CH642751A5 - Verfahren zur bestimmung von ungebundenen hormonen, pharmaka oder vitaminen. - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen, Pharmaka oder Vitaminen.

Steroide werden im menschlichen Serum an Proteine gebunden. In der klinisch-chemischen Hormonanalytik basieren die Hormonbestimmungen fast ausschliesslich auf dem Prinzip, die Bindung der Transportproteine zu den Hormonen zu lösen und die Gesamtkonzentration des Hormons zu messen. Als Techniken zur Bindungslösung kommen die verschiedensten Verfahren, wie Lösungsmittelextraktion, Hitze-denaturierung, enzymatische Hydrolyse und Säure- oder Alkaheneinwirkung in Frage.

Der Gehalt der Bindungsproteine im menschlichen Serum ist aber nicht immer gleich gross. Es ist bekannt, dass bei Patientinnen unter Antiovulantientherapie oder in der späten Schwangerschaft deutlich erhöhte Werte von z.B. cortisolbindendem Globulin bzw. tyroxin-bindendem Globulin gemessen werden. Daneben wurden isolierte Vermehrungen oder Verminderungen des Bindungsproteingehaltes gefunden, deren familiäre Häufung und Erblichkeit noch diskutiert wird.

Solche veränderten Bindungsproteinspiegel führen bei der Bestimmung des Gesamthormons zu Werten, die ein Syndrom anzeigen, während die Patienten aber das klinische Bild des entsprechenden Syndroms nicht zeigen, da die Regulation der Hormone offenbar nur über den nicht an Protein gebundenen Anteil erfolgt, wogegen der an Protein gebundene Anteil biologisch inaktiv ist.

Bekannte Techniken zur Bestimmung von proteingebundenem und freiem Hormon sind entweder solche, bei denen das Gleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Hormon während der Trennung aufrechterhalten wird, wie z.B. bei der klassischen Gleichgewichtsdialyse oder der Ultrafiltration, oder Techniken, bei denen zwar das Gleichgewicht während der Trennung nicht aufrechterhalten wird, wie z.B. bei der Säulenchromatographie oder den Adsorptionsmethoden, die aber dennoch ein Mass für den tatsächlich freien Anteil des Hormons liefern. Bei diesen Techniken ist die Reaktionszeit ein kritischer Faktor, da die Bindung zwischen Adsorbent und Steroid irreversibel ist.

Die bekannten Trennverfahren sind sehr aufwendig und liefern nur den prozentualen Anteil des freien Hormons. Der Absolutwert muss durch zusätzliche Ermittlung der Gesamthormonkonzentration berechnet werden. Durch diese indirekte Bestimmung ist die Messung mit entsprechender Unge-nauigkeit verbunden, abgesehen von den äusserst aufwendigen Techniken, die nötig sind, um den Prozentanteil zu bestimmen.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen, Pharmaka oder Vitaminen, das die Bestimmung der absoluten Konzentration der freien Hormone und nicht lediglich des prozentualen Anteils gestattet. Das Verfahren soll ferner einfach und automatisierbar sein.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen, Pharmaka oder Vitaminen durch Reaktion derselben mit einem Antikörper und immunologischer Auswertung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Lösung,

die ungebundene Hormone, Pharmaka oder Vitamine und an Bindungsproteine gebundene Hormone, Pharmaka oder Vitamine sowie Bindungsproteine enthält, auf einen immobilisierten Antikörper aufgegeben wird,

die ungebundenen Hormone, Pharmaka oder Vitamine mit dem Antikörper reagieren gelassen werden.

die an Bindungsproteine gebundenen Hormone, Pharmaka oder Vitamine und die Bindungsproteine mit einer Lösung, die das markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin enthält, eluiert werden,

das markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin mit dem Antikörper reagieren gelassen wird,

das nicht mit dem Antikörper umgesetzte markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin eluiert wird und das markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin bestimmt wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet die Bestimmung der absoluten Konzentration von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka oder Vitaminen in einem Verfahren. Diese Bestimmungsmethode ist äusserst einfach, schnell und automatisierbar.

