DE2744028A1

DE2744028A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der antigenmenge in einer loesung

Info

Publication number: DE2744028A1
Application number: DE19772744028
Authority: DE
Inventors: Tom Bertil Bjoerklund
Original assignee: Bonnierforetagen AB
Current assignee: Bonnierforetagen AB
Priority date: 1976-10-01
Filing date: 1977-09-30
Publication date: 1978-04-06
Also published as: JPS5379025A; FR2366571A1; SE7610939L; GB1549921A; US4193981A

Description

S 27U028

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigenmenge in einer Lösung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigen- oder Antikörpermenge in Lösung unter Verwendung einer sogenannten indirekten oder direkten Hämagglutinationsmethode.

Kurz gesagt beruht die vorliegende Erfindung nach einem ihrer Aspekte auf einer Modifizierung der klassigen Hämagglutinationshemmreaktion, bei der Antigen in einer Probe die Fähigkeit eines Antiserums, mit Antigen markierte rote Blutkörperchen zu agglutinieren, hemmt. Die bisher für die Bestimmung von Antigen, wie beispielsweise zur Krebsdiagnose verwendete Methode beruht auf der Verwendung von mit Antigen markierten Blutkörperchen, die man mit einer konstanten Antikörpermenge und einer stufenweise abnehmenden Antigenkonzentration reagieren läßt. Nach der Inkubation wird zu jedem der resultierenden Gemische von Antigen und Antikörpern eine Suspension mit dem gleichen Antigen markierter roter Blutkörperchen zugegeben, wobei man eine Hämagglutination bekommt, spezieller eine steigende Hämagglutinationsreaktion mit abnehmenden Antigenmengen in der zum Antiserum zugesetzten Anfangsantigenlösung. Wenn nun das entsprechende Verfahren mit einer Antigenlösung von unbekannter Antigenkonzentration angewendet wird, bekommt man eine entsprechende Reihe von Proben mit steigender Hämagglutination_/ und bei Vergleich der Reihen bekannter Antigenkonzentrationen

8098U/0801

und der Reihen unbekannter Antigenkonzentrationen ist es möglich, qualitativ das Vorhandensein von Antigen in der unbekannten Probe anzuzeigen und gegebenenfalls eine halbquantitative Bestimmung der Antigenkonzentration zu erhalten.

Da eine genaue Bestimmung der Antigenkonzentration in einer unbekannten Probe von großer Wichtigkeit ist, unter anderem bei der Krebsdiagnose, die auf dem Vorhandensein von menschlichem Krebsantigen beispielsweise im Blut beruht, ist es erwünscht, eine einfache und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung der Antigenkonzentration in Lösung zu finden. Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand in einem solchen Verfahren zur quantitativen Antigenbestimmung. Es ist von Wichtigkeit, daß ein solches Verfahren auf einfachen Analysenmethoden ohne Verwendung komplizierter Anlagen, wie sie beispielsweise im sogenannten Radioimmunotest verwendet werden, beruht.

In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß dann, wenn in Verbindung mit dem Hämagglutinationsbild, das man bei der oben genannten ReihenVerdünnung und der Umsetzung zwischen Antigen und Antikörper erhält, die Durchmesser der Ablagerungen gemessen und in einem Diagramm als eine Funktion der Antigenkonzentrationen in den Lösungen aufgetragen werden, man eine S-förmige Kurve erhält, deren mittlerer Teil um den Biegungspunkt eine steile Neigung hat. Selbst wenn die Durchmesser nicht mit gesonders hoher Genauigkeit aufgezeichnet werden können, bedeutet dies doch, daß die Genauigkeit der Antigenkonzentration auch überraschend hoch ist. Die Tatsache, daß das Auftragen der Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen als eine Funktion des Logarithmus der Antigenkon-

