JPS58151558A - ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、「ｈｃＧ
Ｊと略称することもある）の特異的な免疫測定法におけ
る非特異的ｌ１ｌｊＩ１作用の除去法に関するものであ
る。

ｈｃＧは妊娠と同時に形成される絨毛細胞から産生され
る蛋白ホルモンの一種であシ、１０ゲステロンの分泌を
促進する。ｈＣＧの検出は妊娠の初期診断に汎用されて
いるが、また近年絨毛性腫瘍以外にもｈＣＧ産生の悪性
腫瘍が見つかっており、腫瘍患者の尿中、血中あるいは
髄液から４ｈＣＧが検出されている。更に正常人の各種
臓器および血中からもｈＣＧが検出されるに至った。

このようＫこのホル毛ンの定性および定量的検出が悪性
腫瘍の診断と経過観察あるいは正常人におけるその生理
学的意義を決定する上にも重要であることが分ってきた
。しかしこれらの診断には１−１０墓工Ｕ以下の微量ｈ
ＣＧの測定が必要であり、この際問題となるのはｈＣＧ
とｍ似の構造をもつヒト黄体形成ホμモン（以下、ｒｈ
ＬＨＪと略称することもある。）との免疫学的な交叉反
応である。生湯的なｈＬＨ濃度は尿中で１００−１５０
工Ｕ／Ｊ　ｅ血中で２００−３０　ｏ　ｘＵ／ｌに達す
ること４あるので、微量の体液あるいは臓器中のｈｃ。

を測定するためにはｈＣＧとｋＬＨとを免疫学的に区別
することが必要である。

そこで本発明者らはｈＬＨと交叉反応せず、ｈｃＧに特
異的な抗体を作成するため、ｈＬＨ４（は存在しないア
ミノ酸配列を有するｈＣＧ−βのＣ末端ペプチドを合成
し、これらのべ１チドと反応する抗体を調製し、この抗
体を保持した担体を用いる免疫学的測定法によりｈＣＧ
の正確な測定ができることを見出した（特願昭５５−８
０４６７゜特願昭５５−１４４６８９）。しかしながら
この方法においてもなお、約０．１−２　Ｉｎ工Ｕ以下
の微量ｈＣＧを測定する場合においては共存するｈＬＨ
が抗体結合固相に非特異的に吸着し、特異的なｈＣＧの
測定を阻害する欠点が存在していたものである。

本発明者らは上記の事情に鑑み、更に検討を重ねたとこ
ろ、免疫測定法において用いる緩衝液に血清とアｙプミ
ン等の蛋白性物質とを添加することによシ、ｈＬＨの抗
体結合固相への非特異的段着が抑制されうるという新知
見を得、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を
完成した。

本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定方法に
おいて、未知量の抗原を含む被検液と担体上に保持され
た抗体との反応に際し、血清および蛋白性物質を添加す
る仁とを特候とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化
学的測定法および（２）血清および蛋白性物質を含有す
るヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定試薬であ
る。

本発明において用いられる担体上に保持される抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロー
ヌゲ〃〔例、セファロース４Ｂ。

セファロース６Ｂ（ファμマシア・ファインケミ力に社
（スエーデン）製〕、デキストフンゲル〔例、セファデ
ックスＧ７５．セファデックスＧ１００、セファデック
ス０２００　（ファルマシア・ファインケミカル社製）
〕、ポリアクリルアミトゲ〃〔例、パイオゲＡ／Ｐ３０
．パイオゲ／Ｌ／Ｐ６０゜パイオゲ／’Ｐ　１００　（
パイオヲツド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セルロ
ース粒子〔例、アビセＡ／（脂化成製）、イオン交換七
〜ロース（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロース）〕、物理的ｇ＆着剤〔例、ガ
ラスＣ例、カラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガ
ラス球、アミノアルキルガラスロンド）、シリコン片、
スチレン系樹脂（例、ポリスチレン環。

ポリスチレン粒子）〕、イオン交換樹脂（例、弱酸性陽
イオン交換樹脂〔例、アンパーライトエＲＣ−５０（ロ
ーム・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２６（パー
ムチット社（西ドイツ）［））。

弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アンパーシイトエＲ−
４Ｂ　、ダウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）
〕）などが挙げられる。

上記担体上に保持される抗体における抗体および標識剤
を結合させる抗体における抗体としては、ｋｘｃＧに非
特異的に反応する抗体であってもよいしに＋ｃＧに特異
的に反応する抗体であってもよい。