Dem erfindungsgemässen Verfahren liegt folgendes Prinzip zugrunde. Im Serum oder Plasma befindet sich das Hormon oder Pharmaka oder Vitamin (H) entsprechend dem Massenwirkungsgesetz mit dem Transportprotein (B) im thermodynamischen Gleichgewicht:

H + B HB.

Wird das Serum auf getrocknetes Antikörpergelpulver aufgegeben, so beginnt die Matrix stark zu quellen. Dieser Quellvorgang, der sehr rasch verläuft, führt zur Trennung des diffusiblen, freien Hormons und dem Hormon/Bindungsprotein-Komplex, da während des Quellvorgangs aufgrund der kleinen Porengrösse der Matrix nur relativ kleine Moleküle in diese eindringen können. Das kleine freie Hormon wird mit der Flüssigkeit in das Gelinnere Vj mitgenommen, während die Proteine und die proteingebundenen Hormone wegen der kleinen Porengrösse des Gels nur das die Gelpartikel umgebende äussere Volumen Va benützen können. Mit dem Quellvorgang wird praktisch eine äusserst rasche, vollkommene Trennung von freiem und gebundenem Hormon erreicht.

Da sich in dem von den Gelpartikeln umschlossenen Volumen V;, das etwa 80 bis 90% des gesamten Gelvolumens ausmacht, der Antikörper befindet, erfolgt dort die Reaktion des Antikörpers mit dem einströmenden Hormon:

Ak + H AkH.

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In einem zweiten Schritt erfolgt die Elution nur so lange, sehen 1 und 99 Mol%, vorzugsweise 5 bis 95 Mol%, und ins-

dass das Aussenkornvolumen Va eluiert wird. In Va befinden besondere 20 bis 80 Mol%, betragen.

sich unter anderem auch das Bindungsprotein und der Hör- Besonders geeignet sind Copolymerisate aus Acrylamid mon/Bindungsprotein-Komplex. und Methacrylsäure und insbesondere solche, bei denen der

Das diffusibile Hormon befindet sich nach dem Quellvor- 5 Methacrylsäureanteil 20 bis 60 Mol%, ausmacht.

gang hauptsächlich in dem inneren Gelkornvolumen Vj. Durch den Einsatz von Copolymerisaten, die Acrylsäure

Während des Quellvorgangs hat sich der Antikörper bereits oder Methacrylsäure oder deren Salze enthalten, lässt sich fer-

mit dem Hormon umgesetzt. Ferner ist das Volumen V; be- ner ein Neutralisationseffekt oder eine Pufferwirkung für deutend grösser als Va. Aus diesen Gründen wird durch eine saure bzw. alkalische Lösungen erzielen. Als Salze werden die Elution, die nur das äussere Gelkornvolumen Va umfasst, we- 10 Alkali- und/oder Erdalkalisalze bevorzugt.

nig von dem diffusiblen Hormon aus dem Gel ausgewaschen. Die Herstellung der Polymermatrices mit immobilisiertem Wird die Elution des Hormon/Bindungsprotein-Komple- Antikörper kann beispielsweise derart erfolgen, dass eine Lö-xes mit einer Lösung durchgeführt, die markiertes Hormon sung des Antikörpers dem Monomergemisch zugegeben wird, enthält, kann in einer zweiten Reaktion der noch nicht vom Der Ansatz wird beispielsweise radikalisch polymerisiert und unmarkierten Hormon komplexierte Antikörper mit dem 1S das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und gemarkierten Hormon erfasst werden. trocknet.

Da die Reaktionen des nicht-markierten Hormons und Zur Erzielung einer geeigneten Porengrösse der Polymer-

des markierten Hormons mit dem Antikörper nacheinander matrix wird die Monomerkonzentration variiert. Eine Mono-

ablaufen, muss bei der Inkubation mit dem markierten Hör- merkonzentration im Bereich von etwa 20% führt zu einer mon nicht die Einstellung des Gleichgewichts abgewartet wer- 20 Porengrösse von etwa 7 bis 10 Â.

den. Nach gewisser Zeit kann die Trennung des antikörperge- Eine bevorzugte Anordnung zur automatisierten Durch-

bundenen und des nicht-gebundenen markierten Hormons führung des erfindungsgemässen Verfahrens ist in der Figur durch Elution mit Pufferlösung erfolgen. gezeigt.