8098U/0801

27U028

zentration zu einer S-förmigen Kurve führt, war äußerst überraschend, da man tatsächlich eine in etwa lineare Funktion hätte erwarten müssen.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird somit zur quantitativen Bestimmung der Antigenmenge in einer Lösung unter Reihenverdünnung eine Reihe von Proben dieser Lösung mit abnehmender Antigenkonzentration hergestellt, und zu diesen Proben wird dann eine vorbestimmte Menge Antiserum, das bezüglich des fraglichen Antigens spezifische Antikörper enthält, zugesetzt. Zu jeder der resultierenden Proben wird dann nach der Inkubation eine vorbestimmte Menge des von einem feinteiligen Träger getragenen Antigens zugesetzt, wobei Hämagglutination in einem Umfang entsprechend der Menge von zugänglichem Antikörper stattfindet. Sodann wird eine entsprechende Reihe von Kontrollproben bekannter abnelimender Antigenmengen hergestellt. Die Erfinding ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen der Kontrollproben mißt und die gemessenen Werte der Durchmesser gegen den Logarithmus der Antigenkonzentrationen aufträgt, so daß man eine S-förmige Kurve erhält, deren Mittelteil einschließlich des Wendepunktes eine steile Neigung hat. Sodann wird eine Probe dieser Reihe von Proben, die unbekannte Antigenmengen enthalten, mit einem Durchmesser, der im Mittelteil der Kurve liegt, ausgewählt, und mit Hilfe dieser Probe wird die Antigenkonzentration entsprechend dem letzterwähnten Durchmesser festgestellt. Im Hinblick auf die Tatsache, daß der Mittelteil der Kurve eine steile Neigung hat, bekommt man eine genaue Messung der Antigenkonzentration der entsprechenden Probe trotz der Tatsache, daß die Ablesung des aufgetra-

8098U/0801

27U028

genen Durchmessers des Hämagglutinates nicht mit besserer Genauigkeit als mit etwa +0,05 mm erfolgen kann.

Mit anderen Worten, die nach dem Verfahren der Erfindung für eine quantitative Bestimmung der Antigenmenge in einer Lösung durchgeführten Stufen sind folgende:

a) Messung des Durchmessers der Hämagglutinationsniederschläge der Kontrollproben und

b) Aufzeichnung der gemessenen Durchmesser gegen die Antigenkonzentrationen unter Ausbildung einer S-förmigen Kurve, deren Mittelteil eine steile Neigung besitzt,

c) Auswahl einer Probe in dieser Reihe von Proben unbekannter Antigenkonzentration mit einem bekannten Durchmesser, der im Mittelteil der Kurve liegt,

d) Vergleich dieses bekannten Durchmessers der unbekannten Probe mit den Durchmessern von Proben bekannter Konzentration, die in Stufe b) aufgezeichnet wurden, und

e) Ablesen der Antigenkonzentration entsprechen dem bekannten Durchmesser der unbekannten Probe.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahren nach der Erfindung wird der Durchmesser auch für eine der ausgewählten Probe benachbarte Probe gemessen, deren Antigenkonzentration bestimmt wurde, da bei Kenntnis des Antigenkonzentrationsverhältnisses zwischen den beiden Proben und mit Hilfe der erhaltenen Kurve die Genauigkeit der Analyse nachgeprüft werden kann, indem man den in dem Diagramm gemessenen zweiten Durchmesser aufzeichnet, wobei, wenn alles in Ordnung ist, die letzterwähnte Aufzeichnung in der Kurve oder nahe der Kurve liegen sollte.

8098U/0801

Die Methode nach der Erfindung ist allgemein anwendbar auf alle Arten von Hämagglutinationsverfahren, z.B. die Bestimmung von Albumen- oder Proteinantigenen, doch wird die Erfindung nachfolgend an Hand einer speziellen Krebsart erläutert, die mit Polypeptidantigen verbunden ist und im folgenden CAPA bezeichnet wird.

