DE69131237T2

DE69131237T2 - Hormonnachweisverfahren.

Info

Publication number: DE69131237T2
Application number: DE69131237T
Authority: DE
Inventors: Michael O'connor
Original assignee: Enfer Technology Ltd
Current assignee: Enfer Technology Ltd
Priority date: 1990-08-23
Filing date: 1991-08-23
Publication date: 1999-09-02
Anticipated expiration: 2011-08-24
Also published as: DK0544805T3; IE74193B1; ES2128324T3; US5460976A; ATE175277T1; AU8524191A; NZ239528A; WO1992003738A1; EP0544805A1; DE69131237D1; EP0544805B1; AU659612B2; AR245824A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fruchtbarkeitsprobleme bei Tieren, insbesondere bei Pferden, Kühen, Schafen und Schweinen, und stellt Verfahren bereit, durch die die tierische Fruchtbarkeit maximiert werden kann.
Die Fruchtbarkeitsrate bei Vollblutpferden beträgt etwa 60%. Dieses niedrige Fruchtbarkeitsniveau wird durch eine Anzahl von Faktoren verursacht, welche einschließen: zu frühe Paarung der Stuten in der Zuchtsaison, wenn die Hormonspiegel nicht optimal sind; Einschränkung der Verwendung des Hengstes, so daß die Stute nicht zum Zeitpunkt der Ovulation beschält wird; Hormon-Ungleichgewichte bei der Stute als Ergebnis einer anstrengenden Rennlaufbahn, und Paarung von Hengsten und Stuten, die nicht wegen der Fruchtbarkeits-, sondern eher wegen ihrer Rennleistung ausgewählt sind.
Um hohe Empfängnisraten, einen niedrigen Fortpflanzungsverlust und hohe Fohlungsraten bei der Stute zu erhalten, ist es notwendig, die Stute mit einem hochfruchtbaren, frischen Hengst 12 bis 24 h vor der Ovulation zu beschälen. Die Zeitwahl ist kritisch, um es den Spermien zu erlauben, angemessene Speicher im Fortpflanzungstrakt der Stute zu bilden, und damit die Endreifung oder Befähigung der Spermien im Uterus/in den Eileitern vor der Ovulation stattfindet. Obwohl Samenzellen des Hengstes für 3 bis 5 Tage im Fortpflanzungstrakt der Stute überleben können, haben sie ihre höchste Befruchtungskapazität innerhalb 24 h der Beschälung. Im Gegensatz dazu wird angenommen, daß die fruchtbare Lebensspanne der ovulierten Eizelle von kurzer Dauer ist, d. h. 8 bis 12 h, und damit die kritische Notwendigkeit besteht, die Stute zum optimalen Zeitpunkt vor der Ovulation zu beschälen.
Weil die Dauer der Brunst jedoch variabel ist, im allgemeinen aber bei der Stute eine Dauer von 4 bis 7 Tagen aufweist und die Ovulation im allgemeinen 24 bis 48 h vor dem Ende der Brunst auftritt, ist es schwierig, genau während der Brunst vorherzusagen, wann die Stute ovulieren wird und wann sie daher beschält werden muß. Im Anschluß an die Rückbildung des Gelbkörpers und dem resultierenden Abfall von Progesteron in der nicht-trächtigen Stute fährt das Follikel zu wachsen fort, und die Östradiolspiegel steigen an. Die Stute wird paarungsbereit, und die Follikelgröße erhöht sich um 2 bis 3 mm pro Tag, und die Östradiolspiegel steigen gleichzeitig mit der zunehmenden Follikelgröße an. Die Follikelgröße erreicht ein Plateau und die Östradiolspiegel beginnen 1 bis 2 Tage vor der Ovulation abzusinken. Mit dem Wachstum des Follikels erzeugt es wahrscheinlich zunehmende Spiegel eines Peptid-Hormons, das Inhibin genannt wird; dieses Hormon unterdrückt FSH im Blut, wodurch nur dem einen, aber manchmal zwei Ovulationsfollikeln erlaubt ist zu reifen. Somit spielt Inhibin eine Schlüsselrolle bei der Unterdrückung von FSH während der Brunst, so daß die Ovulationsrate von Stuten bei 1 in der Mehrzahl der Fälle beibehalten wird. Mit der Entwicklung des Ovulationsfollikels während der frühen Brunst ist das zunehmende Östradiol für die Erweiterung des Muttermundes, einen verringerten Gebärmuttertonus und das Zeigen intensiverer Signale der Brunst vor der Ovulation verantwortlich.
