SE437304B - Forfarande och medel for samtidig bestemning av hormonerna humant korionogonadotropin (hcg) och prolaktin (prl) - Google Patents

Description

7905898-a o~ ' 2 kutant injicerat till mus, att producera corpora lutea. Friedman- testet är ett annat biologiskt test, varvid ett urinprov från kvinna med misstänkt graviditet' injiceras till öronvenenehos en vuxen kanin- hona, som isolerats 3-4- veckor, och 48 timmar efter injektionen under- osökes ovarierna med avseende på. brustna blödningsfolliklar, vilka indi- kerar en -positiv reaktion. Ett mindre känt test, utvecklat 1943 av Kupperman, omfattar injektioniav patientens urin till honråtta och efter- i följande undersökning av ovariet beträffande tecken på. hyperemi. Ehuru dejtvåi timmar som erfordras för utförande av detta test innebära en itetydiigt kortare tid än de 48 timmer som erfordras för Friedman-testet och de nästanfem dagar som erfordras för Aschheim-Zondek-testetf är nämnda test icke tillförlitligt, eftersom. det behövs en erfaren tekniker " .för att skilja ett något ljusrött, negativt ovarium från ett rödfárgat positivt ovarium, för tillförsäkrande av hög noggrannhet. Ett test utvecklat av Gßalli och Mainini i slutet av 1940-talet erfordrar endast ungefär två; timmar, men detta test omfattar injektion av patientens urin till grodor och efterföljande undersökning beträffande utstötning av o spermier, och .dessa djur är relativt okänsliga jwört med kaniner, möss' och råttor.

Samtliga av nämnda biologiska tester är behäftade med allvar- liga olägenheter, inkl. tillgången på. djur, behovet av att upprätthålla en stor koloni av djur och relativt långa testperioder, frekvent före- komst av falska positiva 'och negativa resultat och, vad som är mest signifikant, det faktum ett ett pesftivt test kan erhållas med en endast _ 957-ig tillförlitlighet- efter en period av 25-30 dagar efter ovulationen.

En andra generation av graviditetstester utvecklade under den tidigare delen avl960-talet karakteriseras såsom immunologiska eller' immunokemiska metoder. Då HCG är ett proteinhormon, åstadkommer j det en antigen verkan hos ieniheterolog. art. När således HCG enligt lämplig teknik injiceras till ifrågavarande försöksdjur, oftast en kanin, produceras en antikropp mot HCG inom djuret. Vid tidigare tester, vari- denna princip tillämpades, försökte man att utnyttja den direkta anti- ~ gen-antikropps-preoipitinreaktionen, enligtvilken ett synligt precipi- i tat skulle bildas såsom ett resultat av kombinationen av HCGoch dess antikropp, för pàvisning av detta hormons närvaro. Mera vanliga: proce- durer omfattade så. kallade indirekta bestämningsmetoder, såsom latex- _ partikelslidtestet_ enligt Brody och Carlström och hemagglutinations- och inhibitionstestet enligt Wide and Gemzel. Enligt den förstnämnda proceduren sättas ett antiserum till urinen från en patient, varefter en latexbärare, som belagts med HCG, tillföras. Om urinprovet är från en gravid kvinna och innehåller [HCG, kommer antikropparna i' antiserumet o _ 7905898-8 3 att neutraliseras och reagerar därför icke med det HCG som pàförts bäraren för åstadkommande av agglutination. Vid den sistnämnda metoden tillämpas en liknande princip, men med det undantaget att indikatorn omfattar HCG konjugerat med röda blodkroppar eller formalinbehandlade röda blodkroppar. Det första testet kan utföras inom en tidrymd av endast ungefär två minuter, medan det andra testet erfordrar ungefär två timmar. Vid dessa metoder kan man använda patientens urin eller blod.

Enligt en mera nyligen utvecklad påvisningsmetod för graviditei baserad på en modifikation av den grundläggande immunologiska mekanismen, använder man radiologiska medel för påvisning och/eller uppmätning av närvaron av HCG i patientens blod eller urin; se exempelvis Goldstein et al, Fert. Steril., 21 (1872), 817. Vid dessa radioimmuncanalys- tester bringas antikroppen i kontakt med en blandning av den kropps- vätska från patienten som skall undersökas och en känd mängd HCG, märkt med en radioaktiv isotop, varefter HCG i provet och märkt HCG får tävla om reaktionen med HCG-antikroppen. Antikroppen avskiljes därefter från vätskan och endera fraktionen kan analyseras radiologiskt för bestäm- ning av de respektive proportionerna av märkt och omärkt HCG, som bundit vid antikropparna, och koncentrationen av HCG i provet kan beräknas på basis av denna information, eftersom proportionen mellan märkt och omärkt HCG kommer att vara lika i de båda fraktionerna. Med radio- immunoanalystekniken har man övervunnit en signifikant begränsning vid det immunokemiska graviditetstestet, nämligen beträffande känsligheten.

Radioimmunoanalystekniken är flera tusen gånger känsligare än de ovan beskrivna testerna och möjliggör således pávisning av graviditet be- tydligt tidigare än efter 25-30 dagar efter ovulationen som erfordras vid latexpartikelslidtestet och hemagglutinationstestet. Även om gravi- ditet kan påvisas den 10-12:e dagen efter ovulation med en pålitlighet av 95 % enligt radioimmunoanalysmetoden, uppvisar emellertid dessa tester den-olägenheten att de erfordrar en längre tid, vanligen 24-48 timmar. g Den allvarligaste olägenheten med all hittills känd teknik för påvisning av graviditet avser emellertid den frekventa indikationen av falska positiva och negativa resultat. Vad beträffar det immunokemisk graviditetstester beror denna svårighet på det icke-specifika gensvaret i samband med icke-specifika antikropps-antigenreaktioner. Således har närvaron av ett vanligt hormon, icke-specifik a-enhet i follikelsti- mulerande hormon (FSH), luteiniserande hormon (LH), HCG och tyroidsti- mulerande hormon (TSH) och homologer i aminosyrasekvensen hos de hormone specifika_B-underenheterna förorsakat ytterligare svårigheter vid pro- fduktion av specifika antisera att användas vid den immunokemiska tek- 7905898-si i 4 niken. Dessa svårigheter förstoras vid radioimmmoanalysmetoden. på. grund av den höga känslighetsgraden vid denna teknik. Denna sistnämnda e olägenhet har man speciellt kringgått genom bildning av antisera speci- fika mot B-underenheten hos HCG; denna manipulation erfordrar emellertid användning av dyrbart material, immunisering, selektion och rening' för tillhandahållande av specifika antikroppar, vilka procedurer är i tidskrävande, dyrbara och mycket besvärliga. Trots dessa försiktighets- mått har manicke uppnått målet av en nästan l00%-ig pålitlighet vid pávisning av graviditet genom radioimmunoanalys. i Det föreligger vidare ett allvarligt behov av ett medel för påvisning av ektopiska graviditeter vid_ tidigast möjliga tillfälle.

Sådana graviditeter ger negativa hemagglutinations- eller latexslid- tester hos 40-60 % av patienterna, även efter den period om 25-30 dagar efter ovulation som erfordras för att utföra dessa tester. Skälet till detta sammanhänger med antagandet att den immunokemiska tekniken för påvisning av graviditet möjliggör sådan påvisningy endast efter det att eimplantation av det abefwlctade ägget har skett. Samtliga hittills kända. metoder för graviditetstester är såsom nämnts behäftade med olägenheten att de nicke är effektiva förrän efter nidation. Ett test som kunde bestämma graviditet under perioden mellan befruktning av ägget och im- plantation av det befruktade ägget skulle vara ovärderligt vid behand- ling av exempelvis hotande missfall hos kvinnor som vanligen får miss- fall, fall omfattandeartificiell insemination ochi samband med nya kontraceptionsmetoder, vilka effektivt avbryter en 'graviditet före i implantati on. _ Närvaron av specifika receptorer för olika-hormoner har 'länge Jmisstärikts hos mälfall bland både människor och djur och forskare har - under de sista fem åren lyckats identifiera och direktstudera vissa av dessa receptorer och deras reaktion med många av ifrågavarande hor- moner. Preliminära studier utförda av föreliggande uppfinnare har indi- Åkerat närvaro av en receptor för HCG i corpus luteum hos dräktiga eller pseudodräktiga råttor, Gonadotropins, Chapter 21, 1972, John Wiley d: Sons. Dessa preliminära studier gav emellertid 'icke någon indikation på. om en liknande receptor närvarande hos människa eller andra djur, om den hos råtta funna receptorn är artspecifik eller specifik även för Hce, em den skulle utgöra en pålitlig inaiketer på Hce i kreppevateke- .-,_prov eller om den är beständig under-en förlängd tidsperiod.

