Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania wolnych hormonów lub srodków leczniczych.W surowicy ludzi steroidy zwiazane sa z bialka¬ mi. Oznaczanie hormonów w kliniczno-chemicznej analizie opiera sie prawie wylacznie na zasadzie 5 uwalniania hormonów z ich polaczenia z bialkiem przenoszacym i pomiaru calkowitego stezenia hor¬ monów. Sposoby uwalniania hormonów sa rózne, jak ekstrakcja rozpuszczalnikami, denaturacja pod wplywem ciepla, enzymatyczna hydroliza i dziala- io nie kwasami lub alkaliami.Zawartosc bialka wiazacego hormony w surowicy ludzi nie zawsze jest jednakowa. Wiadomo, ze u pacjentek z zaawansowana ciaza lub leczonych srodkami przeciw jajeczkowaniu stwierdza sie wy- is raznie zwiekszona zawartosc np. globuliny wiazacej kortizon lub globuliny wiazacej tyroksyne. Ponadto stwierdzono takze wahania (zwiekszenie lub zmniej¬ szenie) zawartosci bialka wiazacego, przy czym pro¬ wadzi sie nadal dyskusje na temat jego gromadze- 20 nia i dziedzicznosci w rodzinie.Tak zmienny poziom bialka wiazacego prowadzi przy oznaczaniu calkowitej zawartosci hormonów do otrzymania wartosci, które wskazuja pewien syn¬ drom, podczas gdy u pacjentów kliniczny obraz nie 25 wykazuje odpowiadajacego syndromu, prawdopo¬ dobnie dlatego, ze regulacja pracy hormonów prze¬ biega tylko przy wspóludziale hormonów niezwia¬ zanych z bialkiem, podczas gdy czesc hormonów zwiazana z bialkiem jest biologicznie nieaktywna. 30 Do znanych metod oznaczania zwiazanego z bial¬ kiem i wolnego hormonu naleza albo takie, w któ¬ rych podczas rozdzielania zachowana zostaje rów¬ nowaga miedzy zwiazanym i wolnym hormonem jak np. klasyczna dializa równowagowa lub ultrafiltra- cja, albo te, w których wprawdzie podczas rozdzie¬ lania wymieniona równowaga nie utrzymuje sie, jak na przyklad w metodach chromatografii kolumno¬ wej lub metodach adsorpcyjnych, ale które podaja jednak rzeczywista wartosc udzialu wolnego hormo¬ nu. W metodach tych istotnym czynnikiem jest czas reakcji, gdyz polaczenie miedzy adsorbentem i ste¬ roidem jest nieodwracalne.Znane metody rozdzielania sa bardzo kosztowne i podaja jedynie procentowy udzial wolnego hor¬ monu. Wartosc bezwzgledna mozna obliczyc dopie¬ ro po przeprowadzeniu dodatkowego oznaczenia calkowitego stezenia hormonów. Ta posrednia dro¬ ga oznaczania daje pewne niedokladnosci pomiaru, nie mówiac juz o tym, ze metoda oznaczania udzialu procentowego jest wyjatkowo kosztowna.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu ozna¬ czania niezwiazanych hormonów lub srodków lecz¬ niczych, który pozwolilby na oznaczanie bezwzgled¬ nych stezen wolnych hormonów, a nie jedynie ich udzialu procentowego. Poza tym sposób ten winien byc prosty i latwy do zautomatyzowania.Sposób oznaczania niezwiazanych hormonów lub srodków leczniczych przez reakcje hormonów lub srodków leczniczych z przeciwcialem i ocene radio- 111139111139 immunologiczna polega wedlug wynalazku na tym, ze roztwór zawierajacy hormony niezwiazane, hor¬ mony zwiazane z bialkiem wiazacym i bialko wia¬ zace, kontaktuje sie z unieruchomionym przeciw¬ cialem, niezwiazany hormon pozostawia sie do prze- reagowania z przeciwcialem, a hormony zwiazane z bialkiem wiazacym i bialko wiazace eluuje sie roztworem zawierajacym znaczony hormon. Zna¬ czony hormon pozostawia sie do przereagowania z przeciwcialem, a znaczony hormon, który nie prze- reagowal z przeciwcialem, eluuje sie i