DE2548868C2

DE2548868C2 - Verfahren zur Bestimmung von Schwangerschaftshormonen

Info

Publication number: DE2548868C2
Application number: DE2548868A
Authority: DE
Inventors: Brij B. Englewood N.J. Saxena
Original assignee: Carter Wallace Inc
Current assignee: Meda Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1974-11-11
Filing date: 1975-10-31
Publication date: 1984-09-13
Also published as: AT373396B; NL7511109A; US4094963A; ATA852575A; SE432485B; NO753203L; SE7510554L; SE7905898L; DK420475A; SE437304B; DE2548868A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Schwangcrschdftshormonen in einer wäßrigen Probe durch Inberührungbringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, wobei das Mittel das in der Lage ist, jo das Hormon spezifisch zu binden, ein Plasmamembranextrakt von dem Corpus luteum einer Tierspezies ist, die einen Rezeptor für das zu bestimmende Hormon besitzt (nach Patentanmeldung DE-OS 25 11 698). Das Verfahren dient insbesondere zur Bestimmung der Schwangerschaft bei der Frau.

Tests tür die Bestimmung der Schwangerschaft basieren im allgemeinen auf der Bestimmung von Hormonen,

welche durch die sich entwickelnde Plazenta erzeugt werden, wie beispielsweise gonadotropc Hormone, die ähnlich jenen sind, die durch die vordere Hypophyse erzeugt werden und Steroidhormone, ähnlich jenen des Eierstockes und der Nebenniere. Heute verwendete Schwangcrschafistcsts beruhen fast ausschließlich auf der Untersuchung des Plazentahormons des menschlichen Choriongonadotropins (HCG). Dieses Hormon wird in Körperflüssigkeiten wie Blutserum und Urin nur während der Schwangerschaft festgestellt, mit der Ausnahme verschiedener anderer, sehr seltener Hormon erzeugender Zustände des Körpers. Die Internationale Einheit

(1. U.) von menschlichem Choriongonadotropin wurde 1938 eingeführt und wird als die spezifische gonatropc Aktivität von 0,1 mg eines getrockneten Standards definiert, der in dem National Institut of Health, London, England aufbewahrt wird.

Die frühesten Tests auf Schwangerschaft basierten auf biologischen in vivo-Verfahren zur Bestimmung von HCG. Zum Beispiel beruhte der frühcste Test, der Aschheim-Zondcck-Tcst, auf der Fähigkeit von subuctan in Mäuse injiziertem HCG, Corpora lutea zu erzeugen. Der Friedman-Test ist ein anderer biologischer Test, in welchem eine Urin-Probe der vermuteten Schwangerschaft in die ührvene eines erwachsenen, weiblichen Kaninchens injiziert wird, welches 3 bis 4 Wochen isoliert gewesen ist. und 48 Stunden nach der Injektion werden die Ovarien auf rupturierte hämorrhagische Follikel untersucht, welche eine positive Reaktion anzeigen. Ein 1943 durch Kupperman entwickelter weniger bekannter Test umfaßt die Injektion von Urin des Patienten in eine weibliche Ratte mit anschließender Inspektion des Ovariums auf Zeichen von Hyperämie. Obwohl zwei Stunden zum Ausführen dieses Testes notwendig sind, ist er beträchtlich kürzer, als die für den Friedman-Test erforderlichen 48 Stunden und die annähernd 5 Tage, die für den Aschhcim-Zondekt-Test erforderlich sind, doch ist dieser Test nicht sehr zuverlässig, da er eines geübten Technikers bedarf, um ein hell rosa negatives Overaium von einem geröteten positiven Ovarium zu unterscheiden, um einen hohen Grad von Genauigkeit zu erreichen. Ein Durch GaIIi und Mainini in den spaten 40er Jahren entwickelter Test benötigt zur Ausführung auch nur etwa 2 Stunden, jedoch umfaßt dieser Test die Injektion des Urins des Patienten in Frösche mit der anschließenden Beobachtung des Ausstoßens von Sperma, und diese Tiere sind verhältnismäßig unempfindlich, verglichen mit Kaninchen, Mäusen und Ratten.

Die obigen biologischen Tests leiden sämtlich an schwerwiegenden Nachteilen einschließlich der Verfügbar-

bo keit von Tieren, der Notwendigkeit, eine große Kolonie von Tieren zu halten, und verhältnismäßig langer Untersuchungszeiträumc, der häufigen falschen positiven und negativen Ergebnisse, und sinbesondere der Tatsache, daß ein positiver Test mit nur 95% Ziiverlässigkeitsgrad erst nach einem Zeitraum von 25 bis 30 auf die Ovulation folgenden Tagen erreicht werden kann.

Eine zweite, während der zeitigen bOcr jähre entwickelte Art von .Schwangerschaftstests wird als immunologitv-, sches oder immunochemisches Verfahren bezeichnet. Da HCG ein Protein-Hormon ist, wirkt es bei einer hetcrologen Art antigen.

Wenn demgemäß HCG durch geeignete Techniken in ein geeignetes Testtier injiziert wird, am typischsten in Kaninchen, wird ein Antikörper zu HCG in dem Tier erzeugt. Bei ersten Tests, die dieses Prinzip verwendeten,

wurde versucht, die Amigen-Antikörper-Direktniederschlagsrcaklion zu verwenden, nach welcher sich ein sichtbarer Niederschlag aufgrund der Kombination von HCG und seinem Antikörper bildet, um das Vorhandensein dieses Hormons zu ermitteln. Üblichere Verfahren umfaßten sogenannte indirekte Besümmungsverfahren, wie beispielsweise der Latexteilchen-Objcktträger-Test von Brody und Carlstrom und des Hämagglutinations- und Inhibitions-Test von Wide und Gemzel. Bei dem ersteren Verfahren wird ein Antiserum dem Urin eines Patienten zugesetzt, worauf ein Latexträger folgt, welcher mit HCG beschichtet worden ist. Wenn die Urinprobe einer schwangeren Frau HCG enthält, werden die Antikörper in dem Antiserum neutralisiert und reagieren deshalb nicht mit dem HCG, das auf den Träger geschichtet ist, um Agglutination zu erzeugen. In dem letzteren Testverfahren wird ein ähnliches Prinzip verwendet, ausgenommen, daß der Indikator HCG enthält, das mit roten Blutzellen oder mit formalinisierten roten Blutzellen verbunden ist. Der erste Test wird in einem Zeitraum von nur etwa 2 Minuten ausgeführt, wohingegen der zweite etwa 2 Stunden benötigt. Sowohl Urin als auch Blut eines Patienten können für diese Teslverfahren verwendet werden.

