JPS63163166A - 不均質免疫学的測定試験に用いるための安定な固定化ハプテン試薬及びその製造方法並びに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は液体試験媒体中の分析対象物を測定するだめの
特異的結合試験及び該試験において用いられる試薬に関
する。特に、本発明は標識試薬の結合体と′Ｍ＃体への
分離に、固定化されたハプテン試薬を用いるハプテン測
定のための不均質イムノアッセーに関する。

通常、測定すべき分析対象物、該分析対象物の特異的結
合相手及び標識試薬（分析対象物の結合相手と同一であ
っても異っていてもよい）の間の特異的結合相互作用が
関与する種々の不均質特異的結合試験が開発されている
。かかる試験を行う場合、標識試薬はその対応する結合
相手と結合して結合様となり、このような結合が行なわ
れない標識試薬はいずれも遊離種であり、この場合にお
ける結合の程度が存在する分析対象物の量の関数である
。標識試薬の検知し得る応答が結合様及び遊離種におい
て実質的に識別不能である場合は、存在する分析対象物
の量を効果的に測定するために、かかる結合様と遊離種
とを物理的に互いに分、２ｍすることが必要である。し
たがって、標識試薬の結合様と′Ｍ遊離種が互いに分離
されたならば、標識試薬の特定の標識の活性を測定し、
かかる活性を存在する分析対象物の量に相関させること
によってどちらかのフラクションに存在する標識の贋が
、求められる。

結合様と遊離種との物理的分離は種々の方法で行うこと
ができる。免疫学的測定試験として公知の不均質特異的
結合試験において、標識試薬は抗分析対象物抗体の標識
体である。かかる方式によれば、結合標識試薬からの遊
離標識試薬の分離は、′Ｍ＃、標識試薬の抗体と結合す
ることになる、測定される分析対象物又はその類縁体の
固定化体を加えることによって行なわれる。例えば米国
特許第４，２００，４３６号は、測定すべき抗原に対す
る。標識された１価の抗体の結合体と遊離体とを分離す
るために、測定すべき抗原の固定化体を用いた抗原測定
のためのイムノアッセーを開示している。抗原の固定化
体は、抗原を多糖類又はプラスチックのような固体支持
体又はキャリヤー材に化学的に結合させるか又は物理的
に吸着せしめることによって当該技術公知の方法により
製造される。

同様に、米国特許第４，５５１，４２６号は抗ジゴキシ
ン標識抗体の結合体及び遊離体を分離するために、ウア
バイン（ジゴキシンの類縁体）の固定化体を用いた、ハ
プテンジゴキシンのための不均質イムノアッセーを開示
している。ウアバインの固定化体は、ウアバインを直接
又は蛋白質、ポリアミノ酸もしくは合成リンカ−のよう
なスペーサ−アームを介してビーズ状アガロース、ビー
ズ状デキストラン、ポリアクリルアミドもしくはガラス
のような支持体材料に当該技術の方法によって結合せし
めることにより製造される。

しかしながら、かかる支持体材料並びに所望の分析対象
物又はその類縁体（リガンド）をかかる支持体材料へ結
合させる方法によれば、得られる試薬は比較的不安定な
ものとなり、上記のようなイムノアッセーに用いた場合
、試薬はリガンドを周囲液体へ実質的に放出するか又は
溶出させる。そのような不安定性は、リガンドの支持体
材料に対する非特異的結合のみならずリガンドと支持体
間の結合の不安定さの結果であると思われる。そのよう
な結合の不安定さ及びリガンドの非特異的結合の結果、
かなりの量のリガンドが周囲媒体に徐々に放出されるか
又は溶出するようになる。リガンドの試験媒体中への溶
出は、主に、支持体材料の内部及び外部に非特異的に結
合した結果起る。該表面に非特異的に結合したリガンド
は、不便ではあるが、支持体材料を試験操作に供する前
に水性洗浄溶液で洗浄することにより除去することがで
きる。しかしながら、内部に非特異的に結合したリガン
ドを有効に除去するのは不可能であり、そのような内在
化せしめられたりガントは支持体材料から液体試験媒体
中へ溶出する。そこで、リガンドと試験試料からの分析
対象物とを識別することは実質的に不可能となり、その
結果試験試料中に実際に存在する分析対象物の量の測定
が不正確になる。

ペプチド骨格構造と物理化学的に適合性を有する化学構
造の支持体材料、特に架橋ポリマー支持体の合成及び使
用もまた固体相ペプチドの合成に用いられることが記載
されている。特にペプチドをポリマーに結合せしめる方
法［５ｔａｈ１等、Ｊ、　Ａ１１ｌｅｒ、　Ｃｈｅｗ、
　Ｓａｃ、第１０１（１８）巻、５３８３頁（１９７９
年）］及び、水性有機溶媒混合物中での逆相懸濁重合を
用いた種々のポリマーの架橋［Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ
等、　肛剃山μ」、第２２巻、８３９頁（１９８３年）
］が、かかる支持体材料に好ましい膨潤性を与えて外部
及び内部反応部位を増加させるために用いられている。

したがって、本発明の目的は、水溶液中で安定で、かつ
ハプテンが周囲水溶液に徐々に放出されたり溶出するこ
とのない固定化されたハプテン試薬を提供することであ
る。

更に、本発明の目的は、非特異的に結合したハプテンが
実質的に内在しない、キャリヤー材の表面のみにハプテ
ン成分を実質的に共有結合（さもないとハプテンは周囲
媒体に徐々に放出されるか又は溶出する）せしめる方法
を提供することである。

本発明の他の目的はイムノアッセーに使用するための安
定な固定化されたノーブテン試薬を提供して有効に固定
化を行いかつ標識試薬の遊離種をその結合種から分離す
ることである。

本発明のまた更なる目的は、液体試験試料中のハプテン
又はその結合性類縁体を正確に測定するための、分析上
非有意量の低い初期ノくツクグラウンド信号を有する高
感受性の液体イムノアツヤ−法を提供することである。

「発明の概要」 本発明は液体試料からハプテン又はその結合性類縁体を
測定するための特異的結合試験、特にイムノアッセーに
用いるための、水性環境下で実質的に安定な固定化され
た／Ｘブテン試薬（固定化ハプテン試薬）を提供する。

固定化ハプテン試薬はポリアクリルアミドゲル粒子及び
それに結合せしめられる複数のハプテン成分から成るキ
ャリヤー材料である。ゲル粒子はその内部及び外面上に
それぞれ複数の外部及び内部官能性基を有し、ここで実
質的に全ての結合したハプテン成分は、水溶液、特にイ
ムノアッセー試験媒体中で実質的に安定な連結基によっ
て官能基の該表面に共有結合せしめられ、キャリヤー材
に非特異的に結合したまま残存するハプテン成分の量は
分析上非有意量である。したがって、イムノアッセー実
施中には実質的に全てのハプテン成分がキャリヤー材に
共有結合した状態に留り、キャリヤー材から試験媒体中
へ解離もしくは溶出するハプテン成分は、もし存在する
としても非有意量にすぎない。

また本発明によれば、ハプテン成分のゲル粒子への非特
異的結合、特にハプテン成分の、ゲル粒子の内部域への
非特異的を極小化する、安定な固定化ハプテン試薬を製
造する方法が提供される。上記方法は下試の工程から成
る： （ａ）ハプテン成分を、溶媒（この溶媒中でゲル粒子は
実質的に１１１７１１！Ｌない）中でかつハプテン成分
と、水溶液中で実質的に安定な外部の官能基とが共有結
合を形成する条件下で複数の、内部及び外部の化学的に
活性な官能基から成るポリアクリルアミドゲル粒子とを
反応させ； （ｂ）工程（ａ）で得られたゲル粒子を非ｌｌ１１潤溶
媒で洗浄し； （ｃ）工程（ｂ）で得られたゲル粒子を水性緩衝溶液で
洗浄し； （ｄ）ゲル粒子及びそれに結合せしめられたハプテン成
分（ここで実質的にすべての結合ハプテン成分は外表面
の官能基に共有結合せしめられている）から成る、工程
（ｃ）で得られた固定化ハプテン試薬を単離する。

ゲル粒子は非膨潤溶媒の存在下にハプテン成分と反応せ
しめられた場合、実質的に非１１ＨｔＩ性を示し、した
がって実質的にハプテン成分不浸透であって、その共有
結合は実質的にゲル粒子の外表面官能基のみに限定され
る。工程（ａ）においてゲル粒子の外表面に非特異的に
結合せしめられるハプテン成分はいずれも工程（ｂ）及
び（ｃ）それぞれの水性洗浄溶液によって除去される。

ハプテン又はその結合性類縁体と結合せしめられる標識
試薬をそのように結合していない標識試薬からすべて分
離することが必要な、ハプテン又はその結合性類縁体と
ハプテン又はその結合性類縁体の標識された結合相手で
ある標識試薬との間の結合が関与する不均質特異的結合
試験において固定化ハプテン試薬は特に有用である。試
験媒体からのハプテン又はその結合性類縁体に結合しな
い標識試薬はいずれも固定化ハプテン試薬のハプテンに
結合させることによって結合標識試薬から分離され、こ
の場合の結合の程度が液体試験試料中に存在するハプテ
ン又は結合性類縁体の関数である。

［好ましい実施態様の説明］ 本発明の固定化ハプテン試薬はハプテン又はその結合性
類縁体とハプテンもしくはその結合性類縁体の特異的結
合相手の標識体である標識試薬との結合が関与する従来
の不均質特異的結合試験法、特に不均質酵素イムノアッ
セーに用いることができる。更に、固定化ハプテン試薬
のハプテン成分は、生物系中に特異的結合相手が存在す
るハプテン又はその結合性類縁体を検出するためのかか
る特異的結合試験に用いるために変化させてもよく、ま
た合成することもできる。ハプテン又は・その結合性類
縁体の特異的結合相手が抗ハプテン、例えばハプテンも
しくはそのフラグメントに対する抗体である場合に、か
かる特異的結合試験法を免疫学的測定方法という。