Prolaktin (PRL) representerar ett hormon som under många år 'icke troddes vara närvarande hos människa. Dess närvaro hos människa bekräftades under den tidiga delen av 1970-talet. Närvaron av PBL-recep- torer i .däggdjursvävnad har dokumenterats och hormonet förmodas vara av nukutll ; pp p, a, 5 79osà9sës \ e betydelse vid bröst-kancer, hypofystumörer, laktationsbesvär, hypo- tyroidism och andra besvär. Det förmodas finnas icke mindre än 84 olika funktioner hos PRL, omfattande komplex samverkan med andra hypofys-, gonodala och adrenala hormoner, möjligen i rollen såsom mellanregulator för dessa andra hormoner. En luteotropisk såväl som luteolytisk funk- tion hos PRL har även föreslagits i samband med östruscykeln hos rätta -och under de allra senaste åren har bevis därpå framlagts. Den specifika bindningen av PBL till ràttovarium har nyligen föreslagits i littera- turen, men nàgon specifik receptor har icke identifierats. Turkington et al, Rec. Prog. Horm. Res., 22 (1973): 417. Olika forskares studier har indikerat att PRL har ringa funktion i samband med upprätthàllandet av corpus luteum hos människa, Hwang et al, Prcc. Nat. Acad. Soi., §§ (1971), 1202; Midgley et al, Proc. IV Int. Cong. Endocrinal, Int. Gong.

Series No. 273, Excerpta Medica, Amsterdam 1972.

I samband med nämnda sjukdomar och besvär, vid vilka hormonet PBL kan vara av betydelse, är det ofta önskvärt att bestämma och/eller övervaka PBL-halten i ett testprov erhållet från en individ, exempelvis ett kroppsvätskeprov. I vissa fall är endast små prover tillgängliga, såsom vid pediatriska fall, och därför är det önskvärt att ha ett mycket specifikt test som erfordrar endast ett litet prov och endast en kort tidrymd för att utföra. Specificitet är önskvärd för att differen tiera ett hormon från andra hormonarter, vilka kan vara närvarande i provet, och detta gäller särskilt fall varvid man samtidigt önskar be- stämma eller uppmäta två eller flera olika hormoner. Det föreligger hittills icke något verkligt specifikt medel för att utföra en sådan bestämning. D Det är därför ett ändamål med uppfinningen att tillhandahålla en metod för bestämning av humant, korioniskt gonadotropin (HCG) och prolaktin (PRL) i ett vattenhaltigt prov.

Ett annat ändamål med uppfinningen avser en metod som ger en nästan 100%-ig pålitlighet vid pàvisning av graviditet.

Det är även ett ändamål enligt uppfinningen att tillhandahålla en metod för påvisning av ektopiskt havandeskap och hotande missfall, varvid graviditetstillståndet kan fastställas 6-8 dagar efter inception.

Ett ytterligare ändamål med uppfinningen avser en metod för _pâvisning av graviditet så tidigt som den 6:e till 8:e dagen efter ovula- tion med en nästan 100%-ig pålitlighet.

Ett ytterligare ändamål med uppfinningen avser ett medel för att påvisa närvaron av hormonet HCG i ett vattenhaltigt prov, särskilt för ändamålet att fastställa graviditet genom att man undersöker ett prov av en kroppsvätska. ' flåiÅflJ1“{ 7905898-8 6 Ett ytterligare ändamål enligt uppfinningen avser en metod för uppmätning av halten PBL i ett vattenhaltigt prov, särskilt i ett prov från en kroppsvätska.

Det är även ett ändamål med uppfinningen att tillhandahålla en metod resp. medel för bestämning av HCG, eller PRL i ett vattenhaltigt prov, särskilt i ett mycket litet prov av kroppsvätska.

Enligt uppfinningen har man således utvecklat en metod för bestämning av humant, korioniskt gonadotropin (HCG) eller prolaktin (PRL) i ett vattenhaltigt prov, varvid man bringar ett sådant prov i kontakt med ett medel med förmåga att selektivt binda hormonet, tillför ett medel som indikerar om en sådan bindning uppkommit och observerar indikationsmedlet för bestämning av närvaron av hormonet i provet, 'varvid bindningsmedlet är ett plasmamembranextrakt av corpus luteum från ett djur, som innehåller receptorn för hormonet HCG och/eller PRL.

Det vid denna metod använda indikatorsystemet kan vara ett sådant som konventionellt användes vid en liknande immunokemisk metod för bestämning av proteiner och/eller polypeptider. Således kan indikatorn vara ett material som behandlats med hormonet på så sätt att den i närvaro av ifrågavarande receptor avfärgas, färgas, agglutineras, utfälles eller ger någon annansvnbar indikation (såsom fluorescens) på närvaron eller frånvaron av hormonet i testvätskan, eller företrädesvis använ- A des den noggrannare radiologiska mättekniken. Vid tillämpning av denna metod för påvisning av graviditet bringas ett blod- eller urin- prov i kontakt med nämnda specifika receptor och närvaron_eller från- varon av HCG i provet bestämmes på basis av den bindningsgrad som- indikeras av indikatorsystemet. I , Uppfinningen avser en metod för samtidig bestämningíav två hormoner i ett och samma vattenhaltiga prov, såsom kroppsvätska från en kvinna med misstänkt graviditet, särskilt blodserum eller urin, ,varvid provet bringas i kontakt med skiljaktigt märkta hormoner och en receptor för hormonet och mängden hormon bestämmes på i och för sig känt sätt, genom att man sammanför provet med ett bindningsmedel, som har förmåga att binda vart och ett av hormonerna i provet, vilket ' medel utgör ett plasmamembranextrakt från ett kroppsorgan hos människor eller djur som i nämnda organ uppvisar den specifika receptorn för vart och ett av hormonerna och som framställts enligt en metod som omfattar steg för beredning av ett finfördelat vävnadshomogenat från corpus luteum- vävnad, separation av plasmamembranerna från homogenatet och val av den plasmamembranfraktion som har förmåga att selektivt binda biologiskt I aktivt PRL och HCG, varefter man avskiljer bindningsprodukterna inne- ny! 00 quAL,ll rr .;J;>,,,» 7905898-8 hållande hormonerna, vilka skall bestämmas för indikation av att bindningen ägt rum, och observerar var och en av nämnda bindningspro- dukter för bestämning av närvaron av vart och ett av hormonerna.

Bindningsmedlet är ett plasmamembranextrakt av ett kroppsorgan från en art som är känd för att i organet uppvisa en specifik receptor för vart och ett av de för mätning avsedda hormonerna. Receptorn är före- trädesvis ett plasmamembranextrakt av corpus luteum från ett däggdjur, som uppvisar receptorer för både HCG och PRL. De lämpligaste medlen omfattar olika radioaktiva isotoper, exempelvis olika isotoper av jod, såsom l25I och l3lI, 3H och l4C. Med en sådan indikator kan HCG och PRL uppmätas samtidigt genom att man bringar receptorn i kontakt med provet och på olika sätt märkt HCG och PRL, varigenom efi del av de märkta och omärkta hormonerna bindes vid receptorn, varefter man avskiljer det bundna och obundna hormonet från provet och bestämmer radioaktiviteten hos varje isotoptyp för påvisning av närvaron av respektive hormoner i proportion till den uppmätta radioaktiviteten.