該ｈＣＧに非特異的に反応する抗体としては、たとえば
、人尿より公知の方法で精製したｈＣＧを、人以外の温
血動物に接種してｋｌｃＧに対する抗体を形成せしめ、
さらに塩析により得たγ−グロブリン画分をｈＣＧ−β
のＣ末端ペプチドを結合させた固相を充てんしたカラム
を用いるアフィニテイークロマトグヲフィーにかけて素
通り一分を得、さらにｈｃＧを結合させた固相を充てん
しｉカラムを用いるアブイニテイークロマトｆラーｙイ
ーで精製して得られたｈＬＨなど類似の構造を有する蛋
白ホμモンとも交叉反応を示す抗体などが挙げられる。

該ｈＣ（）に特異的に反応する抗体としては、たとえば
■　エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
）。

第１０４巻（１９７９年）、第３９６頁に記載されてい
るような抗体が挙げられる。即ち、ｋｌｃＧ−β鎖のＣ
末端側のｈＣＧに特異的なべ１チドと牛アｙブミンや牛
チログロブリンなどキャリ゛アー用タンパクとｔ−１−
エチＡ／−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミＦなど水溶性カルボジイミドを用いて得た縮合物
をフロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュ
バントと共に人以外の温血動物たとえばウサギにＲＩＩ
ｌ！］接櫨して抗体を形成せしめ、これを採取すること
によりｈＣＧに特異的に反応する抗血清ｔＰ得ることが
できる。

■　特開昭５６−１３８２４８に記載され九ｈＣＧに特
異的に反応する抗ｈＣＧ抗体、すなわち担体上に不溶化
した一般式（ｉ） Ｈ−Ｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−４ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−工
１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−８９１０ｕ　　　１２　　１３
　　１４−８ｅｒ−Ｐｒｏ−８ｅ１４−８ｅｒ−Ｐｒｏ
−８ｅｒ−Ａｒで示されるペプチドの１４位のＧｌｙｔ
−含む１〜１４債の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わ
されるペプチドによシ得られた抗ｈＣＧ抗体が挙げられ
る。

該ｈｃＧに特異的に反応する抗体としては、さらに、■
　前記一般式（Ｉ）で表わされるべ１チドとキャリア用
タンパクとをグルタμアμデヒド（ｒＧＬＡｊと略称す
ることもある。）の存在下に縮合せしめた縮合生成物を
人以外の単車動物に接種して抗体を形成せしめ、これを
採取することにより得られ九抗体が挙げられる。

ここにおいてキャリア用タンパクとは、単独では抗体産
生を誘導することができないぺ１タイドなどハプテン（
低分子量物質）に対する抗体を産生させるためにハプテ
ンと結合させて用いられるものをいい、その例としては
たとえば牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、牛チ
ログロブリン。

破傷風トキソイＦ、ヘモシアニンおよびポリアミノ酸な
どが挙げられる。

一般式（Ｉ）で表わされるペプチドとキャリア用タンパ
クとをＧＬＡの存在下に結合させるには、公知の方法〔
例、ホルモン・アンド・メタポリツクＱリサーチ（Ｈｏ
ｒｍｏｎｅ　　ａｎａ　　１ｉｅｔａｂｏｌｉｃＲｅｓ
ｅａｒｏｈ　）　、第８巻（１９７６年）、第２４１頁
〕によって実施し得る。一般式（Ｉ）で表わされるペプ
チドとキャリア用タンパクの使用量比は１対１ないし２
対１が適当であり、反応ｐＨは７．３前後が良好な結果
を与える場合が多い。また反応に要する時間は２〜６時
間がよい場合が多いが、特に３時間が適当である。この
様にして作成した縮合生成物は常套手段で４℃前後で水
に対して透２析し、凍結乾燥して保存することができる
。

以上の様にして製造した縮合生成物は大以外の溢血動物
に接種される。

上記ｈＣＧに特異的に反応する抗体の製造に用いられる
人以外の温血動物としては、たとえば哺乳温血動物（例
、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、ウシ
、ウマ、ブタ）、鳥１１（１’ｌ、ニワトリ、ハト、ア
ヒル、ガチ゛ヨウ、ウズラ）などが挙げられる。

該縮合生成物を人以外の温血動物に接種する方法として
は、動物に接種する縮合生成物は抗体産生ずるに有効な
量でよく、たとえばウサギに１回２４を等容量（１露り
の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳
化して、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接
種すると抗体を産生させ得る場合が多い。

このようにして、溢血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。

ｈｃｏの特異抗体の製造に用いられる担体上に保持され
た抗原における担体としては、前記した担体と同様のも
のが埜げられ、担体に机側を味持させるには、公知の常
套手段を応用し得るが、たとえば“代謝”、第８巻（ｆ
９７１年）、第６９６頁に記載されているブロムシアン
法−、ＧＬＡ法などが挙けられる。また、より簡易な方
法として掩伸÷物理的に担体表面に吸着させて４よい。