In einem jüngst entwickelten auf einer Modifikation des grundlegenden immunologischen Mechanismus basierenden Schwangerschaftstestverfahren werden radiologische Anordnungen verwendet, um das Vorhandensein von HCG in dem Blut oder Urin des Patienten zu ermitteln und/oder zu messen (siehe z. B. Goldstein et al in Feru Steril, Band 23, Seite 817, 1972). In diesen Radioimmununtersuchungstests wird der Antikörper in Berührung mit einem Gemisch der Körperflüssigkeit eines zu testenden Patienten und einer bekannten Menge HCG gebracht, das mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, und das HCG in der Testprobe und das markierte HCG wirken kompetitiv auf den HCG-Antikörper. Der Antikörper wird dann von der Flüssigkeit getrennt und jede Fraktion wird radiologisch analysiert, um die jeweiligen Anteile des markierten und nicht markierten HCG zu bestimmen, welche an die Antikörper gebunden wurden, und die Konzentration des HCG in der Probe kann aus dieser Information berechnet werden, da das Verhältnis von markiertem und nicht markiertem HCG in beiden Fraktionen gleich ist. Die Radioimmununtersuchungstechniken haben eine erhebliche Begrenzung des immunochemischen Schwangerschaftstestes überwunden, nämlich die der Empfindlichkeit. Radioimmununtersuchungstechniken sind mehrere tausend Mal empfindlicher als die oben beschriebenen indirekten Tests und erlauben deshalb eine Feststellung der Schwangerschaft viel früher als den 25 bis 30 der Ovulation folgenden Tagen, die mit dem Latexteilchen-Objektträgertest und dem Hämagglutjiationstest erforderlich sind. Aber auch, wenn die Schwangerschaft nach dem 10. oder 12. der Ovulation folgende Tag mit einem 95prozentigen Zuverlässigkeitsgrad durch das Radioimmununtersuchungsverfahren festgestellt wird, haben diese Tests den Nachteil, daß sie mehr Zeit zur Ausführung erfordern, typischerweise etwa 24 bis 48 Stunden.

Der schwerwiegendste Nachteil aller bisher bekannten Schwangerschaftstesttechniken besteht jedoch in der häufigen Indikation von falschen positiven und negativen Ergebnissen. Im Fall des immunochemischen Schwangerschaftstest ist diese Schwierigkeit der nichtspezifischen Immunreaktion bezüglich der nichtspezifischen Antikörper-Antigenreaktionen zuzuschreiben. Zum Beispiel haben die Anwesenheit eines üblichen Hormons der nichtspezifischen Alpha-Untereinheit bei dem Follikel stimulierenden Hormon (FSH), luteinisierenden Hormon (LH), HCG und Thyroid stimulierenden Hormon (TSH) und den Homologen der Aminosäurereihe der hormonspezifischen Beta-Untereinheilen weitere Schwierigkeiten bei der Herstellung spezifischer Antisera zur Anwendung bei den immunochemischen Techniken verursacht. Diese Schwierigkeiten werden in Radioimmununtersuchungsverfahren infolge des hohem Fmpfindlichkeitsgrades dieser Technik verstärkt. Dieser zuletzt erwähnte Nachteil ist teilweise durch Antiscren, die für die Beta-UiHereinheii von HCG spezifisch sind, umgangen worden. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Verwendung von wertvollem Material, Immunisierung, Auswahl und Reindarstellung, um spezifische Antikörper zu erhalten und sind somit zeitraubend, teuer und sehr umständlich. Trotz dieser Maßnahmen ist das Ziel der annähernd 100%igen Zuverlässigkeit bei der Feststellung der Schwangerschaft durch Radioimmununlersuchung nicht erreicht worden.

Ferner besteht ein starker Bedarf nach Maßnahmen, um Extrauterinschwangerschaft zum frühestmöglichen Augenblick festzustellen. Solche Schwangerschaften weisen negative Hämaglutinations- oder Latex-Objektträgertests bei 40 bis 60% aller Patienten auf, selbst nach 25 bis 30 der Ovulation folgenden Tagen, die erforderlich sind, um diese Tests auszuführen. Es wird dabei angenommen, daß die immunochemischen Schwangerschaftstesltechniken nur dann für den Nachweis einer Schwangerschaft sorgen, nachdem die Implantation des befruchteten Ovariums eingetreten ist. Alle bisher bekannten Schwangerschaftstestverfahren leiden an diesem Nachteil, daß sie nicht bis nach der Nidation wirksam sind. Ein Test, welcher das Vorhandensein einer Schwangerschaft während des Zeitraums zwischen der Befruchtung des Eies und der Implantation des befruchteten Eies feststellen könnte, würde unschätzbar sein bei der Behandlung von z. B. befürchtetem Abort bei Frauen, die gewöhnlich zu früh gebähren. Fällen die künstlichen Insemination umfassen und im Zusammenhang mit neuen empfängnisverhütenden Verfahren, welche eine Schwangerschaft vor der Implantation wirksam beenden.

Das Vorhandensein spezifischer Rezeptoren für die verschiedenen Hormone ist seit langem sowohl in Menschen als auch in Tieren vermutet worden, und es wurden innerhalb der letzten 5 Jahre Erfolge hinsichtlich des Erkennens und des Studiums bestimmter dieser Rezeptoren und ihrer Wechselwirkung mit vielen entsprechenden Hormonen erzielt. Vorausgegangene Studien des Erfinders der vorliegenden Erfindung haben das Vorhandensein eines Rezeptors für HCG in dem Corpus luteum von schwangeren oder pseudo-schwangeren Rauen vorgeschlagen (Gonadotropins, Kapitel 21, 1972, John Wiley & Sons). Diese früheren Studien gaben jedoch keinen Hinweis darauf, ob ein ähnlicher Rezeptor in Menschen oder anderen Tieren vorhanden ist, ob der in Ratten gefundene Rezeptor artspezifisch oder spezifisch selbst für HCG ist, ob er ein zuverlässiger Indikator für HCG in Körperflüssigkeitsproben sein würde oder ob er stabil über einen ausgedehnten Zeitraum ist.

Prolaktin (LTH) stellt ein Hormon dar, von welchem viele Jahre nicht angenommen wurde, in Menschen vorhanden zu sein. Seine Anwesenheit in Menschen wurde in den frühen 70er Jahren bestätigt. Die Anwesenheit von LTH-Rezcptorcn in mammären Gewehe ist nachgewiesen worden, und man nimmt an, daß das Hormon eine Rolle bei ßmstkar/.inom, Hypophyseniumoren, Laktationsstörungen, Hypothyroidismus und anderen Stö-

rungen spielt. Man nimmt 84 verschiedene Funktionen von LTH an, die komplexe Wechselwirkung mit anderen Hypophyse-Gonadal- und Adrenal-Hormonen möglicherweise in der Rolle als Zwischcnregulator für diese anderen Hormone herbeiführen. Eine luteotrope sowie eine luteolytische Rolle von LTH während des Estues-Zyklus der Ratten ist ebenfalls vorgeschlagen worden, und es gibt gewisse Beweise, die in den letzten Jahren bezüglich der Untersuchungen der Ratte entwickelt worden sind. Die spezifische Bindung von LTH an das Ratten-Ovarium wurde kürzlich in der Literatur vorgeschlagen, jedoch wurde kein spezifischer Rezeptor identifiziert Turkinkton et al, Rec. Prog. Horm. Res, 29:417 (1973). Studien verschiedener Forscher haben vorgeschlagen, daß LTH geringe Funktion hinsichtlich der Beibehaltung von Corpus luteum im Menschen aufweist. Hwang et al, Proc. Mat Acad. Sei.. 68:1902 (1971); Midgley et al, Proc. iV Int. Cong. Endocrinal,

ίο Int. Cong. Series Nr. 273, Excerpta Medica, Amsterdam, 1972.

