NO781474L - Fremgangsmaate ved bestemmelse av ikke-bundne hormoner og farmasoeytika - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved bestemmelse av ikke-bundne hormoner og farmasøytika.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved bestemmelse av ikke-bundne hormoner eller farmasøytika. Nærmere definert vedrører oppfinnelsen reaksjonen mellom ikke-bundne hormoner eller farmasøytika og st antistoff etterfulgt av bestemmelse ved hjelp av radiologisk-immunologiske målinger.

Steroider i humant serum er knyttet til proteiner. I klinisk kjemisk hormonanalyse er hormonbestemmelsene nesten utelukkende basert på prinsippet av bindingen mellom trans-porthormonene og hormonene oppløses og den totale konsentrasjonen av hormonene måles. Teknikken som brukes for å oppløse båndene kan være av de mest forskjellige typer som løsningsmiddelekstraksjon, oppvarmingsdenaturering, enzymatisk analyse og behandling med syrer eller alkali.

Imidlertid er innholdet av bindende proteiner i humant serum ikke alltid av samme størrelsesorden. Det er f.eks. kjent at kvinnelige pasienter under antiovulasjonsterapi eller på slutten av svangerskapet har tydelig større mengder kortisol-bindende globulin eller tyroksinbindende globulin. Andre eksempler innbefatter de isolerte kontroversielle økninger eller reduksjoner i innhold av bindende protein som finnes hos forskjellige individer med beslektet familiær bakgrunn og av-stamning.

Mengder av bundet protein som på denne måten varierer resulterer ofte i bestemmelse av totale hormoner i størrelser som indikerer et vist syndrom mens pasientene ikke viser det kliniske bildet for det tilsvarende syndromet. Åpenbart skyldes dette at resultatene bare viser andelen som ikke er bundet til proteiner, mens andelen som er bundet til protein

er biologisk inaktivt.

De kjente metoder for bestemmelse av proteinbundne eller frie hormoner er enten sådanne hvori likevekten mellom bundne og frie hormoner opprettholdes under separasjonen, som f.eks.

i klassisk ekvilibriums-dialyse eller ultrafiltrering, eller sådanne hvori likevekten ikke holdes under separasjonen, som f.eks. kolonne-kromatografi eller absorpsjonsmetoder. Ikke desto mindre gir disse metodene et mål for andelen av hormonene som faktisk er frie. I disse metodene er reaksjons-tiden i en kritisk faktor fordi bindingen mellom absorp-. sjonsmiddelet og steroidet er irreversibelt.

Blant ulempene ved kjente separasjonsmetoder er at de er meget dypere og bare gir en prosentell andel av det frie hormonet. Den absolutte verdien må beregnes ved tilleggsbestemmelsen av total hormonkonsentrasjon. På grunn av denne indirekte bestemmelsen blir målingene tilsvarende unøyaktige bortsett fra de meget dyre metoder som kreves for å bestemme den prosentuelle andelen.

Et av formålene ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en metode for bestemmelse av ikke-bundne hormoner eller farmasøytika som egner seg for bestemmelse av den absolutte konsentrasjonen av frie hormoner og ikke bare deres prosentuelle andel. Videre bør metoden være enkel og kunne tilpasses automatise-ring.

Disse hensikter oppnås ved foreliggende oppfinnelse hvor en metode for bestemmelse av ikke-bundne hormoner eller farma-søytika fremskaffes ved reaksjon av hormonene eller farma-søytika med et antistoff og radioimmunologisk måling hvor en løsning som inneholder ikke-bundne hormoner, hormoner bundet til bindende proteiner og bindende hormoner adderes til et immobilisert antistoff. Det ikke-bundne hormon får reagere med antistoffet mens hormonet som er bundet til proteiner og bindingsproteinet elueres med en løsning som inneholder et markert hormon, der det markerte hormonet får reagere med antistoffet, og alt det markerte hormonet som ikke<!>reagerer med antistoffet elueres etterfulgt av bestemmelsen av det markert hormonet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å bestemme den absolutte konsentrasjonen av ikke-bundne hormoner eller farmasøytika i en enkelt prosess. Bestemmelsesmetoden er ekstremt enkel, rask og i stand til å automatiseres.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er basert på det. følgende prinsipp. I sera og plasma er hormonene.eller farmasøytikumet