En ytterligare utföringsform av uppfinningen avser ett medel för bestämning av ett flertal hormoner i ett vattenhaltigt prov, om- fattande (a) ett första reagens och ett antal andra reagens motsvarande antalet för bestämning avsedda hormoner, (b) varvid det första reagenset omfattar en i huvudrak ren form av den specifika fraktionen av plasma- membranextrakt från ett kroppsorgan hos en art som uppvisar den speci- fika receptorn i nämda organ för selektiv bindning av hormonerna i biologiskt aktiv form, (c) och varvid de övriga reagensen omfattar vart och ett av de för bestämning avsedda hormonerna i märkt form med för- måga att emittera strålning, vilken emitterade strålning är olika för, de olika hormonerna, och varvid det första reagenset är avsett att bringas i kontakt med provet, innehållande det för mätning avsedda hor- monet, och med de övriga reagensen för bindning av en del av de märkta och omärkta hormonerna till receptorn, (d) medel för uppmätning av den mängd märkt hormon som bundits till receptorn, varvid den emitterade strålningen av vart och ett av de märkta hormonerna är en funktion av respektive hormone koncentration i-det vattenhaltiga provet. Vid denna utföringsform utgöres det första reagenset företrädesvis av plasma- membranextraktet från ett däggdjur och de övriga reagensen omfattar HCG och PRL märkta med olika isotoper.

Ytterligare ändamål, utföringsformer och fördelar i samband med uppfinningen framgår av den följande detaljerade beskrivningen av uppfinningen i samband med de bifogade ritningarna.. ' n., _g__\ Utmana QUALITY i79o5s9s-s 8 iuFig. l avser enlogit-log-linearisering av det konkurrerande inhibitinnssvaret vid radioreceptoranalys av HCG, vilken användes såsom beräkningsstandard vid metoden enligt uppfinningen. I Fig. 2 åskådliggör datorsvaret från en logit-log-transforma- tion av standarden för radioreceptoranalys av HCG.- I Fig. 3 visar en jämförelse mellan plasmanivåerna för HCG under , två normala (Hm, RS) och en inducerad normal intrauterin graviditet ~i S.L. med HCG-nivåer för 10 patienter med ektopisk graviditet.

I samband med uppfinningen har man således utvecklat en ny, "mycket specifik metod för bestämning av hormonet humant, korioniskt gonadotropin (HCG) och/eller prolaktin (PRB). I motsats till tidigare ïbiologiska tester avseende HCG, vilka visat sig vara mycket opraktiska, och de mera nyligen utvecklade immunokemiska testerna, vilka är baserade på principen med antigen-antikroppsbindning, men icke är tillräckligt pålitliga, baserar sig föreliggande metod på användningen'av en i hög, grad selektiv receptor för HCG. Receptorn isoleras från màlvävnaden hos lett lämpligt djur, medan vid immunokemiska metoder ett antiserum produ- * för bildning av ett antigen-antikroppssvar. ceras från blodet hos ett lämpligt djur, till vilket hormonet injicersts Före tillkomsten av föreliggande uppfinning har det icke före- legat något erkänt skäl för bestämning av PRL hos människa och således har det icke funnits något behov av att utveckla lämpliga metoder. Upp- finningen bygger på upptäckten av en specifik receptor för detta hormon.

Genom användningen av en specifik receptor isolerad från màlvävnaden, isom uppvisar denna specifika receptor, övervinner man uppenbarligen full- ständigt olägenheten med icke-specifika svar, som ofta förekommer i sam- band med immnnokemiska metoder. I de flesta fall erfordrar den specifika receptorbindningen den naturliga konfigurationen hos ett honmon i sin biologiskt aktiva form. När således den receptor-kemiska testmetoden kombineras med radioanalysindikationsteknik, åstadkommas en radioreceptor- analysmetod som uppvisar samma känslighetsgrad som radioimmunoanalys- tekniken och samtidigt samma specificitetsgrad som bioanalys, varför denna metod medför en högre dokumenterad noggrannhet jämfört med samt- liga existerande immunologiska och biologiska hormontester, särskilt graviditetstester.. f " Pà grund av att receptorn erfordrar användning av daibiologiskt aktiva formen av hormonet för bindning medför den endogena syntesen av ett imeteboiiekt bristfälligt' Hce, som normalt skulle ge en positiv reaktion vid immunokemiska testmetoder, men som icke antages ha förmåga V _>_____V__ _ V. " ______ nov. troefikueïn 7905898-8 9 att bevisa graviditet, icke nàgot falskt positivt prov vid testmetoden enligt uppfinningen.

Såsom antytts i beskrivningsinledningen har hormonet prolaktin angetts ha en viss funktion i östruscykeln hos råtta, men det har sam- tidigt anförts att det icke spelar någon roll i ovarie- och reproduk- tionsprocesserna hos människa. I samband med denna uppfinning har det upptäckts att det uppkommer en höjning av PRL-nivån hos kvinna under graviditet. Det har vidare visat sig att ovarievävnad från flera arter, inkl. ko och människa, innehåller specifika receptorställen för hormonet PRL förutom receptorställen för HCG. D _ Eörutom att tillhandahålla en allmänt tillämplig procedur för bestämning av PRL i samband med de olika, ovan nämnda sjukdomarna är det således även möjligt att använda metoden enligt uppfinningen för bestämning eller företrädesvis såsom medhjälp vid bestämning av gravidi- tet. En påvisad höjning av PRL-nivån hos en kvinna med misstänkt gravidi- tet ger en ytterligare indikation, tillsammans med bestämning av HCG enligt uppfinningen, att graviditet verkligen är för handen. Denna ytterligare bekräftelse är av stort värde, särskilt i fall av abnorm graviditet eller hotande missfall. Han förmodar att PBL är av stor bâjydelse vid fosterutvecklíngen och bestämningen därav ger således ytterligare information förutom den som erhålles genom bestämning av acc. D Enligt uppfinningen är det möjligt att samtidigt bestämma HCG och PBL, eftersom det visat sig att samma receptor uppvisar receptorställen för båda dessa-hormoner.

Det är en särskilt oväntad upptäckt med hänsyn till att receptorställen för PRL hittills icke bekräftats i corpus luteum hos något djur och receptorställen för HCG har man endast funnit hos råtta. Sa tidig pà- visning ger uppenbara fördelar vid graviditetstestning med hänsyn till nämnda betydelse av PRL vid graviditet. Ett enda kroppsvätskeprov och en enda testmetod ger den mest fullständiga och noggranna tillgäng- liga indikationen på graviditet{ -Denna samtidiga beseamningseernik ar icke begränsad till hormonerna HCG och PRL. Det är således känt att däggdjursvävnad inne- håller receptorställen för mer än ett hormon, såsom östrogen, prolak- tin och oxidocin, och tekniken enligt uppfinningen är därför likaledes tillämplig vid samtidiga bestämningar av dessa hormoner med användning av en receptor, härledd från bröstvävnad. if/Jóíí/ agmv ~~~~ r a 7905298-3 to i 10 Det har i samband med uppfinningen även visat sig att radio- receptoranalystekniken möjliggör pàvisning av graviditet så tidigt som en vecka efter ovulation. Detta innebär verkligen en signifikant l fördel inom området för tester avseende påvisning av graviditet, efter-- isom_graviditetstillstàndet hittills icke kunnat påvisas tidigare än ungefär den 10:e eller 12:e dagen efter ovulation. Detta resultat är i mera signifikant, när man inser att det stora flertalet graviditete- atester i dag icke utföres enligt radioimmunoanalysmetoden, vilken möjliggör bestämning så tidigt som 10 eller 12 dagar efter ovulation, utan snarare med hjälp av hemagglutinations- eller latexslidtesterna, vilka såsom nämnts möjliggör en bestämning av graviditet först,efter lungefär 25 eller 30 dager efter ovulation. Radioimmunoanalystester gerfordrar minst 24 timmars laboratorietid och typiskt ungefär 48 timmars testtid i kombination med besvärliga och dyrbara metoder för frem- ställning av en tillräckligt specifik antikropp resp. antiserum. Å andra sidan är den tid som erfordras för att utföra testmetoden enligt uppfinningen nämt en timme, typiskt ungefär 30 minuter. De praktiska fördelarna med en sådan testmetod som möjliggör bestämning av gravidi- tetstillståndet före implantation av det befruktade ägget i endometrial 'vävnad har kortfattat diskuterats ovan och dessa fördelar såväl som den signifikativa nyttan därav vid grundläggande forskning beträffande re- produktion hos människa enligt uppfinningen är uppenbara vid jämförelse med teknikens ståndpunkt. ' Vad beträffar de fundamentala likheterna avseende bindnings- mekanismen vid föreliggande receptor-kemiska testmekanism och den väl- kända immunokemiska testmekanismen är det möjligt att tillämpa de förut 'utvecklade indikationsmekanismerna i samband med föreliggande upp- finning. Indikatorsystemet kan således bestå av ett indikatormaterial, som behandlats med HCG på så sätt att i närvaro av receptorn kommer indikdtormaterialet att avfärgas, färgas, agglutineras, precipitcras eller ge någan annan synbar eller kemisk indikation.pà närvaro eller i frånvaro av HCG i det för testning avsedda vattenhaltiga provet resp. kroppsvätskan. Det framgår emellertid tydligt av det föregående att i de mest_effektiva resultaten erhålles när en radiologisk analysteknik användes såsom indikatorsystem. Radioreceptoranalys-utföringsformen av uppfinningen representerar således tydligt den bästa tillämpningen av uppfinningen. Det bör icke desto mindre inses att uppfinningen icke ligger i tillhandahållandet av ett särskilt indikationssystem för an- vändning vid föreliggande metod, utan i den fundamentala och nya till- E 7905898-8 1-1 lämpningen av receptor-kemisk teknik och en specifik receptor för bestämning av närvaron av HCG och/eller PRL. _ På grund av den extrema graden av specificitet och känslighet vid radioreceptoranalysmetoden enligt uppfinningen är det möjligt att göra en tillfredsställande bestämning på ett extremt litct prov. Sá- ledes är det exempelvis möjligt att vid tillämpning av metoden enligt uppfinningen för testning av graviditet möjligt att utföra testet pà endast ungefär 0,1 ml eller därunder av blod från patienten. Provtag- ningen pà patienten kan utföras genom ett enkelt nàlstick i finger- spetsen. Metoden enligt uppfinningen är vidare effektiv för bestämning av HCG i ett godtyckligt vattenhaltigt prov och således kan man lämp- ligen använda antingen blodserum eller urin från patienten.