In einer kürzlichen Untersuchung von Woods et al. (Lit. 4) wurde gezeigt, daß der optimale Zeitpunkt zur Besamenung von Stuten etwa 1 Tag vor der Ovulation ist. Die Untersuchung zeigte, daß, falls die Besamen einen Tag vor der Ovulation stattfand, 89% der besamten Stuten trächtig wurden und 14% dieser Trächtigkeiten später einen Embryotod aufwiesen. Wenn die Besamung am Tag der Ovulation stattfand, gab es eine 52%ige Trächtigkeitsrate mit einer 34%igen Embryotodesrate. Eine Besamung am Tag nach der Ovulation resultierte in einer 6%igen Trächtigkeitsrate und einer 33%igen Embryotodesrate.
Selbst die sorgfältigste rektale Untersuchung von Stuten, die zur Zeit durchgeführt wird, worin die Eierstöcke mit einem Ultraschall-Abtastgerät durch das Rektum alle 3 h untersucht werden, werden nur die Ovulation zeigen, wenn sie auftritt. Die oben beschriebene Untersuchung zeigt, daß eine Besamung an diesem Tag nur in einer 52%igen Trächtigkeitsrate mit einer anschließenden 34%igen Embryotodesrate resultieren wird.
Es ist bekannt, daß Östradiol oder ein Hauptmetabolit Östron S04 während der Brunst täglich ansteigt und vor der Ovulation ein Plateau erreicht und abfällt. Somit könnte dieses Östradiol-Muster verwendet werden, um den Zeitpunkt der Ovulation genau zu bestimmen oder vorherzusagen. Diese Beobachtung besaß jedoch keinen größeren praktischen Vorteil für den Gestütleiter wegen eines fehlenden verläßlichen, schnellen (Ergebnisse am gleichen Tag) Assays für Östradiol.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, den Zeitpunkt der Ovulation im voraus genau bestimmen zu können, was es erlaubt, die höchste Trächtigkeitsrate zu erreichen und gleichzeitig den Embyotod zu minimieren. Ein weiteres Ziel ist es, einen schnellen zuverlässigen Assay zur Bestimmung der Ovulation bereitzustellen, insbesondere einen Assay, der kleine Mengen von Fortpflanzungshormonen genau mißt.
Eine Anzahl von verschiedenen Techniken werden zur Zeit verwendet, um die Trächtigkeit zu optimieren. Die Stuten werden durch Abstrich auf Uterus- und Muttermundinfektionen untersucht und dann mit Antibiotika behandelt, falls festgestellt wird, daß sie infiziert sind. Der Eierstock kann manuell durch den Veterinärchirurgen manipuliert werden, um ein großes Follikel nachzuweisen, wodurch somit festgestellt wird, daß sich die Stute der Ovulation nähert. Ultraschall- Abtasttechniken werden verwendet, um eine Trächtigkeit früh festzustellen. Empirische Behandlungen werden ebenfalls eingesetzt, worin Kombinationen von Hormonen an Stuten verabreicht werden, welche weite Variationen in den Ergebnissen ergeben, und gewöhnlich wird keine Trächtigkeit erreicht. Schließlich wird eine Kombination von Progesteron- Therapie und einer Beleuchtungsregulierung verwendet, um die Stute dazu zu verleiten zu denken, daß es Frühling ist. Die Stuten werden 8 Wochen einer erhöhten Belichtung mit elektrischem Licht ausgesetzt, das Ernährungsniveau wird angehoben, und ihre Heizung wird erhöht. Dieses verursacht einen kleinen Fluß von Hormonen in der Stute und die Erzeugung von follikelstimulierendem Hormon (FSH) und luteinisierendem Hormon ("Lutinizing Hormon" LH) durch den Hypophysenvorderlappen. Dann werden 500 mg Progesteron durch Injektion verabreicht. Das Progesteron beendet die Aktivität des Hypophysenvorderlappens, und es wird angenommen, daß eine größere Menge FSH und LH freigesetzt werden, wenn der Progesteronspiegel wieder abfällt. Die Stute gelangt dann in einen Brunstzyklus und wird paarungsbereit. Diese letztgenannte Technik hat eine annehmbare Erfolgsrate im Vergleich mit überhaupt keinem Eingriff, und 50% der behandelten Stuten können darauf reagieren.
Der spezielle Spiegel jedes Hormons im Blut zu einem gegebenen Zeitpunkt zusammen mit den Spiegeln eines beliebigen der anderen Hormone, die an der Trächtigkeit beteiligt sind, wird einen spezifischen physiologischen Effekt auf den Fortpflanzungsprozeß verursachen. Es ist deshalb wichtig, Zugang zum Spiegel eines Hormons zu haben, um die Trächtigkeit zu optimieren. Falls die Konzentration eines gegebenen Hormons im Blutstrom nicht so schnell ansteigt wie sie sollte, wäre es möglich, direkt eine entsprechende Menge des Hormons zu verabreichen, um den Brunstzyklus zu optimieren.