Die vorliegende Erfindung ist natürlich auch auf die sogenannte direkte Ilämagglutinationsmethode anwendbar, mit der die Antikörpermenge in einer Lösung in entsprechender Weise bestimmt werden kann. In diesem Fall wird eine Reihe von Proben einer Antikörperlösung hergestellt, und zu jeder der resultierenden Proben wird eine vorbestimmte Menge eines Antigens zugesetzt, das speziell mit dem fraglichen Antikörper reagiert und von einem feinteiligen Träger getragen wird, was zu einer Hämagglutination führt. Außerdem wird eine entsprechende Reihe von Kontrollproben bekannter abnehmender Antikörpermengen hergestellt. Wenn nun der Durchmesser der Hämagglutinationsniederschläge der Kontrollproben als eine Funktion der Antikörperkonzentration aufgetragen wird, erhält man eine Kurve von umgekehrter S-Form, deren Mittelteil, welcher einen Wendepunkt einschließt, in der gleichen Weise eine steile Neigung hat, wie man sie durch die Hämagglutinationshemmethode erhält. Diese umgekehrte S-Kurve führt zu den gleichen Vorteilen aus der Sicht der Aufzeichnung, wie die oben beschriebene S-Kurve.

Demnach sind die bei Verwendung der sogenannten direkten Hämagglutinationsmethode nach der Erfindung durchzuführenden Stufen folgende:

8098U/0801

/IO 27U028

a) Messung des Durchmessers der Hämagglutinationsablagerungen der Kontrollproben und

b) Aufzeichnung der gemessenen Durchmesser als Funktion der Antikörperkonzentrationen, wobei man eine Kurve von umgekehrter S-Form erhält, deren Mittelteil eine steile Neigung hat,

c) Auswahl einer Probe in dieser Reihe von Proben unbekannter Antikörperkonzentration mit einem bekannten Durchmesser, der in dem Mittelteil der Kurve liegt,

d) Vergleich dieses bekannten Durchmessers der unbekannten Probe mit den Durchmessern von Proben bekannter Konzentration, die in Stufe b) gegen bekannte Durchmesser aufgetragen wurde, und

e) Ablesung der Antikörperkonzentration entsprechend dem bekannten Durchmesser der unbekannten Probe.

Als feinteiligen Träger für das Antigen können vorteilhafterweise rote Blutkörperchen verwendet werden, besonders rote Blutkörperchen vom Schaf, doch sind auch Latex, Bentonit oder Collodium als Träger vorstellbar.

Die Erfindung wird an Hand eines Beispiels in Verbindung mit der Zeichnung weiter erläutert. In der Zeichnung zeigt Fig. 1 ein Diagramm, in dem die Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen als Funktion der Logarithmen der Antigenkonzentrationen aufgetragen sind, und

Fig. 2 eine photographische Aufzeichnung einer Standardreihe von Hämagglutinationsreaktionen.

8098U/0801

Beispiel

Das im folgenden verwendete Material CAPA ist das Material, das

gemäß Beispiel I der US-PS 3 960 327 hergestellt wird. So ist

das Material ein Polypeptid, das für menschlichen Krebs charakteristisch ist.

Ein Anteil des nach Beispiel I der obigen US-PS hergestellten CAPA wurde in Ameisensäure (beispielsweise 0,05 M, der pH-Wert sollte im Bereich von 2 bis 3 liegen) aufgelöst. Es wurde eine klare Lösung erhalten. Zu dieser Lösung wurde Albumenpulver oder eine Albumenlösung mit dem gleichen pH-Wert wie derjenige der obigen Ameisensäurelösung zugesetzt (200 Gewichtsteile Albumen je Gewichtsteil CAPA), was zu einer klaren Lösung von CAPA und Albumen führte. Sodann wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer Base (beispielsweise einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung oder von Ammoniak) langsam gesteigert, bis der pH-VJert etwa 7,5 erreichte. Dies führte zu einer klaren Lösung, die CAPA und Albumen in der Form eines Komplexes enthielt.

Diese Lösung, die 12 .ug CAPA je Milliliter enthielt, konnte direkt in dem nachfolgend beschriebenen diagnostischen Verfahren verwendet werden, oder der Komplex konnte in der Form eines weißen Pulvers durch Gefriertrocknung isoliert werden. Das Pulver ist in der Kälte (4 C) lange Zeit beständig.

Es wurde durch Experimente gezeigt, daß eine maximale Ausnutzung der CAPA-Aktivität bei einem Gewichtsverhältnis von Albumen zu CAPA gleich oder etwa gleich oder oberhalb 200 : 1 erhalten wird.