上記一般式（Ｉ）で表わされるペプチドの具体例として
は、たとえばｈＣＧ−βのＣ末端べ１チド（Ｉ　）　（
１２３−１４５）　（Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−Ｐｒｏ−８ｏ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｐｒｏ−８ｏ　ｒ−Ｐ
ｒｏ−８ｅ　ｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓ　ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−
ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ”ＯＨ）が挙げられ、これは
特開昭５６−１３８２４８号公報に記載の方法によシ製
造することができる。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合、それらは工ＵＰ
ＡＣ−工ＵＢ　Ｃｏｍａｍｉｓｓｉｏｎ　　ｏｎＢｉｏ
ｌｏｇｉｏａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｏ　　によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であリ、その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関
し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ
体を示すものとする。

Ａｌａ　：　　アラニン Ｐｒｏ　　：　　グロリ・ン Ｓθｒ：　セリン Ｌｅｕ　：　　ロイシン Ａｒｇ　：　　アルギニン Ｇｌｙ　：　　グリシン Ａｓｐ　：　　アスパラギン酸 Ｔｈｒ　：　　スレオニン エｌｅ　：　　イソロイシン Ｇｌｎ　：　　グルタミン 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の
公知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法
のいずれによってもよいが、液相合成法が有利な場合が
多い。そのようなペプチド合成の手段としては、たとえ
ば“ＴｈθｐｅｐｔｉｄｅＥｌ”、第１巻（１９６６）
、５ａｈｒ２：ｄｅｒ　　ａｎａ　Ｌｕｂｋｅ著、Ａｃ
ａｄｅｍｉｏ　　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　
Ｕ、８．Ａ、あるいは“ペプチド合成”、東屋ら著、九
倫株式会社（１９７５年）に記載され友方法、たとえば
アジド法、クロフィト法、酸無水物法、混合無水物法、
ＤＣＣ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用い
る方法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ
／７デイテイプ（例、ＨＯＩＪＢ　。

ＨＯＢｔ、ＨＯ８ｕ）法などがあげられる。

本発明方法において用いられる担体に抗体を保持させる
には、公知の常套手段を応用し得るが、たとえば“代−
”、第８巻（１９７１年）、第６９６頁に記載されてい
るプロムンアン法、ＧＬＡ法などが挙げられる。また、
よシ簡易な方法として抗体を物理的に担体表面にｉ層さ
せてもよい。

ｈＣＧの測定において用いられる標識剤を結合させた抗
体における標識剤としては、放射性同位元素、酵素、螢
光物質２発光物質などが挙けられる。放射性同位元素と
してはたとえば　　工。

１３１工、３Ｈ１１′Ｃなどが、上記酵素としては、安
定で比活性の大きなものが好ましく、その例としてはた
とえば（１）力〃ボヒドフーゼ〔例、グリコシダーセ（
例、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グμコシダーゼ、
β−グμクロニダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−ガ
ラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、α−マンノシダ
ーゼ）、アミラーゼ（例、β−アミラーゼ、β−アミラ
ーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラ
ーゼＡ）、セルラーゼ、リゾチーム〕、（２）アミダー
ゼ（例、ウレアーゼ、アスパラギナーゼ＞　、（ａ）エ
ステラーゼ（例、コリンエステフーゼ（例、７セチルコ
リンエステラーゼ）、ホスファターゼ（例、アルカリホ
スファターゼ）、スルファターゼ、リパーゼ）、（４）
ヌクレアーゼ（例、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌ
クレアーゼ）　、（５）鉄・ｄｖフィリン酵素（例、カ
タラーゼ、べ〃オキシダーゼ、チトクロームオキシダー
ゼ）　、（６）鋼酵素（例、チロシナーゼ、アスコルビ
ン酸オキシダーゼ）　、　（７）脱水素酵素（例、アル
コール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素、イソクエン酸脱水素酵素）などが、螢光物質として
は、フルオレスカミン、フルオレッセンスインチオシア
ネートなどが、発光物質としてはルミノーｓｙ、ｉｖ−
、ノー〜誘導体、ｆｉ／シフニリン、／Ｌ／シゲニンな
どがそれぞれ挙げられる。特に、β−Ｄ−ガフクトシダ
ーゼが好ましい。

上記抗体と標識剤とを結合させるには、公知の常套手段
であるクロフミンＴ法〔“１Ｊａｔｕｒθ″、第１９４
巻（１９６２年）、第４９５頁〕、過ヨウ素酸法〔“Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｈ１ｓｔｏｃｈｅｍｉａｔｒ
ｙａｎ４　　Ｃｙｔｏｏｈｅｍｉｓｔｒｙ　”　、第２
２巻（１９７４年）。

第１０８４頁〕、マレイミド法〔“Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″、第７９巻（１９７６
年）。