かかる不均質特異的結合試験法、特に免疫学的測定法に
よれば、検出されるハプテン又はその結合性類縁体を、
通常標識試薬と合わせることにより反応混合物が形成さ
れ、ここで標識試薬は測定すべきハプテンに結合せしめ
られる。次に、かかる結合の程度を測定して測定すべき
ハプテンに関係づけられる。測定されるハプテンに結合
した標識試薬（すなわち結合種）の量のそのように結合
していない標識試薬（遊離種）の量に対する比率が存在
するハプテンの量の関数である。結合種と＊雑種両者の
標識試薬の標識から発せられる信号は識別不可能である
ため遊離種と結合種とを物理的に分離してどちらか一方
に存在する標識の量を単独に測定する必要があり、次に
この測定値を存在するハプテンの量に関係づけることが
できる。

本発明の固定化ハプテン試薬は、遊離種が固定化ハプテ
ン試薬に結合することによって固定化されて所要の分離
工程が行なわれる特異的結合試験において、標識された
抗ハプテン抗体の遊離種を、そのような抗ハプテン抗体
の結合種から分離する際に特に有用である。特に、本発
明の固定化ハプテン試薬は適切な官能性を与えられたポ
リアクリルアミドゲル粒子のキャリヤー材とそれに結合
する複数のハプテン成分から成る。ゲル粒子は複数の、
外部及び内部官能基を有し、実質的に全ての結合ハプテ
ン成分がゲル粒子の外表面基のみに連結基によって共有
結合せしめられる。連結基は水溶液、特にイムノアツヤ
−上の液体試験媒体から成る水溶液中で実質的に安定な
共有結合を与え、ここでハプテン成分はイムノアッセー
操作工程中キャリヤー材に共有結合した状態に留って遊
離種を結合種から有効に分離する。水性環境下における
かかる安定性によってキャリヤー材からのハプテン成分
の解離が防止され、したがって、試験媒体環境中へのハ
プテン成分の溶出が防止されることにより、以下により
詳細に説明するように試験の感受性及び正確度が増強さ
れるものと理解すべきである。

本発明の好ましい実施態様によれば、固定化ハプテン試
薬は液体試験試料からジゴキシンを検出するためのイム
ノアッセーにおいて特に有用である。標識試薬は通常当
該技術公知の方法によって得られ、酵素、好ましはβ−
Ｄ−ガラクトシグーゼで標識された、ジゴキシンに対す
るモノクローナル抗体、好ましくはジゴキシンに対する
モノクローナルＩｇＧ抗体のＦ　ａ　ｂ’フラグメント
から誘導される１価の酵素標識抗体フラグメントから成
る。好ましくは、標識試薬は本願と同日付で出願された
共に審査にかかっている米国特許出願、「実質的に純粋
な酵素−抗体単複合体（モノコンジュゲート）の製造」
　（書類番号ＭＳ−１４７７）に記載の方法によって、
電気泳動法により電気泳動ポリアクリルアミドゲル上で
精製することにより単一の酵素成分に共有結合せしめら
れた単一の１価の抗体フラグメントセ成分から成る実質
的に純粋な標識試薬の単複合体調製品が得られる。

ジゴキシンに対するイムノアッセーは、以下により詳細
に説明するように標識試薬、好ましくはその単複合体調
製品を、ジゴキシンを含有する試験試料と反応させてか
ら、アミン官能化されたポリアクリルアミドキャリヤー
材の外表面アミン基に連結基によって共有結合せしめら
れたジゴキシン又はその類縁体、例えばジギトキシゲニ
ンから成る本発明の固定化ハプテン試薬を加えることに
よって行なわれる。かかる固定化ハプテン試薬のハプテ
ン成分がジゴキシン又はジゴキシンの類縁体、例えばジ
ギトキシゲニンである場合、液体試験試料からのジゴキ
シンは標識試薬の抗体フラグメントに結合してその結合
種を形成し、試験試料からのジゴキシンに結合しない標
識試薬の′Ｍ遊離種いずれも固定化ハプテン試薬に結合
して固定化された後結合種から分離される。この場合、
結合種は溶液中に残り、′Ｍ＃種は沈降除去される。次
に標識試薬の結合種の酵素活性を測定することにより、
試験試料中のジゴキシンの量が求められる。

本発明の他の好ましい実施態様によれば、固定化ハプテ
ン試薬は、本願と同日付で出願された共に審査にかかっ
ている米国特許出願「架橋ポリアクリルアミドスルフヒ
ドリルゲル及びそのスルフヒドリル官能性誘導体」　（
書類番号ＭＳ−１４７８）Ｊに記載されるようなポリア
クリルアミド−スルフヒドリル誘導キャリヤー材の外表
面のスルフヒドリル基に共有結合したグリコシル化ペプ
チド配列、例えばヒトヘモグロビンのβ−サブユニット
中のグリコシル化Ｎ−末端ペプチド配列（グリコペプチ
ド）に対応するものから成る。

標識試薬は、上記のようにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで
標識され、単複合体に精製された、ヒトヘモグロビンの
β−サブユニット中のグルコシル化Ｎ−末端ペプチド配
列に対して特異的なモノクローナル抗体から誘導された
１価の抗体フラグメント（欧州特許出願筒１８５，８７
０号参照）から成り、液体試験試料中のＨｂＡ文Ｃの量
は一識試薬の結合種の酵素活性を測定することによって
求められる。

かかるイムノアッセーにおける酵素活性の測定は、アリ
コート量の上澄みを取り、これを酵素標識に対する色原
体性基質、例えばレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、０−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、またより好ましくは、本願と同日付で出願され
た共に審査にかかっている米国特許出願「色原体性アク
リジノン酵素基質」　（書類番号ＭＳ−１４７０）に記
載されるような、β−Ｄ−ガラクトース残基で誘導され
た７−ヒドロキシ−９Ｈ−アクリジン−１−オン色原体
から成るβ−Ｄ−ガラクトシグーゼに対する色原体性ア
クリジノン酵素基質を含有する試薬パッド上に施すこと
によって行なわれる。酵素と色原体性基質との相互作用
によって発生する検知可能な信号は、次に例えば反射光
度計によって測定され、液体試験試料中に存在するハプ
テンの量に関係づけられる。

−ハプテン１′ 液体試験試料中に存在するハプテンの量を正確に測定す
るための高感受性イムノアッセーを与えるためには、キ
ャリヤー材に対するハプテン成分の非特異的結合を極小
化すべきであることが理解されるべきである。さもない
と、もしそのような非特異的結合ハプテン成分が存在し
た場合、キャリヤー材からハプテン成分が解離して徐々
にイム／アッセー液体試験媒体中に遊離ハプテン種とし
て放出されるか又は溶出することになり、カ離ハプテン
種は標識試薬への結合について試料からのハプテンと競
合する。したがって、かかる解離ハプテン成分に結合し
た標識試薬の標識はバックグラウンド信号を発生し、該
信号により試験試料からのハプテンに結合した標識試薬
の標識によって与えらる信号の測定が妨害される結果、
液体試験試料から検出されるハプテンの測定が不正確に
なる。

したがって、本発明の主な特徴は、水溶液中で安定であ
って、適切な官能性を付与されたポリアクリルアミドゲ
ル粒子キャリヤー材の外表面のみに実質的に共有結合し
たハプテン成分から成り、上記キャリヤー材に非特異的
に結合するハプテン成分は、もし存在しても分析上非有
意量であるような固定化ハプテン試薬を提供することで
ある。

本発明によれば、非特異的に結合するハプテンは、ハプ
テン成分と適切に官能性を付与された又は誘導されたポ
リアクリルアミド樹脂とを、それらを安定に共有結合せ
しめる連結基の存在下、非ｔ１１ｎ溶媒中で反応させる
ことにより許容し得る限度に制御することができ、水溶
液中で実質的に安定な固定化ハプテン試薬が得られる。

以下に、より詳細に述べるように、非膨潤溶媒は共有結
合の程度を実質的にキャリヤー材の外表面の官能基にの
み制限する。

（ａ）キャリヤー材 本発明の好ましい実施態様によれば、固定化ハプテン試
薬のキャリヤー材は、一般に水溶液中で膨潤性であって
、当該技術において公知の方法によって製造されるアミ
ノエチル誘導ポリアクリルアミド樹脂である。かかる方
法によれば、まず、アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミドとの共重合によりポリアクリルア
ミド樹脂を製造［Ｓ、　Ｈｊｅｒｔｅｎ及びＲ，Ｍｏ５
ｂａｃｈ。

Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｆｉｌ、第３巻、１０９頁（１９６
２年）］し、適切な条件下で架橋ポリアクリルアミド鎖
を形成した後、無水エチレン−ジアミンで処理［Ｊ、　
Ｋ、　Ｉｎｍａｎ及びＨ，Ｍ、　Ｄｉｎｔｚｉｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、第８巻、４０７４頁（１９
６９年）］することにより、本発明の固定化ハプテン試
薬のキャリヤー材として使用される、複数のアミン官能
基から成るアミノエチル誘導ポリアクリルアミドゲルが
得られる。上記のように、ポリアクリルアミド樹脂をア
ミン官能基によって直接活性化することによって前者を
誘導する以外にも、アクリルアミド及びメチレンビスア
クリルアミドを例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
もしくはＮ−ヒドロキシフタルイミドのアクリル酸エス
テルと共重合せしめてから直ちにアミンヘキシル基のよ
うな第１級アミン官能基を有するハプテンと反応させて
上記樹脂中の活性エステルを置換する［Ｊ、　Ｋ、　Ｉ
ｎｍａｎ、　Ｍｅｔｈｏｄユｎ　Ｅｎｚ　１ｏｔａ　　
、−第３４Ｂ巻、３０〜５８頁（１９７４年）　、　　
Ｇ、　Ｌ。