809814/0801

42, 27U028

ü§istellun2_von_2e2erbten_und_markierten_roten_Blutkör2erchen Frisches Schafsblut (1 Volumenteil) wurde zu steriler Alsever¹ scher Lösung (1,2 Volumenteile) zugesetzt (Alsever'sehe Lösung wird aus 250 g Glucose, 80 g Natriumcitratdihydrat, 42 g NaCl unter Zugabe von Wasser auf 10 1 und pH-Einstellung mit 10 %-igem Zitronensäuremonohydrat auf 6,1 hergestellt). Das Gemisch wurde zentrifugiert, und die roten Blutkörperchen wurden erneut einmal in Alsever'scher Lösung und zweimal in einer Pufferlösung von pH 6,8 suspendiert. Schließlich wurde eine Suspension der roten Blutkörperchen in dem Puffer von 6,8 mit einer Konzentra-

9
tion 10 Blutzellen je Milliliter angemacht.

Ein Volumenteil der oben hergestellten Suspension roter Blutkörperchen wurde zu einem Volumenteil Pufferlösung von pH 6,8, die etwa 1 8 ,ug Tannin je Milliliter enthielt, unter Rühren zugesetzt. Die so gegerbten roten Blutkörperchen wurden zentrifugiert und erneut zweimal in Puffer von pH 7,5 suspendiert.

Schließlich wurden die roten Blutkörperchen in Puffer von pH

9
7,5 mit einer Konzentration von 10 Blutzellen je Milliliter suspendiert.

Ein Anteil des oben hergestellten CAPA-Komplexes wurde in einer Pufferlösung von pH 7,5 aufgelöst, um eine Konzentration von 3 ,ug CAPA je Milliliter (berechnet auf reines CAPA) zu ergeben. Ein Volumenteil der Suspension gegerbter roter Blutkörperchen, die oben hergestellt wurde, wurde tropfenweise bei 0° C zu 1 Volumenteil der CAPA-Komplexlösung während 10 Minuten zugesetzt. Die markierten Zellen wurden zentrifugiert und erneut in einer Pufferlösung von pH 7,5, die eine stabilisierende Menge (etwa 1,2 Volumenteile je Volumenteil) inertes menschli-

8098U/0801

27U028

ches Serum enthielt, suspendiert, um eine Suspension zu ergeben, die 1,6 χ 10 markierte Blutzellen je Milliliter enthielt. Diese markierten Blutzellen wurden, wie nachfolgend gezeigt, in dem diagnostischen Verfahren nach der Erfindung verwendet.

Im Hinblick auf die Tatsache, daß das CAPA bei neutralen pH-Werten irreversibel denaturiert, führt parenterale Injektion des Polypeptids nicht zur Bildung von Antikörpern. Um in der Lage zu sein, das Polypeptid in einer aktiven Form auf die Antikörper produzierenden Zellen zu übertragen, ist es erforderlich, das Polypeptid in der Lösung bei pH-Werten unterhalb etwa 3 (0,02 m HCOOH, pH 2,8) zu halten und die Lösung unter Bildung extrem kleiner, von einer schützenden Ölschicht umgebener Tropfen zu emulgieren. Die Injektion der Emulsion führte zur Bildung zufriedenstellender Antikörpermengen, die speziell mit dem CAPA in Hämagglutinationsreaktionen reagierten, bei denen die Blutkörperchen mit CAPA markiert waren.

von_:Lmmu^i s ier^n^sm^t te 1

316,ug eines CAPA, das aus gesammelten menschlichen Krebstumoren hergestellt worden war, wurden in 1,0 ml 0,02 m HCOOH von pH 2,8 gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde tropfenweise 1,0 ml Hilfsöl (handelsübliches Präparat der Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, Bacto-Adjuvant, Freund) unter gleichzeitiger Emulgierung zugesetzt. Die Emulgierung erfolgte gemäß Freund durch Verwendung einer Injektionsspritze, wobei das Gemisch in der Spritze unter Bildung einer gleichförmigen weißen Emulsion mit etwa der gleichen Konsistenz wie Schlagrahm auf- und abgezogen wurde. Ein Tropfen dieser Emulsion wur-

8098U/0801

274A028

de mit Eiswasser getestet, um zu bestätigen, daß sie getrennt schwimmt und intakt bleibt. Die resultierende halbflüssige Emulsion wurde für subkutane und intramuskuläre Injektionen bei Kaninchen verwendet.

