NO753203L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en metode og anordning for bestemmelsen av hormonene humant korionisk gonadotropin (HCG), luteiniserende hormon (LH) og prolaktin (PRL) og særskilt en fundamental ny metode og anordning for bestemmelse av gravi-

ditet hos kvinner.

Prover for bestemmelse av graviditet er generelt basert på bestemmelsen av hormoner som fremstilles av den voksende placenta, slik som gonadotropiske hormoner lignende dem som fremstilles av den forreste hypofyselappkjertelen og steroide hormoner som ligner dem fra eggstokk og binyrekjertelen. Graviditetstester som brukes i dagner nesten utelukkende basert på en prove av det placentale hormonet, humant korionisk gonadotropin (HCG). Dette hormonet finnes i kroppsvæskene (blodserum og urin)

bare under graviditet med unntagelsen av flere andre meget sjeldne hormonproduserende tilstander i kroppen. Den inter-nasjonale enheten (I.U.) for HCG ble antatt i 1938 og er definert som den spesifikke gonadotropiske aktiviteten for 0,1 mg av en tbrket standard som oppbevares i National Institutes of Health, London, England.

De forste graviditetstestene var basert på biologiske in vivo-metoder for bestemmelsen av nærværet avHCG..F.eks., den forste testen, Aschheim-Zondek-testen var basert på evnen av HCG injisert subkutant .i mus til produksjon av corpora lutea. Friedman-testen er en annen biologisk test, hvori en urin-

prbve, fra mistenkt graviditet injiseres i brevenen hos en voksen hunkanin som har vært isolert 3-4 uker, og 48 timer etter injeksjonen undersbkes ovariene med hensyn til brukne blodningsfollikler som indikerer en positiv reaksjon. En mindre kjent test utviklet av Kupperman. i 1943 innebærer

I

I

injeksjonen av pasientens urin i en hun-rotte med etterfolgende jinspeksjon av ovariet etter tegn på hyperemi. Skjbnt de 2 ' timene som er nodvendig for å gjennomfbre denne testen^er betraktelig kortere enn de 48 timene som trengs for Friedman-testen og de nesten 5 dagene som trengs for Aschheim-Zondek-testen, er testen ikke så pålitelig^da det trengs en bvet fag-mann for å differensiere en lyserbd negativ eggstokk fra en rod positiv eggstokk for å oppnå en hby nbyaktighetsgrad. En test utviklet av Galli og Mainini i de sene 1940 årene trenger også bare tilnærmet 2 timer for gjennomfbring av testen^imidlertid innbefatter denne testen injeksjon av pasientens urin i frosker med etterfolgende observasjon for utstbtning av sperm, og disse dyrene er relativt ubmfintlige sammenlignet med kaniner, mus og rotter.

Alle de foregående biologiske testene lider av alvorlige ulemper, innbegrepet tilgjenglighet av dyr, nødvendigheten av å holde en stor dyrekoloni; og relativt lange testperioder, hyppig forekomst av gale positive og negative resultater;

og av stbrst betydning; det faktum at en positiv test kan oppnås med bare en 95% pålitelighetsgrad forst etter en periode på 25-30 dager etter egglbsning.

En annen generasjon av graviditetstester utviklet i de tidlige 1960 årene blirkarakterisertsom immunologiske eller immunokjémiske fremgangsmåter. Da HCG er et proteinhormon, virker det antigenetisk i en heterolog rase. Fblgelig, når HCG injiseres ved egnede teknikker i et passende testdyr,

mest typisk en kanin, fremkalles et motstoff til HCG i dyret. I tidlige tester som benyttet dette prinsippet^ble det forsbkt å benytte antigen motstoff direkte precipitin-reaksjonen, ifblge hvilken et synlig presipitat ville dannes som et resultat av kombinasjonen avHCG og dets motstoff for å påvise nærværet av dette hormonet. Mer vanlige fremgangsmåter innbefattet såkalte indirekte bestemmelsesmetoder, slik -som Brody og Carlstroms lateks partikkelobjektglasstest og Wide og Gemzels hemagglutinasjon og inhibisjonstest.

I den forste fremgangsmåten settes et antiserum til urinen

fra en pasient etterfulgt av en lateksbærer som er blitt belagt med HCG. Hvis urinprbven er fra en gravid kvinne og|.i

I

I

inneholder HCG, vil motstoffene i antiserumet bli noytralisert ]og vil derfor ikke reagere med HCG lagt på bæreren for å fremkalle agglutinering. I den siste testmetoden benyttes

et lignende prinsipp bortsett fra at indikatoren omfatter HCG konjugert med rode blodceller eller formaliniserte rode blodceller. Den forste testen kan utfores i et tidsrom på bare

rundt 2 minutter, mens den andre trenger tilnærmet 2 timer. Enten pasientens urin eller blod kan benyttes for disse testprosedyrene.

I en meget nylig utviklet graviditetstestprosedyre/basert på en modifikasjon av den grunnleggende immunologiske mekanismen, benyttes radiologiske anordninger for å påvise og/eller måle nærværet av HCG i pasientens blod (eller urin). Se f.eks. Goldstein et al. i Fert. Steril., vol. 23, side 817 (1972).

I disse radioimmunoforsokstestene plasseres motstoffet i kontakt med en blanding av pasientens kroppsvæske som skal testes og en kjent mengde HCG markert med en radioaktiv isotop; og HCG i testproven og det markerte HCG konkurrerer om vekselvirkning med HCG motstoffet. Motstoffet blir så adskilt fra væsken og hver fraksjon kan analyseres radiologisk for å bestemme de respektive deler av markert og ikke-markert HCG som ble bundet til motstoffene)og konsentrasjonen av HCG i proven kan beregnes fra denne informasjonen da andelen av markert og ikke-markert HCG vil være i samme forhold i begge fraksjonene. Radioimmunof or soksteknikkene har overvunnet

en signifikant begrensning av den immunokjemiske graviditets-testen, nemlig bmfintligheten. Radioimmunoforsoksteknikker er flere tusen ganger ømfintligere enn de ovenfor beskrevne indirekte tester og tillater folgelig en påvisning av graviditet mye tidligere enn de 25-30 dagene etter egglosningen som trengs ved latekspartikkelobjektglasstesten og hemaggluti-nasjonstesten. Selv om, imidlertid, graviditet kan påvises etter den 10. eller 12. dagen etter egglosningen med en 95% grad av pålitelighet ved radioimmunoforsoksmetoden, har disse testene den ulempe at de krever mer tid for utforelsen, typisk rundt 24-48 timer.

Den storste ulempen, imidlertid, ved alle forut kjente gra-,viditetstestteknikker utgjor den hyppige indikasjonen av gale j

I I I

positive og negative resultater. I tilfellet av immunokjemiskjgraviditetstest, ligger denne vanskeligheten i ikke-spesifikk immunitetsreaksjon på grunn . av ikke-spesifikke motstoff-antigene reaksjoner. F.eks. nærværet av et felles hormon, ikke-spesifikk alfa-subenhet blant follikkelstimulerende hormon (FSH) , luteiniserende hormon (LH) , HCG og tyroidstimulerende hormon (TSH) og homologier i aminosyresekvensen hos de hormon-spesifikke beta-subenhetene har- forårsaket videre vanskeligheter ved produksjonen av spesifikke antisera for bruk i de immunokjemiske teknikker. Disse vanskelighetene fremheves for sterkt i radioimmunoforsoksmetoder grunnet den hbye bmfintlighets-graden ved denne teknikken. Den sistnevnte ulempen er delvis omgått ved å fremstille antisera som er spesifikke for beta-subenheten av HCG^imidlertid, krever denne manipulasjonen bruken av verdifult materiale, immunisering, seleksjon og rensning for å oppnå spesifikke motstoffer og disse frem-gangsmåtene er tidskrevende, dyre og meget tungvindte. Til tross for disse forholdsreglene har målet for nær 100% pålitelighet ved påvisningen av graviditet ved radibimmunoforsok. ikke blitt oppnådd.

Videre består et stort behov for en anordning som påviser ektopiske graviditeter på tidligst mulig tidspunkt- Slike graviditeter har negativ hemagglutinering eller lateksobjektglasstester i 40-60% hos alle pasienter, selv etter 25-30 dagers perioden etter egglbsning som kreves for å foreta disse testene. Grunnen til dette ligger i antagelsen at de immunokjemiske graviditetstestteknikkene forst duger for påvisning av graviditet etter implantasjon av det befruktete egget har funnet sted. Som ovenfor beskrevet lider alle de hittil kjente gra-viditetstestmetodene av den ulempe at de ikke er virksomme for etter eggets innleiring i livmorslimhinnen. En test som kunne påvise tilstedeværelsen av graviditet under perioden mellom befruktning av egget og implantasjon av det befruktede egget,ville være uvurderlig i behandlingen av f.eks. aborttrusel hos kvinner som vanligvis aborterer, tilfeller som omfatter kunstig innpodning og i forbindelse med nye kontraseptive metoder> som virkelig stopper en. graviditet for implantasjon.

i i

Nærværet av spesifikke reseptorer for forskjellige hormoner

Jhar lenge vært antatt å være det sentrale problem hos både mennesker og dyr, og forskere har hatt suksess i den siste halve 10-års periode med å identifisere og direkte studere visse av disse reseptorer og deres vekselvirkning med mange respektive hormoner. , Tidligere studier foretatt av foreliggende oppfinner har foreslått nærværet av en reseptor for HCG i corpus luteum hos gravide eller pseudo-gravide rotter. Gonadotropiner, kapittel 21, 1972,

John Wiley & Sons. Disse tidligere studiene ga imidlertid

ingen indikasjon på om en lignende reseptor er tilstede i mennesker eller andre dyr' , om reseptoren funnet i rotter er artsspesifikk eller spesifikk selv for HCG, om den ville være en pålitelig indikator for HCG i kroppsvæskeprover eller om den er stabil gjennom en utstrakt tidsperiode.