In einer normalbrünstigen Stute werden sich drei bis sieben Graaf-Follikel im Eierstock unter dem Einfluß geringer Spiegel von FSH und LH zu einer Größe von mehr als 18 mm entwickeln. Dies kann durch Ultraschall-Abtastung festgestellt werden. Von Tag sieben bis Tag zehn des Zyklus findet eine Auswahl eines oder möglicherweise zweier dieser Follikel statt, so daß das Follikel reift und an Größe zunimmt. Der Auslöser für die Reifung des Follikels scheint ein Konzentrationsstoß von FSH im Blut zu sein, der etwa am Tag 7 des Zyklus stattfindet. Es wird angenommen, daß unter den sich entwickelnden Follikeln zu jedem Zeitpunkt ein Follikel ein besseres Kapillarnetzwerk aufweist, welches eine erhöhte Exposition von FSH im speziellen Follikel erlaubt. Mit dem Wachstum dieses sich schneller entwickelnden Follikels schaltet es die anderen Follikel aus, wodurch sie degenerieren, wahrscheinlich durch die Gegenwart eines lokalen Hormons. Somit muß ein angemessener FSH-Spiegel zwischen Tag sieben und Tag zehn beibehalten werden, um die Freisetzung einer Eizelle sicherzustellen.
Östradiol ist ein Hormon, dessen Spitze 48 h vor der Ovulation auftritt, und so würde die Fähigkeit, die Östradiolspiegel zu bestimmen, eine Zeitwahl für die Paarung auf den Punkt der höchsten Fruchbarkeit erlauben. Hohe Spiegel des Hormons Prolactin sowohl bei Hengsten als auch bei Stuten führen zu einem hohen Maß an Unfruchtbarkeit, was durch Bromocryptin behandelt werden kann. Somit kann durch genaue Bestimmung der Prolactinspiegel die Fruchtbarkeit gesteigert werden. Die Spiegel des luteinisierenden Hormons (LH) steigen etwa am Tag 14 des Zyklus an, was einen Riß des Graaf-Follikels verursacht und zur Ovulation führt. Eine Bestimmung der LH-Spiegel erlaubt es, die Paarung zu dem Zeitpunkt stattfinden zu lassen, an dem die Empfängnis am wahrscheinlichsten auftritt.
GB-A-2162946 betrifft die Verwendung bestimmter aromatischer Amine als Verstärker der Chemolumineszenz-Emission und stellt verstärkte Lumineszenz- oder luminometrische Assays und Kits unter Verwendung aromatischer Amine bereit. Die Druckschrift offenbart ebenfalls die Verwendung eines verstärkten Chemolumineszenz-Assays für Steroide wie Östradiol.
EP-A-219352 betrifft ebenfalls Amine, die als Katalysatoren zur Verstärkung des Lichtausgangs einer Chemolumineszenzreaktion verwendet werden, was in einer erhöhten Empfindlichkeit und Nützlichkeit des Assays resultiert. Steroide werden als Gruppe von Verbindungen offenbart, die durch den Assay der Erfindung untersucht werden können.
Es wurde überraschend gefunden, daß menschliche Antikörper, die gegen FSH gerichtet sind, ebenfalls mit Pferde-FSH reagieren können.
FSH tritt bei Säugetieren als ein Glycoprotein mit zwei Untereinheiten auf, wobei die zwei Untereinheiten nicht- kovalent gebunden sind und als α- und β-Untereinheiten bezeichnet werden. Die biologische Aktivität liegt in der β- Untereinheit. Obwohl zu einem gewissen Maße ähnlich, variiert FSH aus unterschiedlichen Tierarten in seiner molekularen Größe, den Aminosäuresequenzen und der Konformationsfaltung (Lit. 1, 2 und 3).
Der Vergleich von FSH von Pferden mit dem vom Menschen zeigt:
1) die α-Untereinheit ist 10 Aminosäuren kürzer bei Pferde- FSH,
2) die α-Untereinheit unterscheidet sich in 26 Aminosäurepositionen zwischen Pferde- und menschlichem FSH, und
3) die β-Untereinheit enthält 6 Aminosäureunterschiede, die beinahe gleich entlang ihrer 118 Reste verteilt sind.
Das Pferde-Molekül ist deshalb vom menschlichen Molekül verschieden.