oznacza.Sposób wedlug wynalazku pozwala oznaczyc w jednym procesie .bezwzgledne stezenie wolnych hor¬ monów, lub srodków leczniczych. Ta metoda ozna¬ czania jest wyjatkowo prosta, szybka i mozna ja zautomatyzowac.Sposób wedlug wynalazku oparty jest na naste¬ pujacej zasadzie: W surowicy lub plazmie znajduje sie hormon lub srodek leczniczy (H) w termodyna¬ micznej równowadze z bialkiem przenoszacym (B), zgodnie z prawem dzialania mas: H+B^HB Jezeli surowice podaje sie na wysuszony sprosz¬ kowany zel przeciwciala, to nosnik zaczyna silnie peczniec. Ten zachodzacy bardzo szybko proces pecznienia prowadzi do rozdzielenia zdolnego do dy¬ fuzji wolnego hormonu i kompleksu hormon — bialko wiazace, na tej zasadzie, ze w trakcie pro¬ cesu pecznienia w male pory nosnika moga sie wcis¬ nac tylko wzglednie male czasteczki.Male czasteczki wolnego hormonu sa zabierane z ciecza do wnetrza zelu Vi, podczas gdy bialka i hor¬ mony zwiazane z bialkami moga, ze wzgledu na maly wymiar porów zelu, zajmowac tylko zewne¬ trzna przestrzen Va otaczajaca czastki zelu. W pro¬ cesie pecznienia mozna praktycznie osiagnac nad¬ zwyczaj szybkie, calkowite rozdzielenie wolnego i owiazanego hormonu.Poniewaz w zamknietej objetosci Vi czastek zelu, stanowiacej okolo 80—90% calkowitej objetosci ze¬ lu, znajduje sie przeciwcialo, zachodzi tam reakcja miedzy przeciwcialem i doplywajacym hormonem: Ak+H5=*AkH W drugim etapie eluowanie prowadzi sie tylko tak dlugo, aby wyeluowac przestrzen Va obejmu¬ jaca tylko zewnetrzna strone ziarn. W przestrzeni Va znajduje sie miedzy innymi takze bialko wia¬ zace i kompleks hormon—: bialko wiazace.Po procesie jecznienia, zdolny do dyfuzji hor¬ mon znajduje sie glównie wewnatrz ziarn zelu — w przestrzeni Vi. W trakcie procesu pecznienia przeciwcialo juz przereagowalo z hormonem. Po¬ nadto objetosc Vi jest znacznie wieksza od objetos¬ ci Va. Dlatego przez eluowanie, które obejmuje tylko zewnetrzna objetosc Va ziarn zelu, wymywa sie z zelu tylko^ niewiele zdolnego do dyfuzji hor¬ monu.Jezeli eluowanie kompleksu hormon — bialko wiazace prowadzi sie za pomoca roztworu zawiera¬ jacego znaczony hormon, to w drugiej reakcji mozna uchwycic przeciwcialo polaczone z hormonem zna¬ czonym, które jeszcze iiie utworzylo kompleksu z hormonem niezaiaczonym.Poniewaz reakcje nieznaczonego i znaczonego hormonu z przeciwcialem przebiegaja jedna po dru¬ giej, nie musi sie czekac na ustalenie sie równowa¬ gi przy inkubacji hormonu znaczonego. Po pewnym czasie mozna przez eluowanie roztworem buforowym rozdzielic hormon zwiazany z przeciwcialem od nie- 5 zwiazanego.Pomiar stezenia znaczonego hormonu w eluacie lub zelu przeprowadza sie radiologicznie w znany sposób. Radioimmunologiczne oznaczanie hormo¬ nów nieznaczonych jest równiez znane. Dokladny io opis oceny radioimmunologicznej znajduje sie np. w Clinical Chemistry tom 19 nr. 2/1973, str. 145. Na uwage zasluguja takze ewentualnie inne metody oz¬ naczania jak oznaczanie fluoroimmunologiczne lub oznaczanie za pomoca znakowania enzymatycznegOw is Sposób wedlug wynalazku jest przydatny do oz¬ naczania róznych hormonów i srodków leczniczych znajdujacych sie w surowicy lub osoczu, zwiaza¬ nych czesciowo ze specyficznymi lub niespecyficz¬ nymi bialkami wiazacymi. Na uwage zasluguja tu 20 hormony tarczycy, zwlaszcza tyroksyna i trójjodo- tyronina, hormony steroidowe jak kortizon, testo¬ steron, progesteron, estron, estradiol