Prolaktin (PRL) representerer et hormon som i mange år ble

antatt å være tilstede hos mennesker. Dets nærvær i mennesker ble fastslått i de tidlige 1970 årene. Tilstedeværelsen av PRL reseptorer i pattedyrvev er blitt dokumentert og hormonet antas å spille en rolle i brystkreft, hypofysesvulster, melkedannelsesforstyrrelser, hypotyroidisme og andre forstyr-relser. Det antas å foreligge hele 84 forskjellige funksjoner av PRL omfattende kompleks vekselvirkning med andre hypofysegonadale og binyrehormoner, muligens i rollen som en intermediær regulator for disse andre hormonene En luteotropisk,så vel som en luteolytisk rolle for PRL under

■estuessyklusen hos rotte)er også blitt foreslått,og det er fremlagt en viss sannsynlighet for dette de siste få år ut fra studier av rotten. Den spesifikke bindingen av PRL til rotte-eggstokken har blitt foreslått meget nylig i litteraturen,

men ingen spesifikk reseptor er blitt identifisert. Turking-

ton et al., Ree. Prog.Horm. Res., 29:417 (1973)..Studier fra forskjellige forskere har foreslått at PRL har liten funksjon under opprettholdelsen av corpus luteum i mennesker.

Hwang et al., Proe. Nat. Acad. Sei., 68:1902 (1971)^Midgley

et al'., Proe. IV Int. Cong. Endocrinal, Int. Cong. Series #-273, Excerpta Medica, Amsterdam, 1972.

I betraktning av de sykdommer som er identifisert ovenfor,

som er kjent å omfatte hormonet PRL,er det ofte onskelig å j

i

I

bestemme og/eller kontrollere PRL-innholdet i en testprove oppnådd fra jet subjekt, f.eks.en prove av kroppsvæske. I neen tilfelle er bare små prover tilgjengelige, f.eks. pediatriske tilfelle, og derfor er det bnsket å ha en meget spesifikk test som bare krever en liten prove og bare en kort tidsperiode for utforelse. Spesifitet er onskelig for å differensiere fra andre hormontyper

som kan være tilstede i proven og dette er særlig tilfelle hvor det kan være bnsket å simultant bestemme eller måle to eller

flere forskjellige hormoner. Det eksisterer i byeblikket ingen virkelig spesifikk anordning for slike bestemmelser.

Det er derfor et mål for den foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for bestemmelsen av humant korionisk gonadotropin (HCG), luteiniserende hormon (LH), prolaktin (PRL) og HCG-lignende materialer i en vandig prove.

Et annet mål for foreliggende oppfinnelse har sitt utspring

i frembringelsen av en graviditetstestmetode som gir nær 10O% pålitelighet i påvisning av graviditet.

Det er også et mål for foreliggende oppfinnelse å frembringe

en metode for påvisning av graviditet méd abnorm stilling og truet abort, hvori graviditetstilstand kan fastslås 6-8 dager etter påbegynnelse.

Et videre mål for foreliggende oppfinnelse ligger i å frem-

skaffe en graviditetspåvisningsmetode)ifblge hvilken en graviditet kan oppdages så tidlig som sjette til åttende dag etter, egglosningen med nesten 100% pålitelighet.

Det er ytterligere et formål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en anordning for å bestemme tilstedeværelsen av hormonet HCG i en vandig prove, særlig med det formål å fast-

slå graviditet hos kvinner ved å undersbke en prove av kroppsvæske .

Et annet formål for oppfinnelsen ligger i å fremskaffe en metode for måling av innholdet av PRLi en vandig prove, særlig i en prove av kroppsvæske.

I

Det er også et formål for oppfinnelsen å frembringe en metode I og anordning for samtidig bestemmelse av HCG eller LH og PRL i en vandig prove, særlig en meget liten prove kroppsvæske.

Et videre formål for foreliggende oppfinnelse ligger i å fremskaffe, den spesielle reseptor anvendbar i radioreseptorforsoksmetoden fremsatt ovenfor.

Det er også et formål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for fremstilling av den spesifikke reseptoren som brukes i radioreseptorforsoksmetoden referert til ovenfor.

For å nå de foregående målsetninger har det ifolge foreliggende oppfinnelse blitt frembrakt en metode for bestemmelse av humant korionisk gonadotropin (HCG) , luteiniserende hormon (LH) og HCG-lignende materiale og/eller prolaktin (PRL) i en vandig prove som omfatter trinnene å bringe en slik prove.i kontakt med et reagens som er i stand til selektivt å binde hormonet, frembringe en anordning for å indikere om sådann binding har funnet sted og observere den indikerende anordning for å fastslå nærværet av hormonet i proven, hvori et særlig forbedret aspekt består i at bindereagenset er et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum i et dyr som besitter reseptoren for hormonet HCG og/eller PRL. Indikatorsystemet brukt ved denne metoden kan være hvilket som helst av de konvensjonelt brukte i en lignende immunokjemisk metode for bestemmelse av prote-iner og/eller polypeptider. F.eks. kan indikatoren være et materiale som har blitt behandlet med hormoner, slik at i nærvær av den foreliggende reseptor vil indikatoren avfarges,

bli farget, agglutinere, presipitere eller gi en annen synlig indikasjon (f.eks. fluoresens) av nærvær eller fravær av hormonet i væsken som blir testet, eller fortrinnsvis kan de mer noyaktige radiologiske måleteknikkene benyttes. Under bruk av denne metoden for bestemmelse av graviditet hos kvinner kontaktes en blod-eller urinprbve med ovenfor beskrevne spesifikke, reseptor og nærvær eller fravær av HCG i proven bestemmes basert på mengden av tegn på binding i indikatorsystemet.

i

I

j j

I en foretrukket utforelse av foreliggende oppfinnelse er det

{fremskaffet en metode for bestemmelse av HCG i en vandig prove, fortrinnsvis blodserumet eller urinen fra en pasient med mistenkt graviditet,ved kontakt med en meget spesifikk reseptor

for hormonet HCG, hvor reseptor er et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum hos et dyr som besitter reseptoren for dette hormon med den vandige proven som er tilsatt en HCG mengde som er blitt markert med en radioaktiv isotop. I denne metoden blir det mulige HCG tilstede i proven og en del av det radioaktivt markerte HCG bundet til reseptoren. Reseptoren med sitt bundne HCG blir så adskilt fra den vandige proven og radioaktiviteten av en eller begge de adskilte fraksjonene måles for å bestemme konsentrasjonen av HCG i den vandige proven, idet denne konsentrasjonen er en funksjon av den målte radioaktiviteten. Det foretrekkes å skaffe reseptoren fra corpus luteum hos en ku, sau, hest eller hund, særlig fra et dyr som er gravid og helst et dyr i den forste tredjedelen av graviditetsperioden.

En videre utforelse omfatter en metode for bestemmelse av hormonet prolaktin (PRL) i en vandig prove, igjen fortrinnsvis en kroppsvæske som omfatter trinnene å bringe proven i kontakt med en meget spesifikk reseptor for PRL, hvor denne reseptoren også er et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum av et dyr som besitter denne reseptoren,og utstyre denne proven med en viss mengde PRL som er markert med en radioaktiv isotop.-De ovrige trinnene er identiske med dem som er foran anfort

■ for bestemmelse av HCG. Denne metoden kan brukes som en indikasjon på graviditet hos en kvinne eller for indikasjon av andre uregelmessigheter som omfatter nærværet av prolaktin.

Ifolge oppfinnelsen er det også fremskaffet en metode for samtidig bestemmelse av to eller flere forskjellige hormoner i en enkelt vandig prove. I denne utforelsen er trinnene lignende som ved måling av enkelte hormoner, unntatt at den vandige prove kontaktes med en eller flere reagenser som er i stand til selektivt å binde hvert av hormonene som skal bestemmes, frembringe en adskilt og avklarende anordning for indikasjon om binding har funnet sted for hvert hormon og observere hver av indikatorene for å bestemme nærværet åv hvert hormon. Bindereagenset er et plasmamembranekstrakt j I

fra et kroppsorgan av en type som er kjent og i organet besitter jen spesifikk reseptor for hvert av hormonene som skal måles. Fortrinnsvis er reseptoren et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum i et pattedyr som besitter reseptorposisjoner for både HCG og PRL. Den foretrukne indikasjonsanordning omfatter forskjellige radioaktive isotoper, f.eks. forskjellige isotoper av jod, såsom J12^, J<131>, H3 og C"^. Med en slik indikator kan HCG og PRL måles samtidig ved å bringe reseptoren i kontakt med „ proven og forskjellig markert HCG og PRL> slik at en del av de markerte og ikke-markerte hormonene blir bundet til reseptoren, adskillelse av det bundne og ubundne hormonet fra proven og telling av radioaktiviteten hos hver isotoptype for å bestemme nærværet av de respektive hormoner i forhold til den målte radioaktiviteten.

I en annen utforelse av foreliggende oppfinnelse frembringes et reagens for reseptorkjemisk bestemmelse av hormonet HCG, hvor reagenset omfatter i hovedsakelig ren form den spesifikke fraksjonen av plasmamembranekstrakt fra corpus luteum hos et dyr som besitter reseptoren for HCG, og den spesifikke fraksjonen er en som er i stand til å selektivt binde biologisk aktivt humant korionisk gonadotropin.

I ennå en annen utforelse av den foreliggende oppfinnnelse til-veiebringes en metode for fremstilling av et reagens for reseptorkjemisk bestemmelse av hormonet HCG, omfattende trinnene for fremstilling åv et fint sammenblandet vevhomogenisat fra corpus luteum-vev i et dyr som besitter reseptoren for HCG, adskille plasmamembranene fra nevnte homogenisat og velge ut den plasmamembranfraksjon som er istand til selektivt å binde biologisk aktivt humant korionisk gonadotropin.

Testfremgangsmåten er også egnet for påvisning av gravidi-

tet hos dyr. Folgelig kan den brukes for å påvise graviditet i enhver dyrerase h\D r den spesifikke reseptor ifblge oppfinnelsen finnes, dvs. pattedyr og muligens utvalgte ikke-pattedyr.