５ｔａｈ１等、Ｊ、　Ｏｒ　、　Ｃｈｅｗ、第４４巻、
３４２４頁（１９７９年）　　；　　Ｇ、　Ｌ、　５ｔ
ａｈ１等、Ｊ、　Ａｍｅｒ。

ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓａｃ、第１０１巻、５３８３頁（１
９７９年）参照］ことによって本発明の固定化ハプテン
試薬を提供することができる。

アミ／エチル誘導ポリアクリルアミドゲルは、ハプテン
をそこへ結合又は固定化せしめる高い能力、並びに低い
非特異的吸着性故に特に好ましい。更に、樹脂乾燥重量
ｇ当り通常的１．０〜２．０ｍｅｑの種々のアミノエチ
ル能を有するゲルも市販されている（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　Ｃａ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　、上記
ゲルはまたｐＨ２，０〜１０．０の好ましいｐＨ域を有
し、′このＰＨ域より高いか又は低いｐＨ値においては
アミド側基が加水分解されやすい。

本発明の他の実施態様によれば、固定化ハプテン試薬の
キャリヤー材は官能基として複数のスルフヒドリル基を
有する新規なポリアクリルアミドスルフヒドリルゲル（
本願と同日付で出願された共に審査にかかっている米国
特許出願「架橋ポリアクリルアミドスルフヒドリルゲル
及びそのスルフヒドリル官能性誘導体（書類番号ＭＳ−
１４７８）Ｊにより詳細に記載されている）である。ポ
リアクリルアミドスルフヒドリルゲルはアクリルアミド
、ビスアクリルアミド及びＮ、Ｎ’−ビスアクリリルシ
スタミンの遊離基重合によって調製され、ＨｂＡＪｌｃ
として知られるグリコシル化された形態のヘモグロビン
のイムノアクセ−Ａ１１ｌ定用の固定化グリコペプチド
試薬の製造に特に有用である。ポリアクリルアミドスル
フヒドリゲルは同様に水溶液中で膨潤し得るものである
ことが理解されるべきである。膨潤特性は用いる七ツマ
ー類の比率、架橋度、特定の架橋基及び活性官能基によ
って制御することができる。

一般に、ポリアクリルアミドゲル粒子の物理的構造は外
表面及び内部を画定する架橋ポリアクリルアミド鎖から
成り、ここでは、上記のようにゲル粒子が膨潤しない場
合はハプテン成分及び他の試薬の内部域へのアクセシビ
リティ−は制限される。ゲル粒子の膨潤特性は、架橋ポ
リアクリルアミド鎖の網状構造の結果書られるもので、
通常多孔質のゲル粒子が得られる。したがって、ゲル粒
子が膨潤していない場合、ポリアクリルアミド鎖は架橋
基によって結束保持されることにより、ハプテン成分よ
り小さい又はハプテン成分を透過しない有効な孔径が得
られ、それにより、それらがゲル粒子の内部域へ侵透し
たり内在化するのが防止される。上記粒子は、以下によ
り詳細に説明するように更にそれらの外表面及び内部域
に、ハプテン成分と上記粒子との連結基による安定な共
有結合を形成するために必要な複数の化学的に活性な官
能基をそれぞれ有する。ハプテン成分と上記粒子の官能
基との間に共有結合が形成されない場合は、恐らくかか
るハプテン成分は非特異的結合相互作用、例えば、イオ
ン性及び疎水性結合相互作用等によって粒子に非特異的
に結合することが理解されるべきである。そのような、
ハプテン成分の粒子への非特異的結合により、キャリヤ
ー材からのかかる非特異的結合ハプテン成分の解離度が
大きくなり、イムノアッセー試験条件下又は他の水性環
境下での溶出又は徐放の度合も高くなる。

上記のように、水性環境下又は有機性環境下のいずれに
おいても、／Ｘブテン成分と官能基との間には実質的に
安定な共有結合を形成し得るが、本発明により、ハプテ
ン成分のゲル粒子、より詳細にはゲル粒子の外表面への
みに非特異的結合を最少量にとどめるために本発明によ
る非膨潤溶媒を用いることが好ましい、特に、上記粒子
の親水性が実質的に高いために、望ましくないゲルの膨
潤が起り、水溶液中ではハプテン成分や他の試薬がゲル
粒子に侵透したり内在化する一方、有機溶媒又は水を少
量含むかもしくは全く含まない溶媒中においては実質的
に膨潤が起ることはなく、膨潤に伴うかかる侵透や内在
化も実質的には起らない。したがって、本発明による非
膨潤溶媒を用いることにより、ゲル粒子のｗ潤が実質的
に防止され、それによって、ハプテン成分及び他の試薬
の粒子内への侵透又は内在化が極小化されることによっ
てハプテン成分の共有結合は実質的にゲル粒子の外表面
の官能基に対してのみに制限される。さもないと、その
ような内在化が起ることにより、上記のようにハプテン
成分とゲル粒子の内表面域に存在する官能基との間に望
ましくない共有結合が形成されることになる。また、そ
のような、ハプテン成分及び他の試薬の内在化により、
そのような内在化ハプテン成分は洗浄溶液によっては除
去することの困難な非特異的吸着を起す可能性が大きく
なり、これが後に、イムノアッセー実施中にゲル粒子か
ら溶出すると試験の感受性や正確度が低減される。

したがって、ハプテン成分のゲル粒子への固定化は、ジ
メチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトン
、塩素化炭化水素、環式及び非環式アルキルエーテル等
のような好ましくは水を殆ど又は全く含まない非膨潤有
機溶媒中で行い、それによりゲル粒子の膨潤が実質的に
無くなり、従って膨潤に伴うハプテン成分や他の試薬の
ゲル粒子内への侵透又は内在化が実質的に無くなる。粒
径のわずかな増大によりハプテン成分や他の試薬を実質
的に透過しないゲル粒子が得られると共に、それらがゲ
ル粒子内へ侵透するのを有効に防ぐことができるので、
ハプテン成分の非特異的結合は実質的にゲル粒子の外表
面にのみ制限される。ゲル粒子の外表面に非特異的に結
合するハプテン成分はいずれも非膨潤洗浄溶液、次いで
適切に緩衝化されたリンス溶液又は洗浄溶液、例えば酸
性食塩溶液によって有効に除去される。そのような外表
面の非特異的結合ハプテン成分の除去により、得られた
固定化ハプテン試薬は実質的に全てがゲル粒子の外表面
に共有結合しているハプテン成分から成る。したがって
上記試薬は、キャリヤー材に非特異的に結合するハプテ
ン成分が非有意量である結果として水溶液中では実質的
に安定なものとなる。特に、本発明によれば、水溶液、
例えば実施例５に記載のリン酸塩−クロリド試験緩衝液
のような緩衝液中に静置した際に、ゲル粒子から解離す
るのは樹脂１ｇ当りハプテン成分約１×ｌＯ′１２モル
未満、より一般的には樹脂１ｇ当りハプテン成分的Ｉ　
Ｘ　１０　”モル未満、好ましくは樹脂１ｇ当りハプテ
ン成分的１×ＩＱ−１４モル未満であり、イムノアッセ
ー実験中のハプテン成分の溶出は非有意量となり得るこ
とが理解されるべきである。

（ｂ）ハプテン成分 固定化ハプテン試薬のハプテン成分は測定すべきハプテ
ンであっても、また標識試薬であるその特異的結合相手
に結合し得るその類縁体であってもよく、上記ハプテン
又はその結合性類縁体は、本発明によりキャリヤー材粒
子の外表面官能基に共有結合することができる。

特に、生物系中に結合相手が存在するか又は結合相手を
合成することができるハプテンを測定するために本発明
の固定化ハプテン試薬のハプテン成分を選択することが
でき、例えばジゴキシン、ジギトキシゲニン、ジギトキ
シン、ジゴキシゲニン、１２−Ｏ−アセチルジゴキシゲ
ニン及びグリコシル化ペプチド配列、例えばヒトヘモグ
ロビンのβ−サブユニー／　）中のグルコモル化Ｎ−末
端ペプチド配列、並びにその他一般薬剤類、代謝物、ホ
ルモン、ビタミン、毒素及び同様の有機化合物が挙げら
れるがそれらに制限されることはない。ハプテン性ホル
モンとしては、チロキシン及びトリョードチロニンが挙
げられる。ビタミンとしてはビタミンＡ、Ｂ、例えばＢ
Ｌ２、Ｃ，Ｄ、Ｅ及びに、Ｍ酸及びチアミンが挙げら、
れる。薬剤としては、アミノグリコシド類、例えばゲン
タマイシン、トブラマイシン、アミカシン、シソマイシ
ン、カナマイシン、ネチルマイシン、ペニシリン、テト
ラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、及び
アクチノマイセチンのような抗生物質；ヌクレオシド類
及びヌクレオチド類、例えばアデノシンニリン酸（ＡＤ
Ｐ）、アデノシン三’）７％　（ＡＴＰ）、フラビンモ
ノヌクレオチド（ＦＭＮ）　、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチｌ”（ＮＡＤ）及びそのリン酸塩誘導体（
ＮＡＤＰ）、チミジン、グアノシン及びアデノシン；プ
ロスタグランジン類；ステロイド類、例えばエストリオ
ール及びエストラジオールのようなエストロゲン類、ス
テロイド類、アンドロゲン類、及びアドレノコルチ力ル
ステロイド類；その他フェノバルビクール、フェニトイ
ン、プリミドン、エトスクシミド、カルバマゼピン、バ
ルプロエート、テオフィリン、カフェイン、プロプラノ
ロール、プロ力インアミド、キニジン、アミトリブチリ
ン、コルチゾール、デシプラミン、ジンビラミド、ドキ
セピン、ドキソルビシン、ノルトリブチリン、メトトレ
キセート、イミプラミン、リドカイン、プロ力インアミ
ド、Ｎ−７セチルプロカインアミド、アンフェタミン類
、カテコールアミン類、及び抗ヒスタミン類が挙げられ
る。毒素としてはアセチルニー２トキシン、アルファト
キシン、コレラトキシン、シトリシン、サイトカラシン
類、スタフィロコッ力ルエンテロトキシンＢ、ＨＴ−１
トキシン等が挙げられる。