i estriol, i gli¬ kozydy sercowe jak digitoksyna i digoksyna.Ponadto mozna równiez oznaczac witaminy, zwla- 25 szcza witaminy B^ i kwas foliowy, jak tez srodki lecznicze o silnych wiazaniach bialkowych, jak na przyklad antykoagulanty, dwukumarol, srodki prze¬ ciwbólowe i salicylany.Przeciwciala mozna unieruchamiac za pomoca 30 róznych nosników. Jako nosniki stosuje sie przykla¬ dowo agaroze, celuloze, czastki szkla, poliamidy, po- liakryloamidy i kopolimery akryloamidu, przy czym te ostatnie sa szczególnie korzystne. Przeciwciala zamkniete w nosniku maja te zalety, ze unika sie 35 tu szkodliwego wplywu molekul o wyzszym cieza¬ rze czasteczkowym, odpada etap pipetowania i od¬ wirowywania, a unieruchomione przeciwcialo wy¬ kazuje przedluzona trwalosc w temperaturze oto¬ czenia. 40 Mikrosrodowisko nosnika z polimeru mozna ksztaltowac na drodze kopolimeryzacji akryloami¬ du ze zdolnymi do kopolimeryzacji z nim zwiazka¬ mi. Dzialanie polega w zasadzie na efektach hydro¬ fobowych i hydrofilowych jak tez elektrostatycz- 45 nych.Przez zmiane rodzaju polimeru nosnika na drodze kopolimeryzacji mozna znacznie zwiekszyc specy¬ ficznosc wiazania przeciwciala i stlumic niepoza¬ dane reaktywacje krzyzowe. 50 Szczególnie korzystne sa kopolimery z akrylo¬ amidu i jednego lub kilku zwiazków kwasu akrylo¬ wego, kwasu metakrylowego, metakryloamidu, ich pochodnych i soli kwasu akrylowego lub metakry¬ lowego. 55 Udzial akryloamidu w kopolimerze moze wynosic od 1 do 99% molowych korzystnie 5 do 95% molo¬ wych, zwlaszcza 20 do 80% molowych.Szczególnie przydatne sa kopolimery z akryloami¬ du i kwasu metakrylowego a zwlaszcza te, w któ- 60 rych udzial kwasu metakrylowego wynosi 20 do 60% molowych.Przez zastosowanie kopolimerów zawierajacych kwas akrylowy lub metakrylowy lub ich sole mozna ponadto osiagnac neutralizacje lub dzialanie bufo- 65 rujace dla roztworów kwasnych lub alkalicznych.111139 Korzystnymi solami sa sole metali alkalicznych i/lub ziem alkalicznych.Nosniki z polimerów z unieruchomionym w nich przeciwcialem mozna wytwarzac na przyklad w ten sposób, ze do mieszaniny monomerów diodaje sie roztwór zawierajacy przeciwcialo. Calosc poddaje sie na przyklad rodnikowej polimeryzacji i otrzy¬ many polimer rozdrabnia sie, przemywa i suszy.Dla otrzymania nosnika z polimeru o odpowied¬ niej wielkosci" porów nalezy odpowiecfcnio zmieniac stezenie monomeru. Stezenie monomerów wynosza¬ ce okolo 20% prowadzi do wielkosci porów od oko¬ lo 7 do 10 A.Schemat urzadzenia do zautomatyzowanego prze¬ prowadzania sposobu wedlug wynalazku przedsta¬ wiono na rysunku.Unieruchomione przeciwcialo znajduje sie w ma¬ lych kolumienkach 5. Kolumienki te umieszczone sa w plycie mocujacej 4. Pod nia umieszczone sa zbior¬ niki zasilajace i odbieralniki, które moga stanowic, polaczona jednostke 6. Kolumienki 5 polaczone sa za pomoca przewodów doprowadzajacych 7 z pom¬ pami 1 i 2. Urzadzenie sterowane jest za pomoca elektronicznego aparatu sterujacego 3.Przeznaczona do badania próbke umieszcza sie w naczyniu reakcyjnym i wsuwa pod gotowa kolu¬ mienke zawierajaca przeciwcialo. Nastepnie za po¬ moca urzadzenia sterujacego nastawia sie nastepu¬ jacy program: Jedna lub dwie pompy pracuja wstecznie pirzez jakis czas przez có badana próbka zostaje zassana do suchego zelu przeciwciala.Bezposrednio po tym nastepuje krótka przerwa.W tym czasie zachodzi proces pecznienia zela i roz¬ dzielanie wolnych i zwiazanych z bialkiem hormo¬ nów. Faza pecznienia trwa okolo 1 minuty.W nastepnym etapie pracuja obie pompy, przy czym pompa 1 podaje ciecz eluujaca, na przyklad roztwór buforowy lub wode, a pompa 2 ciecz elu¬ ujaca ze znaczonym hormonem (Tracer — wskaz¬ nik izotopowy), albo pracuje tylko pompa 2 do przo¬ du. W ten sposób równoczesnie eluuje sie frakcje bialkowa i podaje wskaznik izotopowy.Aby wskaznik ten przed dodaniem go do zelu nie zmieszal sie z roztworem buforowym, to znaczy nie ulegl rozcienczeniu, doprowadza sie roztwór bufo¬ rowy i roztwór wskaznika osobnymi przewodami konczacymi sie bezposrednio tuz nad zelem.Eluowanie i dodawanie wskaznika nalezy prze¬ prowadzic mozliwie jak najszybciej, aby zapobiec dyfuzji hormonu z zelu.Zadana dokladnosc oznaczenia uzyskuje sie wtedy, gdy albo dodawany znaczony hormon jest starannie dozowany albo gdy oznaczenie prowadzi sie w ob¬ szarze stanu nasycenia przeciwciala.Bezposrednio po tym nastepuje nastepna przer¬ wa, podczas której znaczony hormon reaguje z wol¬ nymi jeszcze miejscami w unieruchomionym prze¬ ciwciele. Przerwa ta zwykle trwa okolo 10 minut.Nastepnie prowadzi sie eluowanie za pomoca czys¬ tego roztworu buforowego, podczas którego pracuje pompa 1 (do przodu). Przez eluowanie rozdziela sie hormon zwiazany z przeciwcialem i niezwiazany hormon znaczony.Miara stezenia oznaczanych substancji jest ra¬ dioaktywnosc pozostala w eluacie lub w kolumien¬ ce.Sporzadzono krzywa cechowania, postepujac tak 5 samo jak wyzej opisano tylko przy uzyciu znanych stezen hormonów bez bialek.Z porównania oznaczen sposobem wedlug wyna¬ lazku i znanych oznaczen metoda dializy i adsorpcji na weglu wynika, ze sposobem wedlug wynalazku io rzeczywiscie dokonuje sie pomiaru tylko wolnych, zdolnych do dyfuzji hormonów.Pokazany na rysunku zestaw jest urzadzeniem wielokanalowym, pozwalajacym na równolegle prowadzenie oznaczen wielu próbek. 15 Przeprowadzanie oznaczen w praktyce wykaza¬ lo, ze nie jest konieczne termostatowanie próbek w temperaturze 0°C w celu zmniejszenia dysocjacji, gdyz pomiary przeprowadzone nawet w 22°C daly wartosci identyczne. 30 Wynalazek objasniono blizej na przykladzie ilu¬ strujacym oznaczanie zdolnego do dyfuzji kortizo- nu w surowicy.Zel polimeru z unieruchomionym przeciwcialem sporzadzono nastepujaco: Dla kazdego polimeru tak 25 dobierano stezenie, by calkowite stezenie monome¬ rów wynosilo 3,13 mola/l. Na jedna porcje rozpusz¬ czono w zlewce np. 5 g akryloamidu, 1,25 g N\N'- -metylenobisakryloamidu w 24 ml buforu fosfora¬ nowego (pH 7,2). Przy wytwarzaniu kopolimerów 30 zastepowano akryloamid równowaznikowo pochod¬ nymi akrylowymi. Po dodaniu przeciwsurowicy w 1 ml buforu fosforanowego rozpoczeto reak¬ cje z 0,15 mg ryboflawiny i 0,10 ml N,N,N',N'-cztero- metyloetyleno-dwuaminy i naswietlano promiehia- 35 mi UV. W trakcie naswietlania, które trwalo okolo 45 minut, utrzymywano temperature ponizej 50°C.Nastepnie blok zelowy rozdrabniano, przemywano woda destylowana i suszono.Podczas oznaczania zdolnego do dyfuzji kortizo- 40 nu stosowano dwie pompy tlokowe: pompe 1 o szyb¬ kosci pompowania równej 0,68 ml/min. i pompe 2 o szybkosci 0,5 ml/min, które moga pracowac do przodu i wstecz. Do malej kolumienki z umieszczo¬ nym w niej filtrem wprowadza sie 60 mg suchego 45 zelu przeciwciala antykortizonowego. Do kolumien¬ ki zasysa sie pompa z naczynia reakcyjnego 320 fil