En videre utforelse av oppfinnelsen omfatter anordninger

Ifor bestemmelsen av humant korionisk gonadotropin (HCG) , luteiniserende hormon (LH) eller HCG-lignende materiale i en vandig prove, omfattende (a) en forste-reagens og en annet-reagens; (b) denne f brste-reagensen. består av en hovedsakelig ren form av den spesifikke fraksjonen av plasmamembranekstraktet fra corpus luteum hos en rase som har reseptoren for humant korionisk gonadotropin, som er istand til selektivt og biologisk binde aktivt humant korionisk gonadotropin; (c) dette.andre reagenset består av markert humant korionisk gonadotropin som er istand til å emittere stråling, denne fbrste-reagensen er ment å kontaktes med proven som inneholder hormonet som skal måles og med det andre reagenset for å binde en del av det markerte og ikke-markerte hormonet til denne reseptoren; (d) anordning for måling av mengden markert hormon bundet til denne reseptor, hvor emittert stråling derfra er en funksjon av hormonkonsentrasjonen i den vandige proven. Denne utforelsen får fortrinnsvis form av graviditetstestingsutstyr.

Ifolge foreliggende oppfinnelse fremskaffes også en anordning for bestemmelse av prolaktin (PRL) i en vandig prove, bestående av (a) en f br ste-reagens og en amnen-reagens; (b) denne fbrste-reagensen består av en i hovedsakelig ren form spesifikk fraksjon av plasmamembranekstrakt fra corpus luteum fra en rase som har reseptor for prolaktin som er istand til selektivt å biologisk binde aktivt prolaktin; (c) dette andre reagenset består av markert prolaktin som er istand til å emittere stråling, denne f brste-reagensen er ment å" bringes i kontakt med proven som inneholder hormonet som skal måles og med den andre reagensen for å binde en del av det markerte og ikke-markerte hormonet til denne reseptoren; (d) anordninger for måling av mengden av markert hormon bundet til nevnte reseptor, idet emittert stråling derfra er en funksjon av konsentrasjonen av hormonet i den vandige proven.

Til slutt er der i en annen utforelse av oppfinnelsen frembrakt en anordning for bestemmelse av et flertall hormoner i en vandig prove, bestående (a) av en fbrste-reagens og et antall andre reagenser tilsvarende antall hormoner som skal bestemmes; (b) denne fbrste-reagensen består av i hovedsakelig

I

ren form den spesifikke fraksjonen av plasmamembranekstraktet

i

ifra et kroppsorgan av en rase som har den spesifikke reseptor

i nevnte organ,for selektivt å binde hvert av disse hormonene i biologisk aktiv form; (c) disse andre reagensene består hver av disse hormonene som skal bestemmes i en markert form som er istand til å emittere stråling, hvor emittert. stråling er forskjellig for hvert markert hormon, denne forste-reagensen er ment å bringes i kontakt med proven som inneholder hormoner

som skal måles og med den andre reagensen for å binde en del av de markerte og ikke-markerte hormonene til denné reseptoren;

(d) anordning for måling av mengden markerte hormoner bundet til denne reseptoren, idet emittert stråling fra hvert markert hormon er en funkjson av konsentrasjonen av det respektive hormon i den vandige proven. I denne utforelsen er det forste reagenset fortrinnsvis plasmamembranekstraktet fra et pattedyr og de andre reagensene består av HCG og PRL markert med forskjellige isotoper. Videre intensjoner, trekk og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil bli klare fra den detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen som folger, betraktet sammen med den vedlagte tegning. ' Fig. 1 er en logit-log-lineærisering av den kompetitive in-hiberingresponsen på radioreseptormålingen av HCG som tjener som beregningsstandard for metoden i foreliggende oppfinnelse; Fig. 2 illustrerer komputerresultåtet av logit-log-transfor-masjonen av standarden for radioreseptormålingen av HCG; og Fig. 3 er en sammenligning av plasmanivåene av HCG under to normale (HD, RS) og en indusert normal graviditet i livmoren i S.L. med HCG-nivåer i 10 pasienter med abnormal stillings-graviditet.

Ifolge den foreliggende oppfinnelse er det oppdaget en ny og meget spesifikk metode for bestemmelse av hormonet humant korionisk gonadotropin (HCG) og/eller prolaktin (PRL).

I motsetning til tidligere biologiske tester for HCG som har

vist seg å være meget upraktiske og til mer nylig utviklede

i immunokjemiske tester som er basert på prinsippet antigen-'motstof f binding , men som ikke er tilstrekkelig pålitelig, er foreliggende metode basert på bruken av en meget selektiv reseptor for HCG. Reseptoren isoleres fra det formålstjenelige vevet i et egnet dyr, mens i tilfellet av immunokjemiske metoder fremstilles et antiserum fra blodet av et egnet dyr som er blitt injisert med hormonet for å fremskaffe antigen-motstoff-respons.

Forut for den foreliggende oppfinnelse har det ikke vært noen kjent grunn for å bestemme PRL i mennesker og derfor ingen vekt på utvikling av egnede fremgangsmåter. Oppfinnelsen er basert på oppdagelsen av en spesifikk reseptor for dette hormonet. Bruken av en spesifikk reseptor isolert fra det formålstjenelige vevet i et dyr som besitter denne spesifikke reseptoren; overvinner åpenbart fullstendig ulempene av ikke-spesifikke responser som ofte opptrer i forbindelse med immunokjemiske fremgangsmåter. I de fleste tilfelle krever den spesifikke reseptorbindingen den naturlige konfigurasjonen

av et hormon i sin biologisk aktive form. Folgelig, når den reseptorkjemiske testfremgangsmåten kombineres med radio-målingsindikerende teknikker, resulterer det en radioresep-tormålingsmetode som besitter radioimmunomålingteknikkens omfintlighet og på samme tid biomålingens spesifitetsgradjog derfor åpenbarer denne metoden storre sammenhengende nøy-aktighet fremfor alle eksisterende immunologiske og biologiske

hormontester, særlig tester for graviditet.

Videre fordi reseptoren krever den biologisk aktive form av hormonet for binding, ville den endogene syntesen av et meta-bolisk defekt HCG som normalt ville gi en positiv reaksjon;

ifolge de immunokjemiske testfremgangsmåtene, men som antas å være ubrukbare ved vedvarende graviditet, ikke være årsak til en gal positiv test,ifolge testmetoden ved foreliggende oppfinnelse.

Som fremhevet i innledningen er hormonet prolaktin foreslått

å ha en funkjson i estrussyklusen hos rotte, men er på samme tid ikke identifisert til å spille noen ^rolle i eggstokken og re-produksjonsprosessene hos mennesker. Som en basis for denne

i

oppfinnelsen er det oppdaget at det er en okning i PRL nivået [hos kvinner under graviditet. Videre er det oppdaget at eggstokkvev fra forskjellige typer omfattende ku og mennesker inneholder spesifikke reseptorposisjoner for hormonet PRL i tillegg til reseptorposisjoner for HCG.

Således, i tillegg til å fremskaffe en generelt anvendbar fremgangsmåte for å bestemme PRL i forbindelse med forskjellige,

sykdommer som ovenfor nevnt, er det også mulig å benytte metoden ifolge oppfinnelsen for å bestemme eller fortrinnsvis hjelpe bestemmelsen av graviditet. En påvist okning av PRL-nivået hos en kvinne som er mistenkt for å være gravid^gir en videre indikasjon, sammen med bestemmelsen av HCG ifolge oppfinnelsen på at graviditet virkelig foreligger. Denne ytterligere grad av fastslåelse er av stor verdi , særlig i tilfelle som innbefatter abnorm graviditet eller aborttrusel. Det antas at PRL spiller en viktig rolle i fetalutvikling og folgelig fremskaffer dets bestemmelse ytterligere informasjon til den som oppnås ved en bestemmelse av HCG.

I et foretrukket aspekt ved foreliggende oppfinnelse er det mulig å samtidig bestemme både HCG og PRL.siden det er funnet at den samme reseptor besitter reseptorposisjoner for begge disse hormonene. Det er en særskilt uventet oppdagelse i betraktning av det faktum at reseptorposisjonene for PRL hittil ikke er blitt fastslått i corpus luteum hos noe dyr,og re-septorposi sj oner for HCG har bare blitt vist hos rotten.

Samtidig påvisning har åpenbare fordeler ved graviditetstesting

i betraktning av den ovenfor angitte rollen av PRL ved graviditet. En eneste kroppsvæskeprove og en enkel testprosedyre tilveiebringer den mest fullstendige og mest noyaktige indikasjon på graviditet som er tilgjengelig.

Denne samtidige bestemmelsesteknikken er ikke begrenset til hormonene HCG og PRL. F.eks. er det kjent at brystvev inneholder reseptorposisjoner for mer enn et hormon, f.eks. ostrogen, prolaktin og oksydosin og derfor er teknikken ifolge oppfinnelsen like anvendelig for samtidige bestemmelser av disse hormonene ved å bruke en reseptor avledet fra bryst-vevet.

!

Det er også oppdaget ifolge foreliggende oppfinnelse at radio-Ireseptormålingsteknikken muliggjor påvisning av graviditet så j tidlig som en uke etter egglosning. Dette representerer virkelig et betydlig fremskritt på området.graviditetsbestemmel-sestester, siden hittil graviditets.tilstanden ikke kunne påvises tidligere enn rundt tiende til tolvte dag etter egglosningen. Dette resultatet er mer signifikant når det forstås at det uhyre flertall av graviditetstester i dag ikke blir utfort ved hjelp av radioimmunomålingsprosedyren som muliggjor bestemmelse så tidlig som 10 eller 12 dager etter egglosning, men heller ved hjelp av hemagglutinasjons eller lateksobjektglasstester sånn som heri fremhevet og .tillater en bestemmelse av graviditet forst etter rundt 25 eller 30 dager etter egglosning. Radioimmunomålingstester krever minst 24 timer laboratorietid og typisk rundt 48 timer testtid forbundet med tungvinte og dyre fremgangsmåter for å fremstille tilstrekkelig spesifikt motstoff eller antiserum. På den annen side oker ikke tiden som trengs for å utfore testprosedyren ifolge foreliggende oppfinnelse til mer enn rundt 1 . time og typisk bare rundt en 1/2-time. De praktiske fordelene som fremgår fra en slik graviditetstestmetode som muliggjor bestemmelsen av graviditetstilstand for implantasjon av det befruktede egget i det endometriske vevet har blitt diskutert ovenfor, og disse fordelene så vel som de klare fremskrittene innen feltet grunnforskning og menneske-lig reproduksjon som resulterer fra foreliggende oppfinnelse^ er helt åpenbare for dem som har kjennskap til dette faget.