第２３３頁〕、　“Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ”。

第１１６巻（１９７６年）、第１５５４頁〕などが用い
られる。

本発明の免疫測定法において用いられる被検試料として
は、尿、血清、血漿、髄液、＊器抽出液等いずれの生体
試料を用いてもよく、とシわけ尿。

血清、血漿などが繁用される。

本発明に使用する血清としては、ｈＣＧを含まない血清
であればいずれを用いてもよく、例えば羊血清、ウサギ
血清、仔牛血清が好ましい血清として挙げられる。更に
アフイニテイーカフムクロマトグラフィーでｈＣＧを除
去したヒト血清も好ましく便用される。これらの血清は
免疫測定系に約２ないし４０％、好ましくは約１０ない
し３０％となる濃度で添加される。

本発明に使用する蛋白性物質としては、たとえば血清蛋
白質類（例えばアルブミンおよびグロブリン等）、疎水
性の強い蛋白質＄Ｃ例、ゼラチン。

コラーゲン氷解物）などが挙げられ、好ましくはウシ血
清アルブミンが用いられる。これらの蛋白性物質は免疫
測定系に約０．３ないし５％、好ましくは約０．５ない
し２％となるように高濃度で添加される。

かかる特異的免疫化学的測定方法を実施するには、（１
）未知量のｈＣＧ　　　°　　　　　を含有する被検試
料に公知の常套手段で物理的もしくは化学的に抗体を結
合させ麺固相を加えて反応させる。

ここにおいて、反応系Ｋｍ清および蛋白性物質をＩｉｌ
衝液に添加し使用する（第１反応）。同相を洗浄したの
ち、標識剤で標識した抗体の一定盪を加えて反応させる
（第２反応）。次に通常、固相をよく洗浄し、固相上に
結合している標識剤の活性を測定する。標識剤が放射性
同位元素である場合、ウニμカウンターもしくは液体Ｖ
ンチレーションカウンターで測定する。標識剤が酵素で
ある場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは螢光法
で酵素活性を測定する。標識剤が螢光物質９発光物質で
あっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。上述
のアッセイ方法において、第１反応と第２反応の間にお
ける洗浄を省略してもよいし、さらに簡略化するために
被検液、抗体結合固相および標識剤で標識した抗体を同
時に加えて反応させてもよい。

本発明においては、ｈＬＨの非特異的ｌ＆層を抑制する
ためには、血清および蛋白性物質の両者を共存せしめる
と、その効果が発揮される。

本発明の方法によると、被検液中に含まれることもある
ｋｌＬＨが、担体上に保持された抗体に吸着されること
を眸き゛、被検液中の微量のｈｃＧが特異的に該抗体に
反応することから、被検液中に存在する微量のｈＣＧが
正確に測定される。本発明は、絨毛性腫瘍中その他のｈ
ＣＧ産生腫瘍などの＃新、予後管理などに極めて有用な
手段を提供する本のである。

上記したように、本発明の免疫測定法は、生体試料（被
検液）中に含まれるに＋ＬＨの非特異吸着を除去し微量
のｈＣＧを正確に測定することができ、Ｅ工Ａ等の免疫
反応を用いる各種の微量ｈＣＧ測定法の測定値の信頼性
を高め、更に微量なｈＣＧをｈＬＨの共存下で特異的に
測定することができる。

さらに、このようＫして得られた血清と蛋白性物質とを
共存させた緩衝液はｋｌｃＧの診断試薬の１つとして有
用であシ、Ｒ工Ａ、Ｅ工Ａ等の測定試薬の１つとして有
用である。

本発明にもとづ（ｈＣＧの免疫化学的測定法に用いられ
る定量用キットとしては、主として（１）担体上に保持
された抗体 （２）標識化された抗体 （３）約０ないし１０工Ｕの標準ｆｉｃＧ（４）上記（
２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈に用いる緩衝
液（血清と蛋白性物質とを共存せしめ友釣１０％ヒツジ
血清および約１％牛血清アμプミン（以下、Ｂ８Ａと略
称することもある。）を含むｐＨ約６ないし９のリン酸
緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）（５）イ
ンキュベージラン後、担体の洗浄に用いる緩衝液（該担
体の洗浄に用いることができる緩衝剤であればいずれで
もよいが、その−例としてはリン酸緩衝液またはグリシ
ン緩衝液が挙げられる。） （６）標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測定に
必要な試薬。その−例として、β−Ｄ−ガヲクトシダー
ゼの場合は、酵素基質（好ましくは４−メチ〜ウンベリ
フェリルβ−Ｄ−ガフクトシドまたはオμトニトロフェ
ニルーβ−Ｄ−ガフクトシド）、酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止に用いるｉ１！衝液（好まし〈は炭酸緩衝液またはグ
リシン緩衝液）が挙げられる。標識剤に発光性物質を用
いる場合は、該発光性物質を測定する材料。その−例と
してルミノールでは酸化剤（好ましくは過酸化水素）、
触媒（好ましくはミクーバーオキシダーゼまたは次亜塩
素酸塩）および酸化剤、触・媒の溶解に用いる緩衝液（
好ましくは水酸化ナトリウム液または炭酸緩衝液）が挙
げられる。