Immunisierun2_von_5_Kaninchen

Bei der ersten Injektion wurde ein sogenanntes vollständiges Hilfsmittel verwendet, und in den anschließenden Injektionen wurde ein sogenanntes unvollständiges Hilfsmittel verwendet. Nach anfänglichem Abzapfen von Blut bei jedem der 5 Kaninchen, um Null-Werte festzustellen, wurden insgesamt 408,ug emulgiertes CAPA bei pH 2,8 subkutan jeweils an der rechten und linken Seite injiziert. In 10-tägigen Intervallen wurden weitere drei Injektionen verabreicht, die erste intramuskulär in jedes der Hinterbeine und die zweite und die dritte subkutan an beiden Vorderseiten bzw. beiden Rückenseiten. Die Auswahl der Injektionsstellen erfolgte in der Weise, um die Zugangsbereiche der regionalen Lymphdrüsen zu benutzen. Insgesamt erhielt jedes Kaninchen etwa 1,6 mg CAPA in der Form einer Emulsion. 14 und 24 Tage nach der letzten Injektion wurden Bluttestproben abgenommen, die einer Hamagglutinationsanalyse bezüglich des Vorhandenseins spezifischer Antikörper gegen CAPA unterzogen wurden. Zwei Tage nach der letzten Probe wurde eine Maximalblutmenge abgezapft, die in der Form von Serum gewonnen wurde, und dieses wurde steril filtriert und in sterile Röhrchen in kleinen Anteilen überführt. Diese Röhrchen konnten in der Kälte gelagert werden, während sie ihre Spezifität behielten.

8098U/0801

Wie bereits aufgezeigt, beruht die Analysenmethode nach der Erfindung auf der Anzeige des Vorliegens von CAPA mit Hilfe einer modifizierten Hämagglutinationshemmethode (Mikromethode). Im Prinzip wurde das folgende Verfahren angewendet:

25/Ul eines Patientenserums und von standardisiertem CAPA-Präparat, deren beide mit roten Blutkörperchen vom Schaf absorbiert worden waren, wurden in 8 Stufen mit 2 Verdünnungen in Linbro-IS-MRC-96-Verdünnungsplatten titriert, und dann wurden 25 ,ul spezifisches Antiserum in der Grenzverdünnung (etwa 1 : 2OOO) jeder Mulde zugegeben. Nach einer Inkubation bei 22 C während 10 Minuten wurden jeder Mulde 50 ,ul einer Suspension von etwa 6 bis 8 000 000 roten Blutkörperchen vom Schaf, die entsprechend

mit den obigen Angaben gegerbt und mit isoliertem/menschlichem Blut

vernetztem CAPA markiert waren (etwa 2 bis 4 .ug je 10 Blutkörperchen) zugesetzt.

Als Antiserum wurde Anit-HeLa vom Pferd vom 19. November 1962 verwendet, das von normalen Geweben und angesammeltem menschlichem Serum absorbiert worden war. Die Immunisierung erfolgte mit gewaschenen Bruchstücken von HeLa-Zellen, die in Eagles Medium mit einem Gehalt von 20 % inaktiviertem menschlichem Serum in flachen Glasflaschen gezüchtet worden waren. Die Zellen waren mit EDTA geerntet, zentrifugiert und dreimal mit Wasser gewaschen worden.