I betraktning av. de fundamentale likheter ved bindemekanis-men for den foreliggende reseptorkjemiske testmekanismen og den velkjente immunokjemiske testmekanismen,er det mulig å utnytte de forut utviklede indikasjonsmekanismene innen rammen av foreliggende oppfinnelse. Folgelig kan indikatorsystemet bestå av et indikatormateriale som er blitt behandlet med HCG, slik at i nærvær av reseptoren vil indikatormaterialet avfarges, bli farget, agglutinere, presipitere eller gi.en annen synlig eller kjemisk indikasjon på nærværet eller fra-været av HCG i den vandige proven eller kroppsvæsken som testes. Fra det foregående er det imidlertid åpenbart at de mest effektive resultatene oppnås når en radiologisk , i I

! I

! måleteknikk benyttes som indikatorsystem - Folgelig repre-jsenteær klart den radioreseptormålende utforelsen av foreliggende oppfinnelse den helst foretrukne utforelse. Ikke dessto mindre må det forstås at foreliggende oppfinnelse ikke ligger i til-veiebringelsen av et særskilt indikatorsystem for bruk i sakens metode, men heller i den fundamentale og nye utnyttelsen av

reseptorkjemiske teknikker og en spesifikk reseptor for bestemmelse av nærværet av HCG og/eller PRL.

I betraktning av den ekstreme spesifitetsgrad og ømfintlighet ved radioreseptormålingsmetoden i foreliggende oppfinnelse, er

det mulig å utfore en tilfredsstillende bestemmelse med.en ekstremt liten prove. F.eks. ved å bruke metoden i foreliggende oppfinnelse som en test for graviditet, er det mulig å gjennomfare testen ved å bruke bare rundt 0,1 ml eller mindre av blod tatt fra pasienten. Tappingen fra pasienten kan utfores ved hjelp av et enkelt nålestikk i enden av en finger. Videre er metoden i oppfinnelsen effektiv for å bestemme nærværet av HCG i enhver vandig prove og folgelig, kan enten blodserum eller en urinprbve fra en pasient uten videre brukes.

Den spesifikke reseptor som benyttes i testfremgangsmåten ifolge den foreliggende oppfinnelsen er avledet fra eggstokkvev. Som ovenfor fremhevet er reseptoren betrakelig mer selektiv for HCG ogHCG-lignende materialer eller PRL, enn etHCGeller PRL-motstoff, fordi reseptoren krever den

•vative konfigurasjonen av hormonet i sin biologisk aktive form for binding. Derfor er det ingen mulighet for ikke-spesifikk immunrespons. Hos alle dyr som besitter denne spesifikke reseptor, er det enkelt påviselig i eggstokkvev som representerer produksjonsvevet for hormonet. Skjont reseptoren kan isoleres fra ethvert pattedyr og muligens fra visse ikke-pattedyr, foretrekkes det å fremskaffe reseptoren fra eggstokkene hos relativt store dyr slik som kuer, sau, griser, hester og lignende,i betraktning av det faktum at disse dyr har forholdsvis storre mengder av eggstokkvev og videre eksisterer et bredt forråd vev som folge av det faktum at disse dyrene blir slaktet kommersielt for kjottet sitt. Det er fastslått at opptil 200 graviditetstester kan gjennomfbres fra en enkel kueggstokk. Eggstokkene

f.eks. fra rotter er så små at det praktisk umuliggjor bruken

|av disse dyrene som en kilde for reseptor. Som ovenfor diskutert er testmetoden i oppfinnelsen også anvendbar på dyr som besitter reseptorenjog frembringer derfor positiv evaluering av graviditet hos en gitt rase også en metode for granskning av dyr med hensyn til nærværet av reseptoren.

Fortrinnsvis er dyret hvorfra reseptoren oppnås i en gravid tilstand på slaktetidspunktet fordi mengden av egg-

stokkvev og antallet reseptorposisjoner på dette tidspunkt er ved et maksimum. Den forste tredjedelen av graviditeten er blitt funnet å være den mest fordelaktige tid for oppnåelse av vevet.

Den spesifikke reseptor i oppfinnelsen oppnås ved adskillelse av rene plasmamembraner fra eggstokkvev etterfulgt av evaluering av forskjellige plasmamembranfraksjoner ved testing mot isotop markert HCG eller PRL og velge ut den fraksjon som viser sterkest binding av hormonet. Reseptoren er ekstremt stabil og kan lagres i lange tidsperioder eller kan sogar brukes på nytt i en .annen eller påfolgende testprosedyre. Plasmamembranreseptoren er stabil etter lyofilisering for graviditetstest. Den eksakte fremgangsmåten for å oppnå reseptoren beskrives mer fullstendig nedenfor. f

Siden testprosedyren ifolge oppfinnelsen ikke er artsspesifikk, kan den også brukes ti. 1 å påvise graviditet hos hvilket som helst dyr som er funnet å besitte den spesifikke reseptor ifolge oppfinnelsen. Således, selv om reseptoren er meget spesifikk for HCG i mennesker og LH i mennesker og dyr,

er den også istand til å selektivt binde HCG-lignende prote-iner som spiller en rolle i dyr svarende til HCG hos mennesker, d.v.s. de tilsvarer de korioniske gonadotropiner hos mennesker. Det samme holder stikk for PRL. Fordelen ved dette er at standard laboratorietestdyr, slik som apekatter, hunder, kaniner:, mus, o.s.v. kan testes ved denne metoden, mens adskilte motstoffer trengtes for hvert dyr, ifolge de immunokjemiske testprosedyrene..

I

Markering av HCG^et eller PRL-et med en radioaktiv isotop kan

\ joppnås på konvensjonell måte med en egnet isotop for dette i 131 14 3

formålet som velges f.eks. fra J , C , H og lignende.

En spesielt egnet isotop er en radioaktiv isotop av jod slik

125

som J ,i betraktning av det faktum at markering med denne isotopen er relativ enkel og mange laboratorier besitter det nbdvendige utstyr for å måle denne isotopen.

I tilfellet av samtidig hormonbestemmelse ved reseptormålings-teknikken i oppfinnelsen, er det nodvendig å markere hvert hormon som skal bestemmes med en karakteristisk isotop for at målingen av de bundne og/eller ubundne hormonfraksjonene skal frembringe en separat indikasjon for hvert hormon som skal bestemmes. F.eks. under utforelsen av samtidig bestemmelse av HCG og PRL kan rensede prover av disse to hormonene mar-keres medJ<125>og J<131>henholdsvis, og lett tilgjengelige telleanordninger kan brukes for å separat telle hver£ isotop.

For mer komplett å beskrive foreliggende oppfinnelse, presenteres nedenfor forskjellige spesifikke metoder for fremstilling av testreagensene og anvendelse av radioreseptormålingen, så vel som spesifikke eksempler på kliniske bestemmelser ved bruk av foreliggende oppfinnelse, idet det forstås at spesifikke prosedyrer bare er ment å være illustrerende og på ingen måte begrensende.

I. Radioisotop markering av hormoner

Meget rent HCG (inneholdende 12 000 I.U./mg ble brukt for testingen. HCG-et ble markert med J 125 ved å bruke laktoperoksydase fremstilt fra melk (RZ = 0,78; Sigma Company, St.

125

Louis, Missouri). To mCi av J i 20 -u.1 0,1 M., natriumacetatpuffer med pH 6,0 ble blandet med 25 ug HCG i en reaksjonsampulle. En alikvot 50 ng. laktoperoksydase i 20 ul og 200 ng ^ 2°2 i 10 ^ vann ble s^ tilsatt ampul-len. Tre alikvoter av 100 ng H202ble tilsatt med 5 minutters intervaller. Etter 20 minutter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 0,5 ml 0,15 M NaCl inneholdende 1% bovin serum albumin (BSA) med pH 7,0. Det markerte hormonet ble så adskilt fra fritt jod ved gelfiltrering på en 1 x 30 cm kolonne med Sephadex G-100 ekvilibrert med 0,15 M NaCl inne- I holdende 1% BSA, pH 7,0. Den spesifikke aktiviteten for det I markerte HCG ble bestemt ved felling med trikloreddiksyre. 5 u.1 av den rå reaksjonsblandingen ble fortynnet til 5 ml med 0,05 M fosfatpuffer med pH 7,5 inneholdende 0,1% BSA.

Til en 200 ul alikvot av denne losningén ble gitt 400 pl trikloreddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 10% trikloreddiksyre. De utfelte proteinene ble gjenvunnet ved sentrifugering. Radioaktiviteten forbundet med det utfelte materialet ble betraktet som bundet til proteinet og brukt for å beregne den spesifikke aktiviteten av det markerte hormonet. Den rå reaksjonsblandingen ble renset ved gelfiltrasjon gjennom en 1 x 30 cm kolonne av Sephadex G-50 ekvilibrert med 1% BSA i 0,9% NaCl. Den spesifikke aktiviteten for det brukte HCG i radioreseptormålingen var 20-30 ^uCi/ug. Den biologiske aktiviteten av det markerteHCGbrukt i testen hie bestemt ved egg-stokkaskorbinsyre-uttynningsmåling og ga 8 923 I.U./mg med 95% pålitelighetsbegrensning av 5 826 - 12 250 I.U./mg.