（ｃ）連結基 アミノエチル誘導ポリアクリルアミドゲル粒子を用いる
本発明の固定化ハプテン試薬の連結基は当該技術公知の
種々の連結基から選択することができ、例えば１，６−
ヘキサメチレンジアミン、６−アミノヘキサノール、１
．１２−ジアミノ−４，５−ジオキサドデカン、１．１
，１７−ジアミノ−３．８，９，１２．１５−ペンタオ
キサヘプタデカン、ウシ血清アルブミン及び６−７ミノ
カプロン酸の二官能性残基が挙げられるが、これらに制
限されることはない。

同様に、上記のように新規なポリアクリルアミドスルフ
ヒドリルゲルを用いる本発明の固定化ハプテン試薬の連
結基は当該技術公知の種々の連結基からも選択すること
ができ、例えばビスマレイミド（１，１’［メチレンジ
−４．１−フェニレン］　ビスマレイミド）、ビスマレ
イミド−ヘキサン、及びビスマレイミド−ヘキサエチレ
ングリコールの二官能性残基が挙げられるがそれらに制
限されることはない。

本発明により、パチン成分とゲル粒子との間に安定な共
有結合を与えるための適切な連結基を選ぶ際に最も考慮
すべきことは、正しい配向間隔及び固定化ハプテン試薬
と標識試薬の遊離種との間の結合相互作用中にそれらに
立体障害が無いことである。特に、固体支持体材料に緊
密に結合するハプテンは、生物体の活性部位がその分子
構造内の深部に位置しているため、標識試薬の特異的結
合相手との相互作用性が弱く、したがって結合相互作用
を起しにくい。一方、適切な長さのフレキシブルなスペ
ーサーアーム又は連結基を介してかかるハプテンを固体
支持体に結合せしめることにより結合の実質的増加が起
るようである。しかしながら、実質的に長めのスペーサ
ーアームは液体試験試料中の物質を、疎水性結合相互作
用〔Ｐ、０°Ｃａ　ｒ　ｒａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓ
ｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、、第１巻、２８９〜２９０頁（１
９７３年〕］によって結合せしめられることが証明され
ている。

したがって、連結基が短すぎる場合、ハプテンはその特
異的結合相手に結合せず、また長すぎると、非特異的結
合効果が顕著になって標識試薬の結合種のその遊離種か
らの分離選択率が低下する。

したがって、当業者は本発明の新規な特徴を実質的に無
視しないように上記の点を考慮すれば連結基を選択する
ことができる。安定な連結基を選択しかつ実質的に内在
化を防止するような方法でハプテン成分を結合すること
により、水溶液中で実質的に安定な本発明の固定化ハプ
テン試薬が得られる。

特に、ハプテン成分とアミノエチル誘導ポリアクリルア
ミドゲル粒子との間の安定な共有結合は、上記のように
有機溶媒、好ましくは無水の有機溶媒のような非膨潤溶
媒の液体反応環境下でゲル粒子の外表面上のアミン基と
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化された、カル
ボキシ官能化ハプテン成分との間にアミド結合を形成す
ることによって形成することができる。特に、ハプテン
成分は、まずクロロ蟻酸ｐ−ニトロフェニルで活性化し
、次にスペーサーアーム又は連結基としての６−アミノ
カプロン酸でカルボキシ官能化する０次に、カルボキシ
官能化ハプテン成分をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで
活性化してそのエステルと成し、次にこのエステルをジ
メチルホルムアミドから成る無水有機液体反応環境下で
７ミノエチル誘導ポリアクリルアミドゲルと反応させる
。

特に、活性化されたハプテン成分のエステルはゲルと、
乾燥樹脂重量１ｇにつきノ＼ブテン成分約５０ルモル〜
Ｏ，０００５ｇモル、好ましくは乾燥樹脂重量１ｇにつ
きハプテン成分０．０５ｐモル（この場合、反応混合物
中のハプテン成分の濃度はいずれも１０ｎｎＭ〜ＩＪＬ
Ｍ、好ましくは１０、Ｍである）の量で反応せしめられ
る。ゲル粒子の外表面に非特異的に結合するハプテン成
分は、上記のように有機洗浄溶液、次いで例えば２ＭＮ
ａＣ１及び０．１Ｍ酢酸（ｐＨ２，３）溶液から成る洗
浄水溶液によってすべて除去され、この間及びその後の
かかる固定化ハプテン試薬を用いるイムノアッセーの実
施中もアミン基に共有結合せしめられたハプテン成分は
アミン基と結合したままである。

本発明の固定化グリコペプチド試薬の場合は、ヒトヘモ
グロビンのβ−サブユニットにおけるグリコシル化Ｎ−
末端ペプチド配列（例えばグリコペプチド）と、新規な
ポリアクリルアミドスルフヒドリルゲルとの間の安定な
共有結合は、ゲル粒子の外表面上のスルフヒドリル基と
活性化されたグリコペプチドとの間にスルフィド結合を
形成することによって形成することができる。特に、グ
リコペプチドは、まず連結基として１．１′−［メチレ
ン−４，１−フェニレン］ビスマレイミド、ビスマレイ
ミド−ヘキサン又はビスマレイミド−ヘキサエチレング
リコールのようなビスマレイミド化合物で活性化せしめ
られる。次に活性化せしめられたグリコペプチドは予め
非膨潤溶媒中で、例えばジチオトレイトールで還元した
ポリアクリルアミドスルフヒドリルゲルと反応せしめら
れることによりスルフヒドリル官能基が与えられる。

試」Ｌ系 本発明は更に、所望のイムノアクセ−法を行うために必
要な主要要素をすべて含む試薬系を提供する。試薬系は
市販用の包装品形態で、試薬間に相容性のある組成物又
は混合物として、試験具の形態で、又はより一般的には
試験キットとして（つまり１以上の容器の組合わせ）、
必要な試薬の入った装置等として、通常はイムノアッセ
ー実施のための説明書と共に提供される。

特に、試薬系は少くとも（１）本発明の固定化ハプテン
試薬（２）標識されたハプテンの特異的結合相手、好ま
しくは、酵素で標識された、測定すべきハプテンに対す
るモノクローナル抗体から誘導された一価の抗体フラグ
メントから成る標識試薬、好ましくは上記のような実質
的に純粋なその単泡合体から成る。好ましくは、試薬系
はまた、標識試薬の指示薬、好ましくは上記のような標
識試薬の標識が酵素であり、検知可能な信号（これは測
定して存在するハプテンの量に関係づけることができる
）を発する色原体性アクリジノン酵素基質が含浸せしめ
られた試薬パッドから成る試験片のような指示薬手段を
含む。

特に、本発明を下記の実施例により説明するが、本発明
はそれらによって制限されるものではない。

実」１殊ユ ジギトキシゲニンの合成及び精製 ジギトキシン（Ａｌｃｌｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、。

Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ、ＵＳＡ、製品Ｎｏ、ＪＭ
Ｏ２６２４ＭＬ）　７６５ｍｇ　（１ミリモル）及びエ
タノールと０、ＩＮ　　ＨＣ文とのｆ　：　１　（Ｖ／
Ｖ）ａ合物４０−から成る溶液を８０°Ｃで６０分撹拌
してから室温に冷却した。溶媒を約１０ｒｎｌまで減圧
蒸発した。溶媒は固体の白色沈澱を含んでいた。この混
合物をクロロホルム２０−ずつで３回抽出した。抽出物
を合わせて水２０−で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥
し、溶媒を減圧蒸発すると白色の固体物質が得られた。

上記の白色固体物質をクロロホルムとエタノールとのｌ
　：　１　（ｖ／ｖ）混合物４−中に溶解せしめてから
シリカゲル（２００〜４００メツシユ）４０ｇの入った
フラッシュクロマトグラフィー用カラム（１２、５ｃｍ
Ｘ　６０ｃＩＩ＋）に通し、ヘキサンと酢酸エチルとの
ｌ　：　１　（ｖ／ｖ）　混合物で溶出した。カラムか
ら溶出されたフラクションを採取して薄層クロマトグラ
フィーによって分析［クロロホルム／メタノール９：　
１　（ｖ／Ｖ）］　Ｌ、ジギトキシゲニン生成物を含有
するフラクションを、Ｐ−アニスアルデヒドスプレー試
薬（９５％エチルアルコール９００−１ｐ−アニスアル
デヒド５０ｄ、濃縮硫酸５０−及び酢酸５０−）を用い
所望のジギトキシゲニン生成物の存在を示す、加熱によ
る青色発色を観察することによって測定した。生成物フ
ラクションを合わせ、溶媒を減圧蒸発せしめることによ
り白色の固体物質が得られた。次にこれをエタノールと
水との１；Ｌ（ｖ／ｖ）Ｖｆｆ１合物から再結晶すると
光沢のある白い結晶状のジギトキシゲニン３００ｍｇが
得られた。