Den specifika receptor som användes vid testmetoden enligt uppfinningen härleder sig från ovarievävnad. Receptorn är såsom nämnts mera selektiv för HCG och HCG-liknande material eller PBL än vad fallet är med en HCG- eller PRL-antikropp, eftersom receptorn för bindning kräver den vativa konfigurationen av hormonet i sin biologiskt aktiva form. Det finns således icke någon möjlighet till ett icke-specifikt immunsvar. Hos samtliga djur som uppvisar denna specifika receptor är den med lätthet pävisbar i ovarievävnaden, vilken representerar mål- vävnaden för hormonet. Ehuru receptorn kan isoleras från varje dägg- djur och möjligen från vissa icke-däggdjur, är det särskilt lämpligt att ta receptorn från ovarierna hos relativt stora.djur, såsom ko, fâr, svin, häst och liknande på grund av att dessa djur uppvisar en propor- tionellt större mängd ovarievävnad och att de kommersiellt slaktas för sitt kött. Det har fastställts att upp till 200 graviditetstester kan utföras med ett enda koovarium. Ovarierna hos exempelvis råtta är så små att de är opraktiska såsom receptorkälla. Såsom diskuteras i det följande är testmetoden enligt uppfinningen även tillämplig på djur som uppvisar rcceptorn och därför ger positiv påvisning av dräktighct hos en given art en metod för screening av djur med avseende på när- varon av receptorn.

Det djur från vilket receptorn tages är företrädesvis i dräktigt tillstànd vid slakttillfället, eftersom mängden ovarievävnad och antalet receptorställen vid denna tid är maximala. De första tre månaderna av dräktigheten har visat sig vara den lämpligaste tiden för tillvaratagande av vävnaden.

Den specifika receptorn enligt uppfinningen erhålles genom separation av rena plasmamembraner från ovarievävnad och värdering flboon uuAuTv 7905898-8 12 av olika plasmamembranfraktioner genom testning mot isotopiskt märkt HCG eller PRL och urval av den fraktion som visar den effektivaste bindningen för hormonet. Receptorn är extremt beständig och kan för- varas under långa tidsperioder eller kan även åter användas i en andra _ eller följande testprocedur. Plasmamembranreceptorn är beständig efter lyofilisering för graviditetstetet. Den exakta metoden för framtag- ning av receptorn beskrives närmare i det följande.

Eftersom testmetoden enligt uppfinningen icke är artspecifik, ~kan den även användas för att påvisa graviditet hos något av de djur som visat sig uppvisa den specifika receptorn enligt uppfinningen. Även om receptorn_är mycket specifik med avseende på HCG hos människa och LH hos människa och djur, har den även förmåga att selektivt binda HCG-liknande proteiner, som hos djur har en betydelse motsvarande den hos människa, dvs. att de motsvarar de korioniska gonadotropinerna hos människa. Detsamma gäller för PRL. Fördelen med detta är att standard-laboratorieförsöksdjur, såsom apor, hundar, kaniner, mössk etc., kan testas enligt denna metod, medan separata antikroppar er- fordras för varje djur enligt de immunokemiska testmetoderna.

Märkning av HCG eller PRL med en radioaktiv isotop kan utföras på konventionellt sätt med en lämplig isotop' som väljes för detta ända- mål, sàsqm 1.311, mo, 3H 9011 liknande. En särskilt lämplig isotop är en sådan av jod, såsom IZDI, med hänsyn till att märkning med denna isotop är relativt enkel och många laboratorier har den utrustningen som är nödvändig för uppmätning av denna isotop. iVed beträffar samtidig horncnbestänning enligt receptoranalys- tekniken enligt uppfinningen är det nödvändigt att märka varje för be- .stämning avsett hormon med en urskiljningsbar isotop för att mätning av de bundna och/eller obundna hormonfraktionerna skall ge en separat indikation på varje för bestämning avsett hormon. êär man således utför _en.liknande bestämning av HCG och PBL, kan renade prover av dessa tvâ 0 l2 ' l l H . l . _ ._ . hormoner markas med 1 51 resp. 3 I och lattlllgangllga lmpulsraknlngs- metoder kan sedan användas för separat impulsräkning av varje isotop.

För en mera fullständig beskrivning av uppfinningen redogöres vi det följande för flera olika specifika metoder för framställning av testreagenser och tillämpning av radioreceptoranalys såväl som speci- fika ekempel på kliniska bestämningar med tillämpning av föreliggande, uppfinning, varvid det bör inses att beskrivningen av de beskrivna I specifika-procedurerna enbart är âskà'liggörande och icke i något avseende begränsande. " ' p ' ___ ___, g P00 , ff" amfiplj 7905898-8 13 I. Radioisotopisk märkning av hormon Höggradigt renat HCG (innehållande 12.000 IE/mg) användes för testning. HCG märktes med 1251 med användning av laktoperoxidas, fram- ställd ur mjölk (RZ = 0,78, Sigma Company, St. Louis, Missouri). 2 mCi 1251 i 20411 o,11v1 netriumeeetetbuffert med pH 6,0 blandades med 25 eg HCG i en reaktionsvial. En mängd av 50 ng laktoperoxidas i 20 ul och 200 ng H202 i 10 ul vatten nedfördes därefter i vialen. Tre portioner om 100 ng H202 tillsattes med intervall om fem minuter. Efter 20 minu- ter avbröts reaktionen genom tillsats av 0,5 ml 0,l5M NaCl-lösning, innehållande l % bovint serumalbumin (BSA) med pH 7,0. Det märkta hor- monet avskildes därefter från fri jod genom gelfiltrering på en pelare (1 x 30 cm) av Sephadex G-100, jämviktsinställd med 0,l5M NaCl, inne- hållande l % BSA, med pH 7,0. Den specifika aktiviteten av märkt HCG bestämdes genom precipitation med triklorättiksyra. 5 ul av den orena reaktionsblandningen utspäddes till 5 ml med 0,05M fosfatbuffert med pH 7,5, innehållande'0,l % BSA. 200 pl av denna lösning försattes med 400 pl triklorättiksyra till en slutlig koncentration av 10 % triklor- ättiksyra. De utfällda proteinerna tillvaratogs genom centrifugering.