HPRL ble jodert ved Hunter og Greenwood - metoden, med små modi-fikasjoner: 50 ul 0,5 m fosfatpuffer med pH 7,5 ble tilsatt

i25

1 mCi Na j (New England Nuclear, Boston Massachusetts) ,

5 ug hPRL, og 70 ug kloramin-T, etter 15 sekunder fulgt av natriummetabisulfitt. 100 mg "iobeads" (Hycel Reagents, Houston, Texas) ble satt til den rå joderte blandingen for å

125 absorbere ureagert J . hPRL ble også jodert enzymatisk med laktoperoksydase (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri). Rensning ble oppnådd ved gelfiltrasjon på en Sephadex G-100 kolonne (0,7 x 18 cm). Den spesifikke aktiviteten og renheten av det markerte PRL ble bestemt ved kromato-125

elektroforese. J -hPRL som var i stand til spesifikt å bindes til pattedyrvev fra diende rotte ble brukt ved bindings-studiene med partielt renset eggstokkhomogenisat.

II. Fremstilling av reseptor

Alle fremgangsmåter ved fremstillingen av plasmamembraner ble utfort i et isbad eller ved 4°C. Friske bovineggstokker fra tidlig graviditet (forste tredjedel: fetuslengde fra skalle til hale opptil 22 cm) ble skaffet fra slakteri og lagret i flytende nitrogen inntil forbruk. I et typisk eksperiment ble

)

I - I

I

! I

100 g vev fra omtrent 25 store corpora lutea kuttet i små styk-jker med et skarpt stålblad og malt i 500 ml 10 mmol.

Tris-HCl puffer av pH 7,8 inneholdende 1 mmol MgCl2, 1 mmol ditiotreitol, 10 000 I.U. trasylol (FBA Pharmaceuticals) pr.

liter og 0,25 mol sukrose.Homogenisåtet ble filtrert gjennom to sjikt osteklede og de storre partiklene ble gjenoppblandet i 500 ml puffer ved 10 - 15 takter i en Teflon-glass-homo-genisator, type G med klaringsstorrelse på 0,12 - 0,17 mm ved 4°C. Homogenisåtet ble sentrifugert ved 650 xg i 20 minutter i en Sorvall kjolesentrifuge (RC B, rotor GSA) for" å fjerne intakte celler, nedbrutte celler og kjerner. 650 xg supernantanten ble igjen sentrifugert ved 13 000 g i 20 minutter i den samme sentrifugen. Supernantanten ble denne gang kastet og avsetningen ble resuspendert i 50 - 70 ml tris-HCl puffer ved hjelp av Teflon-glass-homogenisatoren. Denne suspensjonen ble injisert i kjernen av en TI-14 sonisk rotor (Model Beckman Spinco L3-50) som spinner ved 3 000 rpm og inneholder 500 ml

av en lineær sukrosegradient (LKB Ultrograd 11300 pump) fra 30% (vekt/volum) til 50% (vekt/vPlum) sukrose og 120 ml polstring av 50% (vekt/volum) sukrose (pumpehastighet 20 ml/min.). Et oversjikt på 20 ml ble injisert etter proven. Etter 2

timers sentrifugering ved 45 000 rpm. ble sentrifugen retardert og rotorinnholdet erstattet^ med 55% sukrose ved 20 ml/min. Plasmamembranet ble fjernet fra rotoren etter okende partik-kelstorrelse og fraksjoner på 12 ml ble oppsamlet og umiddelbart nedfrosset inntil måling av binding og enzymatisk ak-. tivitet. Membraner ble holdt frosne gjennom 3 måneder uten åpenbart tap av bindingsevne. Alikvot av fraksjonene ble tatt for elektronmikroskopi for nedfrysing. Sukroseinnholdet i suspensjonen interfererte ikke med bindingen av det markerte

HCG.

Alikvoter av eggstokkhomogenat og egnede alikvoter av forskjellige fraksjoner frembrakt ved den kontinuerliger sukrose-densitetgradienten ble lost i 1 molar NaOH inneholdende 0,1% natriumdodesylsulfat for å bestemme proteininnholdet ved Lowrys metode (J.Biol. Chem., Vol. 193, side 265, 1951)

ved bruk av bovinserumalbumin som standard. Alikvoter av de forskjellige fraksjoner ble også kombinert med HCG mar-

125

kert med J og bindingsgraden målt i hvert tilfelle.

I

På basis av proteinkonsentrasjonen viste plasmamembranene

S som inneholdt den spesifikke reseptoren for markertHCG en

10 ganger storre binding enn det rå eggstokkhomogenisåtet.

Hver fraksjon ble også analysert med hensyn til forurensning

ved undersøkelse av dets enzymatiske aktivitet. Hver fraksjon ble målt for 5" nulcleodiaseaktivitet ved Song et al1 s metode (J. Biol. Chem., Vol 262, side 694, 1967) og det uorganiske fosfatet som ble frigjort ble målt ved Fiske et al<1>s metode (J. Biol. Chem., Vol. 66, side 375, 1925). Sytokrbm C

reduktase ble bestemt ifolge Cooperstein et al's metode (J. Biol. Chem., Vol. 189, page 665, 1951).

Som en videre renhetskontroll av plasmamembranene ble de enkelte fraksjoner underkastet elektronmikroskopi. En alikvot av hver proteinfraksjon ble blandet 24 timer i 6,25% glutaraldehyd i 0,067 M kakodylatpuffer ved pH 7,3.

Provene ble vasket 5 minutter i avkjolt 0,25 M kakodylat

eller fosfatpuffer inneholdende 1% 0s04ved pH 7,3 i 2 timer.

Etterpå ble alle provene dehydrert ved passasje gjennom en gradert alkoholserie og plassert i enten Epon eller Aralditt. Det ble kuttet snitt på 0,06-0,09 um,beiset i en

4% vandig uranylacetatlosning og fotografert i et Phillips Em-300 elektronmikroskop.

En fraksjon som viser den sterkeste binding med det mar-

kerte HCG, en lav enzymaktivitet og inneholder rene plasmamembraner som vist ved elektronmikroskopi ble eluert med en sukrose-densitet på 1,16 (ca. 35% vekt/volum). Egnede alUkvoter av denne fraksjonen ble oppbevart i flytende nitrogen og brukt som reseptor.

III. Fremgangsmåte for radioreseptorbestemmelse Radioreseptorbestemmelsen ble utfort i 10 x 75 ml polystyren-ror ifolge protokollen fremsatt i tabell I. i

Protokollen for samtidig radioreseptorbestemmelse av hPRL og hCG vises i tabell ia.

i

I tabell I ble inkubasjon utfort i 30 minutter ved 37 i en Dunaboff vannbadrister. 1 ml avkjolt diluent ble så tilsatt hvert ror. Innholdene av rorene ble. blandet i en vordexmikser og sentrifugert 20 minutter ved 3 OOO xg i en Sorvall kjolesentrifuge (modell RC2B; rotortype HS-4). Supernantantene ble avsuget og avsetningene telt i en Packard Autogamma-teller ;

i i

I

125 med en 51% virksomhet for J . Standardkurvene og den hormonale Ikonsentrasjonen i plasmaprovene ble beregnet av en "time sharing" IBM regnemaskin ved bruk logit-log-transformasjoner.

En logit-log-lineærisering av den kompetitive inhiberingsrespon-sen for radioreseptorbestemmelsen av HCG er vist i figuren i tegningene som er vedheftet. Omfintligheten av bestemmelsen var mindre enn 3,0 ng/ml med en presisjon på 10%. Intra og ihter-bestemmelsesvariasjonene bestemt ved måling av et plasmaforråd ved forskjellige fortynninger i 12 målinger, var -5% og - 15%;henholdsvis,gjennom måleområdet som således fremskaffet evidens for den hoye reproduserbarheten av målingen. Plasmaproven fra en gravid kvinne viste responsdose identisk med HCG-standarden og fastslo verdien av målemetoden. Det var en fullstendig mangel på kryssreaksjon med hoyt rensede preparater av FSH,

PRL og HPL, såvel som plasma fra hypotyroide . subjekter, akromegalier og kvinner under senere del avdiing, hvorved en hoy spesifitet av radioreseptorbestemmelsen indikeres. Radioreseptorbestemmelsen skilte . ikke mellom HCG og LH: 125 imidlertid har en radioimmunobestemmelse som bruker J markert FSH, LH og HCG og motstoffer til deres hormon-spesifikke beta-underenheter vist at det ikke er noen okning i plasmanivået av LH og FSH under tidlig graviditet. Folgelig påvirker ikke mangel av evne til å skille mellom HCG og LH påvisning av graviditet når radioreseptorbestemmelsen brukes.

125

, Binding av J - hPRL til eggstokkhomoqenisat.

En reaksjonsblanding som inneholder 100 ul inkubasjonspuffer inneholdende 10 IU "trasylol" (FBA Pharmaceuticals, New York, New York) , 50 ul reseptorpreparat ekvivalent med 1 - 300 p. g

1 25

protein og 100 ul J -hPRL (SA; 50-70 uCi/ug) ble inkubert ved 37°C i 2 timer i fravær og i nærvær av 1 ;ug ikke-markert bovin PRL. Ved slutten av inkuberingen ble 1 ml iskald puffer tilsatt alle ror og rorene ble sentrifugert ved 5 000 rpm i 20 minutter. Supernantantene ble avsuget. Avsetningene som

inneholdt reseptorbundne hormoner ble telt i en Automamma-teller med en 51% virkningsgrad for J 125 (Packard Instrument Company, Downers Grove, Illinois). Spesifikk binding ble beregnet som forskjellen på binding i rorene med og uten ikke-markert PRL.