Hir.sichtlich der oben bezeichneten Krankheiten, die bekanntlich mit dem Hormon LTH verbunden sind, ist es häufig erwünscht, den LTH-Gehalt in einer Testprobe, die von einem Patient erhalten wird, z. B. einer Körperflüssigkeitsprobe, zu bestimmen und/oder zu überwachen. In einigen Fällen sind nur kleine Proben verfügbar, z. B. bei pädiatrischen Fällen, und deshalb ist es erwünscht, einen sehr spezifischen Test zu haben, weicher nur eine sehr kleine Probe und nur einen kurzen Zeitraum zur Ausführung erfordert. Spezifizität ist erwünscht, um von anderen Hormonarten zu differenzieren, welche in. der Probe vorhanden sein mögen, und dies trifft insbesondere in Fällen zu, wo es erwünscht sein mag, gleichzeitig zwei oder mehr verschiedene Hormone zu bestimmen oder zu messen. Es besteht z. Zt kein wirklich spezifisches Mittel zur Ausführung einer solchen Bestimmung.

Gegenstand des Hauptpatents Nr. 25 11 698 ist ein Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin CG), luteinisierendem Hormon (LH) oder dem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichem Material in einer wäßrigen Probe durch Inberührungbringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, vorgeschlagen, wobei das Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden, ein Plasmamembranextrakt von dem Corpus luteum einer Tierspezies ist, die einen Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine weitere Ausbildung des Verfahrens des Hauptpatents dar.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Messen des Gehaltes von LTH in einer wäßrigen Probe speziell in einer Probe von Körperflüssigkeil, das annähernd 100%ige Zuverlässigkeit bezüglich des Feststellens von Schwangerschaft zu einem sehr frühen Zeitpunkt erreicht

Ferner soll das Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von HCG oder LH und LTH in einer wäßrigen Probe, insbesondere einer sehr kleinen Probe von Körperflüssigkeit, geeignet sein.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Schwangerschaftshormonen in einer wäßrigen Probe durch Inberührungbringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, wobei das Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden, ein Plasmamcmbranextrakt von dem Corpus luteum einer Tierspezies ist, die einen Rezeptor für das zu bestimmende Hormon besitzt (nach Patentanmeldung DE-OS 25 11 698), das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Verfahren zur Bestimmung des Hormons Prolaktin (LTH) angewandt wird. Das in diesem Verfahren verwendete Anzeigesystem ist eines von jenen, die üblicherweise in ähnlichen immunochemischen Verfahren zum Bestimmen von Proteinen und/oder Polypeptiden verwendet werden. Zum Beispiel kann der Indikator ein Material sein, welches mit dem Hormon behandelt worden ist, so daß in Gegenwart des in Frage kommenden Rezeptors der Indikator sich verfärbt, gefärbt wird, agglutiniert, ausfällt oder eine andere sichtbare Anzeige (z. B. Fluoreszens) der Anwesenheit oder Abwesenheit des Hormons in der getesteten Flüssigkeit gibt. Vorzugsweise werden die genaueren radiologischen Meßtechniken verwendet.

Bei Anwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung der Schwangerschaft bei Frauen wird eine Blut- oder Urinprobe in Berührung mit dem oben beschriebenen, spezifischen Rezeptor aus einem Plasma-Membranextrakt von dem Corpus luteum einer Tierspezies gebracht, und die Anwesenheit oder Abwesenheit von LTH in der Probe wird auf Grund der Menge von Bindungen, die durch das Anzcigesystem angezeigt werden, bestimmt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die Bestimmung von LTH in

einer wäßrigen Probe, vorzugsweise dem Blutserum oder Urin eines Patienten, mit vermuteter Schwangerschaft

so vorgesehen, wobei das Mittel zum Anzeigen, ob eine spezifische Bindung des Hormons stattgefunden hat, mit einem Radioisotop markiertes Prolaktin enthält. Bei diesem Verfahren wird das in der Probe möglicherweise vorhandene LTH und der Teil des radioaktiv markierten LTH an den Rezeptor gebunden. Der Rezeptor mit seinem gebundenen LTH wird dann von der wäßrigen Probe getrennt, und die Radioaktivität einer oder beider der abgeschiedenen Fraktionen wird gemessen, um die Konzentration von LTH in der wäßrigen Probe zu bestimmen, wobei diese Konzentration eine Funktion der gemessenen Radioaktivität ist

Vorzugsweise ist das markierte Prolaktin mit einem Isotop aus der Gruppe von ¹²⁵J, "¹J, ¹H und ¹⁴C markiert Es wird bevorzugt, den Rezeptor von dem Corpus luteum einer Kuh, eines Schafes, eines Pferdes, oder eines Hausschweines zu erhalten, insbesondere von einem Tier, welches schwanger ist und am bevorzugtesten einem Tier, während des ersten Vierteljahres der Schwangerschaft

bo Das Verfahren kann als eine Anzeige von Schwangerschaft bei einer Frau oder zum Anzeigen anderer Störungen, die das Vorhandensein von Prolaktin einschließen, angewendet werden.

Gemäß der Erfindung ist auch ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung zweier oder mehrerer verschiedener Hormone vorgesehen, die in einer einzigen wäßrig"n Probe enthalten sind.

In dieser Ausführungsforni sind die Vorgänge jenen zur Messung einzelner Hormone, ausgenommen, daß die

fe5 wäßrige Probe mit einem oder mehreren Mitteln in Berührung gebracht wird, die in der Lage sind, jedes der zu bestimmenden Hormone selektiv zu binden, wobei gesonderte und unterscheidbare Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung für jedes Hormon stattgefunden hat, vorgesehen sind und jeder Indikator zur Bestimmung der Anwesenheit jedes Hormons beobachtet wird. Das Bindemittel ist ein Plasmamembrancxtrakt eines Körperor-

gans einer Spezies, von der bekannt ist, in dem Organ einen spezifischen Rezeptor für jedes der zu messenden Hormonsc zu besitzen. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Plasmamembranextrakt des Corpus luteum eines Säugetieres, welches Rez.eptorstellen sowohl für HCG als auch I.TH besitzt. Das bevorzugte Anzeigemittel enthält verschiedene radioaktive Isotope, z. B. verschiedene Isotope von )od, beispielsweise ¹²⁵1.^1JIJ, ^SH und ¹⁴C. Mit einem derartigen Indikator können HCG und LTH durch Inbcrührungbringen des Rezeptors mit der Probe und unterschiedlich markiertem HCG und LTH, so daß ein Teil der markierten und nicht markierten Hormone an den Rezeptor gebunden werden. Abtrennung des gebundenen und nichtgebundenen Hormons von der Probe und Zählen der Radioaktivität jeder Isotopenart, um die Anwesenheit der jeweiligen Hormone im Verhältnis zu dergemessenenen Radioaktivität zu bestimmen, gleichzeitig gemessen werden.