Es ist besonders überraschend, eine Kreuzreaktivität zwischen den zwei Typen von FSH unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zu finden, da monoklonale Antikörper im allgemeinen als spezifisch betrachtet werden und monoklonale Antikörper normalerweise entwickelt werden, um eine Kreuzreaktion oder verringerte Spezifizität zu vermeiden. Damit ein monoklonaler Antikörper spezifisch für FSH ist, muß es ein Antikörper sein, der gegen die β-Untereinheit herangezogen ist, oder er muß einen Teil der β-Untereinheit zusammen mit einem Teil der α-Untereinheit erkennen, da identische α-Untereinheiten in FSH, dem thyreotropen Hormon ("Thyroid Stimulating Hormone", TSH), LH und Choriongonadotropin (CG) innerhalb einer einzelnen Spezies gefunden werden.
Monoklonale Anti-(menschliches FSH)-Antikörper sind erhältlich von einer Anzahl kommerzieller Quellen, einschließlich Amersham International, Plc., England, York Biologicals International, New York, USA und Immuno Search, New Jersey, USA. Monoklonale Anti-(menschliches Prolactin)- Antikörper, polyklonale Anti-Östradiol-Antikörper und polyklonale Anti-Progesteron-Antikörper sind ebenfalls kommerziell erhältlich von einer Anzahl von Quellen, einschließlich Amersham International, Plc.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Vorhersage der Ovulation bei einem Pferdeartigen bereitgestellt, umfassend die Bestimmung des Spiegels des follikelstimulierenden Hormons in einer vom Pferdeartigen entnommenen Blutprobe durch einen verstärkten Lumineszenz = Immungssay unter Verwendung eines Anti-(Follikel-stimulierendes Hormon)- Antikörpers, worin der Antikörper ein Anti-(Humanfollikelstimulierendes Hormon)-Antikörper ist. Der Östradiol-Spiegel kann ebenfalls unter Verwendung eines Anti-Östradiol- Antikörpers bestimmt werden. Die Ovulation kann aus einer Spitze der Östradiol-Spiegel oder aus dem niedrigsten FSH- Spiegel vorherbestimmt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des follikelstimulierenden Hormons in einem Pferdeartigen bereitgestellt, worin ein Anti-(Humanfollikel-stimulierendes Hormon)-Antikörper in einem verstärkten Lumineszenz- Immungssay verwendet wird. Östradiol kann ebenfalls unter Verwendung eines Anti-Östradiol-Antikörpers nachgewiesen und quantifiziert werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Testkits zum Nachweis von follikelstimulierendem Hormon in einem Pferdeartigen durch einen verstärkten Lumineszenz- Assay bereit, umfassend einen Anti-(Human-FSH)-Antikörper. Das Testkit kann zur Vorhersage der Ovulation verwendet werden. Die Verwendung des Testkits zur Vorhersage der Ovulation kann ebenfalls einen Anti-Östradiol-Antikörper umfassen.
Der Anti-Human-Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein.
Das von Amersham International Plc, England, vermarktete Amerlite (TM)-System ist ein nichtradioaktives Immungssay- System zum Nachweis von Hormonspiegeln im Menschen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein nicht- radioaktives Immungssay-System des gleichen Typs wie das Amerlite-System zur Verwendung beim Nachweis der Spiegel von Fortpflanzungshormonen bei Tieren, insbesondere Pferdeartigen.
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Testkit zum Nachweis von FSH bei Pferdeartigen durch einen immunometrischen Assay, umfassend einen monoklonalen Anti-(Human-anti-FSH)-Antikörper. Der monoklonale Antikörper ist bevorzugt ein Anti-Human-Antikörper der Maus.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Maximierung der Trächtigkeit bei Pferdeartigen, umfassend:
(i) Bestimmung des Spiegels des follikelstimulierenden Hormons in einer vom Pferdeartigen entnommenen Probe mittels eines verstärkten Lumineszenz-Immungssays, der einen Anti- (Humanfollikel-stimulierendes Hormon)-Antikörper verwendet, und
(ii) Besamung des Pferdeartigen innerhalb 48 h des Auftretens des niedrigsten FSH-Spiegels.
Der Östradiolspiegel kann ebenfalls unter Verwendung eines Anti-Östradiol-Antikörpers bestimmt werden, und das Pferdeartige wird innerhalb 48 h des Auftretens des Östradiol-Spitzenspiegels oder sowohl des Östradiol- Spitzenspiegels als auch des niedrigsten FSH-Spiegels besamt.