Die Messung der Konzentration des markierten Hormons Der immobilisierte Antikörper befindet sich in kleinen kann im Eluat oder im Gel in bekannter Weise radiologisch 25 Säulchen 5. Diese sind in einer Adapterplatte 4 fixiert. Darun-erfolgen. Die radioimmunologische Bestimmung von nicht- ter werden die Aufgabe- und Auffanggefässe angeordnet, die markierten Hormonen ist gleichfalls bekannt. Eine ausführ- in einer Einheit 6 zusammengefasst sein können. Die Säulliche Beschreibung des Radioimmunoassays findet sich bei- chen 5 sind mittels Zufuhrleitungen 7 mit den Pumpen 1 und spielsweise in Clinical Chemistry, Vol. 19, Nr. 2,1973, Seite 2 verbunden. Die Anordnung wird durch ein elektronisches 145. Gegebenenfalls kommen auch alternative Bestimmungs- 30 Steuergerät 3 gesteuert.

methoden, wie die fluoroimmunologische Bestimmung oder Die zu bestimmende Probe wird in ein Reaktionsgefäss die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Be- gegeben und unter ein Fertigsäulchen mit Antikörper gescho-

tracht. ben. Dann wird durch das Steuergerät folgendes Programm

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur Bestim- eingestellt:

mung der verschiedenen Hormone und Pharmaka und Vit- 35 Eine oder beide Pumpen laufen eine Zeit lang rückwärts,

amine, die im Serum oder Plasma zum Teil an spezifische wodurch die Probe in das trockene Antikörpergel eingesaugt oder nicht-spezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen. wird.

In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Anschliessend erfolgt ein kurzes Pausenintervall. Wäh-

Thyroxin und Trijodthyronin, die Steroidhormone, wie Cor- rend dieser Zeit erfolgt der Quellvorgang des Gels und die tisol, Testosteron, Progesteron, Östron, Östradiol und Östriol 40 Trennung von freien und proteingebundenen Hormonen,

und die Herzglycoside, wie Digitoxin und Digoxin. Ferner Diese Quellphase liegt in der Grössenordnung von 1 min,

werden Vitamine, besonders Vitamin B12 und Folsäure, so- In der nächsten Stufe laufen beide Pumpen, wobei die wie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Pumpe 1 Eluierflüssigkeit, beispielsweise eine Pufferlösung

Antikoagulantien, Dicumarol, Analgetika und Salyzilate be- oder Wasser, fördert und die Pumpe 2 Eluierflüssigkeit mit stimmt. 45 markiertem Hormon (Tracer) fördert, oder nur die Pumpe 2

Die Antikörper können mittels verschiedener Matrices vorwärts. Auf diese Weise wird gleichzeitig die Proteinfrak-

immobilisiert sein. Beispiele für Matrices sind Agarose, Zellu- tjon eluiert und der Tracer aufgegeben.

lose, Glaspartikel, Polyamide, Polyacrylamide und Copoly- Damit der Tracer vor der Aufgabe ins Gel sich nicht mit merisate des Acrylamids. Letztere werden besonders bevor- der Pufferlösung vermischt, d.h. verdünnt wird, werden Puf-

zugt. Die Vorteile der in einer Matrix eingeschlossenen Anti- 50 ferlösung und Tracerlösung durch getrennte Kanäle zuge-

körper liegen im Ausschluss von störenden Molekülen höhe- führt die direkt über dem Gel enden.

ren Molekulargewichts, der Einsparung von Pipettier- und D'iese Elution und Traceraufgabe soll möglichst schnell

Zentrifugierschritten und der langen Haltbarkeit des immobi- erfolgen, damit das Hormon nicht Zeit hat, aus dem Gel her-

lisierten Antikörpers bei Raumtemperatur. auszudiffundieren.