Den radioaktivitet som förbands med det utfällningsbara materialet ansågs såsom proteinbundet och användes vid beräkningen av den specifik aktiviteten för det märkta hormonet. Den orena reaktionsblandningen renades medelst gelfiltrering genom en pelare (1 x 30 cm) av Sephadex(É G-50, jämviktsinställd på l % BSA i 0,9 % NaCl. Den specifika aktivi- teten hos HCG använt vid radioreceptoranalysen var 20-30 uCi/pg.

Den biologiska aktiviteten hos märkt HCG, använt vid testet, bestämdes genom ovarie-askorbinsyrautarmningsanalys och visade sig vara 8923 IE/ mg med de 95%-iga konfidensgränserna 5826-12250 IE/mg.

HPRL joderades enligt Hunter och Greenwood med mindre modifie- ringar: so pi o,5m feefetbuffert med pH 7,5 föreettee med 1 mci Ne 1291 (New England Nuclear, Boston, Massachusetts), 5 pg hPRL och 70 pg klor- amin-T och efter 15 sekunder med natriummetabisulfit. 100 mg "iobeads" (Hycel Eeagents, Houston, Texas) sattes till den orena joderade bland- ningen för adsorption av icke omsatt l25I. Även hPRL joderades enzyme- tiskt med laktoperoxidas (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri).

Rening utfördes genom gelfiltrering på en pelare (0,7 x 18 cm) av Sepha dex G-100. Den specifika aktiviteten och renheten av märkt PBL be- læi-hrnïce förmege ett specifikt bindas till vävnad från mjölkgivande råtta användes för undersökning av bindningen med speciellt renat ovariehomogenat. stämdes genom kromatoelektrofores.

; PÛÛR QUALITY vøospsss-s ' 14 -II. Framställning av receptor Alla procedurer vid framställningen av plasmamembraner utfördes i ett isbad eller vid.4b. Färska bovinovarier från tidig dräktighet (första trimester: fosterlängd från krona till svans upp “till 22 cm) erhölls från slakthuset och förvarades i flytande kväve, tills de bearbetades. Vid ett typiskt försök skars 100 g vävnad från ungefär 25 stora corpora lutea i små bitar med ett skarpt stålblad och maldes i 500 ml l0mM Tris-H01-buffert med pH 7,8, innehållande l mM MgCl2, l mM ditiotreitol, 10.000 I.E. "Trasylol" (FBA ïharmaceuticals) per liter och 0,25 M sackaras. Homogenatet filtrerades genom två sikt av ostduk och de större partiklarna behandlades åter i 500 ml av bufferten§ Vävnaden homogeniserades ytterlígare_medelst 10-15 slag i¿en Teflon-glashomogenisator, typ 0, med en klarningsstorlek av 0,12- 0,l7 mm vid 4°. Homogenatet'centrifugerades-vid 650 x g under 20 minu- ter i en kvld Sorvall-centrifug (RC B, rotor GSA) för eliminering av intakta celler, celldebris och kärnor. Det överstående materialet från 650 x g-centrifugeringen centrifugerades åter vid 13.000 x g under 20 minuter i samma centrifug. Det överstående materialet bortkastades poch pastillen suspenderades åter i 50-70 ml av Tris-H01-bufferten med hjälp av Teflon-glashomogenisatorn. Denna suspension injicerades i kärnan av en TI-14-zonrotor (modell Beckman Spinco L3-50) med en 2 hastighet av 3000 varv per minut och innehållande 500 ml linjär sacka- rosgraaient (mcs ruin-agree 113oo-pumpc) från 3o ø (vikt/vplym) till 50 %-(vikt/volym) sackaros och l20 ml av en kudde av 50 % (vikt/volym) _sackaros (pumphastighet 20 n44minut){ Ett överskikt av 20 ml injicera- des efter provet. Efter två timmars centrifugering vid 45.000 varv .per minut retarderades centrifugen och rotorinnehållet ersattes med 55 % sackaros vid 20 ml/minut. Plasmamembranerna borttogs från rotorn 'för att öka partikelstorleken och fraktioner om 12 ml tillvaratogs och frystes omedelbart tills de analyserades med avseende på bindning och enzymatisk aktivitet. Membraner upprätthölls i fryst tillstånd under tre månader utan tydlig förlust av bindningsförmåga. Portioner av fraktionerna uttogs för elektromikroskopering före frysning. Sackarosen i suspensionen störde icke bindningen av märkt HCG.

,Portioner av ovariehomogenatet och lämpliga portioner av de olika fraktioner som erhållits från den kontinuerliga sackaros- densitetsgradienten solubiliserades i 1 M Na0H, innehållande 0,1 % natriumdodecylsulfat för bestämning av proteinhalten enligt Lowry, J.

Biol. Chem., lg; (1951), 265, med användning av bovint.serumalbumin såsom standard. Portioner av de olika fraktionerna kombinerades även med HCG märkt med 1125 och bindningsgraden uppmättes i varje enskilt fi P00 :QUALJILL 7905898-8 15 fall. På basis av proteinkoncentrationen uppvisade plasmamembranerna, innehållande den specifika receptorn för märkt HCG en l0-faldigt större bindning än det orena ovariehomogenatet.

Varje fraktion analyserades även med avseende på förorening genom undersökning av dess enzymatiska aktivitet. Varje fraktion analyserades med avseende på 5'-nukleodias-aktivitet enligt Song et al J. Biol. Chem., gåg (1967), 694, och det frigjorda oorganiska fosfatei uppmättes enligt Fiske et al, J. Biol. Chem., Éá (1925), 375. Cytokron C-reduktas analyserades enligt Cooperstein et al, J. Biol. Chem., l§2 (1951), 665.

För ytterligare kontroll av plasmamemhranernas renhet underkastades de individuella fraktionerna elektronmikroskopering.

En portion av varje proteinfraktion blandades 24 timmar i 6,25%-ig glutaraldehyd i 0,067 M kakodylatbuffert med pH 7,3. Proverna tvättade fem minuter i kyld 0,25 M kakodylat- eller fosfatbuffert, innehållande l % OsO4 med pH 7,3 under två timmar. Därefter dehydratiserades alla prover genom att föras genom en graderad serie av alkohol och inbädda- des i antingen "Epon" eller "Araldite". Sektioner om 0,06-0,09 pm utskars, färgades med en 4%-ig uranylacetatlösning i vatten och foto- graferades med ett Phillips Em-300 elektronmikroskop.

En fraktion uppvisande den största bindningen mednärkt HCG och låg enzymaktivitet och innehållande rena plasmamembraner, såsc visas genom elektronmikroskopering, eluerades vid en sackarosdensitet av 1,16 (ungefär 35 % vikt/volym). Lämpliga portioner av denna frak- tion förvarades i flytande kväve och användes såsom receptor. 7905898-8_ 16 III. Procedur vid radiorecentoranalys 0 Radioreceptoranalysen utfördes i 10 x 75 ml polystyrenrör enligt de i tabell I angivna föreskrifterna.

' Tabell I Prov Ufspädnings- 1 Plasmamembranf l25I_HCG 2 ¶ - medel proteln: 40 pg Blindprdv l00 pl 100 pl 5 100 pl HCG 3 (ng/ml) ¶ 3,0 5 100 pl ' _ 100 pl ' 100 pl 6,2 0 0 loo pl ' loo pl- ¶ loo pl 12,5 100 pl ' 100 pl ' 100 pl 25,0 100 pl _l0O pl 100 pl 0 50,0 ' 100 pl ¶ _ 100 pl 100 pl el00,0l 100 pl 100 pl 100 pl Plasma (utspädd 100 pl 100 pl lOO pl l:2 # 1250) . ' 1) 10 mM Tris-H01-buffert med pH 7,2, innehållande 0,1 % BSA, l mM.CaCl2 och 20 I.E. Trasylol per rör ' 2) Ungefär (1,5 ng : 50.000 impulser per minut) ¶ 3) 12.ooo I.E. per mg (7).