(H) i termodynamisk likevekt som følger massevirkningsloven med det transporterende protein (B):

Hvis serum plasseres på det tørkede antistoff-gel-pulveret begynner matrisen å svelle sterkt. Denne svelleprosessen som går meget raskt resulterer i separasjonen av dét diffunderbare frie hormonet og det hormon/bindende proteinkomplekset. Under svellingsprosessen som skyldes matrisens lille pors-størrelse kan bare relative små molekyler trenge gjennom matrisen. Det lille frie hormonet opptas av væsken inne i

gel , mens proteinene og de protein-bundne hormoner grunnet gelens lille porestørrelse bare er i stand til å benytte det ytre volumet V a som omgir gelpartiklene. Følgelig fører svelleprosessen i praksis til en ekstremt rask og fullstendig separasjon av fri og bundne hormoner.

Fordi volumet V. omfatter ca. 80 til 90% av det totale gel-volumet som inneholder antistoffet, finner reaksjonen mellom antistoffet og det innstrømmende hormonet ned i volumet V\

som følger:

I et annet trinn fortsetter elueringen bare inntil det ut-vendigJ e<p>artikkelvolumet V a er eluert. Blant annet inneholder V a- også det bundne proteinet og komplekset hormon/ bindingsproteinkompleks. Etter svelleprosessen finnes det diffunderbart hormonet hovedsaklig i det innvendige gelpartikkelvolumet V\. Under svelleprosessen har antistoffet allerede reagert med hormonet. Videre er volumet Vi .,vesentlig større enn V a. Av disse

grunner vil elueringen som bare innbefatter det ytre volumet av gelpartikkelen V a bare vaske vekk en minimal mengde diffunderbart hormon fra gelen.

Hvis eleuringen av hormon/bindings-protein-komplekset ut-

føres med en løsning med et markert hormon, kan i en ytter-ligere reaksjon det antistoffet som ennå ikke er kompleksert med det ikke-markerte hormonet bestemmes sammen med det markerte hormonet.

Fordi reaksjonene til det ikke-markerte hormonet og det markerte hormonet etterfølger hverandre, er det under inku-bering med det markerte hormonet ikke nødvendig å avvente likevektens innstilling. Etter en viss tid kan hormonet som er bundet til antistoffet og det bundne hormonet separeres ved eluering med en bufferløsning.

Konsentrasjonen av det markert hormonet kan måles i eluatet eller i gelen på kjent måte som ved radiologisk immunologisk måleteknikk. Den radiologisk immunologiske bestemmelsen av ikke-markerte hormoner er også kjent. En detaljert beskri-velse av radiologisk immunologisk måling er f.eks. kjent fra Clinical Chemistry, bind. 19, nr. 2, 1973, s. 145. Alternativt kommer også andre metoder for bestemmelser som fluor-immunologisk bestemmelser eller bestemmelser ved hjelp av enzymatisk markering på tale.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er egnet for bestemmelse

av forskjellige hormoner og farmasøytika som er til stede i sera eller plasma bundet delvis til spesifikke eller ikke-spesifikke bindende proteiner. Disse kan bestå av tyroid-hormoner, spesielt tyroksin og tri-jodtyroksin, steroidhormoner som kortisol, testosteron, progesteron, estron, estradiol og estriol og hjerteglykosidene som digitoksin og digoksin. Videre kan vitaminer bestemmes, spesielt vitamin

B12 og folinsyre samt farmasøytika med sterkeproteinbin-dinger som f.eks. anti-koagulanter, analgetika og salycy-. later.

Antistoffene kan1 immobiliseres ved hjelp av forskjellige matriser. Eksempler på slike matriser er agar, cellulose, glasspartikler, polyamider, polyakrylamider og kopolymere av akrylamid. Sistnevnte foretrekkes særlig. Fordelene ved antistoffene som sitter i en matrise ligger i at inn-virkning med molekyler med høy. molekylarvekt utelukkes, pipeterings- og sentrifugeringstrinnene elimineres og de immobiliserte antistoffene har øket stabilitet ved romtem-peratur.