125 '''

Spesifikk, binding av J -hPRL til plasmamembran fra bovin Icorpora lutea var en mettbar prosess. Metningen ble demonstrert ved inkubering av plasmamembranet fra bovin corpora lutea

o

(150 ;ug protein) ved 37 C i 2 timer i 250 ul volum med varier-125

ende konsentrasjoner av J -hPRL.Bindingskapasitet pr. mg protein og Kd beregnet ved Scatchard-analyse fra data oppnådd

-13 -12

fra metningskurven var 1,4 x 10 m og Kd = 1,4 x 10

125

Spesifikk binding av J -hPRL til eggstokkhomogenisater oket som en funksjon av mengden av tilsatt homogenisat og ble inhibert ved tilsetning av 1 p. g ikke-markert bovin PRL til inkubasjonsblandingene. Ved å bruke 100 ug homogenisat, ble

125

tilnærmet 20-30% av J -hPRL bundet i fravær av ikke-markert

PRL.

o

Ved 37 C var bindingen rask i lopet av de forste 30 minuttene;

deretter oket bindingen langsomt for å nå likevekt ved 2 timer. Ved 0°C ble lite binding observert selv etter 18 timers inkubasjon.

For å demonstrere spesifiteten av J 125-hPRL-binding til eggstokkhomogenisater, ble humant veksthormon (hGH) , humant follikel-stimulerende hormon (hFSH), humant luteiniserende hormon (hLH), bovin PRL (bPRL), ovin PRL (oPRL) og humant korionisk somatomammotropin (hCS) inkubert ved forskjellige

125

konsentrasjoner. Ingen fortrengning av J -hPRL bundet til reseptorproteinet ble observert med hFSH og hLH. hCS og hGH var i stand til å fortrenge reseptorbundet J 125-hPRL, imidlertid|var evnen av hGH-preparatet til å fortrenge reseptor-

125

bundet J -hPRL omtrent 0,5-1% av hPRL. Bovin og ovin PRL preparater ble vist å ha hovedsakelig lignende evne til å

125

konkurrere med J -hPRL. Mangel på konkurranse med FSH og LH hos PRL for reseptorbinding viser PRL-spesifiteten for reseptorposisjonen. hCs som har både strukturell og biologisk likhet med PRLviste noe kryssreaksjon; imidlertid er kryss-reaktiviteten på 0,5-1% observert ved hGH-preparatet i over-ensstemmelse med rapportert blanding av hGH i en meget lik grad.

I

i i

IV. Kliniske tester

I 100 personer som hadde overskredet den forste ventede menstrua-

sjon og var potensielle kandidater for miniabort fikk tatt blod-prøver for radioreseptorbestemmelse og 24 timers urin samlet for agglutineringstest (Pregnosticon-dri-dot-test). Fysikalsk-

og bekkenundersbkelse, endring i livmorstorrelse og konsistens og andre symptoner på en mulig graviditet ble vurdert. Hvis radioreseptorbestemmelsen var positiv, uavhengig av en positiv eller negativ Pregnosticontest, ble en miniabort utfort. Alle eksemplarer ble sendt til det patologiske laboratoriet for å fastslå tilstedeværelse av graviditet. 3 pasienter aborterte spontant og 3 som utviklet abnormal graviditet skal omtales separat. Blodprøvene ble sentrifugert ved 2 500 rpm. ved 40°C

i 15 minutter og plasma eller serumet ble lagret ved -20°C

inntil bruk.

Radioreseptorbestemmelsen av HCG i blod ble gjennomfort 77

ganger hos 72 pasienter for å fastslå tilstedeværelsen av tidlig graviditet. Nøyaktigheten av testen ble bestemt ved å sammen-

ligne den med Pregnosticon-dri-dot-testen og tilstedeværelsen av graviditet ble fastslått ved den histopatologiske under-

søkelsen av endometriske eksemplarer oppnådd ved valgfri eller spontan abort. De vanlige kliniske kriteriene, f.eks. liv-mor sf or størrelse eller inntreden av menstruasjon)frembrakte ytterligere evidens for å fastslå nøyaktigheten av radioreseptorbestemmelsen .

41 pasienter viste, en negativ radioreseptorbestemmelse og et galt positivt pregnosticonresultat ble forbundet med denne gruppen. Alle de 41 tilfellene ble fastslått å ikke være gra-

vide ved videre kliniske observasjoner.

I 14 aborttilfeller stadfestet den patologiske diagnosen av vevekstraktet. resultatet av radioreseptorbestemmelsen. 7 av

de 14 miniabortene som demonstrerte desidualt eller placentalt

vev .som stadfestet graviditet, ga en positiv radioreseptorbestemmelse, men negativ Pregnosticontest.

j

Pregnosticontesten var heller ikke omfintlig nok til åpåvise jtidlig graviditet, mens radioreseptorbestemmelsen var i stand til å påvise graviditet så tidlig som 4. dag etter egglosning og viste seg å ha stor verdi i tilfeller av aborttrusel. 4 tidlige aborttrusler innen de forste 7 uker av svangerskap demonstrerte positive reseptorbestemmelser, men på samme tid negativ Pregnosticontest. Pasientene aborterte i hvert tilfelle spontant og livmorinnholdene som ble gjenvunnet)åpenbarte korionisk vev. I 4 svangerskap som endte i spontan abort, fortsatte fargingen 10 - 14 dager;og livmoren var ikke tilstrekkelig for-storret for gjennomfbringen av svangerskapet, hvilket antydet en abnormalitet i vekst; og ..utvikling av embryo og placenta.

Fra 20 tilfeller som besbkte fodselsklinikken^ble blodprbver tatt daglig under menstruasjonssyklusen for å bestemme FSH og LH ved radioimmunobestemmelsen. På basis av BBT, plasmanivå

av FSH og LH, utskillelse av bstrogen og progesteron i urin og karakteristiske endringer i slimhalsen som tegn på egglosning, ble disse kvinnene tilrådet å bli gravide. Blodprbvene fra 4 av disse kvinnene som ble gravide ble analysert for å fastslå HCG-nivåene ved radioreseptorbestemmelsen og nivåene for FSH og LH ved radioimmunobestemmelsen på egglbsningsdagen og under tidlig graviditet. Egglbsningsdagen hos disse 4 gravide kvinnene ble etterpå fastlagt ved FSH--og LH-be stemme Ise i blodet. Totalt 15 normale graviditeter ble testet under pe- • rioden omfattende egglosning og tidlig svangerskap. En sammenstilling av alle de behandlede tilfellene presenteres

i tabell II.

I

De folgende er ytterligere summariske historiske tilfeller som tjener til videre å illustrere nytten av radioreseptorbestemmelse s tekni kke n .

En 23 år gammel para III, gravida IV ble undersokt 8 dager etter manglende menstruasjonsperiode. Pregnosticon-urintesten var negativ^og radioreseptorbestemmelsen var positiv. En miniabort foretatt på den folgende dag demonstrerte placentalt vev.

En 20 år gammel ikke-gravid fikk innsatt en anordning i livmoren og 9 måneder senere var menstruasjonen 9 dager for sent; radioreseptorbestemmelsen var positiv. Denne bestemmelsen ble igjen positiv 2 dager senere og en miniabort åpenbarte korionisk vev. 2 Pregnosticontester utfort på samme dagene var negative.

! i

En 28 år gammel ikke-gravid med en 28 dagers syklus hadde17!dagers forsinkelse med menstruasjonene; radioreseptorbestemmelsen var positiv og Pregnosticontesten var negativ.

Noen dager senere opptrådte en spontan abort. 3 måneder senere ble hun igjen kontrollert 5 dager etter forste manglende menstruasjonsperiode. Igjen var radioreseptorbestemmelsen positiv og Pregnosticontesten negativ. Livmorveksten slo feil, sortfarging begynte og fortsatte inntil en spontan abort opptrådte igjen 4 uker etter den manglende syklus. Vevsunder-sbkelse fra den andre aborten åpenbarte en amniotisk sekk uten foster.

I et annet tilfelle ble en 30 år gammel gravid undersokt 12 dager etter manglende syklus. På denne tiden var radioreseptorbestemmelsen positiv og Pregnosticontesten var negativ. Etter 2 ukers irregular fargning og tvilsom livmorsforstorrelse opptrådte spontan abort.

Hos 2 pasienter med antatt abnormt svangerskap, viste en positiv radioreseptorbestemmelse og den andre en negativ test. Den forste ble fastslått å ha et uavbrutt tubarsvangerskap. Begge hadde negative Pregnosticontester. Det folgende er

en kort sammenfatning av det abnormale svangerskapet; en 40

år gammel para I, gravida I savnet en mensturasjonsyklus og umiddelbart deretter utviklet det seg en mild lav underliys-smerte og vaginalflekker som fortsatte 2 uker. Hemagglutine-, ringsinhibitorrbrtesten var negativ dagen etter innlegging. v Radioreseptorbestemmelsen på annen dag var positiv. På den tredje dag åpenbarte "currettage" ingen tegn på svangerskap;

cul-de-sac punktur var negativ, laparoskopi demonstrerte en ubrutt venstre ektopi som ble fjernet ved påfolgende laparo-tomi.

13 pasienter fikk adgang til hospitalet p.g.a. antatt abnormt

svangerskap. Den siste menstruasjonsperioden varierte fra 23-76 dager for innlegging. Lav underlivssmerte, amenorre, hyppig vaginal farging og en adneksal masse var de vanlige påvisninger. Plasmaprbver ble tatt fra hver pasient for ope-rasjonen og i et tilfelle på 4 adskilte dager for radioreseptorbestemmelse av HCG. Konvensjonelle hem- eller lateks-

i ! agglutineringstester ble utfort med urinprover på' samme tid. 'Resultatene av svangerskapstestene og de patologiske påvisningene presenteres i tabell III.

Tabell III indikerer resultatene oppnådd ved radioreseptor-j bestemmelsen og hemagglutineringstesten i 13 antatte abnormale svangerskap og'i tillegg tiden fra de siste menstruasjonene og de tubare histologi ske påvisningene. 7 av de 10 abnormale svangerskapene hadde en positiv radioreseptorbestemmelse og negativ hemagglutinasjonssvangerskapstest. Det ble oppnådd en gal positiv hemagglutineringstest og ingen gal positiv radioreseptorbestemmelse. Det forelå et vidt område av svanger-skapsvarigheter' som varierte mellom 23 og 76 dager etter siste manglende periode.

