DE2419884B2

DE2419884B2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Trijodthyronin

Info

Publication number: DE2419884B2
Application number: DE2419884A
Authority: DE
Inventors: Amirav Gordon; Jack Gross
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-24
Publication date: 1979-12-13
Also published as: IL42105A0; FR2227533B1; IL42105A; US3961894A; DE2419884C3; GB1472116A; DE2419884A1; CA1033664A; FR2227533A1; JPS5031898A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Bestimmung von Trijodthyronin (T-3) in biologischer Flüssigkeiten und Gewebeauszügen unter Verwendung von radioaktivem T-3 und eines Τ-3-spezifischen Antiserums sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

T-3 wird als die aktive Form des Schilddrüsenhormons angesehen und daher geben Messungen der in dem Serum enthaltenen Menge an T-3 den Zustand bzw. die Funktion der Schilddrüse klarer wieder als andere Bestimmungen der Schilddrüsenfunktion. Außerdem sind Zustände bzw. Erkrankungen bekannt, bei denen die einzige Abnormität der Schilddrüsenhormone eine

ι ο Zunahme des Gehalts an T-3 ist, eine Erkrankung, die als T-3-Thyrotoxicose bezeichnet wird.

Es sind verschiedene Verfahren zur quantitativen Bestimmung von T-3 in biologischen Materialien bekannt, die jedoch verhältnismäßig zeitraubend und umständlich sind.

In der Deutschen Medizinischen Wochenschrift, 97. Jahrgang, Heft Nr. 3,3. März 1972, ist auf den Seiten 351 bis 353 ganz allgemein ein radioimmunologisches Bestimmungsverfahren für Trijodthyronin angegeben.

Ober die Arbeitsweise dieses Verfahrens finden sich jedoch nur sehr vage Angaben. So ist lediglich präzise angegeben, daß das Plasma vor der eigentlichen Untersuchung mit einem Ionenaustauscher behandelt wird. Über die eigentliche Bestimmung finden sich keinerlei Angaben und man muß davon ausgehen, daß hier die damals üblichen, mit den bekannten Fehlern behafteten Verfahren angewandt wurden. In Biochemical and Biophysical Research Communication, Bd. 46, Nr. 6,1972, S. 2107 bis 2113 ist ein radioimmunologisches Verfahren angegeben, mit dessen Hilfe Trijodthyronin und Thyroxin bestimmt werden können. Dabei wird das zu untersuchende Serum mit einer Lösung des radioaktiven Hormons, einer Lösung eines spezifischen Nachweisreagenses sowie der Antikörperlösung zusammengebracht und das Gemisch eine Zeit lang unter Schütteln inkubiert. Nach dem Abkühlen wird Dextran-Aktivkohle zugegeben, das Gemisch erneut einige Zeit inkubiert und anschließend zentrifugiert. Diese Trennung der flüssigen von der festen Phase durch Zentrifugieren von deren sorgfältiger Durchführung weitgehend die Genauigkeit des Verfahrens abhängt, ist mühsam und umständlich.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur in-vitro-Bestimmung von Trijodthyronin in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeauszügen unter Verwendung von radioaktivem T-3 und einem T-3 spezifischen Antiserum zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, an sehr kleinen Proben (ungefähr 0,1 bis 0,5 ml) unter Verwendung einer einzigen Vorrichtung in kurzer Zeit sehr genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ohne daß umständliche Verfahrensstufen wie Zentrifugieren erforderlich sind. Außerdem soll bei dem Verfahren das Vorhandensein von Thyroxin (T-4) nicht stören.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man

(a) eine vorher bestimmte Menge der biologischen Flüssigkeit mit einer vorher bestimmten Menge radioaktivem T-3 in Lösung vermischt und das

bo Gemisch äquilibriert;

(b) das äquilibrierte Gemisch bei einem pH-Wert von mindestens ungefähr 10,5 oder weniger als 3 in eine Säule einbringt, die mit einem Dextrangel gefüllt ist, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist und ein Wasseraufnahmevermögen von 1—5 g pro g trockenes Gel besitzt.