Das in Frage kommende Testverfahren ist auch für die Bestimmung der Schwangerschaft bei Tieren geeignet. Es kann demgemäß verwendet werden, um Schwangerschaft bei jeglicher Tierspezies festzustellen, worin der spezifische Rezeptor der Erfindung gefunden wird. d. h. Säugetiere und möglicherweise ausgewählte Nichtsäugetiere.

Eine Ausführungsform der Erfindung umfaßt für die Bestimmung von Prolaktin (LTH) in einer wäßrigen Probe die Verwendung

(a) eines ersten Reagenzes und eines zweiten Reagenzes; wobei

(b) das erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion des Plasmamembranextraktes von dem Corpus luteum einer Spezies enthält, die den Rezeptor für Prolaktin aufweist, der in der Lage ist, biologisch aktives Prolaktin selektiv zu binden;

(c) das zweite Reagenz markiertes Prolaktin enthält, das in der Lage ist, Strahlung abzugeben, und das erste Reagenz dazu bestimmt ist, mit der Probe in Berührung gebracht zu werden, die das zu messende Hormon enthält, und das zweite Reagenz dazu, um einen Teil des markierten und nichtmarkierten Hormons an dem Rezeptor zu binden;

(d) der Betrag des markierten Hormons, das an den Rezeptor gebunden ist, gemessen wird, wobei die davon abgegebene Strahlung eine Funktion der Konzentration des Hormons in der wäßrigen Probe ist.

Schließlich umfaßt eine andere Ausführungsform der Erfindung für die Bestimmung einer Anzahl von Hormonen in einer wäßrigen Probe

(a) die Verwendung eines ersten Reagenzes und eine Anzahl zweiter Reagenzien, gleich der Anzahl zu bestimmender Hormone; wobei

(b) das erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion des Plasmamembranextraktes eines Körperorgans einer Spezies enthält, die den spezifischen Rezeptor in dem Organ aufweist, um jedes Hormon in biologisch aktiver Form selektiv zu binden;

(c) die zweiten Reagenzien jedes der zu bestimmenden Hormone in einer markierten Form enthält, die in der Lage ist, Strahlung abzugeben, und die abgegebene Strahlung verschieden für jedes markierte Hormon ist, wobei das erste Reagenz dazu bestimmt ist, mit der Probe in Berührung gebracht zu werden, die das zu messende Hormon enthält, und die zweiten Reagenzien dazu, um einen Teil der markierten und nichtmarkierten Hormone an den Rezeptor zu binden;

(d) der Betrag der markierten Hormone, die an den Rezeptor gebunden sind, gemessen wird, wobei die von jedem markierten Hormon abgegebene Strahlung eine Funktion der Konzentration des jeweiligen Hormons in der wäßrigen Probe ist. In dieser Ausführungsform ist das erste Reagenz vorzugsweise der Plasmamcmbranextrakt eines Säugetieres, und die zweiten Reagenzien enthalten HCG und LTH, die mit verschiedenen Isotopen markiert sind.

Gemäß der Erfindung wird ein neues sehr spezifisches Verfahren zur Bestimmung von HCG und/oder LTH angegeben. Im Widerspruch zu früheren biologischen Tests auf HCG, welche sich als sehr unpraktisch erwiesen haben und jüngst entwickelter immunochemischer Tests, welche auf dem Prinzip von Antigen-Antikörperbindung beruhen, aber nicht ausreichend zuverlässig sind, basiert das vorliegende Verfahren auf der Verwendung eines hochselektiven Rezeptors für HCG. Der Rezeptor wird von dem Gewebe eines geeigneten Tieres isoliert, wohingegen im Faii von immunochemischcn Verfahren ein AniiSci'ufn aus dem Blut eines geeigneten Tieres hergestellt wird, welchem das Hormon injiziert worden ist, um Antigen-Antikörper-Reaktion zu erzeugen.

Vor der vorliegenden Erfindung hat es keinen anerkannten Grund z.ur Bestimmung von LTH bei Menschen gegeben, und somit keine Entwicklung geignetcr Verfahren. Die Erfindung basiert auf der Feststellung eines spezifischen Rezeptors für dieses Hormon. Die Verwendung eines spezifischen Rezeptors, der aus dem Zellgewebe eines Tieres stammt, welches diesen spezifischen Rezeptor besitzt, überwindet offensichtlich vollständig den Nachteil der nichtspezifischen Reaktionen, welche häufig im Zusammenhang mit immunochemischen Verfahren auftreten. In den meisten Fällen benötigt die spezifische Rezeptorbindung die natürliche Konfiguration eines Hormons in seiner biologisch aktiven Form. Wenn demgemäß der rezeptor-chemische Testvorgang mit den Anzeigetechniken der Strahlenuntersuchung kombiniert wird, ergibt sich ein Radiorezeptor-Untersu- ω chungsverfahren, welches den Empfindlichkeitsgrad der Radioimmununtersuchungstechniken besitzt, und gleichzeitig den Grad der Spezifizität des Tierexperiments, und deshalb zeigt dieses Verfahren größere Genauigkeit gegenüber allen bestehenden immunologischen und biologischen Hormontests, insbesondere Tests auf Schwangerschaft

Weil ferner der Rezeptor die biologisch aktive Form des Hormons zur Bindung benötigt, würde die endogene Synthese eines durch den Stoffwechsel geschädigten HCG, welches normalerweise eine positive Reaktion gemäß dem immunochemischen Testverfahren geben würde, das jedoch nicht in der Lage ist, bestehende Schwangerschaft durchzuhalten, keinen Auslaß zu einem falschen positiven Test nach dem Testverfahren der

Erfindung geben.

Es wurde bereits angenommen, daß das Hormon Prolaktin eine Funktion im Östrus-Cyclus der Ratte hat, jedoch wurde gleichzeitig nicht festgestellt, daß es eine Rolle bei den ovaricllen oder reproduktiven Vorgängen der Menschen hat. Als Grundlage der Erfindung wurde festgestellt, daß eine Zunahme im LTH-Niveau bei der ϊ Frau während der Schwangerschaft besteht. Ferner wurde festgestellt, daß ovaricllcs Gewebe verschiedener Spezies einschließlich der Kuh und des Menschen spezifische Re/.cptorstcllen für das Hormon LTH außer Rezeptorstellen für HCG enthält.