Mikro-m.iljøet til polymer-matrisen kan påvirkes ved kopoly-merisasjon av akrylamid med forbindelser som er i stand' til å kopolymere med dette akrylamidet. Virkningen fører hovedsaklig til hydrofobe og hydrofile og elektrostatiske faktorer. Ved å variere polymermatrisen gjennom kopolymerisering er det mulig å vesentlig øke bindingsspesifiteten til antistoffet og undertrykke uønskede kryssreaktiviteter. Kopolymerer av akrylamid og av en eller flere av forbindelsene akrylsyre, metakrylsyre, metakrylamid, deres derivater og salter av akrylsyre og metakrylsyre er spesielt foretrukket. Andelen av akrylamid i kopolymeren kan ligge mellom 1 og 99 mol-%, fortrinnsvis 5 til 95 mol-% og spesielt 20 til 80 mol-%. Kopolymerer av akrylamid og metakrylsyre og spesielt slike med en metakrylsyredel på 20 til 60 mol-% er særlig egnet. Ved å bruke kopolymerer som inneholder akrylsyre og metakrylsyre eller deres salter, kan i tillegg en nøytraliserende eller puffrende virkning oppnås for sure eller alkaliske løsninger. Foretrukne salter er alkalim og/eller jordalkali-saltene.

Polymermatriser med immobiliserte antistoffer kan f.eks. frem-stilles ved å tilsette en løsning av antistoffet til monomer-blandingen. Begynnelsesblandingen blir f.eks. polymerisert ved fri radikal polymerisasjon og den erholdte polymer pulveri-j sert, vasket og tørket.

For å oppnå en passende porestørrelse hos polymermatrisen varieres monomer-konsentrasjoen. En monomer-konsentrasjon rundt 20% fører til en porestørrelse rundt 7 til 10 Å.

En utførelsesform av oppfinnelsen som spesielt viser et arrangement for automatisk utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vist i figuren.

Det immobiliserte antistoffet foreligger i de små koloni v<■■■>-nene 5. Disse er anbrakt i en adapter-plate 4. Fyllings- og opptaks-beholderne er anbrakt under adapter-platen og kan danne en kombinert enhet 6. Kolonne 5 er forbundet med en trykkontroll-anbrdning som tilførelsesrør 7 og med vakuum/ trykkpumper 1 og 2. Anordningen kontrolleres ved en elektronisk kontrollanordning 3. At flere kolonner 5 foreligger indikerer et foretrukket arrangement av et multikanal-system som til-later samtidig bestemmelse av flere prøver.

Prøven som skal bestemmes plasseres i en reaksjonsbeholder cg anbringes" .under en preparert kolonne som inneholder antistoffet. Det følgende program igangsettes så ved Hjelp av kontroll-anordningen:

En eller begge punktene går over et tidsrom og gir et

negativ trykk i rørene 7 og kolonnen 5. Under prosessen

suges derved prøven inn i den tørre antistoffgelen.

Etterpå blir det en kort pause. I denne tiden finner gelens svellningsprosess sted sammen med adskillesen av fri og proteinbundne hormoner. Dette intervallet eller svellnings-fasen er av størrelsesorden 1 minutt.

Under det neste trinnet er begge pumpene i drift idet pumpe 1 transporterer elueringsvæsken, f.eks. en pufferløsning eller vann, og pumpen 2 transporterer elueringsvæske med det markerte hormonet (tracer). Alternativt kan pumpe 2

alene opereres i retning fremad, dvs. i et positivt trykk i de tilsvarende tilføreselsrør. På denne måten élueres protein fraksjonen og tracerens tilsettes samtidig..

For å forhindre blandingen eller fortynningen av traceren

før denne tilsettes gelen med pufferløsningen, innføres pupperløsning og tracerløsning gjennom separate kanaler

hvor kanalene stopper direkte over gelen. Elueringen og tilsetningen av tracer må gjennomføres så raskt som mulig

for å hindre at hormoner diffunderer ut av gelen. Mengden markert hormon som tilsettes kan beregnes nøyaktig for å gi den krevede nøyaktighet i bestemmelsen. I en alternativ målemetode trenger tracer ikke å måles nøyaktig hvis trinnene utføres innenfor antistoffets metningsparametere.

Etter det ovenfor beskrevne elueringstrinn følger et annet pauseintervall, og under dette reagerer det markerte hormonet med de gjenværende frie bindingsposisjoner på det immoblilserte antistoffet.

Dette intervallet er normalt av størrelsesorden rundt 10 minutter. Deretter finner eluering med en ren pufferløsning sted mens pumpe 1 opererer fremover. Ved denne elueringen separeres hormonet som er bundet til antistoffet og det ikke-bundne markerte hormonet.