(c) die Proteine mit Hilfe einer Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 auswäscht;

(d) in die Säule eine vorher bestimmte Menge eines Τ-3-spezifischen Antiserums einbringt, das geeignet ist, einen Teil des T-3 zu binden;

(e) die Radioaktivität in der Säule bestimmt;

(f) das Antiserum in der Säule inkubiert;

(g) das an Antiserum gebundene T-3 auswäscht; (h) die Radioaktivität erneut bestimmt und

(i) aus diesen Radioaktivitätsbestimmungen mit Hilfe einer Eichkurve den Gehalt an T-3 berechnet

Die Eichkurve wird wie oben angegeben erzeugt mit dem Unterschied, daß bekannte Proben von T-3 anstelle des Serums verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Modifikation des Isotopen-Verdünnungs-Verfahrens. Es ist für T-3 sehr spezifisch und die Störung durch T-4 (Thyroxin) ist so gering, daß sie praktisch vernachlässigt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die im Patentanspruch 7 definierte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Ein Ausführungsbeispiel der Testvorrichtung ist in der Zeichnung dargestellt Danach besteht die Vorrichtung aus einem im wesentlichen zylindrischen rohrförmigen Körper 11, der eine bestimmte festgelegte Geometrie besitzt und an einem Ende in eine kegelförmige Spitze 13 ausläuft Der Körper 11 besteht aus Polypropylen oder aus einem anderen geeigneten Material und ist mit Trennplatten versehen, sowie einer durch Reibung sitzenden Kappe 12, die über die Spitze 13 paßt und diese verschließt und von ihr wieder entfernt werden kann. Eine bestimmte Menge vernetztes Dextrangel 14 (im folgenden näher beschrieben) wird zwischen zwei porösen Polyäthylenscheiben 15 und 19 im unteren Teil des Körpers 11 festgehalten. Ein Puffer oder das Reaktionsgemisch 16 können in dem js oberen Teil des Körpers 11 wie angegeben aufgenommen werden. Das äußere Ende des Körpers 11 kann einen nach außen ragenden Flansch 17 besitzen, und zwar zum leichteren Festhalten des Körpers 11 in senkrechter Stellung in einem geeigneten Gestell. Ferner ist eine entfernbare Kappe oder ein Verschluß 18 vorgesehen, um das obere Ende des Körpers 11 dicht zu verschließen und dadurch zu verhindern, daß die Säule während der Lagerung oder dem Versand austrocknet.

Die Säule 14 enthält ein vernetztes Dextrangel, das am unteren Ende des Körpers 11 festgehalten wird. Ein bekanntes handelsübliches vernetztes Dextrangel ist Sephadex. Diese Substanz ist ein vernetztes Polysaccharid, das imstande ist, als Molekularsieb zu wirken, d. h. Moleküle in verschiedenem Maße festzuhalten, je nach ihrer Größe und in gewissem Ausmaß ihrer Ladung. Die Anwendung von Dextrangel als Molekularsieb wird häufig als Gelfiltration bezeichnet. Sephadex G-25, ein Dextrangel bei dem Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 bis 3000 von den Körpern zurückgehalten werden, ist in Wasser und Salzlösungen unlöslich und in alkalischen Medien und schwachen Säuren sehr beständig. Ein derartiges Dextrangel ist erfindungsgemäß bevorzugt. Sephadex G-15 und G-10 to können jedoch ebenfalls für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet sein.