Föreskrifterna för samtidig radioreceptoranalys av hPRL och hCG visas i tabell Ia. 5 Tabell Ia Omärkt hormon 1 Plasma-5 Märkt hormon 3 Kbntroll-4 0 membran 0 plasma ' IÉÉ__-____'TÉI" hPRL hCG Iflhšßß I-hCG 0 100 pl5 loo pl5 loo pl loo pl loo pl' so pl 100,0 0,2 50,0 0,4 ;25g0 0,8 25,5 1,6 6,3- 3,2 _a3,2. 6,3 1,6 12,5 Så Éåfg 0:2 looflo \/ \/” \«' ¿v, 'Ü Ä '\ ¿ Poon ëllllëll 1 5 I v i Poon” nuAuïv 7905898-8 17 l) Dubbel utspädning, utgående från 100 ng i 100 pl inkuberingsbuffert. 2) Ungefär 100 g protein i plasmamembraner isolerat från corpora lutea från dräktig ko. _ - 3) 1251-119111. (6o-.-7o.ooo impulser per minut een rör) een 131I-hcc: (25~30.000 impulser per minut och rör) i inkuberingsbuffert. 4) Plasma från fullständigt hypofysektomiserade individer uppvisande påvisbara nivåer av hPRL och hLH vid respektive radioimmunoanalys 5) Inkuberingsbuffert: 10 mM Tris-buffert, pH 7,3, innehållande l mM MgCl2, CaCl2, O,l % (vikt/volym) BSA och 50 I.E; Trasylol.

Enligt tabell I utfördes inkuberingen under 30 minuter vid 370 i en Dunaboff-vattenbadskakanordning. l ml kylt utspädningsmedel nedfördes därefter i varje rör. Innehållet i rören blandades i en vordexblandare och centrifugerades 20 minuter vid 3.000 x g i en kyld Sorvall-centrifug (modell RGZB, rotortyp HS-4). Det överstående mate- rialet avsögs och pastillerna underkastades impulsräkning i en Packard Autogamme-enoraning med en 517>~1g effektivitet för 1125. standard- kurvorna och hormonkoncentrationen i plasmaproverna beräknades med en tidsynkromiserad IBM+dator med användning av logit-log-transforma- tioner.

En logit-log-linearisering av det jämförande inhiberings- svaret vid radioreceptoranalys av HCG visas i de bifogade ritningarna.

Känsligheten för analysen var lägre än 3,0 ng/ml med en precision av i,l0 %. Intra- och interanalysvariationerna bestämdes genom analys av plasmapool vid olika utspädningar vid 12 analyser var i 5 % resp. 3 15 % under hela analysintervallet, vilket således påvisade hög repro- ducibilitet för analysen..Plasmaprovet från en gravid kvinna uppvisade ett dossvar identiskt med HCG-standarden, vilket bekräftade analysens pålitlighet. Det visade sig föreligga fullständig avsaknad av kors- reaktion med i hög grad renade preparat av FSH, PRL och HPL såväl som plasma från hypotyroida individer, akromegaliska individer och kvinnor under postpartumlaktation, vilket indikerade en hög specificitet vid radioreceptoranalysen. Denna skilde icke mellan HCG och LH, men en reaieimmuneenelys med användning ev :lö-märkt FsH, LH och HCG een antikroppar mot deras hormonspecifika 6-underenheter har visat att det icke föreligger någon höjning av plasmanivåerna för LH och FSH unde tidig graviditet. Brist på åtskillnad mellan HCG och LH påverkar således icke påvisningen av graviditet vid tillämpning av radioreceptoi analysen. ~ 7905898-8 A18 Bindning av l25I-hPRL vid ovariehomogenat _ e En reaktionsblandning, innehållande 100 pl inkuberingsbuffert. som i sin tur innehåller 10 I.E. Trasylol (FBA Pharmaceuticals, New_ Yorkd, 50 pl receptorpreparat, ekvivalent mot l-300 pg protein och ioo ni 125:-hytt (sA; so-70 nci/pg) inkaberadee tva timmer vid 37° i frånvaro och i närvaro av l pgomärkt bovin-PRL. Efter inkuberingen sattes 1 ml iskall buffert till samtliga rör och dessa centrifugerades 0-20 minuter vid 5.000 varv per minut. De överstående materialen avsögs.

Pastillerna, innehållande receptorbundna hormoner, underkastades impuls räkning i en Autogammaeanordning med en effektivitet av 51 % för 1251 (Packard Instrument Company, Downers Grove, Illinois). Specifik bind- g ning beräknades såsom skillnaden mellan bindning i rören med och utan ' var 1,4 x 10 omärkt PBL. ~ Specifik bindning av 1251-hPRL vid plasmamembran från bovin corpora lutea utgjordes av en mättnadsprocess. Mättningen åskådlig- gjordes genom inkubering av plasmamembran från bovin corpora lutea '(150 pg protein) vid 370 under två timmar i 250 ul med varierande kon- oentrationer av 1251-111231.. Bindningekapaoitet/mg protein ooh Kd be- räknade medelst Scatchard-analys av data erhållna från mättnadskurvan “13 n ooh Kd = 1,4 x 10"”. i ' specifik bindning av 1251-119121, vid ovariehomogenat ökade såsom en funktion av mängden tillsatt homogenat och inhiberades genom tillsats_av l pg omärkt bovin PBL till inkuberingsblandningarna. Med _användning av l00 pg homogenat bands ungefär 20-30 % av 1251-hPRL i frånvaro av omärkt PRL. ' _ I vid 37°c ekedde bindningen hastigt under de företa 30 minuter- na; bindningen ökade därefterxlångsamt till en jämvikt vid två timmar.

Vid 0°C observerades endast ringa bindning även efter 18 timmars inku- bering. _ För att åskådliggöra epeoifieiteten för læi-hent-bindningen vid ovariehomogenat inknberades humant tillväxthormon (hGH), humant follikelstimulerande hormon (hFSH), humant luteiniserande hormon (hLH), bovint PRL (bPRL), ovint PBL (oPRL) och humant, korionisk somatomammo- tropin (nos) vid olika koneentrationer. Någon undantrangning av 1251- ehPRL bundet vid receptorproteinet observerades icke för hFSH och hLH. -hCS och hGH hade emellertid förmåga att undantränga receptorbundet ö125I-hPRL; aktiviteten noe hen-preparat beträffande undantrangiiing av receptorbundet 1251-hPRL var ungefär 0,5-l % hPRL. Bovina och ovina PBL-preparat visade sig ha en lika aktivitet beträffande konkurrens med l25I-hPRL. En avsaknad av konkurrens för FSH och LH med PBL beträf- fande receptorbindning åskåådliggör PBL-specificitet för receptor- 7905898-8 is stället, hCs, som uppvisar både strukturella och biologiska likheter med PRL och viss korsreaktivitet; korsreaktiviteten om 0,5-l % obser- verad med hGH-preparatet överensstämmer emellertid i mycket hög grad med rapporterad förorening med hGH.

IV. Kliniska tester På 100 individer, som gått över tiden för den första väntade menstruationen och var potentiella kandidater för miniabort, uttogs blodprover för radioreceptoranalys och 24 timmars urin tillvaratogs för agglutinationstester (Pregnosticon-Dri-Dot Test). Fysikalisk och underlivs-undersökning, ändring av livmoderns storlek och konsistens och andra symtom på möjlig graviditet bedömdes. Om radioreceptorana- lysen var positiv, utfördes oberoende av ett posifivt eller negativt Pregnosticon-test en miniabort. Samtliga prover sändes till det pato- logiska laboratoriet för att bekräfta graviditet. Tre patienter abor- terade spontant och tre patienter, som utvecklade ektopisk graviditet, diskuteras separat. Blodproverna centrifugerades 15 minuter vid 2.500 varv per minut och 40°C och plasman eller serumet förvarades vid -200, tills användningen.