Somit ist es außer dem allgemeinen anwendbaren Verfahren zur Bestimmung von LTH im Zusammenhang mit den verschiedenen oben erwähnten Krankheiten auch möglich, das Verfahren der Erfindung zur Bestimmung oder vorzugsweise zur Unterstützung der Bestimmung der Schwangerschaft einzusetzen. Eine festgestellte Zunahme im LTH-Pegel bei einer Frau, deren Schwangerschaft vermutet wird, ergibt eine weitere Indikation zusammen mit der Bestimmung von HCG gemäß der Erfindung, daß Schwangerschaft tatsächlich besteht. Dieser zusätzliche Grad der Bestätigung ist von großem Wert, insbesondere in Fällen, von abnormaler Schwangerschaft oder drohendem Abort. Es wird angenommen, daß LTH eine wichtige Rollein der fötalen Entwicklung spielt, und demgemäß liefert seine Bestimmung weitere Information zu der durch Bestimmung von HCG erhaltenen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, gleichzeitig sowohl HCG als auch LTH zu bestimmen, da festgestellt worden ist, daß derselbe Rezeptor Rezcptorstellcn für diese beiden Hormone besitzt. Dies ist besonders unerwartet hinsichtlich der Tatsache, daß Rczcptorstcllen für LTH in dem Corpus luteum eines Tieres bisher nicht bestätigt worden sind, und Rezeptorstellen für HCG nur in der Ratte nachgewiesen worden sind. Die gleichzeitige Ermittlung weist offensichtliche Vorteile bei der Schwangerschaftsuntersuchung hinsichtlich der oben angebenen Rolle von LTH bei der Schwangerschaft auf. Eine einzige Körperflüssigkeitsprobe und ein einziges Testverfahren ergeben die vollständigste und genaucstc Indikation von Schwangerschaft.

Diese gleichzeitige Bestimmungstechnik ist nicht auf die Hormone HCG und LTH begrenzt. Zum Beispiel ist bekannt, daß das mammäre Gewebe Rezeplorstellen für mehr als ein Hormon enthält, /.. B. östrogen, Prolaktin und Oxidocin, und deshalb ist die Technik der Erfindung in gleicher Weise anwendbar auf die gleichzeitigen Bestimmungen dieser Hormone unter Verwendung eines Rezeptors, der von Brustgewebe erhalten wird.

Gemäß der Erfindung ermöglicht die Radiorezeptor-Untersuchungstechnik die Erkennung der Schwangerschaft schon nach einer der Ovulation folgenden Woche. Dies stellt in der Tat einen bedeutsamen Fortschritt auf dem Gebiet der Schwangerschaftserkennungstests dar, da bisher der Schwangerschafts/.ustand nicht vor dem 10 bis 12. der Ovulation folgenden Tag nachgewiesen werden konnte. Dies Ergebnis ist umso bedeutender, wenn man weiß, daß die große Vielzahl von Schwangerschaftstests heute nicht durch das Radioimmununtersuchungsverfahren ausgeführt wird, welche die Bestimmung frühestens 10 oder 12 Tage nach der Ovuiation erlaubt, sondern eher mittels der Hämagglutinations- oder Latexobjektträgertests, welche eine Bestimmung der Schwangerschaft erst nach etwa 25 bis 30 der Ovulation folgenden Tagen erlauben. Radioimmumuntersuchungstests erfordern wenigstens 24 Stunden Laboratoriumszeit, und typischerweise etwa 48 Stunden Testzeit, verbunden mit beschwerlichen und teuren Maßnahmen zur Herstellung ausreichend spezifischer Antikörper oder Antisera. Andererseits beträgt die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testvorgangs erforderliche Zeit nicht mehr als etwa 1 Stunde und typischerweise nur etwa 'Λ Stunde. Die praktischen Vorteile eines derartigen Schwangerschaftstestverfahrens, das die Feststellung der Schwangerschaft vor der Implantation des befruchteten Eies in das endometriale Gebe erlaubt, sind bereits eingangs erwähnt.

Die bisher entwickelten Anzeigemechanismen können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Demgemäß kann das Anzeigesystem aus einem Indikatormaterial bestehen, welches mit dem Hormon behandelt worden ist. so daß in Gegenwart des Rezeptors das Indikatormaterial sich verfärbt, gefärbt wird, agglutiniert, ausfällt oder eine andere sichtbare oder chemische Indikation der Anwesenheit oder Abwesenheit des Hormons in der wäßrigen Probe oder der getesteten Körperflüssigkeit ergibt. Die wirksamsten Ergebnisse werden jedoch durch Verwendung einer radiologischen Untcrsuchungstcchnik als Anzeigesystem erhalten. Die Radiorezeptoruntersuchungsausführungsform der Erfindung stellt eindeutig die bevorzugteste % Ausführungsform dar.

Angesichts des extremen Grades der Spezifizilät und Empfindlichkeit des Radiorezeptoruntersuchungsverfahrens der Erfindung ist es möglich, eine zufriedenstellende Bestimmung mit einer extrem kleinen Probe auszuführen. Beispielsweise ist es bei der Anwendung des Verfahrens der Erfindung als Test auf Schwangerschaft möglich, den Test unter Verwendung von nur etwa 0,1 ml oder weniger des von dem Patienten entnommenen Blutes zu verwenden. Diese Entnahme von dem Patienten kann mittels eines einfachen Nadelstiches in die Fingerspitze ausgeführt werden.

Der in dem Testvorgang gemäß vorliegender Erfindung verwendete spezifische Rezeptor wird von ovariellem Gewebe erhalten. Wie oben dargelegt, ist der Rezeptor bedeutend selektiver für LTH als ein LTH-Antikörper, da der Rezeptor die ursprüngliche Konfiguration des Hormons in seiner biologisch aktiven Form zur Bindung bo benötigt. Folglich gibt es keine Möglichkeit der nichtspezifischen Immunreaktion. Bei allen Tieren, welche diesen spezifischen Rezeptor besitzen, ist er leicht in dem ovariellen Gewebe erkennbar, welches das Zielgewebe des Hormons darstellt. Während der Rezeptor von einem Säugetier isoliert werden kann, und möglicherweise von bestimmten Nichisäugetrieren, wird der Rezeptor vorzugsweise von den Ovaricn verhältnismäßig großer Tiere erhalten, wie beispielsweise Kühe. Schafe. Schweine, Pferde und dergleichen, da diese Tiere eine proporh5 tionell größere Menge an ovariellen Geweben aufweisen, und ferner eine leichte Verfügbarkeit eines solchen Gewebes besteht, da diese Tiere für deren Fleisch kommerziell geschlachtet werden. Es wurde festgestellt, daß bis zu 200 Schwangerschaftstests von einem einzigen Kuhovarium ausgeführt werden können. Vorzugsweise ist das Tier, von welchem der Rezeptor erhallen wird, zum Zeitpunkt des Schlachtens in einem

schwangeren Zustand, da dann die Menge des ovariellen Gewebes und die Anzahl von Rezeptorstellen maximal ist. Das erste Quartal der Schwangerschaft hat sich als die vorteilhafteste Zeit zum Erhalt des Gewebes erwiesen.