In Gegenwart von CAPA im Serum wurden die Pferdeantikörper neutralisiert, was zur Abwesenheit von Agglutination führte, wenn die mit Polypeptid markierten Blutkörperchen anschließend

8098U/0801

zugegeben wurden. Die Verdünnungsplatten, die die Hämagglutinationsniederschläge enthielten, wurden dann photographiert, was auch ein praktischer Weg für künftige Dokumentation der experimentellen Ergebnisse ist, und die Durchmesser der Ablagerungen wurden gemessen, zweckmäßig unter Verwendung eines sogenannten Meßvergrößerungsglases mit einer Meßskala in der Optik. In der nachfolgenden Tabelle I sind die erhaltenen Durchmesser angegeben, wenn man von einer Standardplatte ablas, die photographiert wurde. In der Tabelle ist auch das Mittel der fünf Reihen von Mulden angegeben.

Tabelle I

Mulde 1 2 3 4 5 6 7 8

U CAPA/ml 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0937 0,0468 0,0234 0,0117

A Reihe 1 2,7 2,8 3,3 3,9 B Reihe 2 2,7 2,9 3,3 3,8 C Reihe 32,72,9 3,3 3,9 D Reihe 42,72,9 3,3 3,9 E Reihe 5 2,7 2,9 3,3 3,9

Mittlerer

Durchmes- 2,7 2,88 3,3 3,88 4,44 4,72 4,82 4,82

In Fig. 2 der Zeichnung ist eine photographische Reproduktion der Hämagglutinationstests, die in der obigen Tabelle I wiedergegeben sind, gezeigt. Mit Hilfe dieser photographischen Reproduktion ist es leicht, beispielsweise mit Hilfe eines Meßvergrößerungsglases mit eingebauter Meßskala die Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen abzulesen und dann diese in einem Diagramm mit den Durchmessern als eine Funktion der Logarithmen der Antigenkonzentrationen aufzutragen.

8098U/0801

4,5	4,8	4,9	4,9
4,5	4,7	4,8	4,8
4,4	4,7	4,8	4,8
4,4	4,7	4,8	4,8
4,4	4,7	4,8	4,8

>/> 274A028

In Fig. 1 der Zeichnung sind in der Form eines Diagramms die mittleren Durchmesser gegen den Logarithmus der CAPA-Konzentration aufgetragen gezeigt. Wie aus dem Diagramm klar ersichtlich ist, hat die erhaltene Kurve S-Form, und der für die Messung geeignete Bereich ist der Mittelteil der Kurve, d.h. der Bereich zwischen etwa 3 und etwa 4,5 mm, und in diesem Bereich kann die CAPA-Konzentration entsprechend einem bestimmten Durchmesser mit einem hohen Genauigkeitsgrad abgelesen werden.

Durch entsprechende Reihenverdünnung und Hamagglutination einer unbekannten Probe ist es nur erforderlich, einen Durchmesser auszuwählen, der in diesem Teil der Kurve liegt, und die entsprechende CAPA-Konzentration abzulesen. Zu Kontrollzwecken kann eine weitere Probe ausgewählt werden, die unmittelbar oberhalb oder unmittelbar unterhalb des zunächst aufgetragenen Durchmessers der unbekannten Probe liegt, und durch Kenntnis der CAPA-Konzentration für die andere Probe, die entweder doppelt so groß oder halb so groß ist, ist es durch Einzeichnen in die Kurve möglich zu sehen, ob die zweite Probe der erweiterten Konzentration entspricht. Auf diese Weise bekommt man eine Doppelkontrolle der Genauigkeit der Analyse.

Als ein Beispiel einer solchen Messung einer unbekannten Probe sind in der nachfolgenden Tabelle II entsprechend gemessene Durchmesser und deren Mittelwerte aufgeführt. Es wurden nur die Durchmesser von drei Konzentrationen gemessen, die alle innerhalb des Bereiches der Kurve in Fig. 1 lagen, v/elcher zwischen den horizontalen Linien liegt.