Radioreceptoranalys med avseende på HCG i blod utfördes 77 gånger med 72 patienter för bestämning av närvaron av tidig graviditet Noggrannheten vid testet bestämdes genom jämförelse därav med Pregno- sticon-Dri-Dot-testet och närvaron av graviditet bekräftades genom histopatologisk undersökning av endometrialprover, erhållna vid elekti 'eller spontan abort. De vanliga kliniska kriterierna, exempelvis för- storing av livmodern eller igångsättning av menstruation, gav ytter- ligare bevis som bekräftar noggrannheten av radioreceptoranalysen. 41 patienter uppvisade en negativ radioreceptoranalys och ett falskt positivt Pregnosticon-resultat associerades med denna grupp Samtliga 41 individer ansågs såsom icke gravida vid ytterligare kli- niska observationer. 7 > I 14 fall av abort bekräftade den patologiska diagnosen medelst extraherad vävnad resultatet av radioreceptoranalysen. 7 av 14 miniaborter uppvisande decidual- eller placentavävnad, som bekräftade graviditet, hade P0SitiV radioreceptoranalys, men negativt Pregnostiom test. _ ' , u Pregnosticon-testet var icke heller tillräckligt känsligt för att påvisa tidig graviditet, medan man med radioreceptoranalys kan påvisa en graviditet så tidigt som dag 4 efter ovulationen och denna metod visade sig vara av stort värde vid hotande abort. Fyra tidigare hotande aborter inom de första sju veckorna av graviditet gav positiv reoeptoranalys, men samtidigt ett negativt Pregnosticon-test. Patien- fítítíñlä auAuTv g~79o5s98-s 20 terna aborterade spontant i varje enskilt fall och livmoderinnehållet, som tillvaratogs avslöjade korionisk vävnad. I de fyra graviditeter som_avbrutits genom spontan abort fortsatte färgningen 10-14 dagar och livmodern var icke_tillräckligt förstorad i förhållande till graviaitetens varaktighet, vilket inaikeraae ett abnormt tillstånd vid tillväxt och utveckling av embryo ochIplacenta.

I Från 20 individer som besökte mödravârdscentralen uttogs blodprover dagligen under menstruationscykeln för bestämning av FSH och LH genom radioimmnnoanalys. På basis av BBT, plasmanivåer för FSH och LH, urinär extretion av östrogen och progesteron och karakteristiska ändringar i cervikalslem såsom bevis på ovulation antogs dessa kvinnor bli gravida. Blodproverna från fyra av dessa kvinnor som blev gravida analyserades för fastställande av nivåerna för radioreceptoranalysen _och nivåerna för FSH och LH genom radioimmunoanalye på dagen för ovula- tion ooh under tidig graviditet. Dagen för ovulation hos dessa fyra gravida kvinnor bekräftades slutligen genom FSHA och LH-bestämning i blodet. Totalt 15 normala graviditeter testades under den period som omfattade ovulation och tidig graviditet. En sammanfattning av samtliga behandlade individer lämnas i tabell II.

Tabell II Antal I Dag efter Raaioreceptoranaiys Aggiutinations- utebliven mens blod i g test - urin e Miniaborter- _ I I 3 8-ll' + + _ s 6-14 + - 5* 1-11 - i - Normala graviditeter i I 8 14-33I + _ + 7 O-42 + I - Möjliga ektopier I l 14 + o - 1 I _ _ Spontan abort I 3 5-17 + - Icke gravid 43 O-40 I - " I - 1 - I + I* 5 icke-graviditeter rapporterades två gånger /íçíïí/I* iißliiïfl/ Ä 79Û5898-8 21 I det följande lämnas ytterligare fallhistoriska sammanfatt- ningar, som har till uppgift att vidare åskådliggöra värdet av den radioreceptoranalytisk tekniken. H I En 23 år gammal para III, gravida IV, undersöktes åtta dagar efter den utebliven menstruation. Pregnosticon-urintestet var negativt och radioreceptoranalysen var positiv. En miniabort ut- fördes dagen efter pâvisad placentavävnad.

På en 20 år gammal nulligravida apterades en intrauterin an- ordning och nio månader senare var menstruationen nio dagar förse- nad; radioreceptoranalysen var positv. Denna analys var åter positiv två dagar senare och en miniabort avslöjade korionisk vävnad. Två preg nosticon-tester utförda på samma dagar var negativ. En 28 år gammal nulligravida med 28 dagars cykel var 17 dagar sen med menstruationen; radioreceptoranalysen var positiv och Pregnosticon-testet var negativt Flera dagar senare skedde en spontant abort. Tre månader senare unders tes hon åter fem dagar efter den första uteblivna menstruatinsperioden. Ämen i detta fall var radioreceptoranalysen positiv och Pregnosticon-testet negativt. Divmodern tillväxte icke, mörkfärgning började och varade till en spontan abort åter skedde fyra veckor efter den uteblivna cyke Vävnadsundersökning av den andra aborten avslöjade en amniotisk säck utan fetus. ' I ett annat fall undersöktes en 30 år gammal gravida I 12 dagar efter utebliven cykel. Efter 2 veckors oregelbunden färgning och ifrågasatt livmoderförstoring skedde en spontan abort.

Hos två patienter med misstänkt ektopisk graviditet visade den ena positiv radioreceptoranalys och den andra ett negativt test.

Den förra visade sig ha obruten tubalpregnans. Båda uppvisade negativa Pregnosticon-tester. Det följande avser en kort beskrivning av den ektopiska graviditeten: en 40 år gammal para I, gravida I, medxnnbliven menstruationscykel utvecklade omedelbart därefter mild lägre abdominal-smärta och vaginalfläckning, som varade två veckor. Hemagglu ~tinations-inhibitionsrörtestet var negativt dagen efter inläggning.

Radioreceptoranalysen på dag 2 var positiv. Den tredje dagen avslöjade "currettage" icke något bevis på graviditet; cul-de-sac-punktur var negativ, laparoskopi visade en obruten ektopi_till vänster, som av- lägsnades genom efterföljande laparotomi. 13 patienter intogs på sjukhus på grund av misstänkt ektopis graviditet. Den sista menstruationsperioden hade föreh¥fim_fnå,23 till 75 dagar före inläggningen. Lägre abdominal-smärta, amorrè, frekvent vaginalfärgning och en adnexal massa utgjorde de vanliga upptäckterna. /////i /šon fl QÄAUW 7905898-8 22 Ebsmaprover uttogs från varje patient före det kirurgiska ingreppet ioch i ett fall under fyra separata dagar för radioreceptoranalysen med avseende på HCG. Konventionella hem- och latexagglutinationstester utfördes samtidigt på urinprover. Resultaten från graviditetstester och patologiska upptäckter presenteras i tabell III.

Tabell III " c Jämförelse mellan graviditetstester och patologiska upptäckter hos l3 misstänkta ektopiska graviditeter s Éadioreceptor- Agglutinations- Patologi tubal Dagar efter I analys 7 test' ektopi sista mens (antal patienter) “7 positiva 7 negativa 7 positiva 2l,23,24,36,4l;5l,76 3 positiva 3 positiva _ Ä '3 positiva' 29,6l,65, l negativ: l positiv p l negativ okänt 2 negativa 2 negativa 2 negativa 30,48 Tabell III indikerar de resultat som erhållits från radio- receptoranalys och hemagglutinationstester hos 13 misstänkta ektopiska graviditeter och dessutom från tiden för de sista menstruationerna och de tubala histologiska upptäckterna. 7 av 10 ektopiska graviditeter uppvisade en positiv radioreceptoranalys och negativt hemagglutinations- test, men ingen falsk positiv radioreceptoranalys erhölls. Man fann ett brett intervall för graviditetens varaktighet, nämligen mellan 23 och 76 dagar efter den sista uteblivnapefißaan' ' Logit-logtransformationen av standard HCG-dos-svarskurvan gav en känslighet av 0,3 ng eller 3 mI.E./HCG/ml (fig. 2). I denna figur ,avser TSH plasma från hypotyroidpatienter; HGH plasma från akromegaliska individer; PBL plasma från kvinnor med postpartumlaktation. mI.E. (2nd International Reference Preparation) ekvivalent mot motsvarande ng av »HCG indikeras på ordinatan. Olika utspädningar_av plasmaprovet från_ ~ en gravid kvinna gav en lutande parallell till den av HCG som indikerade säkerheten för provet. Man fann icke någon korsreaktion med FSH, TSH, HGH och HRL i provet. Man fann vidare ett 98-l02%-igt utbyte av HCG som satts till plasmaproverna med känd hormonkoncentration. Intra- och interanalysvariationen i de uppskattade hormonnivåerna i plasmapooler var 6 resp. ll %. Badioreceptoranalysen skilde emellertid icke mellan LH och HCG. Denna olägenhet kringgicks genom följande observationer: (1) att varken LH eller FSH ökade under tidig graviditet, såsom fast- f Poon mailing: 7905898-8 23 ställts genom specifik B-underenhetsradioimmunoanalys av FSH, LH och HCG i blodet, (2) att standardproverna innehöll samma mängd plasma erhållen från icke-gravida kvinnor under lutealfasen, uppvisande låga nivåer av LH, (3) att alla okända prover jämföres med en pool av plasma från icke-gravida kvinnor och olika utspädningar av en pool av plasma från gravida kvinnor, som analyserats rutinmässigt, med varje analys med avseende på noggrannhet och kvalitetskontroll och (4) slutligen att under tidig graviditet är HCG-LH-nivåerna 2-3 gånger högre än de basala LH-nivåerna hos icke-gravida kvinnor under lutealfasen.