実」１殊ヱ 炭酸３−ジギトキシゲニニルーｐ−ニトロフェニルの合
成 ジギトキシゲニン（実施例１に従って調製）７４９ｍｇ
（２ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジン６１１Ｉ
１ｇ（０，５ミリモル）を含む無水ピリジン２〇−中の
反応溶液を形成し、クロロ蟻酸ｐ−ニトロフェニル５２
４ｍｇ（２，６ミリモル）と共にアルゴン雰囲気下、室
温で５時間撹拌し、更にクロロ蟻酸ｐ−ニトロフェニル
６０ｍｇ（０，３ミリモル）を加えて同じ条件下で１５
時間撹拌することにより、活性化されたジギトキシゲニ
ンを製造した。溶媒を減圧蒸発した。残渣をクロロフォ
ルム４４中に懸濁せしめ、懸濁液を、シリカゲル（２３
０〜４００メツシユ）１００ｇの入ったフラッシュクロ
マトグラフィー用カラム（３ＣｆｆｌＸ　６０　ｃｍ）
に通し、ヘキサンと酢酸エチルとの１　：　１　（ｖ／
ｖ）Ｑ合物で溶出した。カラムから溶出されたフラクシ
ョンを採取し、薄層クロマトグラフィーによって分析［
クロロホルム／メタノール９　：　ｌ　（Ｖ／Ｖ）］　
］Ｌ炭酸３−ジギトキシゲニニルーｐ二トロフェニルを
含有するフラクションを、ｐ−アニスアルデヒドスプレ
ー試薬を用い、所望の生成物の存在を示す、加熱による
青色発色を観察することによって測定した。生成物フラ
クションを合わせ、溶媒を減圧蒸発することにより固体
生成物が得られた０次にこれをヘキサンとクロロホルム
との混合物から再結晶すると淡黄色の結晶状の炭酸３−
ジギトキシゲニニルーｐ−ニトロフェニル２７９ｍｇが
得られた。

支嵐ｌ」 ３−Ｏ−（５−カルボキシペンタン−１−力ルバモイル
）ジギトキシゲニンの合成 炭酸３−ジギトキシゲニニルーｐ−ニトロフェニル（実
施例２に従って調製）１．０８ｇ　（２ミリモル）の無
水ピリジン５０ａＪ中の反応溶液を形成し、ピリジンと
水との１：ｌ（ｖ／ｖ）混合物１０−中の６−７ミノ力
プロン酸３１５ｍｇ（２，４ミリモル）及びトリエチル
アミン３３７、ｕ（２，４ミリミル）溶液を徐々に５分
間かけて加えながら室温で撹拌することにより、活性化
ジギトキシゲニンをカルボキシ官能化した。次に反応混
合物を室温で２１時間撹拌し、溶媒を減圧蒸発した。残
渣を無水トルエン２５−中に溶解せしめ、溶媒を減圧蒸
発した。

残渣を塩化メチレンとメタノールと酢酸との２００　：
　１０　：　１　（ｖ／ｖ）混合物５ｄに溶解した後、
シリカゲル（２３０〜４００メツシユ）２００ｇの入っ
たフラッシュクロマトグラフィー用カラム（５ｃｍＸ６
０ｃｍ）に通し塩化メチレンとメタノールと酢酸との２
００：１０：１混合物で溶出した。カラムから溶出され
たフラクションを採取し、Ｒ層りロマトグラフィーで分
析［塩化メチレン／メタノール／酢酸２００：１０：１
（ｖ／ｖ）］Ｌ、３−０−　（５−カルボキシペンタン
−１−力ルバモイル）ジギトキシゲニンを含有するフラ
クションをＰ−アニスアルデヒドスプレー試薬を用い、
所望の生成物の存在を示す、加熱による青色発色を観察
することによって測定した。生成物フラクションを合わ
せ、溶媒を減圧蒸発することにより明澄な油状物が得ら
れた。次にこれを無水エチルエーテルｌＯ−で再結晶す
ると白色の固体生成物が得られ、これを戸数し、高真空
下、４０°Ｃで１時間乾燥すると３−Ｏ−（５−カルボ
キシペンタン−１−力ルバモイル）ジギトキシゲニン５
６８ＩＩ１ｇが白色固体として得られた。

見土皇１ ３−Ｏ−（５−カルボキシペンタ−１−カルバモイル）
ジギトキシゲニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドによ
る活性化 ３−○−（５−カルボキシペンタン−１−力ルパモイル
）ジギトキシゲニン（実施例３に従って製造）６４ｒｎ
ｌ（１１７ｇモル）の無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）２Ｊ中反応溶液を形成し、アルゴン雰囲気
下、室温で撹拌し、トリエチルアミン２８．文（２００
島モル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１５ｍｇ（１
３０ｇモル）及びＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイ
ミド２７ｍｇ（１３０ｐモル）を加えることによりカル
ボキシ官能化ジギトキシゲニンのエステルを製造した。

２４時間後、沈Ωしたジシクロヘキシル尿素を７２去し
、３−０−　（５−カルボキシペンタン−１−カルバモ
イル）ジギトキシゲニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを含有する７戸液をＤＭＦで希釈して１１．
１１１−とした。この反応は通常完了することはない。

支土負Ｊ ７ミ／！−ＦルＢＩＯ−ＧＥＬ＠Ｐ−２樹脂に共有結合
した３−０−（５−カルボキシペンタン−１−力ルバモ
イル）ジギトキシゲニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルの合成 まず、７ミ／ｚ＋ルＢＩＯ−ＧＥＬ＠Ｐ−２樹脂（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｔ＋
ｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ；製品陽、２８９４５アミ
ン官能基１．３９ｍｅｑ／ｇ乾燥樹脂）２ｇのＤＭＦ　
１０．＋＋７中懸濁液を形成し、これを室温で４８時間
インキュベートすることによりアミノエチル誘導ポリア
クリルアミドゲル粒子の外表面アミン基に共有結合した
ジギトキシゲニンから成る本発明の固定化ハプテン試薬
を製造した。アミノエチル誘導ＢＩＯ−ＧＥＬＯＰ−２
樹脂のＤＭＦ溶液から上澄のアリコートＩ　Ｏ，／を除
去し、その代わりに実施例４に従って調製したＤＭＦ中
の活性化ジギトキシゲニン１０−を加えて、上記樹脂の
乾燥重量ｇ当り５０ｐモルの活性化ジギトキシゲニンを
含む反応溶液を形成し、回転ミキサー（転倒式撹拌）に
より室温で４８時間緩やかに混合した。

同様に、上記操作に従って、樹脂乾燥重量ｇ当り５壓モ
ル、０．５ｇモル及び０．０５．モルの活性化ジギトキ
シゲニンから成る反応溶液を、同様にして調製したＤＭ
Ｆ中のＢＩＯ−ＧＥＬ＠Ｐ−２樹脂の上澄み１．〇−１
Ｏ，ｌＪ及び０．０１．＋ｌを除去し、その代わりに１
．〇−１０，１ｒｎｌ及び０．０１４の実施例４に従っ
て調製された活性化ジギトキシゲニンのＤＭＦ溶液をそ
れぞれ加えることにより調製した。

上記のようにして調製された、アミノエチル誘導Ｂ　Ｉ
　０−ＧＥＬ＠　Ｐ−２樹脂に共有結合せしめられたジ
ギトキシゲニンから成る本発明の固定化ハプテン試薬の
４つの試料をそれぞれ戸数し、ＤＭＦ　１０−づつで１
０回、次に２ＭＮａＣｆＬと０．１Ｍ酢酸（ｐＨ２，３
）から成る緩衝化洗浄溶液（以後「洗浄緩衝液」と呼ぶ
）１０−づつで５回洗浄した。洗浄された試薬試料をカ
ラムに注ぎ、床の１４倍の量の洗浄緩衝液で洗浄した。

洗浄された各試薬溶液からのアリコート２〜３−を小さ
いカラムに注ぎ、水５０−１次いで０．０５Ｍリン酸す
ｉリウム、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、Ｏ，００１Ｍ塩
化マグネシウム、１００ｇｇ／−ウシ血清アルブミン及
び０．０２％ナトリウムアジドを含む試験緩衝液（ｐＨ
７，４）（以後「試験緩衝液」と呼ぶ）で洗浄し、最後
に十分量の試験緩衝液に再懸濁せしめて、沈澱した樹脂
の２倍の容量の懸濁液（つまり臨界値５０％）を得た。

次に、残りの洗浄された樹脂試１４７〜８−を水６０Ｗ
Ｊで洗浄し、５０％臨界値から凍結乾燥した。

支庶土」 実験結果 実施例５に従って調製した固定化ジギトキシゲニン試薬
樹脂とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＯ３）で活性
化されていないカルボキシ官能ジギトキシゲニンを用い
て同様にして調製した対照のジギトキシゲニン樹脂とを
、本発明により調製した場合の固定化ジギトキシゲニン
試薬における共有結合と非特異的結合の程度を示すため
に比較した。かかる対照を用いた理由は、ジギトキシゲ
ニンのＮＯ３−エステルの形成が１００％完了に至るこ
とは無く、そのため樹脂に非特異的に結合し得る非活性
化ジギトキシゲニンがなおも存在するからである。

