DE2334344C3

DE2334344C3 - Antiserum für Radioimmuntests und seine Verwendung

Info

Publication number: DE2334344C3
Application number: DE2334344A
Authority: DE
Inventors: Pietro Rom Donini
Original assignee: Istituto Farmacologico Serono SpA
Current assignee: Merck Serono SpA
Priority date: 1972-07-17
Filing date: 1973-07-06
Publication date: 1976-01-08
Also published as: ES416801A1; ES440969A1; JPS4950130A; IL42612A0; NL7309849A; IT961450B; ZA734544B; CA1024069A; AR196264A1; AU459426B2; DE2334344A1; AU5800573A; JPS5312968B2; FR2193491A5; IL42612A; DE2334344B2; BE802353A; DD107145A5; GB1369582A; SE417372B

Description

Die Radioimmuntestverfahren konnten jedoch bis- Mit dem erfindungsgemäßen hoch spezifischen

her nicht zur Bestimmung des menschlichen Chorion- Antiserum für Radioimmuntests, das durch Absorpgonadotropins (HCG) in Gegenwart vergleichbarer tion von Anti-HCG-ß-Serum an der HCG-«-Unter-Mengen des luteinisierenden Hormons (LH) ange- einheit erhalten wird, werden Inhibitionskurven erwendet werden, da es außerordentlich schwierig ist, 60 halten, die hinsichtlich von HCG und LH so beein spezifisches Antiserum für diese Hormone zu schaffen sind, daß die zur Erzielung eines äquivalenten erhalten. Inhibitionsgrades in der radioimmunologischen Reak-

Andererseits hat man die Notwendigkeit von tion erforderlichen Mengen LH mindestens lOmal so zuverlässigen Mitteln zur Durchführung dieser Be- hoch sind wie die HCG-Mengen. Stimmung auf diesem Gebiet erkannt. Es ist bekannt, 65 Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, daß solche zuverlässigen Mittel es unter anderem kann bei Verwendung des erfindungsgemäßen speziermöglichen, eine Schwangerschaft schnell (innerhalb fischen Antiserums zur quantitativen radioimmunoloweniger Tage nach Empfängnis) festzustellen, und gischen Bestimmung von HCG in Gegenwart von LH

die Bestimmung nicht nur in einer gepufferten Lösung, z. B. einer durch Phosphat gepufferten Lösung der Hormone, sondern sogar direkt in einer Probe des menschlichen Urins durchgeführt werden. Somit ist dieses Verfahren besonders zur Feststellung einer Schwangerschaft im Frühstadium geeignet.

Das Anti-HCG~/?-Serum, aus dem das erfindungsgemäße hoch spezifische Antiserum erhalten wird, kann wie üblich durch Injektion von menschlichem HCG-ß in heterologe Tiere wie Kaninchen, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen u. dgl. hergestellt werden.

Zweckmäßigerweise wird ein übliches Labortier, insbesondere das Kaninchen, bevorzugt.

Es wurde ein Immunisierungsprogramin verwendet, das dem von Ross vorgeschlagenen entspricht. Die vorliegende Erfindung ist jedoch selbstverständlich nicht auf dieses bestimmte Immunisierungsprogramm beschränkt, da dieses je nach dem Tier, den verwendeten besonderen Adjuvantien usw. geändert werden kann.

Im allgemeinen erfolgt die Absorption des Anti-HCG-/?-Serums dadurch, daß solche Mengen von HCG-Λ verwendet werden, daß schließlich die höchste Spezifität im Antiserum erreicht wird. Diese Mengen können je nach dem verwendeten besonderen Antiserum variieren. Erfindungsgemäß liegen sie gewöhnlich zwischen 0,05 und 5 mg, vorzugsweise zwischen 0,1 und 2 mg und insbesondere zwischen 0,1 und 0,4 mg HCG-Ä pro ml des Anti-HCG-^-Serums.

Der hier verwendete Begriff ^Absorption« hat eine allgemein geltende Bedeutung in der Immunologie, d. h., er bezieht sich auf das Verfahren der Reaktion eines Antiserums mit einem gegebenen Antigen, um den Antikörper, der spezifisch mit dem Antigen reagiert, aus dem Antiserum zu entfernen. Die Zeit- und Temperaturbedingungen einer solchen immunologischen Reaktion sind nicht kritisch. Die Reaktion führt zu einem unlöslichen Antigen-Antikörper-Komplex, der zentrifugiert und verworfen wird, wobei als Überstand ein »absorbiertes« (gereinigtes) Antiserum erhalten wird.

Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1
Herstellung von Anti-HCG-ß-Serum

45

Jedem einer Gruppe von Kaninchen wurde durch intradermale Injektion an mehreren Körperstellen ein durch Ultraschall homogenisiertes Gemisch von 50 μ (Mikrogramm) HCG-/?, gelöst in 1 ml physiologischer Salzlösung, 1 rn Freundsches Adjuvans (DIFCO) und 5 mg trockenen Tuberkelmyccbakterien (H37RA
DIFCO) verabreicht.

An einer anderen Körperstelle wurde jedem Kaninchen subkutan 0,5 ml Pertussisvaccine verabreicht.

Einen Monat später wurde ein Gemisch, das aus 50 μ HCG-/?, gelöst in 1 ml physiologischer Salzlösung, und 1 m Freundsches Adjuvans bestand, intradermal injiziert.

Eine Woche nach der letztgenannten Injektion wurde den Tieren durch Einstich in die Ohrrandvene (marginal ear vein) Blut entnommen. Das in einem Erlenmeyerkolben gesammelte Blut ließ man gerinnen, indem der Kolben etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur geneigt gehalten und anschließend über Nrc'it bei 4°C stehengelassen wurde. Das koagulierte Blut wurde am nächsten Morgen zentrifugiert, um das Serum abzutrennen, dem Natriumazid (1 zu 10(KK) Gewichtsteile/Volumteile) zugesetzt v/urde. In diesem Zusammenhang stehen Gewichtsteile und Volumenteile im gleichen Verhältnis wie Milligramm und Milliliter. Anschließend wurde den Tieren wöchentlich Blut entnommen. Wenn der Antiserumtiter abzunehmen begann, wurden den Tieren subkutan eine zusätzliche Injektion von 50 μ HCG-ß. gelöst in ImI physiologischer Salzlösung, verabreicht.

Absorption von Anti-HCG-/?-Serum an HCG-*

1 ml Anti-HCG-,3-Serum wurden 0,2 mg HCG-λ zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C in einem Thermostat und anschließend 24 Stunden bei 4⁰C gehalten.

Der gebildete Niederschlag wurde zentrifugiert und verworfen.

Es wurde festgestellt, daß das überstehende absorbierte Antiserum hinsichtlich des HCG in Gegenwart von vergleichbaren Mengen LH hoch spezifisch war.

In den nachstehenden Beispielen wird gezeigt, daß das erfindungsgemäße Antiserum in der Lage ist, zwischen HCG und LH zu unterscheiden.

Beispiel 2

Ein Anti-HCG-/9-Serum, das erfindungsgemäß an HCG-s absorbiert war, wurde im Verhältnis 1 zu 2000 mit einem 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5, der normales Kaninchenserum (1:1000), Tetranatriumäthylendiamir.tetraacetat (0,014 M) und Rinderserumalbumin (0,25%) enthielt, verdünnt.

Unter Verwendung des gleichen Puffers, der jedoch kein Kaninchenserum enthielt, wurden zwei Serien von Lösungen mit graduell variierenden Konzentrationen hergestellt, die ein handelsübliches HCG-Präparat (Roussel, 3200 I. U./mg) bzw. ein Urin-LH-Präparat (100 I. U./mg) enthielten.

Ein HCG-ß-Präparat, das mit ¹²⁵J gemäß der von Greenwood und Mitarbeitern in Biochem. J., Bd. 89, S. 114 (1963), beschriebenen Chloramin-T-Methode markiert worden war, wurde mit dem gleichen Puffer, der zur Herstellung der vorstehend genannten HCG- und LH-Lösungen verwendet worden war, in geeigneter Weise verdünnt.