8098U/0801

274A028

	Tabelle	3,8	II	4,4
Reihe 1	4,0	4,4
Reihe 2	3,8	4,4
Reihe 3	3,8	4,4
Reihe 4	3,8	4,4
Reihe 5
Mittlerer	3,84	4,4
Durchmes
ser

4,7 4,7 4,7 4,7 4,7

4,7

Wenn nun der mittlere Durchmesserwert 4,4 ausgewählt und in dem Diagramm in Fig. 1 (durch ein Kreuz angezeigt) eingetragen wird, bekommt man auf der horizontalen Achse die Konzentrations des Antigens in Einheiten je Milliliter. Als Probe kann ein benachbarter Durchmesserwert entsprechend dem Doppelten der Antigenkonzentration angegeben werden (ebenfalls als Kreuz in dem Diagramm eingetragen), wobei bei Kenntnis der ungefähren Konzentration im Vergleich mit dem ersten eingezeichneten Punkt die Genauigkeit der Analyse kontrolliert werden kann, da das zweite eingezeichnete Kreuz auf der Kurve liegt, wenn Genauigkeit vorliegt.

In dem vorliegenden Beispiel wurden als Konzentrationsmaß Mikrogramm CAPA je Milliliter einerseits und in der Tabelle Einheiten je Milliliter andererseits verwendet. Die Beziehung zwischen diesen beiden Methoden, die Antigenkonzentration in Lösung auszudrücken, ist die, daß etwa 3 Einheiten einem Mikrogramm Antigen in der gereinigten Form, wie im vorliegenden Beispiel, entsprechen.

Mit der durch das Verfahren nach der Erfindung möglich gemachten Genauigkeit bezüglich der Bestimmung der Konzentration

8098U/0801

27U028

eines Antigens in Lösung ist es von äußerster Wichtigkeit, daß die in Verbindung mit der Anwendung der Methode durchgeführte Reihenverdünnung mit genügend hohem Genauigkeitsgrad stattfindet.

Um eine solche Genauigkeit in der Reihenverdünnung zu bekommen, erwies es sich als besonders zweckmäßig, die Abgabe- und Pipettiertitrationseinrichtung zu verwenden, die in den US-PSen 3990 313 und 3 998 103 beschrieben ist.

Bei der Methode dieser Erfindung, die somit auf der Hämagglutinationstechnik beruht, und zwar sowohl auf direkter und indirekter Hämagglutination, wobei in an sich bekannter Weise Antigen mit Antikörper reagiert, ist es, um eine maximale Empfindlichkeit bei der Analyse zu erhalten, zweckmäßig, eine Antikörperkonzentration auszuwählen, die etwas unterhalb derjenigen liegt, die erforderlich ist, um eine Agglutination der mit Antigen markierten Blutkörperchen zu vervollständigen. Somit scheint es so zu sein, daß ein großer Antikörperüberschuß die Empfindlichkeit der Analyse stört.

Wie oben aufgezeigt wurde, ist es innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereiches, nämlich in dem, für welchen entsprechende Durchmesser bei steigender Konzentration schnell ansteigen, d.h. in dem Mittelteil der Kurve von Fig. 1, möglich, mit einem hohen Genauigkeitgrad die Konzentration der Probe durch Ablesung des Durchmessers zu bestimmen, und dies beruht auf der Tatsache, daß ein kleiner Fehler in der Ablesung des Durchmessers noch zu einem hohen Genauigkeitgrad bezüglich der Konzentrationsbestimmung führt. Innerhalb des Konzentrationsbereiches, in dem der Durchmesser bei steigender Konzentration nur

80981 A/080 1

JlO 27U028

langsam ansteigt, führt ein sehr kleiner Fehler in der Durchmesserablesung zu einem zu großen Fehler in der Bestimmung der Konzentration. Das daraus erwachsende Problem kann bei niedrigen Konzentrationen einfach dadurch gelöst werden, daß man die Probe einer Reihenverdünnung derart unterzieht, daß ihre Konzentration in den Konzentrationsbereich kommt, der dem Mittelteil der Kurve entspricht. Eine solche Verdünnung ist eine Routinemaßnahme für den Durchschnittsfachmann und ermöglicht in einfacher Weise die Ausnutzung der oben aufgezeigten Vorteile der Beziehung zwischen Durchmesser und Konzentration.