Unter Verwendung der Techniken der vorliegenden Erfindung können die Fruchtbarkeit und Trächtigkeit in einer Anzahl von Arten maximiert werden:
(1) Bestimme, ob die Stute paarungsungünstig ist: Die ovulationslose, paarungsungünstige Stute kann genau durch Messung des Progesterons im Blut der Stute, das in Intervallen von 4 bis 7 Tagen entnommen wird, diagnostiziert werden. Ein niedriger Progesteronspiegel in einer Sequenz von 4 Proben, genommen in Intervallen von 4 bis 7 Tagen, ist ein schlüssiger Beweis, daß die Stute paarungsungünstig ist. Die Gegenwart eines erhöhten Progesteronspiegels (größer als 1 ng/ml) in einer oder mehreren Proben ist ein Nachweis der Anwesenheit eines Gelbkörpers und daher, daß die Stute ovuliert hat. Diese Information ist besonders wertvoll während des Übergangs von der Nicht-Zucht- zur Zuchtsaison.
(2) Bestätigung der Ovulation: Im Anschluß an die Beschälung in der Brunst können eine oder mehrere Blutproben entnommen und die Progesteronspiegel bestimmt werden, und ein Wert größer als 1 ng/ml ist eine Bestätigung dafür, daß die Stute ovuliert hat.
(3) Verlängerter Diöstrus: Es kann vermutet werden, daß eine nicht-trächtige Stute, die keine Brunst 21 bis 24 Tage nach einer vorhergehenden Brunst (d. h. Fohlungshitze) zeigt, eine verlängerte Aufrechterhaltung der Lebensspanne des Gelbkörpers aufweist (in nicht-trächtigen Stuten sollte er nach 14 bis 16 Tagen aufgrund der endogenen Freisetzung von Prostaglandin F2-α in Abwesenheit des Embryos zurückgedrängt werden). Dies kann bestätigt werden durch Entnahme einer Blutprobe nach dem Ausbleiben des Brünstigwerdens 21 bis 24 Tage nach der vorhergegangenen Brunst und Messung des Progesterons darin. Hohe Progesteronspiegel (größer als 1 ng/ml) bestätigen, daß die Stute noch in der Brunst ist und eine entsprechende tierärztliche Behandlung erforderlich ist.
(4) Primäre luteale Insuffizienz: Im Anschluß an Beschälung, Ovulation und Empfängnis bei der Stute kann ein kleiner Prozentsatz der Stuten unzureichende Progesteronspiegel absondern, um die Lebensfähigkeit des Embyros aufrecht zu erhalten (was Spiegel größer als 2 ng/ml erfordert). Solche Stuten könnten durch Entnahme und Messung der Progesteron- Konzentration in zwei bis drei täglichen Blutproben identifiziert werden, die 6 oder 7 Tage nach der Ovulation entnommen werden.
(5) Überprüfung der Funktion der Hilfskörper: Bei der trächtigen Stute werden die endometranen Foveae in den Tagen 38 bis 40 der Trächtigkeit gebildet, und sie erzeugen Pferde- Choriongonadotropin (eCG oder zuvor genannt PMSG), das verantwortlich ist für die Bildung der Hilfsgelbkörper. Diese erzeugenden große Mengen von Progesteron, das wesentlich ist für die fortgesetzte Aufrechterhaltung der Trächtigkeit und Lebensfähigkeit des Embryos. Falls entweder unzureichendes eCG erzeugt wird oder die Hilfsgelbkörper unzureichend sind, könnte die Fortsetzung der Trächtigkeit gefährdet sein. Die Messung des Progesterons in zwei bis drei Proben, entnommen nach Tag 60, könnte helfen, zu bestätigen oder nicht zu bestätigen, daß die Progesteronspiegel unzureichend waren. Diese Verwendung, obwohl nicht von allgemeiner Bedeutung insgesamt, könnte wichtig sein bei denjenigen Stuten, die dazu neigen, eine Trächtigkeit zwischen den Tagen 45 und 150 zu verlieren.
Die Erfindung wird nun in näherem Detail in den folgenden Beispielen beschrieben werden. Der FSH-Assay wurde mit dem Amerlite-System durchgeführt, das ein vollständiges Immungssay-System ist, umfassend:
(i) Ein Analysator, der ein integrierter Lumineszenz- Leser mit einem Datenreduktionssystem ist, und ein Mikroprozessor,
(ii) ein Mikrotiterplatten-Spüler,
(iii) ein Inkubator/Schüttler,
(iv) eine Pipettierstation - entweder manuell oder robotisch,
(v) ein Interface an einen IBM-kompatiblen Personal Computer - mit "RIA Calc"-Datenreduktionseinrichtungen,
(vi) ein entsprechendes immunometrisches Assay-Kit.
In jedem Fall wurden die Hormonspiegel in den Serumproben von 6 Pferden untersucht.