Der spezifische Rezeptor der Erfindung wird durch Abtrennen von reinen Plasmamembranen aus dem ovariellen Gewebe erhalten, worauf die Bewertung der verschiedenen Plasmamembranfraktionen durch Testen gegen mit Isotopen markiertes LTH und Auswahl der Fraktion mit der größten Bindung für das Hormon folgt. Der Rezeptor ist äußerst stabil und kann für lange Zeiträume gespeichert werden oder wird sogar in einem zweiten oder anschließenden Testverfahren wiederverwendet. Der Plasmamembranrezeptor ist nach Lyophilisation für Schwangerschaftstests stabil. Das genaue Verfahren zum Erhalten des Rezeptors wird im folgenden ausführlicher beschrieben.

Da das Testverfahren der Erfindung nicht artspezifisch ist, kann es auch verwendet werden, um Schwangerschaft bei einem der Tiere zu ermitteln, von welchem festgestellt worden ist, daß sie den spezifischen Rezeptor der Erfindung zu besitzen. Der Vorteil besteht darin, daß übliche Laboratoriumstesttiere, wie beispielsweise Affen, Hunde, Kaninchen, Mäuse etc. durch dieses Verfahren getestet werden können, wohingegen gesonderte Antikörper für jedes Tier gemäß den immunochemischen Testverfahren benötigt werden.

Die Markierung von LTH mit einem radioaktiven Isotop kann auf übliche Weise mit einem geeigneten Isotop, das für diesen Zweck gewählt wird, z.B. ^1JI), ¹⁴C, Ή und dergleichen ausgeführt werden. Ein besonders geeignetes Isotop ist ein radioaktives Isotop von Jod, wie beispielsweise ¹²⁵J, da das Markieren mit diesem Isotop verhältnismäßig einfach ist und viele Laboratorien die notwendige Ausrüstung zur Messung dieses Isotops besitzen.

In dem Fall der gleichzeitigen Hormonbestimmung durch die Rezeptoruntersuchungstechnik der Erfindung ist es notwendig, jedes zu bestimmende Hormon mit einem unterscheidbaren Isotop zu markieren, so daß die Messung der gebundenen und/oder nichtgebundenen Hormonfraktionen eine getrennte Anzeige für jedes zu bestimmende Hormon ergibt. Wenn z. B. eine gleichzeitige Bestimmung von HCG und LTH ausgeführt wird, können gereinigte Proben dieser zwei Hormone mit ¹²⁵J bzw. ^U'J markiert werden, und leicht verfügbare Zählvorrichtungen können dann verwendet werden, um jedes Isotop getrennt zu zählen.

Im folgenden werden zur Erläuterung der Erfindung anhand von Beispielen verschiedene spezifische Verfahren zum Herstellen der Testreagenzien und zur Anwendung der Radiorezeptoruntersuchung angegeben.

I. Radioisotope Markierungen der Hormone

HLTH wurde durch das Verfahren von Hunter and Grennwood mit kleineren Modifikationen jodiert: Zu 50 μΐ 0,5 m-Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 wurden 1 mCi Na ¹²⁵J (New England Nuclear, Boston Massachusetts), 5 μg HLTH und 70 μ% Chloramin-T, zugesetzt, worauf nach 15 Sekunden Natrium-metabisulfit folgte. Einhundert mg Iobeads (Hycel Reagents, Houston, Texas) wurden dem unbearbeiteten jodierten Gemisch zugesetzt, um nichtreagiertes ¹²⁵J zu adsorbieren. HLTH wurde auch enzymatisch durch Lactoperoxidase jodiert. Die Reinigung erfolgt durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-100-Säule (0,7 · 18 cm) Die spezifische Aktivität und Reinheit des markierten LTH wurde durch Chromatoelektrophorese bestimmt. ¹²⁵J HLTH, das in der Lage ist, mammäres Gewebe von milchgebenden Ratten spezifisch zu binden, wurde für die Bindestudien mit partiell gereinigten ovariellem Homogenisat verwendet.

II. Herstellendes Rezeptors

Alle Maßnahmen bei der Herstellung von Plasmamembranen wurden in einem Eisbad oder bei 4°C ausgeführt. Frische Rinderovarien von zeitiger Schwangerschaft (1. Quartal, Fötuslänge vom Kopf bis Steiß bis zu 22 cm) wurden von einem Schlachthaus erhalten und in flüssigem Stickstoff bis zur Verarbeitung gelagert. In einem typischen Experiment wurden 100 g Gewebe von etwa 25 großen Corpora lutea mit einer scharfen Stahlklinge, in kleine Stücke geschnitten und in 500 ml 10 mM-Tris-HCL · Puffer mit einem pH-Wert von 7,8 gemahlen, der 1 mM MgCIj, 1 mM Dithiotreit, 10 000 I. U.Trasylol pro Liter und 0,25 m-Saccharose enthielt. Das Homogenisat wurde durch zwei Schichten Käsetuch filtriert, und die größeren Partikel wurden in 500 ml des Puffers wiederverarbeitet. Das Gewebe wurde weiter durch 10 bis 15 Hübe in einem Teflon-GIas-Homogenisiergerät. Typ C mit Zwischenraumgröße von 0.12 bis 0.17 mm. bei 4° C homogenisiert Das Homogenisat wurde bei 650 g für 20 Minuten in einer gekühlten Sorwallzentrifuge zentrifugiert, um intakte Zellen, Zellbruch und Kerne zu entfernen. Die bei 650 g überstehende Flüssigkeit wurde in derselben Zentrifuge 20 Minuten bei 13 000 g erneut zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde diesmal weggeschüttet und die Kügelchen wurden mit Hilfe des Teflon-Glas-Homogenisiergeräts in 50 bis 70 ml Tris-HCl · Puffer erneut suspendiert Diese Suspension wurde in den Kern eines Zonenrotors eingespritzt, der bei 3000 U/min lief und 500 ml eines linearen Saccharose-Gradienten aus 30% (w/v) bis 50% (w/v) Saccharose und 120 ml Kissen von 50% (w/v) Saccharose (Pumpquote 20 ml/min) enthielt Eine Abdeckung von 20 ml wurde nach der Probe eingespritzt Nach 2 Stunden Zentrifugieren bei 45 000 U/min wurde die Zentrifuge abgebremst und der Rotorinhalt mit 55% Saccharose bei 20 ml/min ersetzt Die Plasmamembranen wurden von dem Rotor in der Reihenfolge der zunehmenden Partikelgröße abgenommen und Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt und unverzüglich gefroren, bis sie auf Bindung und enzymatische Aktivität untersucht wurden. Die Membranen wurden während dreier Monate ohne sichtbaren Verlust der Bindefähigkeit gefroren gehalten. Eine Teilmenge der Fraktionen wurde zur Elektronenmikroskopie vor dem Gefrieren genommen. Die in der Suspension enthaltene Saccharose störte nicht die Bindung des markierten Hormons.