また、上記（１）と′（２）とは、あらかじめ混合しで
あるものでもよい。

上記のキットはたとえば下記の方法によシ使用するのが
好ましい。

標準ｈｃＧもしくは被検液約１０ないし２００μｌに試
薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて
約０ないし４０℃で約１ないし２４峙関反応させる。試
薬（６）で担体の洗浄後、試薬（２）の約１０ないし３
００μｌを加えたのち、約０ないし４０℃で反応させる
。約１ないし２４時間反応後、試薬（５）で洗浄し担体
上に結合している標識剤の活性を測定する。榔−剤が放
射性同位元素である場合、ウェルカウンターもしくは液
体シンチレーションカウンターで測定する。標識剤が酵
素である場合、基質液約１０ないし１０００μｌ　を加
えて約２０ないし４０℃で約０，５ないし、２４時間反
応させたのち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度
屯しくけ螢光強度を測定する。

以下に参考例および寮施例を挙げて、本発明をさらに具
体的に説明する。

参考例１ 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約１０　、０００　工Ｕ
膚のｈｃＧｌｑを生理食塩水１　ｍｌに溶解し、これに
フロイントの完全アジュパン）　（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｏ
ｏｍｐｌｅｔｅ　　＆１１ｊｕＶＩＬｎｔ、“免疫の生
化学”、橘ら著、共立出版株式会社（１９６７年）〕１
ｄを加えてよく混和し乳剤を作）、これをウサギの両大
腿部筋内円および背部及下数箇所に注射する。以上の操
作を３週毎に５回行ない最終免疫後ＩＸ！４闇で採血し
パイロットアッセイを実施する。その結果、ｈＣＧ−β
のＣ末端ペプチド（Ｉ）Ｋ４１１和性をもつ抗血清Ｎ３
０５Ｂを得た。

参考例２ 特異抗ｈＣＧ抗体の製造 ｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（■）５雫を０，５Ｍ　Ｎ
ａＣ１を含む、０−　Ｉ　Ｍ　ＭａＨＣＯ３８Ｔ＃ｔに
溶解し、予めＮ／　１．０００　ＨＣＩで洗浄したブロ
ムシアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ社製）１ｆに加え、５℃で一夜攪拌し
た。反応終了後同じ０．５ＭＮａｆ：：ｌを含む０．　
ｌ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３で十分に洗浄し、次いでＨＣＩで
ｐＨ８に調整した０、５Ｍエタノールアミン１０ｇ＜を
添加して室温で１時間反応させ丸後、（１）　ｌ　Ｍ　
ＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸Ｗ１衝液（ｐＨ４，０入（
２）　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１　Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ８，０）および（３）　０．　Ｉ　５　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）で順
次洗浄しカラムに充填した。

参考例１で得られた抗血清Ｎ３０５Ｂ　　Ｂ−を１．５
９の無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈澱させ、得られ
たγ−グロブリン内分を上記のペプチド（Ｉ）結合セフ
ァロース４Ｂカラム（０，９Ｘ４ｃ１１）に付した。

した。次いで０．１７Ｍグリシン−塩酸ｉｉＩ前液（ｐ
Ｈ２，３）で溶出することによってｈＣＧ−βのＣ末端
ペプチド（Ｉ）と強い親和性をもつ特異抗体Ｎ３０５Ｂ
Ｓを得た（蛋白量１．２　ｑ）。

参考例３ 抗ｈＣＧ−βのＣ末端べ１チド（Ｉ）抗体の製造 ｈＣＧ−βｃ）Ｃ末端ぺ’；＃Ｆ（Ｉ）２５１ｓＩ／お
よび牛チログロブリン（ＢＴＧと略称することもある。

）５０１１！！を０．２Ｍリン酸緩鉗液（ｐＨ７，３）
４１１ｔＫｆ＃解し、５％ＧＬＡ水溶液４厘ｔを加えて
室温で３時間攪拌後、４℃で透析（水２１ｘ４　）Ｌ、
凍結乾燥して免疫原を得た。このｈＣＧ−βのＣ末端ペ
プチド（Ｉ）−牛チログロブリン（ＢＴＧ　）縮合物１
．５１１ｖを生理食塩水０．７５　ａｔに溶解し、これ
にフロイントの完全アジュバント（１’ｒθｕｎｄ’ｅ
Ｃ５ｏｍｐｌｅｔｅ　　ａｄｊｕ’ｖａｎｔ　）　０．
７５ｇ／を加えてよく混和し、乳剤を作り、これをウサ
ギの両大腿部筋内円および背部皮下数ケ所に注射し友。