Beispiel 1 - FSH-Assay

Ein handelsübliches Kit zum Nachweis von menschlichem FSH wurde in diesem Beispiel verwendet (erhältlich von Amersham International Plc.). Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte im Kit werden mit monoklonalen Anti-FSH-Antikörpern des Schafes beschichtet. Der/Die Standard/Kontrolle/Probe wurde in die Vertiefungen gegeben. Ein monoklonaler Anti-Human-anti-FSH- Antikörper der Maus, der an Meerrettichperoxidase gebunden ist, wurde dann hinzugegeben und für 1 h bei 37ºC äquilibrieren gelassen. Das ungebundene Konjugat von monoklonalem Antikörper und Peroxidase wurde durch Absaugen und Waschen entfernt. Ein "Signal"-Reagens (enthaltend Lumineszenz-erzeugende Substrate und ein Persäuresalz) mit einem Verstärker wurde dann in die Vertiefungen hinzugegeben. Eine Komplexreaktion zwischen Peroxid, Luminol und Peroxiden findet statt, worin die Peroxidase das Lumineszenz-erzeugende Substrat oxidiert, und diese Oxidationsreaktion verursacht die Emission von Licht.
Der Verstärker ist ein substituiertes Phenol, das das Ausmaß des erzeugten Lichtes erhöht und seine Emission verlängert. Weil die Lichtniveaus aus verstärkter Lumineszenz hoch intensiv sind, kann die Reaktion optimiert werden, um eine kontinuierliche Aussendung von Licht statt eines Blitzes zu ergeben. Das Lichtsignal kann ohne kritische Zeitabhängigkeit gemessen werden, und das Signal kann erneut gemessen werden, falls gewünscht.
Das gebildete Licht wird 2 bis 20 min nach der Zugabe von Signal und Verstärker gemessen. Die Menge des an die Vertiefungen gebundenen Konjugats ist direkt proportional zur in Standard/Kontrolle/Probe vorhandenen FSH-Konzentration. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 gezeigt.
Es ist ebenfalls möglich, FSH-Spiegel in einer Probe unter Verwendung eines nicht-kompetitiven immunometrischen Assay- Systems vom "Sandwich-Typ" zu bestimmen.