Durch die Copolymerisation des Acrylamids mit damit 55

copolymerisierbaren Verbindungen kann die Mikroumge- Die erforderliche Genauigkeit der Bestimmung wird erbung der Polymermatrix beeinflusst werden. Die Wirkung be- reicht, wenn entweder die Zugabe des markierten Hormons in ruht im wesentlichen auf hydrophoben und hydrophilen so- genauer Dosierung erfolgt oder im Sättigungsbereich des An-

wie elektrostatischen Effekten. tikörpers gearbeitet wird.

Durch die Variation der Polymermatrix mittels Copoly- 60 Anschliessend erfolgt ein weiteres Pausenintervall, wäh-

merisation ist eine wesentliche Erhöhung der Bindungsspezi- rend dem das markierte Hormon mit den noch freien Bin-

fität des Antikörpers und eine Unterdrückung unerwünschter dungssteilen des immobilisierten Antikörpers reagiert. Dieses

Kreuzreaktivitäten möglich. Pausenintervall liegt üblicherweise in der Grössenordnung

Besonders werden Copolymerisate aus Acrylamid und ei- von etwa 10 min. Anschliessend erfolgt die Elution mit reiner ner oder mehrerer der Verbindungen Acrylsäure, Methacryl- 65 Pufferlösung, indem die Pumpe 1 vorwärtsläuft. Mit dieser säure, Methacrylamid, deren Derivaten und Salzen der Acryl- Elution wird die Trennung des am Antikörper gebundenen säure oder Methacrylsäure bevorzugt. und nicht-gebundenen markierten Hormons bewirkt.

Der Anteil des Acrylamids im Copolymerisat kann zwi- Die im Eluat bzw. im Säulchen verbleibende Radioaktivi-

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tät ist ein Mass für die Konzentration der zu bestimmenden Säulchen angesaugt, die folgende in Phosphatpufferlösung Substanzen. (pH 7,2) gelöste Substanzen enthielt: für die Dosiswirkungs-Eine Eichkurve wird aufgestellt, indem bekannte Konzen- kurve nicht-markiertes Cortisol in ansteigender Konzentratrationen an Hormon ohne Protein den gleichen Schritten un- tion (0,56 bis 17,66 pMol), für die Serumbestimmung ver-terworfen werden. 5 dünntes Serum (1:12). Die Reaktionstemperatur wurde bei Ein Vergleich der bekannten Bestimmungen mittels Dia- 0 °C ± 0.5 °C konstant gehalten. Mit den Pumpen erfolgte lyse und Kohleadsorption hat gezeigt, dass mit dem erfin- nach 4 min Quellungszeit die Proteinelution aus den Säulchen dungsgemässen Verfahren tatsächlich nur die freien, diffusi- mit 630 nl 3H-Cortisollösung in Szintillationsgläschen. Nach bien Hormone gemessen werden. 10 min Inkubationszeit mit dem 3H-Cortisol wurde das freie Das in der Zeichnung gezeigte System ist ein Mehrkanal- io vom Antikörper gebundene Cortisol durch Elution mit der system, das die Parallelbestimmung zahlreicher Proben ge- Pumpe 2, die Phosphatpufferlösung (pH 7,2) förderte, gestattet. trennt. Das Eluat (1 ml bei 3 min Elutionsdauer) wurde in

Bei der praktischen Durchführung hat sich gezeigt, dass Szintillationsgläschen aufgefangen, mit 15 ml Szintillations-

eine Thermostatisierung auf 0 °C zur Verminderung der Dis- lösung versetzt und die Radioaktivität im Flüssigkeitsszintil-

soziation nicht erforderlich ist, sondern vielmehr auch bei is lator gemessen. Aus den Impulsen je min (cpm) wurde die

22 °C durchgeführte Messungen identische Werte ergaben. Konzentration des freien Indikatorhaptens 3H-Cortisol er-

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels, rechnet. Auf der Dosiswirkungskurve wurde dann der Gehalt das die Bestimmung des diffusiblen Cortisols im Serum zeigt, des diffusiblen Cortisols im Serum abgelesen.

näher beschrieben.