Logit-log-transformasjon av standard HCG dose-responskurven

ga en folsomhet på 0,3 ng eller 3 mIU/HCG/ml (fig-2).

I denne figuren er TSH tegnforklaringen på plasma fra hypotyroide pasienter; HGH, plasma fra akromegaliske tilfeller; PRL, plasma fra kvinner under siste del av diet. mlU fra 2-internasjonale referansfremstilling ekvivalent med tilsvarende ng av HCG indikeres på ordinaten. Forskjellige fortynninger av plasmaproven fra en gravid kvinne ga en skrå parallell til den fra HCG som indikerte gyldigheten av bestemmelsen. Der var ingen kryssreaksjon med FSH, TSH, HGH og HPRL i bestemmelsen. Der var en 98-102% gjenvinning avHCGsatt til plasmaprovene av kjent hormonkonsentrasjon. Intra- og interbestem-melsesvariasjonen i de anslåtte hormonnivåene hos plasmafor-rådene var 6 og 11% henholdsvis. Radioreseptorbestemmelsen skilte imidlertid ikke mellom LH og HCG. Denne ulempen ble

. ikke omgått ved observasjonene 1) at verken LH eller FSH

oker under tidlig svangerskap som fastslått ved spesifikk (3-underenhet- radioimmunobestemmelse av FSH, LH og HCG i blodet, 2) at standardene inneholder samme mengde plasma oppnådd fra ikke-svangre kvinner under lutealfasen som inneholder lave nivåer av LH, 3) at alle ukjente prover sammenlignes med et plasmaforråd fra ikke-svangre og forskjellige fortynninger av et forråd av plasma fra svangre kvinner som analyseres rutinemessig ved hver bestemmelse for noyaktighet og kvali-tetskontroll og 4) til slutt at under tidlig svangerskap er HCG-LH nivåene 2-3 ganger hoyere enn de basiske LH-nivåene

i ikke-svangre kvinner under lutealfasen.

i

I fig. 3 er HCG-nivåene i 10 abnormale svangerskap sammenlignet 'med normale intralivmorgraviditeter i 2 tilfeller (H.D., R.S.) og 1 indusert egglosning og svangerskap (S.L.) med 10 OOO IU av HCG som styres ved radioreseptorbestemmelse. Plasmanivåene for HCG under tidlig indusert eller naturlig svangerskap var lignende. Svangerskapsdagen ble basert på siste menstruasjonsperiode som pasientene anga. I en av 10 pasienter (^....^J, ble radioreseptorbestemmelsen utfort på dagene 21, 24, 30 og 42 av svangerskap. De positive radioreseptorbestemmelsene på dager 21 og 24 ble satt i forbindelse med negative Pregnosticontester. LH-toppen som fulgte innledningen av HCG-stig-ningen ble forst bestemt i blodprøvene tatt forst på dag 6-8 etter egglosning,og den kan derfor være tidligere etter be-fruktningen..3 av abnormalitetene hadde bestemmelsene gjennom-ført for de forste manglende menstruasjoner og HCG-nivåene hos 4 lå i området for normalt svangerskap. De andre 6 abnormale HCG-nivåene var lavere enn det normale. Disse observasjonene antydet at de tidlige utviklingene i roret for brudd og blodning kunne utskille normale mengder HCG. Senere, imidlertid, når blodning, oket separasjon og redusert blodforsyning opptrådte, avtok HCG-utskillelsen.

Som vist i fig. 3 i de foreliggende serier av 13 antatte abnormale svangerskap var HCG 22 og 35 ng/ml eller 0,26 og 0,42 IU, henholdsvis i 2 av de 13 tilfellene. Påvisningen av HCG ved disse lave nivåene hjalp den korrekte behandling av pasienten på et tidligere trinn. De ovrige pasientene hadde verdier på over 100 ng/ml. HCG-nivåene på dagene 21, 24, 30 og 4 2 under svangerskapet (fig. 3) var oppnådd fra den samme pasienten. Initialtesten var forbundet med en negativ Pregnosticontest; skjont begge tester var positive ved 3 etterfølgende bestemmelser. På den 64 dag var under-livsinngrep nodvendig p.g.a. et hoyreavbrutt abnormalt svangerskap.

Radioreseptorbestemmelsen av HCG med en folsomhet på 50 pg eller 3 mIU/ml plasma har frembrakt nær 100% pålitelighet ved fastleggelsen av graviditet etter forste manglende syklus. Denne testen utfort innen 1 time er ideelt egnet for klinisk påvis.ning av abnorm graviditet, spesielt hos pasienter

I

som trenger øyeblikkelig kirurgisk, inngrep. 13 pasienter med .antatt abnorm graviditet ble undersokt ved radioreseptorbestemmelsen, hvorav en ble fulgt av fire separate bestemmelser. Resultatene av bestemmelsen ble deretter sammenlignet med dem fra hemagglutinasjonsgraviditetstester, kliniske symptoner og patologiske resultater. Alle pasientene ble diagnostisert noyaktig ved radioreseptorbestemmelsen, selv når hemagglutineringstester ga falsk indikasjon på graviditet. HCG-nivåene under abnorme graviditeter er ved denne proven generelt lavere enn dem under et normalt intralivmorsvangerskap0, dertil er langt tidligere (for sprengningen) påvisning av svangerskap mulig, enn ved hemagglutineringstester. Videre kan abnorm graviditet utelukkes hos pasienter som får adgang til sykehuset med akutte underlivskriser.

Claims (49)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av humant korionisk gonadotropin (HCG) , luteiniserende hormon (LH) eller HCG-lignende materiale i en vandig prove hvor trinnene erkarakterisert vedat nevnte prove bringes i kontakt med et reagens som er i stand til selektivt å binde ■ dette hormonet, en anordning fremskaffes for å indikere om denne bindingen har funnet sted og observere denne indikasjonsanordningen for å bestemme nærværet av nevnte hormon i proven, hvor forbedringen utgjor at dette reagenset som er i stand til selektivt å binde nevnte hormon er et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum hos en art som besitter reseptoren for humant korionisk gonadotropin.

2. Fremgangsmåten som angitt i krav 1,karakterisert vedat den indikerende anordning omfatter en radiologisk måleanordning.

3. Fremgangsmåten som angitt i krav 2,karakterisert vedat den radiologiske måleanordning innbefatter humant korionisk gonadotropin markert med radioaktiv isotop.

4. Fremgangsmåten som angitt i krav 3,karakterisert vedat disse trinnene for å fremskaffe og observere denne indikasjonsanordningen består av å kontakte denne reseptoren og denne proven i nærvær av humant korionisk gonadotropin som er markert med radioaktiv isotop, hvorved en del av dette markerte hormon og del av dette ikke markerte hormon som er tilstede i proven bindes til denne reseptor, adskillelse av disse reseptorbundne hormonene fra ikke-bundne hormoner i denne vandige proven og måling av radioaktiviteten av i det minste denne adskilte reseptoren eller denne vandige proven for å bestemme konsentrasjonen av dette hormonet som en funksjon av målt radioaktivitet.

5. Fremgangsmåten som angitt i krav 4,karakterisert vedat hormonet som er markert med radioaktiv isotop er markert med en isotop fra gruppen bestående av J 125, J , H og C T131 3 14

6. Fremgangsmåten som angitt i krav 5, karakteri- 125 sert ved at denne isotopen er J .

7. Fremgangsmåten som angitt i krav 4,karakterisert vedat denne proven er en kroppsvæske fra en kvinne som er mistenkt for å være gravid og hvor resultatene . fra denne fremgangsmåten fremskaffer en bestemmelse av svanger-skapsti1standen.

8. Fremgangsmåten som angitt i krav 7,karakterisert vedat denne kroppsvæsken velges fra blodserum eller urin.

9. Fremgangsmåten som angitt i krav 8,karakterisert vedat denne kroppsvæsken er blodserum.

10. Fremgangsmåten som angitt i krav 9,karakterisert vedat dette blodserum brukes i en mengde på rundt 0,1 ml. i ! I

11. Fremgangsmåten som angitt i krav 1,karakterisert vedat denne reseptor oppnås fra corpus luteumi hos et pattedyr.

12. Fremgangsmåten som angitt i krav 11,karakterisert vedat denne reseptor oppnås fra corpus luteum fra en ku, en sau, en gris eller en hest.

13. Fremgangsmåten som angitt i krav 12,karakterisert vedat denne reseptor oppnås fra corpus luteum hos en ku.

14. Fremgangsmåten som angitt i krav 1,karakterisert vedat denne reseptor oppnås ved en metode bestående av trinnene å fremstille et finfordelt vevhomogenisat fra corpus luteum-vev, adskille plasmamembranene fra dette homo-geni såtet og utvelge plasmamembranfraksjonen som er i stand til selektivt biologisk å binde aktivt humant korionisk gonadotropin.

15. Fremgangsmåten som angitt i krav 1,karakterisert vedat proven stammer fra eggstokken til et gravid hunkjbnnsvesen.

16. Fremgangsmåten som angitt i krav 15,karakterisert vedat dette hunkjonnsvesen er i forste tredjedel av svangerskapet.

17. Fremgangsmåten som angitt i krav 1,karakterisert vedat proven er en kroppsvæske fra et hun-pattedyr og at resultatene av denne metoden frembringer en bestem melse av svangerskapstilstanden.

18. Fremgangsmåten som angitt i krav 17,karakterisert vedat denne kroppsvæsken velges fra blod eller urin.

19. En reagens for reseptorkjemisk bestemmelse av hormonet humant korionisk gonadotropin,karakterisertved at den i substansiell ren-form består av den spesifikke I. I fraksjonen fra plasmamembranekstrakt fra corpus luteum av en art som har reseptoren for hormonet humant korionisk gonario- tropin, og denne fraksjonen er i stand til selektivt å binde biologisk aktivt humant korionisk gonadotropin.