Beispiel 2 - Östradiol-Assay

Östradiolspiegel wurden durch einen kompetitiven Radioimmungssay bestimmt, der Anti-Kaninchen-Antikörper vom Esel und polyklonale Anti-Human-anti-Östradiol-Antikörper vom Kaninchen verwendet. Radioaktiv markiertes Östradiol und kalte(r) Standard/Kontrollen/Probe werden dann zum Assay- System hinzugegeben, wo sie um die Bindungsstellen am gebundenen Anti-Östradiol-Antikörper konkurrieren. Die Menge der gebundenen radioaktiven Markierung ist umgekehrt proportional zur Östradiol-Menge in der Probe.
Der Östradiol-Assay verwendet ein polyklonales Anti- Östradiol-Antiserum vom Kaninchen, das eine gewisse Kreuzreaktivität mit Östradiol-3-sulfat, Östron und Östriol erlaubt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 3

Progesteron- und Prolactin-Spiegel wurden ebenfalls unter Verwendung polyklonaler bzw. monoklonaler Anti-Human- Antikörper bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

FSH mIE/ml (monoklonal)

Amerlite Kontrollen: "Tru-value" Kontrollen

niedrig = 10,3 niedrig = 5,7
mittel = 25,0 mittel = 28,3
hoch = 50,2 hoch = 70,2
Patient I = 1,6 trächtige Stute
Patient II = 3,8 trächtige Stute
Patient III = 14,5 Stute im Zyklus
Patient IV = 14,0 Stute im Zyklus
Patient V = 13,5 Stute im Zyklus
Patient VI = 36,9 Wallach

Prolactin mIE/l (monoklonal)

Amerlite Kontrollen: "Tru-value" Kontrollen

niedrig = 269 niedrig = 12,2
mittel = 1334 mittel = 1817
hoch = 5678 hoch = 5080
Patient I = 21,6 trächtige Stute
Patient II = 208 trächtige Stute (Milch "setzt ein")
Patient III = 29,0 Stute im Zyklus
Patient IV = 28,9 Stute im Zyklus
Patient V = 48,7* (117,7) Stute im Zyklus
Patient VI = 32,0 Wallach
* Ergebnisse der Serumproben unterschieden sich von mittlerenen Ergebnissen der Plasma-Proben.

Östradiol pmol/l (polyklonal)

RSL-Kontrollen Wein-Kontrollen

niedrig = 286 niedrig = 293
mittel = 619 mittel = 2621
hoch = 1841 hoch = 5182
Patient I = 10938* trächtige Stute
Patient II = 11889* trächtige Stute
Patient III = 240** Stute im Zyklus
Patient IV = 520** Stute im Zyklus
Patient V = 240** Stute im Zyklus
Patient VI = 325 Wallach
* Kreuzreaktion mit Östriol ?
** Spiegel sind kompatibel mit Stuten in der Brunstphase des Zyklus und korrelieren mit FSH-Ergebnissen Progesteron nmol/l (polyklonal)
N.N. = nicht nachgewiesen

Beispiel 4

Ein Versuch wurde durchgeführt mit insgesamt 112 Stuten, bei denen Östradiol und FSH-Spiegel im peripheren Blut täglich während des Zeitraums bestimmt wurden, in dem die Stute in der Brunst war, durch die in den Beispielen 1 und 2 erörterten Techniken. Die Stuten wurden ebenfalls durch einen Kliniker unter Verwendung herkömmlicher Techniken zur Bestimmung der Ovulation untersucht, z. B. rektale Untersuchung auf die Entwicklung von Größe, Weichheit und Kontur der Follikel und Relaxation des Muttermundes. Ultraschall-Abtastung wurde ebenfalls verwendet, um das Follikelwachstum zu messen und um zu bestimmen, wann die Ovulation aufgetreten war, beruhend auf dem Verschwinden des vor-ovulatorischen Follikels und der Gegenwart eines hämorrhagischen Körpers an dessen Stelle am nächsten Tag.
Ein Vergleich der Hormon-Spitzenspiegel im Verlauf der Ovulation zeigte, daß 84,6% der Stuten innerhalb 48 h der Östradiolspitze ovulierten. In 60% der Stuten fiel der FSH- Spiegel auf seinen niedrigsten Punkt zum gleichen Zeitpunkt wie das Erreichen des Östradiol-Spitzenspiegels.
Der Assay erwies sich als schnell und genau und hat den Vorteil, daß er nicht die Verwendung von Radioisotopen oder anderen gefährlichen Chemikalien beinhaltet.