ａ、ジギトキシゲニンの樹脂に対する共有結合の評価 実施例５に従ってアミノエチル誘導ＢＩＯ−ＧＥＬ＠Ｆ
−２樹脂２ｇのＤＭＦＩＯ−懸濁液からまず上澄をそれ
ぞれｌ　Ｏ、ＯｍＪ、１　、０ｍｌ、及び０．０１４除
去し、その代わりにそれぞれに対応する量の、実施例３
に従って調製した非活性化カルボキシ官能性ジギトキシ
ゲニンの溶液を加えることにより対照樹脂を調製した０
次に、実施例５と同様に操作して、アミノエチル誘導Ｂ
ＩＯ−ＧＥＬ＠Ｐ−２樹脂に非特異的に結合したジギト
キシゲニンから成る対照樹脂をそれぞれ調製した。実施
例５に従って調製した４種の固定化ジギトキシゲニン試
薬樹脂及び本実施例に従って調製した４種のジギトキシ
ゲニン対照樹脂をβ−ガラクトシダーゼ［例えば、Ｉｓ
ｈｉｋａｗａのＪ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋。

第９６巻、６５９頁（１９８４年）；Ｋａｔｏ等のＪ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、第１１６巻、１５５４頁、（１
９７６年６月）：及びＹｏｓｈｉｔａｋｅ等のＥｕｒｏ
。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、第１ｏｔ巻、３９５頁（１
９７７年）参照］で標識されたジゴキシンに対するモノ
クローナル抗体の一価の抗体フラグメント（Ｆａｂ’）
［例えば、　ＰｏｒｔｅｒのＢｉｏｃｈｅａ＋、　Ｊ、
　、第７３巻、１１９頁（１９５９年）；及びＮ１５ｎ
ｏｆｆのＭｅｔｈｏｄｓ　Ｍｅｄ、　Ｒｅｓ、　、第１
Ｏ巻、１３２頁（１９６４年）参照］の、実施例５の試
験緩衝液（ＰＨ７，４）中の１．ｏｎＭ溶液を標識試薬
として用い、正常なヒト血清試験試料（試験Ｉ）及びジ
ゴキシン３００ｎｇ／−を含有する正常なヒト血清試験
試料を対照試料として用いた不均質イムノアッセーによ
り下記のイムノアッセーのプロトコールに従ってそれぞ
れ評価した。

（１）試験Ｉ （１）標識試薬２００ｋｌ及び正常なヒト血清試料３０
ル見から成る第１の反応混合物を室温で５分間インキュ
ベートシ： （２）本試験の工程（１）で得た第１の反応混合物１０
０ル文と樹脂１００ＩＬ！；Ｌ（沈澱樹脂容量５０％の
樹脂混合物、すなわち臨界値５０％、から得たもの）か
ら成る第２の反応混合物を室温で１０分間転倒回転し；
更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱せし
めて上澄の７リコート３０＃ＬＪｌをレゾルフィン−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド［Ｈｈｏｔｔｍａｎ等のＡｎ
ａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ、第１６３
巻、６７頁（１９８４年）］が含浸せしめられた試薬パ
ッドに施して標識試薬のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵
素活性を測定した。

（ＩＩ）試験ＩＩ （１）標識試薬２００ｐｉとジゴキシン３００ｎｇ／ｃ
ｄを含む正常なヒト血清試料３０１Ｌｌとから成る第１
の反応混合物を室温で５分間インキュベートし； （２）本試験の工程（１）の第１の反応混合物１００Ｊ
Ｌ込及び樹脂１００ル見（臨界値５０％）から成る第２
の反応混合物を室温で１０分間転倒回転（３Ｏｒｐｍ）
Ｌ、更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱せし
めて上澄のアリコート３０ｈｌをレゾルフィン−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドが含浸せしめられた試薬パッドに
施した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼとレゾルフィン−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドとの相互作用の結果得られた発色率を
、上澄の標識試薬、すなわち結合種のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ活性を測定するために、試験パッドに試料を施
してから約６０〜８０秒の間に５６０ｎｍにおいて測定
した０反応性の測定（表１）を、多ポートインターフェ
ースを介ししてＨＰ−８５コｙピユータ−（Ｈｅｗｌｅ
ｔｔ−Ｐａｃｋａｒａｄ　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ、　Ｐａ１
ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）に接続された５ｅｒ
ａｌｙｚｅｒ　＠反射光度計（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｅｌｋｈａｒｔ　ＩＮ、　
ＵＳＡ）　テ行った。この際、複合体（ｃｏｎ　ｊｕｇ
ａｔｅ）の樹脂粒子への結合の程度を、下記の等式： バックグラウンド率（％）＝ 試験ＩＩの反応性 に従ってバックグラウンド信号（％バックグラウンド）
の量を計算することによって測定し、結果を表１にまと
めた。％バックグラウンド値が低いことは、溶出し得る
、非特異的に吸着されたハプテンが不存在の場合のみに
起り得る、樹脂による抱合体の良好な結合が行なわれた
ことの表明であると理解すべきである。

同様にして下記の試験操作に従って凍結乾燥樹脂を試験
した。

（１）試験■ （１）標識試薬３７５ル文及び正常なヒト血清試料３０
ル文から成る第１の反応混合物を室温で１０分間インキ
ュベートし； （２）本試験の工程（１）で得た第１の反応混合物２０
０用文と凍結乾燥樹脂１０ｍｇから成る第２の反応混合
物を室温で５分間渦動し；更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱せし
めて上澄のアリコー）３０ｇＭをレゾルフィン−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド［）ｌｏｔｔｍａｎ等の狂り店ｙ
二…紅ｌ±」、第１６３巻、６７頁（１９８４年）コが
含浸せしめられた試薬パッドに施して標識試薬のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。

ｆｌｌ）試験■ （１）標識試薬３７５ｐ文と、ジゴキシン３００ｎｇ／
ｍｌを含む正常なヒト血清試料３０ｋｌとから成る第１
の反応混合物を室温で１０分間インキュベートし； （２）本試験の工程（１）の第１の反応混合物２００ｇ
文及び凍結乾燥樹脂１０ｍｇから成る第２の反応混合物
を室温で５分間渦動し、更に（３）本試験の工程（２）
で得た樹脂を１分間沈澱せしめて上澄のアリコー）３０
ｇＭとレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが含
浸せしめられた試薬パッドに施した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼとレゾルフィン−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼとの相互作用の結果得られた発色率を上
記のようにして測定した。

抱合体の樹脂粒子への結合量を、下記の等式： バックグラウンド率（％）＝ 試験■の反応性 に従ってバックグラウンド信号（％バックグラウンド）
の量を計算することによって測定し、結果を表２にまと
めた。

本発明の固定化ジギトキシゲニン試薬樹脂と対照樹脂と
のバックグラウンド信号における大きな差異は、ジギト
キシゲニン成分が安定な共有結合によって樹脂と強力に
結合したことを示すものである。遊離カルボン酸の形態
のハプテンで処理されて複合体の一部に結合せしめられ
た対照樹脂の能力は、上記化合物が樹脂に非特異的に強
く吸収されていることを示している。上記遊離酸の形態
のハプテンの濃度が減少すると、かかる非特異的吸収も
また減少する。そのような低いハプテン濃度において、
凍結乾爆体の形で最適に機能する本発明の固定化ハプテ
ン試薬樹脂（表２）が得られるのである。

ｂ、固定化ジギトキシゲニン試薬の安定性の評価 本発明に従って調製された固定化ジギトキシゲニン試薬
からのジキトキシゲニンの溶出を、試験緩衝液（低反応
性の対照）１７０終文、試験緩衝液中の１５０　ｎＭジ
ゴキシン（高反応性の対照）、又は試験緩衝液に４℃で
１週間それぞれ保存された（保存後、樹脂をまず再懸濁
せしめ、上澄みを除去する前に沈澱せしめた）樹脂乾燥
ｇ当り５０ｐモル、５ルモル、０．５１Ｌモル及び０．
０５μモルのジギトキシゲニンの上澄１７０用文の試験
試料を用いて下記の試験に従って評価した。

ｆｉ）正常なヒト血清試料３０ｈｌ及び複合体の６．７
ｎＭ溶液３０ＩＬｌから成る第１の反応混合物を上記試
験試料の一つと混合し、室温で５分間インキュベートし
； （１１）第１の反応混合物ｔ　ｏ　ｏ　ＩＬｉと洗浄し
たばかりの上記の臨界値５０％の５ｅｐｈａｄｅｘ＠　
Ｇ　Ｉ　Ｏ−ＢＳＡ−ウアバイン樹脂（デュポン試験試
薬キットカタログ陽、７０５７９７０１．Ｅ、Ｉ。

ｄｕＰｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｒａｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、。

Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ、　ＵＳｉＡから傅たも
の）から成る第２の反応混合物を室温で２０分間転倒回
転（３０ｒｐｍ）Ｌ：更に ０１１１工程Ｃ１１）で得た樹脂を１分間沈澱せしめて
上澄のアリコート３０　ｇＫＬとレゾルフィン−β−り
一ガラクトピラノシドが含浸せしめられた試薬パッドに
施して発色率を５ｅｒａｌｙｚｅｒの反射光度計で上記
のように測定した。試験媒体中に溶出したジギトキシゲ
ニンによる複合体への結合の妨害の量を下記の等式： ％式％ 高反応性対照の反応性 ［式中、％バックグラウンド増加＝試料の％バックグラ
ウンドー低反応性対照の％バックグラウンド］ に従って測定し、その結果を表３にまとめた。