20. Fremgangsmåten for fremstilling av et reagens for reseptor kj emi sk bestemmelse av hormonet humant korionisk gonadotropin,karakteriserte d at trinnene består i å fremstille et finfordelt vevhomogenisat fra corpus luteum-vev hos en art som har reseptoren for humant korionisk gonadotropin, adskille plasmamembranene fra dette homogeni-satet og velge den plasmamembranfraksjonen som er i stand til selektivt å binde biologisk aktivt humant korionisk gonadotropin.

21. Anordning for bestemmelsen av humant korionisk gonado- •tropin (HCG), luteiniserende hormon (LH) eller HCG-lignende materiale i en vandig prove,karakterisertved at den består av a) en forste-reagens og en annen-reagens; b) denne fbrste-reagensen består i vesentlig ren form av den spesifikke fraksjonen av plasmamembranekstraktet fra corpus luteum hos en art som har reseptoren for humant korionisk gonadotropin som er i stand til selektivt å binde bio- ■ logiske aktivt humant korionisk gonadotropin; c) denne andre reagensen består av markert humant korionisk gonadotropin som er i stand til å emittere stråling, denne fbrste-reagensen er tilsiktet å kontaktes med proven som inneholder hormonet som skal måles og med den andre reagensen for å binde en del av det markerte og ikke-markerte hormonet til denne reseptoren; d) anordning for måling av mengden av markert hormon bundet til denne reseptoren, hvor den stråling som emitteres derifra er en funksjon av hormonkonsentrasjonen i den vandige proven. ; j

22. Anordning som angitt i krav 21, karakterl-I ise r t ved at den har form av utrustningssett.

23. Fremgangsmåten ved bestemmelse av hormonet prolaktin (PRL) i en vandig prove,karakterisert vedat denne proven bringes i kontakt med en reagens som er i stand til selektivt å binde dette hormonet, og denne reagensen er --- et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum av en art som besitter reseptoren for prolaktin, hvorved en anordning tilveie-bringes for å indikere om denne bindingen har funnet sted og observere disse indikasjonsanordninger for å bestemme nærværet av dette hormonet i proven.

24. Fremgangsmåten som angitt i krav 23,karakterisert vedat denne indikasjonsanordningen består av en radiologisk måleanordning.

25. Fremgangsmåten som angitt i krav 24,karakterisert vedat denne radiologiske måleanordningen omfatter prolaktin markert med radioaktiv isotop.

26. Fremgangsmåten som angitt i krav 25,karakterisert vedat trinnene for frembringelse og observasjon av denne indikasjonsanordningen består av å kontakte denne reseptoren og denne proven i nærvær av prolaktin markert med radioaktiv isotop, hvorved del av dette markerte hormonet og del av dette ikke-markerte hormonet som er tilstede i proven bindes til denne reseptoren, disse reseptorbundne hormonene adskilles fra ikke-bundne hormoner i nevnte vandige prove og . radioaktiviteten av minst den adskilte reseptor eller nevnte vandige prove måles for å bestemme konsentrasjonen av dette hormonet som funksjon av den målte radioaktiviteten.

27. Fremgangsmåten ifolge krav 26,karakterisert vedat dette hormonet som er markert med radioaktiv isotop er markert med en isotop fra gruppen bestående a _125 _131 3 14 av J , J , H og C i ! I

28.Fremgangsmåten ifolge krav 27, karakt, e ri sert I ' v e d at denne isotopen er J

29. Fremgangsmåten ifolge krav 26,karakterisert vedat denne proven er en kroppsvæske fra en kvinne som er mistenkt for å være svanger og hvor resultatene fra denne metoden tilveiebringer en bestemmelse av svanger-skaps ti 1 standen .

30. Fremgangsmåten ifolge krav 29,karakterisertved at denne kroppsvæsken velges fra blodserum eller urin.

31. Fremgangsmåten ifolge krav 30,karakterisertved at denne kroppsvæsken er blodserum.

32. Fremgangsmåten ifolge krav 23,karakterisertved at denne reseptor erholdes fra corpus luteum av- et pattedyr valgt fra gruppen bestående av en ku, en sau, en gris og en hest.

33. Fremgangsmåten ifolge krav 23,karakterisertved at denne reseptoren oppnås ved en metode som består av trinnene å fremstille et fint fordelt vevhomogenisat fra corpus luteum-vev, adskille plasmamembranene fra dette homo- .genisåtet og utvelge den plasmamembranfraksjonen som er i stand til å selektivt biologisk binde aktivt PRL.

34. Fremgangsmåten ifolge krav 33,karakterisert vedat denne reseptoren stammer fra et gravid hunkjonnsvesen i forste tredjedel av svangerskapet.

35. Fremgangsmåte for samtidig bestemmelse av et flertall hormoner i en enkel vandig prove,karakterisertved at denne proven bringes i kontakt med en reagens som er i stand til selektivt å binde hvert av de nevnte hormonene i proven, og at reagensen er et plasmamembranekstrakt fra et kroppsorgan hos en art som i dette organet besitter den spesifikke reseptoren for hvert av hormonene og frembringer 1 en separat adskilt anordning for hvert hormon som skal [bestemmes for å indikere om nevnte binding har funnet sted ■ og observere hver av disse indikerende anordningene for å bestemme nærværet av hvert av disse hormonene.

36. Fremgangsmåten ifolge krav 35,karakterisert vedat hvert av disse hormonene som skal bestemmes i denne proven består av humant korionisk gonadotropin (HCG) og' prolaktin (PRL), og hvor denne bindende reagensen består av et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum fra en art som besitter reseptoren for HCG og PRL.

37. Fremgangsmåten ifolge krav 36,karakterisert vedat disse indikerende anordninger omfatter en radiologisk måleanordning.

38. Fremgangsmåten ifolge krav 37,karakterisert vedat denne måleanordningen omfatter HCG markert med radioaktiv isotop og PRL markert med en forskjellig radioaktiv isotop.

39. Fremgangsmåten ifolge krav 38,karakterisert vedat trinnene for tilveiebringelse og observasjon av disse indikasjonsanordninger, består av å kontakte denne reseptor og denne proven i nærvær av nevnte HCG markert med en radioaktiv isotop og nevnte PRL markert . med en radioaktiv isotop, hvor en del av hvert av disse markerte hormonene og en del av dette ikke-markerte hormonet, som er tilstede i proven, bindes til denne reseptor, disse reseptorbundne hormonene adskilles fra ikke-bundne hormoner i nevnte vandige prove og radioaktiviteten for hver av disse isotopene fra minst nevnte separerte reseptor eller nevnte vandige prove måles for å bestemme konsentrasjonen av hvert av disse hormonene som en funksjon av den målte radioaktiviteten.

40. Fremgangsmåten ifolge krav 39,karakterisert vedat dette HCG og PRL er radioaktivt isotop markert og markert med to forskjellige isotoper av jod. I

41. Fremgangsmåten ifolge krav krav 40, karakteri-i ^ j. • a. t125 t131 jsert ved at disse isotopene er J og J

42. Fremgangsmåten ifolge krav 41,karakterisertved at denne proven er en kroppsvæske fra en kvinne.

43. Fremgangsmåten ifolge krav 42,karakterisertved at denne væsken er blodserum eller urin.

44. Fremgangsmåten ifolge krav 36, karakt" eri sert ved at denne reseptoren erholdes fra corpus luteum hos et dyr valgt fra gruppen bestående av en ku, en sau, en gris og en hest.

45. Fremgangsmåten ifolge krav 36,karakterisertved at denne reseptor erholdes ved en metode som består a<y>trinnene å fremstille en fint sammenblandet vevhomogenisat fra corpus luteum-vev, adskille plasmamembranene fra dette homogenisåtet og seleksjonere plasmamembranfraksjonen som er i stand til selektivt å binde biologisk aktivt PRL og HCG.

46. Fremgangsmåten ifolge krav 45,karakterisert'ved at denne reseptoren stammer fra et hunkjonnsvesen i forste tredjedel av svangerskapet.

47. Anordning for bestemmelse av prolaktin (PRL) i en vandig prove,karakterisert vedat den • består av a) en. forste-reagens og en annen-reagens; b) denne fbrste-reagensen består av i hovedsakelig ren form den spesifikke fraksjonen fra plasmamembranekstraktet fra corpus luteum hos en art som har reseptoren for prolaktin som er i stand til selektivt å binde biologisk aktivt prolaktin; c) denne annen-reagens består av markert prolaktin som er i .stand til å emittere stråling, denne f brste-reagensen. er ment å bringes i kontakt med proven som inneholder hormonet som skal måles og med den andre reagensen for å binde en del av .i . J det markerte og ikke-markerte hormonet til denne reseptoren; i I d) anordning for å måle mengden av markert hormon bundet til denne reseptoren, idet emittert stråling derfra er en funkjsjon av konsentrasjonen av hormonet i den vandige proven.

48. Anordning for bestemmelse av et flertall hormoner i en vandig prove,karakterisert vedat den består av a) en forste-reagens og et antall andre reagenser likt antallet hormoner som skal bestemmes; b) denne fbrste-reagensen består i hovedsakelig ren form av den spesifikke fraksjonen av plasmamembranekstraktet fra et kroppsorgan hos en art som har den spesifikke reseptoren i dette organet for selektivt å binde hvert av disse hormonene i biologisk aktiv form; c) disse andre reagensene består "av hvert av disse hormonene som skal bestemmes i en markert form i stand til å emittere stråling, og denne emitterte strålingen er forskjellig for hvert markert hormon, og denne fbrste-reagensen er ment å bringes i kontakt med proven som inneholder hormonet som skal måles og med de andre reagensene for å binde en del av de markerte og ikke-markerte hormonene til denne reseptoren; d) anordning for måling av mengden av markerte hormoner bundet til nevnte reseptor, idet emittert stråling fra hvert markert hormon er en funksjon av konsentrasjonen for det respektive hormonet i den vandige proven.

49. Anordning ifolge krav 48,karakterisertved at denne fbrste-reagensen består av et plasmamembranekstrakt fra corpus luteum hos et pattedyr, og hvor disse andre reagensene består av humant korionisk gonadotropin og prolaktin markert med radioaktive isotoper, hvor disse anordningene er i stand til samtidig å indikere HCG og PRL. !