roztworu inkubacyjnego, który zawiera nastepujace rozpuszczone w roztworze buforu fosforanowego (pH 7,2) substancje: nieznaczony kortizon o wzrasta- 50 jacym stezeniu (0,56 do 17,66 pmoli), dla krzywej dzialania dawek, a dla oznaczenia surowicy — roz¬ cienczona surowica (1:12). Utrzymuje sie stala tem¬ perature reakcji w granicach 0°C±0,5°C.Po 4 minutach pecznienia przeprowadza sie za 55 pomoca pomp eluowanie bialek z kolumienek, przy uzyciu 630 1 roztworu 3H-kortizonowego w na¬ czynkach scyntylacyjnych. Po 10 minutach inkuba¬ cji 3H-kortizonem, przez eluowanie za pomoca pomr py 2 dostarczajacej roztwór buforu fosforano- 60 wego (pH 7,2), wydzielano wolny kortizon zwiazany z przeciwcialem. Eluat (1 ml z 3-minutowego wymy¬ wania) zbierano w naczynkach scyntylacyjnych, za¬ dawano 15 ml roztworu scyntylacyjnego i mierzono radioaktywnosc w scyntylatorze cieczowym. Steze- 65 nie wolnego 3H-kortizonu (hapten wskaznikowy)111139 wyliczono z ilosci impulsów na minute (cpm).Z wzorcowej krzywej dzialania dawek odczyty¬ wano nastepnie zawartosc w surowicy zdolnego dio dyfuzji kortizonu.Przebadano równiez nosniki przeciwcial, zawiera¬ jace nastepujace pochodne akrylowe: 100% akrylo- amidu, 60% akryloamidu i 40% estru kwasu meta¬ krylowego; oraz 60% akryloamidu i 40% kwasu me¬ takrylowego, przy czym kazdorazowo koncentracja monomeru wynosila 3,13 mola/l, co odpowiadalo wielkosci porów okolo 0,8 do 1,0 urn. Wielkosc ziarn zelu wynosila srednio okolo 400 jim. Przy szybkosci pompowania równej 0,5 ml/min, wyeluowano po 4 minutach 92% wolnego heptenu.Z oznaczen zdolnego do dyfuzji kortizonu w H-g/100 ml w róznych waruknach uzyskano nastepu¬ jace wartosci: normalne 1,5 do 2,5, próba stymulacji ACTH 4,5 do 10,8, próba przy tlumieniu deksame- tazonu 0,15 do 1,0 i przy ciazy 3,0 do 7,8. Wartosci te odpowiadaja wartosciom uzyskanym przy zasto¬ sowaniu znanych metod jak np. dializa równowa¬ gowa.Sposobem wedlug wynalazku oznaczano takze testosteron. Sposób pracy odpowiadal zasadniczo wyzej opisanemu sposobowi oznaczania kartizonu.Uzyto 160 mg zelu przeciwciala, zassano do kolu¬ mienki 1 ml roztworu inkubacyjnego, oraz przepro¬ wadzono eluowanie bialek za pomoca 1580 pil roz¬ tworu 3H-testosteronu o stezeniu 270 pg/100 ml.Uzyskano formalna czulosc pomiaru równa 10 pg/ml. 5 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oznaczania wolnych hormonów lub srod¬ ków leczniczych przez reakcje hormonów lub srod¬ ków leczniczych z przeciwcialem i ocene radioim- io munologiczna, znamienny tym, ze roztwór zawiera¬ jacy hormony niezwiazane, hormony zwiazane z bialkami wiazacymi i bialka wiazace kontaktuje sie z unieruchomionym przeciwcialem, niezwiaza- ny hormon pozostawia sie do przereagowania 15 z przeciwcialem, hormony zwiazane z bialkami wia¬ zacymi i bialka wiazace eluuje sie roztworem za¬ wierajacym znaczony hormon, znaczony hormon po¬ zostawia sie dq przereagowania z przeciwcialem, a znaczony hormon, który nie przereagowal z prze- 20 ciwcialem, eluuje sie i oznacza. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie przeciwcialo zamkniete w zelu poli¬ meru. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, 25 ze stosuje sie przeciwcialo zamkniete w polimerze akryloamidowym lub kopolimerze akryloami- dowym. / 4 X li // v^7 ///I fi b u u U h IIII U ti fiU II b IIII li /£ o //// o // 1 T^c 3 \ 7 2 LDA. Zakl. 2. Zam. 841/81. JSKakl. 100 egz.Cena zl 45 PL