Teilmengen von ovariellem Homogenisat und geeignete Teilmengen von verschiedenen aus dem kontinuierlichen Saccharose-Dichtegradienten erhaltenen Fraktionen wurden in 1 m-NaOH, das 0,1 % Natriumdodecylsulfat enthielt, gelöst, um den Proteingehalt durch das Verfahren von Lowry (J. Biol. Chem, Band 193, Seite 265,

1951) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Norm zu bestimmen. Teilmengen der verschiedenen Fraktionen wurden auch kombiniert mit LTH, das mit ]¹²⁵ markiert war, und der Grad der Bindung wurde in jedem Fall gemessen. Auf der Basis der Proteinkonzentration zeigten die Plasmamembranen, die den spezifischen Rezeptor für das markierte LTH enthielten, eine lOfach größere Bindung als das unbearbeitete, ovarielle Homogenisat.

Jede Fraktion wurde auch auf Verunreinigung durch Untersuchung ihrer enzymaiischen Aktivität analysiert. Jede Fraktion wurde auf 5' Nucleodiase-Aktivität durch das Verfahren von Song et al (J. Biol. Chem., Band 262, Seite 694,1967) untersucht, und das freisgesetzte anorganische Phosphat wurde durch das Verfahren von Fiske et al (J. Biol. Chem., Band 66, Seite 375,1925) gemessen. CytochromC-Reduciase wurde nach dem Verfahren von

:o Cooperstein et al (J. Biol. Chem., Band 189, Seite 665,1951) untersucht.

Als weitere Nachprüfung bezüglich der Reinheit der Plasmamembranen wurden die einzelnen Fraktionen der Elektronenmikroskopie unterzogen. Eine Teilmenge jeder Proteinfraktion wurde 24 Stunden in 6,25% Glutaraldehyd in 0,067 m-Kakodylat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,3 gemischt. Die Proben wurden 5 Minuten in gekühltem 0,25 m-Kakodylat- oder Phosphatpuffer gewaschen, der 1% OsO^ mit einem pH-Wert von 7,3 für 2 Stunden enthielt. Abschließend wurden alle Proben durch Fließenlassen durch eine gestufte Reihe von Alkohol und eingebettet entweder in Epon oder Araidit dehydriert. Abschnitte von 0,06 bis 0,09 μπι wurden geschnitten und in einer 4%igen wäßrigen Uranylacetatlösung gefärbt und durch ein Elektronenmikrsokop photographiert.

Eine Fraktion, die die höchste Bindung mit dem markierten Hormon zeigte, eine niedrige Enzymaktivität

aufwies und reine Plasmamembranen enthielt, wie durch Elektronenmikroskopie gezeigt, wurde bei einer Saccharosedichte von 1,16 (ca. 35% w/v), eluiert. Geeignete Teilmengen dieser Fraktion wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und als Rezeptor verwendet.

III. Verfahren der Radiore/.eptoruntersuchung

Die Radiorezeptoruntersuchung wurde in zehn 75 ml Polystyrolrohren gemäß dem in Tabelle I angegebenen Protokoll zur gleichzeitigen Radiorezeptoruntersuchung von hLTH und hCG ausgeführt.

Tabelle I

') Doppelte Verdünnung, beginnend bei 100 ng in 100 1. ausgeführt in Inkubationspiiffcr.

^:) Etwa 100 g Protein von Plasmamembranen isoliert aus den Corpora lutca von schwangeren Kühen.

³) '²⁵J-hLTH (60-70 000 cpm/Rohr und ¹³¹ J-hCG (25-10 000 cpm/Rohr ausgeführt in Inkubationspuffcr.

⁴) Plasma aus vollständig hypophysektormisierten Versuchstieren, die nichi feststellbare Mengen an hLTH und hLH in jeweiligen Radioitnmununtersuchungen zeigen.

⁵) Inkubationspuffer·. 10 mM-Trispuffer, pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an I mM-MgCh. CaCIi. 0.1 % (w/V) BAS und 50 IU Trasylol.

Die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 37°C in einer Wasserbad-Schüttelvorrichtung ausgeführt. Ein ml gekühltes Verdünnungsmittel wurde dann jedem Rohr zugesetzt. Die Inhalte der Rohre wurden in einem Wirbelmischgerät gemischt und 20 Minuten lang bei 3000 g in einer gekühlten Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und die Kügelchen in einem Autogamma-Zähler mit einem Wirkungsgrad von 51% für J¹²⁵ gezählt. Die Standardkurven und die hormonelle Konzentration in den Plasmaproben wurde durch einen parallel arbeitenden IBM-Computer unter Verwendung von Logit-Iog-Umsetzungen berechnet

Die Plasmaprobe einer schwangeren Frau zeigte eine Dosenansprechreaktion, identisch zum HCG-Standard, was die Zuverlässigkeit der Untersuchung bestätigt Es bestand ein vollständiger Mangel an Querreaktion mit hochgereinigten Präparaten von FSH, LTH und HPL als auch Plasma von hypothyroiden Patienten, Akromegalen und Frauen während postpartualer Laktation, um dadurch eine hohe Spezifizitäl der Radiorezeptoruntersuchung anzuzeigen. Die Radiorezeptoruntersuchung unterschied nicht zwischen HCG und LH; jedoch hat eine Radioimmununtersuchung, die J¹²⁵ markiertes FSH und LH und HCG und Antikörper zu ihrem hormonspezifischen Beta-Untereinheiten verwendet, gezeigt daß es während der frühen Schwangerschaft keinen Anstieg in den Plasmapegeln von LH und FSH gibt Somit beeinträchtigt der Mangel an Unterscheidung zwischen HCG und LH nicht die Bestimmung der Schwangerschaft, wenn die Radiorezeptoruntersuchung verwendet wird.