Die Herstellung des Polymergeis mit dem immobilisierten 20 Es wurden Antikörpermatrices untersucht, die folgende

Antikörper wurde folgendermassen durchgeführt. Für jeden Acrylderivate enthielten: 100% Acrylamid; 60% Acrylamid

Polymeransatz wurde die Konzentration so eingestellt, dass und 40% Methacrylsäureester; und 60% Acrylamid und 40%

die totale Monomerkonzentration 3,13 Mol/1 betrug. Für ei- Methacrylsäure. Die Monomerkonzentration betrug jeweils nen Ansatz wurden z.B. 5 g Acrylamid, 1,25 g N,N'-Methy- 3,13 Mol/1, so dass eine Porengrösse von ca. 0,8 bis 1,0 nm er-

lenbisacrylamid in einem Becherglas in 24 ml Phosphatpuffer 25 reicht wurde. Die Gelkomgrösse betrug im Mittel etwa 400

(pH 7,2) gelöst. Bei der Herstellung der Copolymerisate |xm. Bei einer Fördergeschwindigkeit von 0,5 ml/min sind wurde Acrylamid äquimolar durch Acrylderivate ersetzt. nach 4 min 92% der freien Haptene eluiert.

Nach der Zugabe des Antiserums in 1 ml Phosphatpuffer Die Bestimmung des diffusiblen Cortisols in (xg/100 ml erwurde die Reaktion mit 0,15 mg Riboflavin und 0,10 ml gab unter verschiedenen Bedingungen folgende Werte: nor-N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin und UV-Bestrahlung so maj ^5 bis 2,5; ACTH-Stimulationstest 4,5 bis 10,8; bei Degestartet. Während der Bestrahlungszeit von etwa 45 min xamethasonsuppression 0,15 bis 1,0 und bei Schwangerschaft wurde die Temperatur unter 50 °C gehalten. Der Gelblock 3,0 bis 7,8. Diese Werte entsprechen jenen, die mit üblichen wurde anschliessend zerkleinert, mit destilliertem Wasser ge- Methoden, wie der Gleichgewichtsdialyse, ermittelt werden, waschen und getrocknet. Das erfmdungsgemässe Verfahren wurde auch zur Be-

Bei der Bestimmung des diffusiblen Cortisols wurden zwei35 Stimmung von Testosteron herangezogen. Die Arbeitsweise Kolbenpumpen mit Fördergeschwindigkeiten von 0,68 ml/ entsprach im wesentlichen der vorstehend beschriebenen Be-min (Pumpe 1) und 0,5 ml/min (Pumpe 2) verwendet, die sich Stimmung des Cortisols. Es wurden jedoch 160 mg Antikör-vorwärts wie rückwärts bewegen können. 60 mg trockenes pergel verwendet, 1 ml Inkubationslösung in die Säulchen ge-Anticortisolantikörpergel wurden in kleinen Säulchen mit saugt sowie mit 1580 jj.1 3H-Testosteronlösung einer Konzeneingelegtem Filter eindosiert. Aus einem Reaktionsgefäss 40 tration von 270 pg/100 jxl die Proteinelution durchgeführt. Es wurden mit den Pumpen 320 nl Inkubationslösung in die ergab sich eine formale Sensitivität von 10 pg/ml.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

642 751 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen, Pharmaka oder Vitaminen durch Reaktion derselben mit einem Antikörper und immunologischer Auswertung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung, die ungebundene Hormone, Pharmaka oder Vitamine und an Bindungsproteine gebundene Hormone, Pharmaka oder Vitamine sowie Bindungsproteine enthält, auf einen immobilisierten Antikörper aufgegeben wird,

die ungebundenen Hormone, Pharmaka oder Vitamine mit dem Antikörper reagieren gelassen werden,

die an Bindungsproteine gebundenen Hormone, Pharmaka oder Vitamine und die Bindungsproteine mit einer Lösung, die das markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin enthält, eluiert werden,

das markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin mit dem Antikörper reagieren gelassen wird,

das nicht mit dem Antikörper umgesetzte markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin eluiert wird und das markierte Hormon, Pharmakum oder Vitamin bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein in einem Polymergel eingeschlossener Antikörper verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein in einem Acrylamidpolymer oder Acryl-amidcopolymer eingeschlossener Antikörper verwendet wird.