Die Testvorrichtung kann vorteilhafterweise hergestellt werden, indem man zunächst das trockene Dextrangel mit einem geeigneten Puffer (wie später _b5 näher beschrieben wird) hydratisiert. Ungefähr 450 mg (Trockengewicht) des Gels 14 werden in das untere Drittel des Körpers 11 zwischen poröse Polyäthylenscheiben 15 und 19 eingefüllt Der dargestellte Körper 11 besitzt einen inneren Durchmesser von ungefähr 13 mm und eine Gesamtlänge von ungefähr 7,6 cm und die Scheiben 15 und 19 haben einen Durchmesser von 13 mn. Das Gel 14 nimmt ein Volumen von ungefähr 2£ ml ein. Während die oben angegebenen Substanzen und Größen nur beispielhaft sind, hat es sich gezeigt, daß eine derartige Geometrie in idealer Weise mit den Zählvorrichtungen bestimmter handelsüblicher Impulszählgeräte, wie dem Gammacord-Gammazählinstrument übereinstimmt

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel

03 ml Serum werden am oberen Ende der Säule mit 0,7 ml T-3¹²⁵J in 0,1 η NaOH vermischt und ungefähr 15 Minuten stehengelassen, um eine Gleichgewichtseinstellung zwischen dem an Protein! gebundenen T-3 und dem zugesetzten radioaktiven T-3 zu erreichen. Nach dieser Zeit läßt man das Gemisch durch die Schwerkraft in das Dextrangel in der Säule laufen, das in 0,1 η NaOH zubereitet ist Das Trijodthyronin wird an dem Gel adsorbiert und anschließend das Serumprotein im wesentlichen quantitativ mit 4 ml 0,1 η Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 eluiert Während das Protein eluiert wird, verbleiben mehr als 98% des T-3 und T-3¹²⁵J in der Säule.

Man pipettiert 0,5 ml verdünntes T-3-Antiserum in die Säule und läßt es zwei Stunden in die Säule einziehen und inkubieren. Die Menge an Antiserum wird so gewählt, daß nur ein Teil des T-3 gebunden wird. Während der zweistündigen Inkubationszeit wird das erste Mal die Radioaktivität gemessen. Am Ende dieser Zeit wird das an Serum gebundene T-3 mit Hilfe von 4 ml des gleichen Puffers ausgewaschen und die Radioaktivität ein zweites Mal gemessen. Die T-3-Menge in dem Serum wird von der Eichkurve, die vorher hergestellt worden ist, abgelesen. Diese Eichkurve wird mit Hilfe eines im wesentlichen identischen Verfahrens hergestellt, wobei lediglich anstelle der unbekannten Serumprobe eine Standardlösung von T-3 angewandt wird. Der gesamte Test erfordert nur ungefähr drei Stunden. Die Standardkurve ist verhältnismäßig konstant und die Abweichung der Neigung von sechs getrennten Kurven beträgt 6,6%. Auf diese Weise wurde der Wert für das T-3 in einem Euthyroid-Serum zu 168 mg/100 cm³ gefunden, während das Serum von hypothyroiden Patienten deutlich niedrigere Werte ergab und das Serum von hyperthyroiden Patienten deutlich höhere Werte.

Das in diesem Beispiel angewandte Antiserum wurde in Kaninchen gebildet gegen ein Konjugat von Rinderserumalbumin und gereinigtem T-3 nach dem folgenden Verfahren:

(a) Das T-3 wurde in 2 η HCl nach dem Verfahren von Gross T. und P. H. Rivers R; Biochemical Journal 53,645 (1953) gereinigt.

(b) Es wurde ein Konjugat aus T-3 und Rinderserumalbumin gebildet und Antiserum gegen dieses Konjugat nach dem Verfahren von Gharib H, et aL; J. CHn Endocr. 31, 709 (1970) erzeugt. Das T-3 kann jedoch auch unter Bildung eines Konjugats an andere polymere Träger gebunden werden, wie Human-Serum-albumin, Hämocyanin (Keyhole Linpet), Poly-L-Lysin und andere. Diese Konjugate

sind gleich wirksam zur Bildung von geeignetem Anti-T-3-Antiserum bei geeigneten Tieren. (c) Der Titer des bei dem Versuch angewandten Antiserums wurde bestimmt als Verdünnung des Antiserums, die ausreicht, um 30% des Hormons (T-3) zu entfernen, wenn es gegen ein Standardserum, enthaltend 5 ng/ml T-3, untersucht wird.