上記結果は、樹脂１ｇ当り０．５ｐモル及び０．０５ｇ
モル、特に樹脂１ｇ当り０．０５ｇモルのジギトキシゲ
ニンの濃度に調製された樹脂からのジギトキシゲニンの
溶出、すなわち非特異的に吸着されたジギトキシゲニン
が極小化されたことを示している。上記のデータが示す
ように、僅かな量の溶出、特に０．５ｐモル／ｇ及び０
．０５用モル／ｇにおいては本発明に従って調製された
樹脂、すなわち上記のように、無水有機溶媒中で反応混
合物の希釈物を用いて調製した樹脂は、ジギトキシゲニ
ンと樹脂との間に実質的に安定な共有結合を有し、弱く
又は非特異的に結合するジギトキシゲニン（溶出したジ
ギトキシゲニンの縫はかかる高い希釈率においては実質
的に減少する）の量は僅少量となることが明確に示され
ている。

Ｃ、ジゴキシンに対する用量応答 本発明に従って調製されたジギトキシゲニン０．０５１
Ｌモル／樹脂１ｇを緩衝溶液（２ＭＮａＣ１及び０．１
Ｍ酢酸、ｐＨ２，３）次いで水で洗浄し、次に凍結乾燥
法により乾燥した。次に、標識試薬として、単一のβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ成分に共有結合したジゴキシンに
対するモノクローナル抗体から誘導された単一の一価抗
体フラグメン）（Ｆａｂ’）から成る実質的に純粋な単
複合体調製物を用いた、液体試験試料からのジゴキシン
を測定するためのイムノアッセーに上記凍結乾燥樹脂を
用いた。−価及び多価複合体、Ｍｒｓβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ成分及び遊離Ｆ　ａ　ｂ’酸成分ら成る複合体
反応混合物から単複合体を得、これを、本願と同日付で
出願された共に審査にかかっている米国特許出願「実質
的に純粋な酵素−抗体単複合体調製物」　（書類番号Ｍ
Ｓ−１４７７）に記載のように電気泳動ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動法によって精製した。上記イムノ
アッセーにおいては、色原体性酵素基質として、本願と
同日付で出願された共に審査にかかっている米国特許出
願ｒ色原体性アクリジノン酵素基質」　（書類番号ＭＳ
−１４７０）に記載の、７位がβ−Ｄ−ガラクトース残
基で誘導された７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−主
ニーアクリジン−２−オンから成るアクリジノン−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドが用いられ、下記のようにして
行った。

（電）単複合体の標識試薬０．３０ｎＭ溶液８７５延又
と、ジゴキシンを含む血清試験試料３５ル又とから成る
反応混合物を室温で６分間インキュベートし； （１１）工程（１）の反応混合物７８０ル交及び凍結乾
燥ジギトキシゲシン０．０５ｔｔモル／樹脂ｔｇ３０ｍ
ｇから成る反応混合物を多孔質プラスチックフィルター
により溶液から分離し、更にＧ１０工程（１１）の反応
混合物のが液からアリコート３０ｇ１を取り、アクリジ
ノン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが含浸せしめられた
試薬片に施した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼとアクリジノン−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドとの相互作用の結果得られた発色率を
、炉液の単複合体標識試薬、すなわち結合種のβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ活性（表４）を測定するために、試験
パッドに試料を施してから約６０〜８０秒の間に６３０
ｎｍにおいて測定した。表４に示したデータに基いて得
られた、ジゴキシンに対する用量応答を第１図に示す。

表−」 ジゴキシンに対する用量応答 ５．０　　　　　　　　　　　Ｇ、２８支庭勿１ 架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルコポリマーゲ
ル粒子の合成 アルゴン雰囲気下で、アクリルアミド（４０％）、ビス
アクリルアミド（１０％）及びＮ。

Ｎ′−ビスアクリリルシスタミン（３，４％）を水３０
−と混合した。混合物の温度を４５〜５０°Ｃに上昇さ
せて固体をすべて溶解せしめた。Ｎ。

Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１００
ｇ文を加え、混合物を４０℃に冷却し、過硫酸アンモニ
ウム２５＋ａｇを加えた後、溶液を水浴中で重合せしめ
て塊状重合体を形成した。３時間後、容器から透明な固
体物質状の塊状重合体を取り出し、水と混合し、ブレン
ダー機で均質化してゲル懸濁液を得た。ゲル懸濁液をま
ず８５メツシユのスクリーン（ＵＳＣ等級）に通し、直
径１５０μｍ未満のゲル粒子を得、次いで４００メツシ
ユのスクリーンに通し、直径３８〜１５０−の粒子を得
た。得られた３８〜１５０−の粒子を水で良く洗浄し、
ゲルを濾過し、エタノールで洗浄した後、最後に真空吸
引乾燥した。

１凰ｌ」 固定化グリコペプチド試薬の合成 実施例７に従って調製したポリアクリルアミドゲルの外
表面スルフヒドリル官能基に共有結合したグリコペプチ
ドから成る固定化ハプテン試薬を下記のようにして調製
した。

（ａ）実施例７に従って調製した架橋ポリアクリルアミ
ドスルフヒドリルコポリマーゲル２．０ｇを、まずジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄（５＋ＪＸ４回）し
、排水し、ジチオトレイ）−ル（ＤＴＴ）４００ｍｇ及
びＤＭＦｏ　、５Ｊと混合した。混合物を室温で撹拌し
、時々渦動させた。１時間後、液体を排し、ゲルをアル
ゴン雰囲気下に保持し、洗浄液からＤＴＴが検出されな
くなるまでアルゴンでパージしたＤＭＦで洗浄した。

（ｂ）別の容器に濃度１．０ｍｇ／ｌｏＯｇＭのグリコ
ペプチド（欧州特許出願第１８５，８７０号に記載の、
ヘモグロビンのβ−サブユニットにおけるクルコシル化
Ｎ−末端ペプチド配列）の水溶液ａｏｏｇｉをビスマレ
イミド−ヘキサエチレングリコール（ＤＭＦ　１００用
文中１．Ｏａ＋ｇ）の溶液及びＤＭＦ６００ｐ文と混合
した。室温にて１０分の後、上記溶液を、本実施例の工
程（ａ）で得た活性化ゲルに加えた。ゲル混合物を２時
間撹拌し、時々渦動させた。ゲルから排液し、ＤＭＦ　
（２，ａＪＸＺ回）、２Ｍ　　ＮａＣ１と０．ＩＮ酢酸
との溶液（５ｍｊＸＢ回）、水（１５０ｍＪ）及びエタ
ノール（１０ａＺＸ４回）で洗浄した。次にゲルを減圧
吸引乾燥すると、実質的に架橋コポリマーゲル粒子の外
表面スルフヒドリル官能基にのみ共有結合したグリコペ
プチドから成る本発明の固定化グリコペプチド試薬２．
０ｇが得られた。

実」Ｕ釧遣 固定化グリコペプチド試薬の反応性試験非結合標識（バ
ックグラウンド）の量を測定するために、標識試薬とし
てβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識された一価の抗体フ
ラグメント（Ｆａｂ’）の単複合体調製物を用いて、実
施例８に従って調製した固定化グリコペプチド試薬（樹
脂）を評価した。−価の抗体フラグメントはＰｏｒｔｅ
ｒ及びＮ１５ｏｎｏｆｆ　（上記参照）によって記載の
方法に従って、ヒトヘモグロビンのβ−サブユニットに
おけるグルコモル化Ｎ−末端ペプチド配列（アミノ酸８
個）に対して特異的なモノクローナル抗体から誘導しく
欧州特許出願第１８５．８７０号参照）　、　Ｉｓｈｉ
ｋａｗａ、　Ｋａｔａ等及びＹｏｓｈｉｔａｋｅ等（上
記参照）によって記載の方法に従って、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼで標識した。−価の抗体フラグメントβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ複合体を、上記に引用した共に審査
にかかっている米国特許出願「実質的に純粋な酵素−抗
体単複合体調製物」に記載のように、ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動法によって精製することにより、単
一のＦ　ａ　ｂ’酸成分単一のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ成分とから成る実質的に純粋な単複合体調製物が得ら
れた。

（ａ）単複合体標識試薬２５０ル父の溶液に、緩衝液（
ｐＨ７，４，０、０５Ｍリン酸ナトリウム、０．０５Ｍ
塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、ウシ血清ア
ルブミン１００ｇｇ／−及びナトリウムアジド０．０２
％）３０ｇＭを加え； （ｂ）本実施例の工程（ａ）で得た溶液のアリコー）２
７０に文に固定化グリコペプチド試薬（樹脂）１０〜２
０ｍｇを混合し、懸濁液を室温で３０分間転倒回転し； （ｃ）樹脂を炉上し、炉液のアリコー）３０ｇＭを、レ
ゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが含浸せしめ
られた試薬パッドに施した。

反応性の測定は前記のように５ｅｒａ１７ｚｅｒ＠反射
光度計を用いて行い、このようにして測定した反応性の
樹脂の処理を行なわない標識試薬の反応性に対する比率
を％バックグラウンドとして示す（表５参照）。

又遁は１上Ａ ＨｂＡ見ｃＪ１定用のイム／アッセー （ａ）種々の濃度の変性血液、すなわちＨｂＡ文Ｃ（第
２図）３０ｐ文を標識試薬の溶液（実施例９）２５０ｇ
文に加え、混合物を室温で１０分間静置し： （ｂ）各１昆合物のアリコート２７０ル文に固定化グリ
コペプチド試薬（実施例８）１５ｍｇを混合し、室温で
１０分間転倒回転し； （ｃ）樹脂を７２去し、炉液３０弘文を、レゾルフィン
−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが含浸せしめられた試薬
パッドに施した。