Nicht markiertes Hormon¹)	hCG	Plasma-	markiertes	Hormon³)	Kontroll
hLTH	100 μΙ⁵)	Membranen²)	¹²⁵J-IiLTH	'"l-hCG	plasma⁴)
100 μΐ⁵)	0,2	100 μΐ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΙ
100,0	0,4	100μ1	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	όϋμΐ
50,0	0.8	100μ1	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΐ
25,0	1.6	100 μΐ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΙ
25,5	3,2	100 μΐ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΐ
6,3	6,3	100 μΐ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΐ
3,2	12,5	100 μΐ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΐ
1,6	25,0	100 μΐ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΙ
0,8	50,0	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΙ
0,4	100,0	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	ΙΟΟμΙ	50 μΐ
0,2	100 μΙ	ΙΟΟμΙ	100 μΐ	50 μΙ

25 48 86S ί:

Bindung von ^|ir>|-hLTH an ovaricllcs Homogenisai

Ein Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 100 μΙ lnkubationspuffer, der 10 IU Trasylol, 50 μΐ Rezeptorpräpa- '

rat äquivalent zu 1 —300 μg Protein und 100 μΐ ^l25J-hLTH (SA; 50—70 u,Ci^g) enthielt, wurde bei 37°C 2 Stun- fi?

den in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 μg nichtmarkierlcm Rinder-LTH inkubiert Am Ende der Inkuba- 5 'v

tion wurde 1 ml eiskalter Puffer zu allen Rohren zugesetzt, und die Rohre wurden bei 5000 U/min 20 Minuten ;

zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt. Die die rezeptorgebundenen Hormone enthalten- j*.

den Kügelchen wurden in einem Autogammazähler zu einem Wirkungsgrad für ¹²⁵J von 51% gezählt. Die |i

spezifische Bindung wurde als Unterschied der Bindung in den Rohren mit und ohne nichtmarkiertern LTH ψ

berechnet io nj

Die spezifische Bindung von ¹²⁵J-IiLTH an Plasmamembrane von Rinder Corpora lutea war ein Sättigungs- ij

prozeß. Die Sättigung wurde durch Inkubation von Plasmamembrane von Rinder-Corpora lutea (150 μg Pro- 1

tein) bei 37^CC für 2 Stunden in 250 μΐ Volumen mit variierenden Konzentrationen von ¹²⁵J-IiLTH nachgewiesen. |

Die Bindungskapazität/mg Protein und Kd, berechnet durch Scatchard-Analyse von Daten, die aus der Sätti- |

gungskurve erhalten wurden, betragen 15 ?

1,4 ■ IO-¹³ mund Kd = 1,4 ■ 10"¹². '

Die spezifische Bindung von ¹²⁵J-hLTH an ovarielle Homogenisa te nahm zu als Funktion der Menge an P

zugesetzten Homogenisaten und wurde durch den Zusatz von 1 μg nichtmarkiertem Rinder-LTH zu den 20 .J.j

Inkubationsgemischen verhindert. Unter Verwendung von 100 μg Homogenisat wurden etwa 20 bis 30% des if*

¹²⁵J-IiLTH in Abwesenheit von nichimarkiertem LTH gebunden. I;

Bei 37°C war die Bindung während der ersten 30 Minuten schnell, danach 1 ihm die Bindung langsam zu, um M

bei 2 Stunden ein Gleichgewicht zu erreichen. Bei 0°C wurde geringe Bindung beobachtet, selbst nach 18stündi- ^

ger Inkubation. 25 4

Um die Spezifität der ^l25J-hLTH-Bindung an ovarielle Homogenisate zu demonstrieren, wurden menschliches χ

Wachstumshormon (hGH), menschliches FoUikel-stimulierendes Hormon (hFSH), menschliches luteinisierendes _:i

Hormon (hLH), Rinderprolaktin (bLTH), Ovinprolaktin (oLTH) und menschliches Chorionsamatomammotropin 2

(hCS) bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Keine Verschiebung von an Rezeptorprotein gebundenen |

^12äJ-hLTH wurde durch hFSH und hLH beobachtet. hCS und hGH waren in der Lage, Rezeptor-gebundenes 30 ;

¹²⁵J-MTH zu verschieben, jedoch betrug die Potenz des hGH-Präparats hinsichtlich der Verschiebung von
Rezeptor-gebundenem ¹²⁵J-hLTH annähernd 0,5 bis 1% von hLTH. Rinder- und Ovin-LTH-Präparate zeigen im
wesentlichen ähnliche Potenz hinsichtlich der kompetitiven Wirkung mit '"J-hLTH. Ein Mangel an kompetitiver
Wirkung durch FSH und LTH für die Rezeptorbindung demonstriert die LTH Spezifität für die Rezeptorstelle
hCS, welche sowohl strukturelle als auch biologische Ähnlichkeiten zu LTH aufweist, und zeigte gewisse 35
Querreaktion; jedoch ist die mit dem hGH-Präparat beobachtete Querreaktionsfähigkeit von 0,5 bis 1 % mit der
berichteten Verunreinigung von hGH zu einem sehr ähnlichen Grad übereinstimmend.

Die erfindungsgemäß aufgrund der Radiorezeptoruntersuchung von LTH durchgeführte Schwangerschaftsbestimmung hatte nahezu 100%ige Zuverlässigkeit, um Schwangerschaft nach dem ersten fehlenden Zyklus
festzustellen. Dieser innerhalb 1 Stunde ausgeführte Test ist ideal geeignet für die klinische Feststellung ektopi- 40 ';

scher Schwangerschaft, speziell bei Patienten, die unverzüglichen chirurgischen Eingriff benötigen. Patienten
mit befürchteter ektopischer Schwangerschaft wurden durch Radiorezeptoruntersuchung ausgewertet. Die
Ergebnisse der Untersuchung wurden anschließend mit jenen von Hämagglutinations-Schwangerschaftstests,
klinischen Symptonen und pathologischen Feststellungen verglichen. Alle Patienten wurden durch die Radiorezeptoruntersuchung genau diagnostiziert, selbst wenn Hämagglutinations-Tests falsche Schwangerschaftsanzei- 45
gen ergaben.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Schwangerschaftshormonen in einer wäßrigen Probe durch Inberührungbringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, wobei das Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden, ein Plasmamembranextrakt von dem Corpus luteum einer Tierspezies ist, die einen Rezeptor für das zu bestimmende Hormon besitzt (nach Patent 25 11 698). dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Bestimmung des Hormons Prolaktin (LTH) angewandt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung ίο stattgefunden hat, mit einem Radioisotop markiertes Prolaktin enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Prolaktin mit einem Isotop aus der Gruppe von ¹²⁵J,'^Jl J, ³H und ¹⁴C markiert ist

4. Verfahren nach Anspruch 1 zur gleichzeitigen Bestimmung einer Anzahl von Hormonen in einer einzigen wäßrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel, das verwendet wird, in der Lage ist, mehrere Hormone in der Probe spezifisch zu binden, und daß für jedes zu bestimmende Hormon ein gesondertes Anzeige-Mittel vorgesehen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß menschliches Choriongonadotropin (HCG) und Prolaktin (LTH) bestimmt werden, wobei als Bindemittel ein Plasmamembranextrakt von dem Corpus luteum einer Spezies, die den Rezeptor für HCG und LTH bcsiizt, verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigemittel radioisotopisch markiertes

HCG und LTH mi', zwei verschiedenen Isotopen von Jod verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Isotope ¹²⁵J und ' ¹¹J verwendet werden.