8098U/0801

Claims

Dr. Hans-Heinrich Willrath t

Dr. Dieter Weber Dipl.-Phys. Klaus Seiffert

PATENTANWÄLTE

D-62 WIESBADEN 29. Sep. 1! Posttach 6145

C'.ustav-Freyiag-Stra&e J5 D^ · "β,

^f (0 6181) J7i7iO

Tflmrainm.Jr.-ss«: WILLPATENT -| gl Telex : 4-186847 '

ΛΒ Bonnierföretagen, Torsgatan 21, S-105 44 Stockholm

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigenmenge in einer Lösung

Priorität: Schwedische Patentanmeldung Nr. 76-10939-6 vom 1. Oktober 1976

Patentansprüche

( 1.!Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigenmenge in einer Lösung unter Verwendung der Hämagglutinationsheiranethode durch Herstellung einer Reihe von Proben der Lösung durch Reihenverdünnung, Zugabe einer vorbestimmten Antiserummenge, die

8098U/0801

ORIGINAL INSPECTED

bezüglich des fraglichen Antigens spezifische Antikörper enthält, zu jeder dieser Proben, Zugabe einer vorbestimmten Menge des von einem feinteiligen Träger getragenen Antigens nach einer Inkubation zu jeder der resultierenden Proben unter Hämagglutination und Herstellung einer entsprechenden Reihe von Kontrollproben mit bekannten abnehmenden Antigenmengen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen der Kontrollproben mißt und

b) die gemessenen Durchmesser gegen die Antigenkonzentrationen aufträgt und so eine S-förmige Kurve erhält, deren Mittelteil eine steile Neigung besitzt,

c) eine Probe in der Reihe der Proben unbekannter Antigenkonzentration mit einem bekannten Durchmesser, der in dem Mitteilteil der Kurve liegt, auswählt,

d) diesen bekannten Durchmesser der unbekannten Probe mit den Durchmessern von Proben bekannter Konzentration, die gegen den bekannten Durchmesser in der Stufe b) aufgetragen wurde, vergleicht und

e) die Antigenkonzentration entsprechend dem bekannten Durchmesser der unbekannten Probe abliest.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Durchmesser für eine in Nachbarschaft zu der Probe liegenden Probe mißt, deren Antigenkonzentration bestimmt wurde, und bei Kenntnis des ungefähren Antigenkonzentrationsverhältnisses zwischen diesen beiden Proben und der Kurve durch Auftragen auf der Kurve die Genauigkeit der Analyse überprüft.

8098U/0801
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als feinteiligen Träger für das Antigen rote Blutkörperchen, Latex, Bentonit oder Collodium verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hämagglutinationsablagerungen photographiert und die Durchmesser der so erhaltenen Photographien mit einem Vergrößerungsglas mißt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltenen Durchmesserwerte gegen die Logarithmen der Antigenkonzentrationen aufträgt.
6. Abwandlung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5 zur quantitativen Bestimmung der Antikörpermenge in Lösung unter Verwendung der Hämagglutinationsmethode durch Herstellung einer Reihe von Proben dieser Lösung durch Reihenverdünnung, Zugabe einer vorbestimmten Menge eines spezifisch mit dem Antikörper reagierenden Antigens, das von einem feinteiligen Träger getragen wird, zu jeder der Proben unter Hämagglutination und Herstellung einer entsprechenden Reihe von Kontrollproben mit bekannten abnehmenden Antigenmengen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen der Kontrollproben mißt und

b) die gemessenen Durchmesser als eine Funktion der Antikörperkonzentrationen aufträgt und so eine Kurve mit umgekehrter S-Form erhält, deren Mittelteil eine steile Neigung besitzt,

c) eine Probe in der Reihe von Proben unbekannter Antikörperkonzentration mit einem bekannten Durchmesser, der in dem Mittelteil der Kurve liegt, auswählt,

ΒΠ9Π14/080 1

if 27U028

d) diesen bekannten Durchmesser der unbekannten Probe mit den Durchmessern von Proben bekannter Konzentration, die in der Stufe b) gegen den bekannten Durchmesser aufgetragen wurde, vergleicht und

e) die Antikörperkonzentration entsprechend dem bekannten Durchmesser der unbekannten Probe abliest.

8098U/0801