Man erhielt die folgenden Ergebnisse: Zustand T-3 (mg %) Hypothyroid(12 Patienten) 66-110 Euthyroid (19 Patienten) 130-281 Hyperthyroid (23 Patienten) 291 - 2047

Reproduzierbarkeit, bestimmt nach den Eichkurvenparametern und Τ-3-Werten einer Vergleichsserum-Eichkurve

(*^B/_F gegen In T-3-Konzentration)

Versuch	Neigung	aufgenommen	0,988	T-3 mg % im
			0,986	Vergieichsserum
104	-3,77	9,39 ·	0,986	167
104 A	-3,36	9,10	0,986	159
105	-3,33	9,03	0,984	204
110	-3,21	8,93	0.996	153
111	-3,12	8,78	0,988 ±0,004	168
112	-3,28	8.85		160
Mittel ± SD	-3,34 ± 0,22	9,01 ± 0,21		168 ±18
.B/ gebundenes T-3
freies T-3

Wenn T-4 in dem Serum in einer wesentlich größeren Menge vorhanden ist als T-3, ist es wichtig, zu bestimmen, ob und in welchem Ausmaß das Vorhandensein des T-4 die Bestimmung des T-3 stört. Ein Standardserum wurde mit T-4 bis zu Mengen von mehr als 40mg% beladen und das T-3 als Funktion der Zunahme des Gehalts an T-4 bestimmt. Die Störung betrug 0,11 % und kann vernachlässigt werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur in vitro-Bestimmung von Trijodthyronin (T-3) in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeauszügen unter Verwendung von radioaktivem T-3 und eines Τ-3-spezifischen Antiserums, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine vorher bestimmte Menge der biologischen Flüssigkeit mit einer vorher bestimmten Menge radioaktivem T-3 in Lösung vermischt und das Gemisch äquilibriert;

(b) das äquilibrierte Gemisch bei einem pH-Wert von mindestens ungefähr 10,5 oder weniger als 3 in eine Säule einbringt, die mit einem Dextrangel gefüllt ist, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist und ein Wasseraufnahmevermögen von 1 - 5 g pro g trockenes Gel besitzt;

(c) die Proteine mit Hilfe einer Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 auswäscht,-

(d) in die Säule eine vorher bestimmte Menge eines Τ-3-spezifischen Antisemms einbringt, das geeignet ist, einen Teil des T-3 zu binden;

(e) die Radioaktivität in der Säule bestimmt;

(f) das Antiserum in der Säule inkubiert;

(g) das an Antiserum gebundene T-3 auswäscht;
(h) die Radioaktivität erneut bestimmt und

(i) aus diesen Radioaktivitätsbestimmungen mit Hilfe einer Eichkurve den Gehalt an T-3 berechnet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteine mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von ungefähr 7,4 oder einem anderen Puffer mit einem pH-Wert von 6 bis 9 auswäscht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das an Antiserum gebundene T-3 iilii Hilfe eines Puffers mit einem pH-Wert von 7,4 auswäscht

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man auch die zweite Radioaktivitätszählung in der Säule durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als biologische Flüssigkeit Serum anwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antiserum ein solches verwendet, das in einem geeigneten Versuchstier gegen ein Konjugat von T-3 und Rinderserumalbumin oder einem anderen Trägerpolymer gebildet worden ist.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens Anspruch 1 — 6, gekennzeichnet durch einen im wesentlichen rohrförmigen Körper (11), der am unteren Ende in eine Spitze (13) mündet und im unteren Teil im Abstand voneinander zwei poröse Platten (15, 19) aufweist, zwischen denen sich ein vernetztes Dextrangel (14) befindet.