Literatur

Fujiki Y., Rathnam P. and Saxena B.B., Amino acid sequence of the subunit of the Follicle Stimulating Hormone from equine pituitary glands, J. Biol Chem. 253.5363-5368, 1978.
Hojo H. and Ryan R.J., Monoclonal antibodies against human Follicle Stimulating Hormone, Endochrinology, 2428-2434, 1985.
Rathnam P., Fuijiki Y., Landefeld T.D. and Saxena B.B., Isolation and amino acid sequence of the alpha subunit of Follicle Stimulating Hormone from equine pituitary glands, J. Biol. Chem. 253.5355-5362, 1978.
Woods J., Bergfelt D.R. and Ginter O.J., Effects of time of insemination relative to ovulation on pregnancy rate and embryonic loss rate in mares. Equine Veterinary Journal. 22 (6) 410-415, 1990.

Claims

1. Verfahren zur Vorhersage der Ovulation bei einem Pferdeartigen, umfassend die Bestimmung des Spiegels des follikelstimulierenden Hormons in einer vom Pferdeartigen entnommenen Blutprobe durch einen verstärkten Lumineszenz-Immunoassay unter Verwendung eines anti-follikelstimulierenden Hormons, worin der Antikörper ein Anti-(Humanfollikel-stimulierendes Hormon)-Antikörper ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Östradiol-Spiegel ebenfalls unter Verwendung eines Anti-Östradiol- Antikörpers bestimmt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Spitzen-Östradiol- Spiegel bestimmt wird.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der niedrigste FSH-Spiegel bestimmt wird.

5. Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des follikelstimulierenden Hormons in einem Pferdeartigen, worin ein Anti-(Humanfollikel-stimulierendes Hormon)- Antikörper in einem verstärkten Lumineszenz-Immunoassay verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin ebenfalls Östradiol unter Verwendung eines Anti-Östradiol-Antikörpers nachgewiesen und quantifiziert wird.

7. Verwendung eines Testkits zum Nachweis von follikelstimulierendem Hormon in einem Pferdeartigen durch einen verstärkten Lumineszenz-Assay, umfassend einen Anti-(Humanfolikel-stimulierendes Hormon)- Antikörper.

8. Verwendung eines Testkits zur Vorhersage der Ovulation in Pferdeartigen durch einen verstärkten Lumineszenz- Immunoassay, umfassend einen Anti-(Humanfollikelstimulierendes Hormon)-Antikörper.

9. Verwendung eines Testkits gemäß Anspruch 8, ebenfalls umfassend einen Anti-Östradiol-Antikörper.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, bevorzugt ein Maus-Antikörper.

11. Verfahren zur Maximierung der Trächtigkeit bei Pferdeartigen, umfassend:

(i) Bestimmung des Spiegels des follikelstimulierenden Hormons in einer vom Pferdeartigen entnommenen Blutprobe mittels eines verstärkten Lumineszenz-Immunoassays, der einen Anti- (Humanfollikel-stimulierendes Hormon)-Antikörper verwendet, und

(ii) Besamung des Pferdeartigen innerhalb 48 h des Auftretens des niedrigsten FSH-Spiegels.

12. Verfahren gemäß Ansprüch 11, worin der Östradiol-Spiegel ebenfalls unter Verwendung eines Anti-Östradiol- Antikörpers bestimmt wird und das Pferdeartige innerhalb 48 h des Östradiol-Spitzenspiegels oder sowohl des Östradiol-Spitzenspiegels als auch des niedrigsten FSH- Spiegels besamt wird.