Eine festgesetzte Menge des verdünnten An'i HCG-/?-Serums wurde 24 Stunden bei 37⁰C mit einer aliquoten Menge von jeder der HCG- oder LH-Lösungen inkubiert. Jedem der Inkubationsgemische wurde eine Menge — entsprechend 10000 Zählungen pro Minute — an markiertem HCG-/? zugesetzt. Die Inkubation wurde 24 Stunden bei 37⁰C fortgesetzt, und das Anti-Kaninchen-y-globulinserum wurde in ausreichender Menge zugesetzt, um den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex auszufällen. Nach weiterer Inkubation für 24 Stunden bei 37°C wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren von dem Überstand, der verworfen wurde, abgetrennt. Schließlich wurde die Radioaktivität des Niederschlags gemessen.

Für jedes der beiden Hormone wurde eine Inhibitionskurve aufgestellt; in diesen Kurven wurde die Radioaktivität des Niederschlags gegen die Hormonkonzentration aufgetragen. Beim Vergleich der beiden erhaltenen Kurven wurde festgestellt, daß 45 m I. U./ml HCG bzw. 523 m I. U./ml HL benötigt wurden, um eine 50%ige Inhibierung der Reaktion zwischen Anti-HCG-/?-Serum und markiertem HCG-ß zu erreichen.

Dieses Beispiel zeigt, daß die erforderlichen LH-

Mengen mehr als lOmal so hoch sind wie die HCG-Mengen, um einen äquivalenten Inhibitionsgrad in der radioimmunologischen Reaktion zu erreichen.

Beispiel 3

Zur Durchführung ähnlicher Radioimmuntest wurde das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß die HCG- oder LH-Lösungen in den Inkubationsgemischen durch Urinproben ersetzt wurden, die von Frauen mit normaler Menstruation während der lutealen Phase gesammelt wurden.

In keinem Fall wurde ein wesentlicher (d. h. höher als etwa 20%) Inhibitionsgrad der radioimmunologischen Reaktion zwischen dem Anti-HCG-/3-Serum und dem markierten HCG-/? beobachtet.

Beispiel 4

Zur Durchführung ähnlicher Radioimmuntests wurde das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß die HCG- oder LH-Lösungen in den Inkubationsgemischen durch Urinproben ersetzt wurden, die von frühschwangeren Frauen (6 bis 12 Tage nach Ovulation und Koitus) gesammelt wurden. Die getesteten Proben ergaben Inhibitionsgrade von 20 bis 70%.

Beispiel 5

Einer während der lutealen Phase des Menstruationszyklus gesammelten Urinprobe (physiologische LH-Menge von 10 bis 15 m I. U./ml) wurden graduell variierenden Mengen von handelsüblichem HCG zugesetzt.

Bei Radioimmuntests, die gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt wurden, wurde ein wesentlicher Inhibitionsgrad bei HCG-Mengen von mehr als 20 bis 25 m I. U./ml beobachtet.

Einer ähnlichen Urinprobe wurden graduell variierende Mengen von LH zugesetzt. Ein wesentlicher Inhibitionsgrad konnte erst beobachtet werden, als LH-Mengen von mindestens 200 m I. U./ml zugesetzt wurden.

Claims

Chlorionkarzinome sowie alle HCG-produzierenden Patentamnrüche· Tumore zu entdecken und zu bekämpfen. Patentansprüche. ^ weitrdchende kiinische Verwendbarkeit eines

1. Antiserum für Radioimmuntests, enthaltend solchen spezifischen Antiserums für die Diagnostiein an HCG-* absorbiertes Anti-HCG^-Serum. 5 zierung und Bekämpfung dieser Tumore und zut

2. Antiserum nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Feststellung einer Schwangerschaft im Fruhstadium zeichnet, daß jeder Milliliter des Anti-HCG- ist daher klar ersichtlich^

/?-Serums an 0,1 bis 0,4 mg HCG-* absorbiert ist. In jüngster Zeit haben R ο s s und Mitarbeiter

3. Verwendung des Antiserums nach Anspruch 1 Antisera gegen «-und ^-Untereinheiten von HCG oder 2 zur quantitativen radioimmunologischen io (im folgenden HCG-« bzw. HCG-ß genannt) in Bestimmung von HCG in Gegenwart einer bis radioimmunologischen Reaktionen getestet und festzu etwa lOfachen Menge LH, ausgedrückt in gestellt, daß das Antiserum gegen HCG ρ eine höhere _m j U /ml Spezifität aufweist (vgl. »Structure-activity relations-