I fig. 3 jämföres HCG-nivåerna vid 10 ektopiska graviditeter med normal intrauterin graviditet hos två individer (H.DJ, R.S.) och en inducerad ovulation och graviditet (S.L.) med l0.000 I.E. av HCG, som övervakades med radioreceptoranalys. Plasmanivàerna för HCG under tidig inducerad eller naturlig graviditet liknande varandra. Graviditetsdagen baserades på den sista menstruationsperiod som rapporterats av patien- terna. Hos en av de l0 patienterna (A.....A) utfördes radioreoeptor- analysen på dag 21, 24, 30 och 42 av graviditeten. De positiva radio- rcceptoranalyserna på dag 21 och 24 associerades med negativa Pregnosti- con-tester. Igångsättningen av HCG-höjningen efter LH-toppen påvisades först i de blodprover som uttagits först dag 6-8 efter ovulation och den kan därför ligga tidigare efter befruktningen. Vid 3'av ektopierna hade analyserna utförts före den första uteb1fima¿mmsuQmtnmEn nivåerna av HCG hos 4 låg därför inom ramen för normal graviditet.

De övriga 6 ektopiska HCG-nivåerna var lägre än de normala. Dessa observationer indikerar att de tidigare nidationerna i tuban före avlossning och blödning kunde avsöndra normala mängder HCG. När emeller- tid senare under blödningen ökad separation och reducerad blodtillför- sel uppkom, avtog HCG-sekretionen.

Såsom visas i fig. 3 var i föreliggande serie av 13 miss- tänkta ektopiska graviditeter HCG 22 och 35 ng/ml eller 0,26 resp. 0,42 I.ß. i två av de 13 fallen. Påvisningen av HCG vid dessa låga nivåer befrämjade den korrekta behandlingen av patienten i ett tidigare stadium.

De övriga patienterna uppvisade värden om över 100 ng/ml. Nivâerna av HCG på dag 21, 24, 30 och 42 av graviditeten (fig. 3) erhölls från samma patient. Initialtestet assooierades med ett negativt Preg- nosticon-test, men båda testerna var positiva vid tre efterföljande bestämningar. På dag 64 visade sig ett abdominalingrepp vara erforder- ligt på grund av en på höger sida avbruten gr viditet.

Badioreceptoranalysen av HCG med en känslighet av 50 pg eller 3 mI.E./ml plasma har gett en nästan 100%-ig pålitlighet vid påvisning' av graviditet efter den första uteblivna cykeln. Detta test :f/lïfiwlíilß - ÛUÅLffY

Claims (1)

1. o79o5a9sès QH PATENTKRAV l. Metod för samtidig bestämning av hormonerna humant, korioniskt gonadotropin (HCG) och prolaktin (PRL) i ett och -samma vattenhaltiga prov, såsom kroppsvätska från en kvinna med misstänkt graviditet, särskilt blodserum eller urin, varvid provet bringas i kontakt med skiljaktigt märkta hormoner och en receptor för hormonet och mängden hormon bestämmes på i och för sig känt sätt, k ä n n e t e c k n a t därav, att man 'sammanför provet med ett bindningsmedel, som har förmåga att binda vart och ett av hormonerna i provet, vilket medel utgör ett plasmamembranextrakt från ett kropsorgan hos människor eller djur sun i _nämnda organ uppvisar den specifika receptorn för vart och ett _av hormonerna och som framställts enligt en metod som omfattar steg för beredning av ett finfördelat vävnadshomogenat från Corpus luteum-vävnad, separation av plasmamembranerna från homogenatet och val av den plasmamembranfufiifim1sauhariir- måga att selektivt binda biologiskt aktivt PRL och HCG, var- efter man avskiljer bindníngsprodukterna innehållande hormoë Knerna, vilka skall bestämmas för indikation av att bindningen ägt rum, och observerar var och en av nämnda bindningspro- dukter för bestämning av närvaron av vart och ett av hor- i IIIOIIEIIIE. . ' .2_ - Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e a t e c k n a t därav, att mätningsmedlet omfattar radioisoto- piskt märkt HCG och ett på annorlunda sätt radíoisotopiskt märkt PRL, varvid isotoperna för märkning av HCG och PRL är olika. 3 Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e - -t e c k n a t därav, att stegen för tillhandahållande av observation av nämnda indikationsmedel omfattar sammanföring av receptorn och provet i närvaro av nämnda radioisotopiskt märkta HCG och nämnda radioisotopiskt märkta PRL, varigenom en del av vart och ett av de märkta hormonerna och en.del av det omärkta hormonet närvarande i provet bindes vid receptorn, ' i :e_.ec:;_':;:::" v oo l QUALÉL _ 7905898-8 25 separation av de receptorbundna hormonerna från obundna hor- moner i det vattenhaltiga provet och uppmätning av radioakti- viteten för nämnda isotoper i åtminstone nämnda separerade receptor eller det vattenhaltiga provet för bestämning av kon- centrationen av vart och ett av hormonerna såsom en fnnktion av den uppmätta radioaktiviteten. 4_ Förfarande enligt patentkravet 5, k äln n e - t e c k n a t därav, att nämnda radioisotopiskt märkta HCG och PRL är märkta med två olika jodisotoper. ' Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e - 5. t e c k n a t därav, att isotoperna utgöres av 1251 och l3lI. 6.- Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e - t e c k n a t därav, att provet är en kroppsvätska från en kvinna. ' 7. Förfarande enligt patentkravet 8, k ä n n e - t e c k n a t därav, att vätskan är blodserum eller urin. 8, Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e - t e-c k n a t därav, att receptorn erhålles från corpus luteum från ett djur, nämligen ko, får, svin eller häst. 9. Förfarande enligt något av patentkraven 1-10, k ä n n e t e c k n a t därav, att receptorn härleder sig från en honkönsindivid i den första tredjedelen av gravidi- teten. l0_ Medel för bestämning av ett flertal hormoner i ett vattenhaltigt prov enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav, att det omfattar (a) ett första reagens och ett andra reagensf (b) det första reagenset omfattar i väsentligen ren form den specifika fraktionen av plasmamembranextrakt från ett kroppsorgan hm människor eller djur med den specifika receptorn i nämnda organ för selektiv bindning av vart och ett av nämnda hormoner i biologiskt aktiv form, och som framställts enligt en metod som omfattar steg för beredning av ett finfördelat vävnads- ,z““' _ zí í oo i (ÉJAUT 7905898-3 Qb homogenat från corpus luteum-vävnad, separation av plasma- membranerna från homogenatet och val av den plasmamembranfrak- tion som har förmåga att selektivt binda biologiskt aktivt PRL och HCG,, 7 _ (c) nämnda andra reagens omfattar vart och ett av de för bestämning avsedda hormonerna i märkt form med förmåga att emittera strålning, varvid den emitterade strålningen är olika för varje märkt hormon, och varvid nämnda första reagens är avsett att sammanföras med provet, innehållande det för upp- mätning avsedda hormonet och med de andra reagensen för bind- ning av de märkta och omärkta hormoner som bindes vid recep- torn, varvid den emitterade strålningen från varje märkt ' hormon är en funktion av koncentrationen av respektive hormon i ett vattenhaltigt prov. ll. Medel enligt patentkravet 12, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det första reagenset omfattar ett plasma- membranextrakt från corpus luteum hos ett däggdjur och att nämnda andra reagens omfattar radioisotopiskt märkt, humant, korioniskt gonadotropin och prolaktin, vilket möjliggör sam- tidig indikation av HCG och PRL. nun i uußlfill