反応性の測定は前記のようにＳｅ　ｒａ　Ｉ　ｙ　ｚｅ
　ｒ８反射光度計を用いて行ったところ、反応性は全血
中に存在するＨｂＡｌｃの濃度に正比例することが判明
した（第２図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ジギトキシゲニンを本発明の固定化ハプテン
試薬におけるハプテン成分として用いたイムノアッセー
において得られた、ジゴキシンに対する用量応答を示す
グラフである。 第２図は、全血試料中のグリコシル化されたヘモグロビ
ンＨｂＡｕｃの量を測定するためのイムノアッセーにお
ける、本発明の固定化されたグリコペプチド試薬の反応
性を示すグラフである。 屓千ノた・務 シパゴヘシン（門Ｓ／− ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試験試料中のハプテン又はその結合性類縁体の
   特異的結合試験測定に使用するための安定な固定化ハプ
   テン試薬の製造方法であって、 （ａ）ハプテン成分を複数の外表面及び内部の化学的に
   活性な官能基から成るポリアクリルアミドゲル粒子と反
   応せしめ（この場合、反応は、ゲル粒子が実質的に膨潤
   しない溶媒中、上記ハプテン成分と、水溶液中で実質的
   に安定な外面の該活性な官能基との間に共有結合が形成
   される条件下で行なわれる）； （ｂ）工程（ａ）で得られたゲル粒子を非膨潤溶媒で洗
   浄し； （ｃ）工程（ｂ）で得られたゲル粒子を水溶液で洗浄し
   ；かつ （ｄ）該ゲル粒子とそれに結合する該ハプテン成分とか
   ら成る、工程（ｃ）で得られた固定化ハプテン試薬を単
   離する工程から成り、ここで実質的に全ての結合ハプテ
   ン成分は水溶液中で実質的に安定な連結基によって外表
   面の官能基に共有結合せしめられることを特徴とする方
   法。 ２、非膨潤性溶媒が有機溶媒である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３、該有機溶媒がジメチルホルムアミド、ジメチルスル
   ホキシド、アセトン、塩素化炭化水素並びに環式及び非
   環式アルキルエーテル類から成る群より選ばれる特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４、ハプテン成分がジゴキシン、ジギトキシゲニン、ジ
   ギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ−アセチルジ
   ゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ５、連結基が１，６−ヘキサメチレンジアミン、６−ア
   ミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−４，９−ジオ
   キサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，６，９，１２
   ，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−アミノカプロ
   ン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残基から成る群
   より選ばれる特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、連結基が６−アミノカプロン酸の二官能性残基であ
   り、ハプテン成分がジギトキシゲニンである特許請求の
   範囲第４項記載の方法。 ７、ハプテン成分がグリコシル化ペプチド配列である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、連結基が１，１′−［メチレンジ−４，１−フェニ
   レン］ビスマレイミド、ビスマレイミド−ヘキサン及び
   ビスマレイミド−ヘキサエチレングリコールの二官能性
   残基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 ９、該グリコシル化ペプチド配列がヒトヘモグロビンの
   β−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ−末端ペプチ
   ド配列に対応し、連結基がビスマレイミド−ヘキサエチ
   レングリコールである特許請求の範囲第７項記載の方法
   。 １０、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾２モル未満のハプテンしか固定化
   ハプテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 １１、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾３モル未満のハプテンしか固定化
   ハプテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲
   第１０項記載の方法。 １２、非膨潤状態のポリアクリルアミドゲル粒子が実質
   的にハプテン成分不透過性である特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １３、液体試験試料中のハプテン又はその結合性類縁体
   の特異的結合試験測定に使用するための安定な固定化ハ
   プテン試薬であって、 上記固定化ハプテン試薬がポリアクリルアミドゲル粒子
   とそれに結合する複数のハプテン成分から成り、該ゲル
   粒子が複数の外面及び内部の官能基から成り、 実質的に全ての該結合ハプテン成分が、水溶液中で実質
   的に安定な連結基によって該外面の官能基に共有結合し
   ていることを特徴とする試薬。 １４、ハプテン成分がジゴキシン、ジギトキシゲニン、
   ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ−アセチル
   ジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許請求の範囲
   第１３項記載の固定化ハプテン試薬。 １５、連結基が１，６−ヘキサメチレンジアミン、６−
   アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−４，９−ジ
   オキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，６，９，１
   ２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−アミノカプ
   ロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残基から成る
   群より選ばれる特許請求の範囲第１４項記載の固定化ハ
   プテン試薬。 １６、連結基が６−アミノカプロン酸であり、ハプテン
   成分がジギトキシゲニンである特許請求の範囲第１４項
   記載の固定化ハプテン試薬。 １７、ハプテン成分がグリコシル化ペプチド配列である
   特許請求の範囲第１３項記載の固定化ハプテン試薬。 １８、連結基が１，１′−［メチレンジ−４，１−フェ
   ニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド−ヘキサン及
   びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコールの二官能
   性残基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第１７項
   記載の固定化ハプテン試薬。 １９、該グリコシル化ペプチド配列がヒトヘモグロビン
   のβ−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ−末端ペプ
   チド配列に対応し、連結基がビスマレイミド−ヘキサエ
   チレングリコールである特許請求の範囲第１７項記載の
   固定化ハプテン試薬。 ２０、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾２モル未満のハプテンしか固定化
   ハプテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲
   第１３項記載の固定化ハプテン試薬。 ２１、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾３モル未満のハプテンが固定化ハ
   プテン試薬のゲル粒子から解離する特許請求の範囲第２
   ０項記載の固定化ハプテン試薬。 ２２、試験試料がハプテン又はその類縁体と結合し得る
   標識試薬次いで抗体試薬と結合し得る固定化されたハプ
   テンと接触せしめられ、かつ試料中の該ハプテン又はそ
   の類縁体に結合される標識抗体試薬の量が固定化試薬に
   結合される標識抗体試薬の量と比較することによって測
   定されて試験試料中のハプテン又はその類縁体の存在と
   関係づけられる、液体試験試料中のハプテン又はその類
   縁体を測定するための免疫学的測定試験法において、 固定化試薬として、ポリアクリルアミドゲル粒子とそれ
   に結合せしめられた複数のハプテン成分から成る実質的
   に安定な固定化ハプテン試薬を用い、該ゲル粒子が複数
   の外面及び内面の官能基から成り、ここで実質的に全て
   の該結合ハプテン成分が、水溶液中で実質的に安定な連
   結基によって該外面の官能基に共有結合していることを
   特徴とする方法。 ２３、ハプテン成分がジゴキシン、ジギトキシゲニン、
   ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ−アセチル
   ジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許請求の範囲
   第２２項記載の試験方法。 ２４、連結基が１，６−ヘキサメチレンジアミン、６−
   アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−４，９−ジ
   オキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，６，９，１
   ２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−アミノカプ
   ロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残基から成る
   群より選ばれる特許請求の範囲第２２項記載の試験方法
   。 ２５、連結基が６−アミノカプロン酸であり、ハプテン
   成分がジギトキシゲニンである特許請求の範囲第２３項
   記載の試験方法。 ２６、ハプテン成分がグリコシル化ペプチド配列である
   特許請求の範囲第２２項記載の試験方法。 ２７、連結基が１，１′−［メチレンジ−４，１−フェ
   ニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド−ヘキサン及
   びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコールの二官能
   性残基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第２６項
   記載の試験方法。 ２８、該グリコシル化ペプチド配列がヒトヘモグロビン
   のβ−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ−末端ペプ
   チド配列に対応し、連結基がビスマレイミド−ヘキサエ
   チレングリコールである特許請求の範囲第２６項記載の
   試験方法。 ２９、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾２モル未満のハプテンしか固定化
   ハプテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲
   第２２項記載の試験方法。 ３０、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾３モル未満のハプテンしか固定化
   ハプテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲
   第２９項記載の試験方法。 ３１、（１）ハプテンはその類縁体と結合し得る標識試
   薬及び（２）該標識試薬と結合し得る固定化されたハプ
   テンから成る固定化試薬から成る、液体試験試料中のハ
   プテン又はその類縁体を測定するための試薬系において
   、 固定化試薬として、ポリアクリルアミドゲル粒子とそれ
   に結合せしめられた複数のハプテン成分から成る実質的
   に安定な固定化ハプテン試薬を用い、該ゲル粒子が複数
   の外面及び内部の官能基から成り、ここで実質的に全て
   の該結合ハプテン成分が、水溶液中で実質的に安定な連
   結基によって該外面の官能基に共有結合していることを
   特徴とする試薬系。 ３２、ハプテン成分がジゴキシン、ジギトキシゲニン、
   ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ−アセチル
   ジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許請求の範囲
   第３１項記載の試薬系。 ３３、連結基が１，６−ヘキサメチレンジアミン、６−
   アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−４，９−ジ
   オキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，６，９，１
   ２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−アミノカプ
   ロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残基から成る
   群より選ばれる特許請求の範囲第３２項記載の試薬系。 ３４、連結基が６−アミノカプロン酸であり、ハプテン
   成分がジギトキシゲニンである特許請求の範囲第３２項
   記載の試薬系。 ３５、ハプテン成分がグリコシル化ペプチド配列である
   特許請求の範囲第３１項記載の試薬系。 ３６、連結基が１，１′−［メチレンジ−４，１−フェ
   ニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド−ヘキサン及
   びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコールの二官能
   性残基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第３５項
   記載の試薬系。 ３７、該グリコシル化ペプチド配列がヒトヘモグロビン
   のβ−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ−末端ペプ
   チド配列に対応し、連結基がビスマレイミド−ヘキサエ
   チレングリコールである特許請求の範囲第３５項記載の
   試薬系。 ３８、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾２モル未満のハプテンが固定化ハ
   プテン試薬のゲル粒子から解離する特許請求の範囲第３
   １項記載の試薬系。 ３９、水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂１ｇ当り
   約１×１０＾−＾１＾３モル未満のハプテンが固定化ハ
   プテン試薬のゲル粒子から解離する特許請求の範囲第３
   ８項記載の試薬系。