以上の操作を４週おきに４回行々い最終免疫後１遍間で
採血し、遠心分離して抗血清を採取しｈＣＧ−βのＣ末
端ペプチド（Ｉ）に対する抗血清！３１３Ｂを得た。

次いで抗血清Ｎ３１３Ｂを常法によシ硫酸アンモニウム
で塩析させて得たγ−グロブリンー分を２岬のｈＣＧを
結合させたセファロース４Ｂカラム（直径Ｑ、　９　ａ
ｍ　、長さ４１）に付した。

０、１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，０）でカラムを洗浄し、次いで０．１７　Ｍグ
リシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出することによ
って、ｈｃＧＫｌ！和性の高い特異抗体Ｎ３１３ＢＳを
調製した。

参考例４ 非特異抗ｈＣＧ抗体の製造 参考例１で得られた抗血清Ｎ３０５Ｂについて、硫酸ア
ンモニウム塩析し、５ダのｈｃＧ−βのＣ末端ペプチド
（Ｉ）を結合させたセファロース４Ｂカラム（直径Ｑ、
９ａ＋＋、［さ４１）のアフイニティークロマトグフフ
イーで素通シする抗体画分を調製した。次いでこの抗体
−分を２ダのに＋ｃＧを結合させたセファロース４Ｂカ
ラム（直径０．９ＣＩ１１゜長さ４ｃ１１）に付した。

０．１５　Ｍ　ａａｃｌを含む０．０２Ｍホウ酸１１！
衝液（ｐＨ９，Ｑ）でカラムを洗浄し、次いで５　Ｍ　
ＭｇＣｌ２で溶出することによって、ｈＣＧに親和性の
高い非特異抗体Ｎ３０５Ｂｏｔ−調製した。

参考例５ 抗体結合固相の調製 ポリスｆＶ：／ポーｌｖ（直径３．２ｗａ　、　Ｐｒｅ
ａｉｅｓ　ツｎＰｌａａｔｉｏｅ　　Ｂａ１ｌ　　Ｃｏ
、、　Ｃｈｉａａｇｏ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　’）１５００
個に、参考例２および３で得られた抗体Ｎ３０５ＢＳあ
るいはＮ３１３ＢＳの３０μｇ／ｇ１０、０１　Ｍ　Ｎ
ａＣ１−０，０１Ｍリン酸緩曽液（ｐＨ８，０）３０耐
を加え５℃で一夜インキュペートし九。

０．１嘱ＢＳＡを含む０．０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で洗浄したのち、用時まで冷所保存し、抗体結
合固相を製造した。

参考例６ β−Ｄ−ガフクＦシダーゼ標織標識ＣＧ抗体複合体の調
製 （１）参考例４で得られた抗体Ｎ５Ｑ５ＢＧ　　４′Ｉ
ｖを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）２ｇ／に溶
解し、１００μｇのｍ−マレイミドベンシイＡ／−Ｎ−
ハイドロキシサクシンイミドエステルを含むテトフハイ
ドロフラン２００μｌを添加して３０℃で３０分間反応
させた。反応混合液を０．０２Ｍ！Ｊン酸緩衝液で平衡
させたセファデックスＧ−２５（直径Ｑ、　９　ｃｍ　
、長さ５５ｃＩ１１）に通し、過剰の試薬とマレイミド
化抗体とを分離した。得られたマレイミド化抗体溶液０
．５１を０．０２　Ｍ　リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７，５
）に希釈したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（１ダ／ｍ
ｌ　）　０．３　ｄに徐々に添加し、時々振り混ぜなか
ら５　’Ｃで１夜反応させた。反応終了後、０．０２Ｍ
！Ｊン酸食塩緩衝液（ｐＨ７，０）を用いるセファロー
ス６Ｂのカラムクロマトグラフィーで精製し、酵素活性
ならびに抗体活性を有するフラクションを分取し、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ榛鎗抗ｈＣＧ抗体複合体を得九。

（２）参考例４で得られ九抗体Ｎ３０５Ｂ０　５Ｍｇに
０．１１１ｖのベグシンを加え３０℃で一夜反応債、セ
ファデックスＧ−１５０カラム（直径’ｌ、　５　ｃｍ
　。

長さ５５ｃ１１）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’
）２ｍ分ｔ−β−メ〜力１トエチルアミンで還元俊、セ
ファデックスＧ−２５カラム（直径０．９３．４１５５
ｃＩｌ）に供し過剰の試薬を除去した。次にＮ。