4." Verfahren zur Feststellung einer Schwanger- hips of protein and polypeptide hormones«, Teil 1 schaft durch Bestimmung von HCG in einer 15 - Reports-Proceedings of the Second International Urinprobe, dadurch gekennzeichnet, daß die Be- Symposion Liege, September 28 — October I 1971, Stimmung radioimmunologisch unter Verwendung S. 153 bis 157, veröffentlicht von Excerpta Medica eines Antiserums nach Anspruch 1 oder 2 durch- [1971]).

geführt wird. Aus einer graphischen Darstellung, in der unter

ao anderem zwei Inhibitionskurven der radioimmunolo-

gischen Reaktion zwischen Anti-HCG-/9-Serum und

markiertem HCG-/? aufgezeichnet sind, die unter Verwendung von HCG bzw. menschlichem HypoGegenstand der Erfindung ist ein Antiserum für physen-LH erhalten wurden, ist ersichtlich, daß die Radioimmuntests, enthaltend ein an HCG-* ab- 25 beiden Inhibitionskurven eine unterschiedliche Neisorbiertes Anti-HCG-/9-Serum sowie die Verwendung gung aufweisen.

dieses Antiserums zur quantitativen radioimmuno- Hinsichtlich der Menge sind die beiden Kurven

logischen Bestimmung von HCG in Gegenwart einer jedoch fast übereinstimmend, zumindest soweit die bis zu etwa lOfachen Menge LH, ausgedrückt in Anteile betroffen sind, die den niedrigen Mengen an m I. U./ml. 30 kaltem Hormon entsprechen (d. h. bis zu etwa 250 bis

Immunolog'sche Hormontestverfahren beruhen auf 300 m I. U./ml).

der Fähijkeit eine; gegebenen Hormon;, in einer ge- In diesem Zusammenhang sei darauf verwiesen,

gebenen Immunitätsreaktion als Antigen zu wirken. daß die vorstehend erwähnten niedrigen Hormon-Auf der Grundlage dieses Prinzips wurden in letzter mengen genau den Mengen entsprechen, bei denen Zeit Radioimmuntestverfahren entwickelt, bei denen 35 eine Unterscheidung des HCG-Hormons von dem eine unbekannte Menge eines zu bestimmenden nicht LH erforderlich ist, da die physiologischen Mengen markierten (kalten) Hormons — in Gegenwart einer LH im Urin höchstens 150 m I. U./ml betragen, bekannten Menge des gleichen markierten Hormons — Demnach kann das von Ross und Mitarbeitern mit einer geeigneten Menge eines spezifischen Anti- entwickelte Verfahren nicht als Standard-Testverserums inkubiert wird. Eine unbekannte Menge eines 40 fahren zur Bestimmung von HCG in Gegenwart Hormons kann daher ohne weiteres aus der Radio- vergleichbarer Mengen von LH verwendet werden, aktivitätsmessung des Antigen-Antikörper-Korn- Die hier verwendete Bezeichnung »m I. U.« bedeutet

plexes durch Vergleich mit einer zuvor angefertigten den tausendsten Teil der Internationalen Einheit, die Standardkurve bestimmt werden, wobei bekannte die Weltgesundheitsoiganisation auf der Basis des Mengen des spezifischen Antiserums, des kalten 45 relevanten Bezugspräparats eingeführt hat; im Falle Hormons und des markierten Hormons verwendet von HCG ist es der »Second International Standard werden und wobei das kalte und das markierte for HCG« und im Falle von LH das »Second InterHormon bei der Bildung des Antigen-Antikörper- national Refernce Preparation-HMG«. Beide Bezugs-Komplexes proportional — d. h. im Verhältnis zu präparate sind bei dem Biological Standard Departihrer jeweiligen Menge — zusammenwirken. Die 50 ment der Weltgesundheitsorganisation in England Radioaktivitätszahl dieses Antigen-Antikörper-Kom- erhältlich.

plexes ist offensichtlich der Menge des dem Reaktions- Der Ausdruck »vergleichbare Mengen LH« bedeutet

gemisch zugesetzten kalten Hormons umgekehrt diejenigen Mengen dieses Hormons (ausgedrückt in proportional, wobei die Mengen des Antiserums und m I. U./ml), die bis zu etwa das lOfachc der Mengen des markierten Hormons unverändert bleiben. 55 an HCG ausmachen.