthielten.
Ein HCG-ß-Präparat, das mit J3 gemäß der von Greenwood
und Mitarb, in Biochem. J., Band 89, S. 11*1 (1963) beschriebenen
Chloramin-T-Methode markiert worden war, wurde mit dem gleichen Puffer, der zur Herstellung der vorstehend
genannten HCG- und LH-Lösungen verwendet worden war, in geeigneter Weise verdünnt.
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Eine festgesetzte Menge des verdünnten Anti-HCG-ß-Serums
wurde 24 Stunden bei 37° C mit einer aliquoten Menge von
jeder der HCG- oder LH-Lösungen inkubiert. Jedem der Inkubationsgemische wurde eine Menge - entsprechend 10
Zählungen pro Minute - an markiertem HCG-ß zugesetzt. Die Inkubation wurde 24 Stunden bei 37° C fortgesetzt, und
das Anti-Kaninchen-y-globulinserum wurde in ausreichender
Menge zugesetzt, um den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex auszufällen. Nach weiterer Inkubation für 24 Stunden
bei 37 C wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren von dem Überstand, der verworfen wurde, abgetrennt. Schließlich
wurde die Radioaktivität des Niederschlags gemessen.
Für jedes der beiden Hormone wurde eine Inhibitionskurve
aufgestellt; in diesen Kurven wurde die Radioaktivität des Niederschlags gegen die Hormonkonzentration aufgetragen.
Beim Vergleich der beiden erhaltenen Kurven wurde festgestellt, daß 45 m I.U./ml HCG bzw. 523 m I.U./ml LH benötigt
wurden, um eine 50 /»ige Inhibierung der Reaktion zwischen
Anti-HCG-ß-Serum und -markiertem HCG-ß zu erreichen.
Dieses Beispiel zeigt, daß die erforderlichen LH-Mengen
mehr als lOmal so hoch sind wie die HCG-Mengen, um einen
äquivalenten Inhibitionsgrad in der radioimmunologischen Reaktion zu erreichen.
Zur Durchführung ähnlicher Radioimmuntests wurde das in
Beispiel 2 beschriebene Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß die HCG- oder LH-Lösungen in den Inkubationsgemischen durch Urinproben ersetzt wurden, die von Frauen
mit normaler Menstruation während der lutealen Phase gesammelt wurden.
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In keinem Pall wurde ein wesentlicher (d.h. höher als etwa
20 /S) Inhibitionsgrad der radioimmunologischen Reaktion
zwischen dem Anti-HCG-ß-Serum und dem markierten HCG-ß beobachtet*
Zur Durchführung ähnlicher Radioimmuntests wurde das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wiederholt, mit der' Ausnahme,
daß die HCG- oder LH-Lösungen in den Inkubationsgemischen durch Urinproben ersetzt wurden, die von frühschwangeren Frauen (6 bis 12 Tage nach Ovulation und Koitus)
gesammelt wurden. Die getesteten Proben ergaben Inhibitionsgrade von 20 bis 70 %.
Einer während der lutealen Phase des Menstruationszyklus gesammelten Urinprobe physiologische LH-Menge von 10 bis
15 m I.U./ml) wurden graduell variierende Mengen von handelsüblichem
HCG zugesetzt.
Bei Radioimmuntests, die gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt wurden, wurde ein wesentlicher
Inhibitionsgrad bei HCG-Mengen von mehr als 20-25 m I.U./ml
beobachtet.
Einer ähnlichen Urinprobe wurden graduell variierende Mengen von LH zugesetzt. Ein wesentlicher Inhibitionsgrad konnte
^erst beobachtet werden, als LH-Mengen von mindestens
200 m I.U./ml zugesetzt wurden.
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Claims (8)
- Patentansprüche(jy. Antiserum für Radioimmuntests enthaltend ein an HCG-oe. absorbiertes Anti-HCG-ß-Serum.
- 2. Antiserum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß jeder Milliliter des Anti-HCG-ß-Serums an 0,1 bis 0,4 mg HCG-cc absorbiert ist.
- 3. Radioimmunologisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von HCG in einer HCG enthaltenden Probe in Gegenwart einer bis zu etwa lOfachen Menge LH,.ausgedrückt in m I.U./ml, dadurch gekennzeichnet, daß man ein System aus einem an HCG-a absorbierten Anti-HCG-ß-Serum und einem radioimmunologisch markierten HCG-ß herstellt und den Inhibitionsgrad bestimmt, den diese Probe auf die radioimmunologische Reaktion zwischen den Komponenten des Systems ausübt, wobei die beobachtete Inhibition im wesentlichen durch das HCG hervorgerufen wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Inhibition dadurch bestimmt, daß man die Probe radioimmunologisch untersucht und die Ergebnisse mit einem bekannten Standard vergleicht.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,daß jeder Milliliter des Anti-HCG-ß-Serums an 0,1 bis 0,4 mg HCG-a absorbiert wird.
- 6. Verfahren zur radioimraunologischen Feststellung einer Schwangerschaft, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren nach Anspruch 3 oder 5 unter Verwendung einer Urinprobe durchführt, wobei eine Schwangerschaft positiv festgestellt wird, wenn die Inhibition größer als etwa 20 % ist.309886/0835- 4.1 -
- 7. Verfahren zur Gewinnung eines Antiserums, das in der Lage ist, HCG in Gegenwart einer bis zu lOfachen Menge LH, ausgedrückt in m I.U./ml, radioimmunologisch zu unterscheiden, dadurch gekennzeichnet, daß man das Anti-KCG-ß-Serum gewinnt, dieses Anti-HCG-ß-Serum mit HCG-a absorbiert und das Antiserum gewinnt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Milliliter des Anti-HCG-ß-Serums an 0,1 bis 0,4 mg HCG-a absorbiert wird.Für: Istituto Farmacologico Serono S.p.A. Rom / Italiet(Dr.H.J.Wolff) Rechtsanwalt309886/0835
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Family Applications (1)
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