Ｎ′−〇−フェニレンジマレイミド飽和ｆ＃液２　ｗｌ
を添加し３０℃で３０分反応させたのち、反応混合液を
セファデックスＧ−２５カラム（直ｆｌ　２．５ｃ１１
゜長さ５５ｃＩ１１）で精製した。得られたマレイミド
化１ｉ’ａｂ’　　にβ−Ｄ−ガフクトシダーゼ溶液（
５’ａｌ／ｍｅ　）５０μｌを添加し、５℃で一夜反応
させた。反応終了後、０．１％Ｂ　８　Ａ　ｙ　Ｏ，１
％　ＮａＮ３．１ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１　Ｍ　
１ｉａＣ１を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐａ６．５
）を用いるセファロース６Ｂのカラムクロマトグラフィ
ーで精製し、酵素活性ならびに抗体活性を有するフラク
ションを分取し、β−Ｄ−ガヲクトシダーゼ標識抗ｈＣ
Ｇ抗体複合体を得た。

実施例１ 緩衝液Ａ　（ｏ、　Ｉ　Ｍ　Ｈａ　Ｃｌ　、　ｌ　ｍＭ
　ＭｇＣ１ｚ　　＋　０．１％Ｂ８Ａ、０．１％ＮａＨ
３を含む０．０２　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０））およびＢ［１，１５ＭＮａＣ１，１ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２　、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３　。

１０％ヒツジ血清を含む０．０２　Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，０）　）　１５０μｌにそれぞれの緩
衝液で適当に希釈したｈＣＧあるいはｈＬＨ含有液５０
μｌを加え、更にポリスチレンボーμｍｈＣＧ特異抗体
Ｎ３０５ＢＳ結合物を１個加えて室温で一夜反応させた
。反応終了後、０．０１Ｍリン酸食樵緩衝液（ｐＨ７，
０）でポリスチレンポールをよく洗浄し、次に緩衝液Ａ
で希釈したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標織標識ＣＧ抗体
複合体２００μｌを加えて３７℃で３時間反応させた。

反応終了後、再び０．０ＩＭ！Ｊン酸食塩緩衝液（ｐＨ
７，０）でポリスチレンポールをよく洗浄し、ポリスチ
レンボーμに結合しているβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ活
性を測定した。

結果を第１図に示す。第１図において、−一−−・−−
−一は緩衝液Ａを用いて得られたｈＬＨの非特異的な吸
着の結果を、−−−−〇−−−−はｉＩ衝液Ｂを用いて
得られたｈＬＨの非特異的な吸着の結果を、−−・□は
緩衝ｌ＆Ａを用いて得られたｈＣＧの標準曲線を、−−
ｏ−−−−は緩＃液Ｂを用いて得られた１ｉＣＧの標準
曲線をそれぞれ示す。

上記の結果から明らかなように、血清と蛋白性物質とを
共存させたｉ＃衝液Ｂの系では１ａ前液Ａの系に比べて
ｈＬＨに対する反応性が約１７４で、しかもｈＣＧに対
する感度は同等であった。

実施例２ 緩衝液■（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，５％エチレンジ
アミン・テトラアセテート・ジＶジウム・２Ｈ２０゜０
．１％Ｎ　ａ　Ｎ３を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，０）　）　、■（０，１５Ｍ　ａａｃ
ｌ、　Ｑ、５％エチレンジアミン・テトラアセテート・
ジソジウム−２Ｈ２０，０，１％ＮａＮ５ｅ　１％Ｂ−
８Ａを含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）　）　。

■（０，ｌ　５　Ｍ　ＮａＣ１，０，５％エチレンジア
ミン・テトラアセテート・ジソジウム・２Ｈ２０，０，
１％Ｎ＆Ｎ３．ｌ　０％ヒツジ血清を含む０．０２Ｍり
糧ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０））および■ＣＯ，１
５蓋ＮａＣ１，Ｑ、５％エチレンジアミン・テトラアセ
テート・ジｙジウム−２Ｎ２０　、０．１％Ｎａ’３　
ｐ　１　％ＢＳＡ、ｌＱ％ヒツジ血清を含む０．０２Ｍ
リン酸ナトリウム緩＃液（ｐＨ７，０）　）　２５０μ
ｌにそれぞれの緩衝液で適当に希釈したしＣＧあるいは
ｋｌＬＨ含有ｇ！５０μｌを加え、更にポリスチレンボ
ーμｍに＋ｃＧ特異抗体Ｎ３１３ＢＳ結合物を１個加え
て室温で一夜反応させた。反応終了後、０．ＯＩＭ！Ｊ
ン酸食塩緩衝液（ｐＨ７，０）でポリスチレンポールを
よく洗浄し、次に実施例１と同様のｉｉ！衝液Ａで希釈
したβ−Ｄ−ガヲクトシダーゼ榛織抗ｈＣＧζ 抗体複合体２００μｌを加えて３７’Ｃで３時間反応さ
せた。反応終了後、再び０．０ＩＭ！Ｊン酸食填緩衝Ｈ
（ｐＨ７，０）でポリスチレンポールをよく洗浄し、ポ
リスチレンポールに結合しているβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定した。結果を第１表に示す。

第１表 ｈＬｍの非特異数層率　（％） 緩衝液　　　ｋｔＬＨ濃度　（ｍ工Ｕ／　ｔｕｂｅ　）
４．２　　８．４　　＋６．８　　３３．５■　　０．
２５　　０．４８　０．５８　　　＋、０９■　　０．
１０　　０．＋３　０．３，８　　０．７４■　　０．
１Ｂ　　　０．１９　０．３５　　０．４Ｌｌ■　　０
．＋５　　０．１８　０．２２　　０．３４第１表から
明らかなように、血清と蛋白性物質とを共存させた緩衝
液■の系では両者を含まない緩衝液■の糸に比べてｋｌ
ＬＨｏ非特異吸非特異吸気率減少し友。

実施例３ ｋｌｃＧの特異免疫化学的測定用キットおよびに＋ｃＧ
の測定 下記のｈＣＧ免疫化学的測定用キットを用い、下記の操
作法に従って正常人、卵巣摘出患者および排卵期婦人血
漿中のｈＣＧ濃度を測定した。

１ｔｃＧの免疫化学的測定キット （１）参考例４で得られる１個あたシ０．６μｇのＩＩ
ｃＧ特異抗体で感作した直径３．２ｍのポリスチレンポ
ー、ル′。

（２）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ｆｉｃＧ抗体複
合体の約１００μＵの酵素活性を有する部分。

（３）Ｏ−１００ｍ工Ｕの標準ｈｃＧ （４）上記（１）　、　（３）の試薬および被検試料の
希釈に用いる、１０％正常ヒツジ血清、１％牛血清アル
ブミン、０．５％エチレンジアミン・テトラアセテート
・ジゾジウム・２Ｈ２０、Ｏ，１％ＮａＮ３　、０−１
５Ｍ　ＮａＣ１ｆ含むｐＨ７，０００，［ｌ　２　Ｍリ
ン酸緩衝液。

（５）２０μｇ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガフクトシド。

（６）上記（２）の試薬の希釈および（５）の酵素基質
の溶解に用いる。０．１％牛血清アルブミン、０．１％
Ｎａｐ３．　ｌ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、　Ｏ，ｌ　Ｍ　
ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液。

（７）上記（１）のポリスチレンポーμの洗浄に用いる
０、ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２を含むｐ
Ｈ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液。

（８）ｐａ　１０．５ｃ７）０．　ｌ　Ｍ＊＊緩衝液。

操作法 標準ｈＣＧもしくは被検試料５０μＪＫ試薬（４）１５
０μｌおよび試薬（１）１個を添加し、室温で反応させ
る。−夜反応後、試薬（７）でポリスチレンポー〜を洗
浄し、次いで試薬（６）で希釈した試薬（２）２ｏ。

μｌを添加し、３７℃で３時間反応させる。再び試薬（
７）でポリスチレンポー〜を洗浄後、試薬（５）５００
μｌを加えて酵素反応を開始する。３７Ｃで１時間反応
させたのち、試薬（８）　２．５−を添加して反応を停
止させる。反応液中の螢光強度を測定し、検液中のｈＣ
Ｇ濃度を決定する。

上記方法により、正常人、卵巣摘出患者および排卵期婦
人血漿中のｈＣＧ濃度を測定した。結果は第２表に示さ
れる。対照として従来の非特異的な酵素免疫測定法の結
果をも示した。

第２表 正常人　＋　　　０．４６　　　２２．１２　　　０．
４０　　　　　＋５．５ ３　　　０．６８　　　　１１．０ ４　　　０．６６　　　　　＋２．２ ５　　　０．７４　　　　１０．４ 卵巣＾本彰脣　１　　　　　１．７０　　　　　　　８
４．０２　　　０．６４　　　　７７．７ ３　　　０．５４　　　　３２．７ ４　　　２．９９　　　　８０．７ ５　　　　＋、２１　　　　４７．７ 排卵期婦人　　０．８２　　　　５２．０

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたｈＣＧの標準曲線ｌＬＩ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　担体上に保持された抗体、抗原および婁謙剤
   を結合させ九抗体を用いる免疫化学的測定方法において
   、未知量の抗原を含む被検液と総体上に保持され九抗体
   と句反応に際し、血清および蛋白性物質を添加すること
   を特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測
   定法。
2. （２）　　血清および蛋白性物質を含有するヒト絨毛性
   ゴナドトロピンの免疫化学的測定試薬。