Den gjenværende radioaktiviteten i eluatet eller kolonnen er et mål for konsentrasjonen av substansene som skal bestemmes.

En kalibreringskurve bestemmes ved å underkaste kjente hor-monkonsentrasjoner uten protein de samme trinnene. En sammen-likning av kjente bestemmelser ved hjelp av dialyse og karbonadsorpsjon viser at bare fri, diffunderbare hormoner måles virkelig ved metoden ifølge oppfinnelsen.

En særlig fordel som er oppdaget ved praktisk anvendelse av metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er elimineringen av en nøyaktig, temperaturkontroll på 0°C for å redusere dis-sosiasjonen. Målinger uført ved 22°C ga identiske verdier med dem som oppnås nøyaktig ved 0°C.

Oppfinnelsen beskrives i det følgende mer detaljert ved hjelp av eksempler som demonstrerer bestemmelsen av diffunderbart kortisol i serum.

EKSEMPEL 1

En polymergel med det immobiliserte antistoffet ble ■ frem-stilt som beskrevet .i det følgende. For hver bégynnelses-polymerisasjonsblanding ble konsentrasjonen innstilt slik at den totale monomerkonsentrasjonen kom på 3,13 mol pr. liter, Som en begynnelsesblanding ble f.eks. 5 g akrylamid, 1,25 g N,N'-metylenbisakrylamid oppløst i et begerglass i 24 ml fosfatpuffer (pH 7,2). Ved fremstillingen av kopolymere ble akrylamidet erstattet i like molare forhold med akrylderivater. Etter tilsetningen av antiserum i 1 ml fosfatpuffer ble reaksjonen påbegynt med 0,15 mg riboflavin og 0,10 ml N,N,N'-tetrametyletylendiamin og UV-bestråling. Under bestrålingsperioden på nær 4 5 minutter ble temperaturen holdt under 50°C. Den resulterende gelblokken ble så pul-verisert, vasket med destillert vann og tørket.

Ved bestemmelsen av diffunderbart kortisol ble to stempel-pumper med pumpehastigheter på 0,60 ml pr. min (pumpe 1) og 0,5 ml pr. min. (pumpe 2) anvendt som begge kunne gå fremover og bakover. 60 mg tørr antikortisolantistof.fgel ble tilsatt i doser til små kolonner med innsatte >filtere. Fra et reaksjonskar ble 320 ul inkuberi.ngsløsning sugd inn i kolonnene med pumpene hvor inkuberingsløsningen inneholdt de følgende substanser oppløst i fosfatpuffer-løsningen.

(pH 7,2): for- doseringsaktivitets-kurven, ikke-markert kortisol i økende konsentrasjoner (0,56 til 17,66 p mol) , for serum-bestemmelsen, fortynnet serum (1:12). Reaksjons-temperaturen ble holdt konstant på 0°C + 0,5°C. Protein-élueringen ved hjelp av pumpene fra kolonnene etter en 4 minutters svelletid med en 630 ul<3>H-kortisol-løsning i scintillasjonsskåler. Etter en 10 minutters inkuberings-periode med<3>H-kortisol ble det fire kortisolet separert fra kortisol som vår bundet til antistoffet ved eluering med pumpen 2 som førte fosfatpufferløsningen (pH 7,2). Eluatet (1 ml med en elueringsperoide på 3 minutter) ble oppsamlet i scintiallasjonsskåler, fortynnet med 15 ml scintillasjonsvæske og radioaktiviteten målt i en væske-scintillator. Fra antall impulser pr. minutt (cpm) ble

1 konsentrasjonen av fritt 3H-kortisol-hapten beregnet. Deretter ble innholdet av diffunderbart kortisol i serumet avlest fra doseringsaktivitetskurven.

EKSEMPEL 2-5

Antistoff-matrise som inneholt de følgende akrylderivater ble undersøkt: 100% akrylamid, 60% akrylamid og 40% metakryl-syreester og 60% akrylamid og 40% metakrylsyre. Monomer-, konsentrasjonen i hvert, tilfelle var 3,13 mol pr, liter slik at en porestørrelse nær 0,8 til 1,0 nm ble oppnådd. Gelens partikkelstørrelse nådde i gjennomsnitt nær 400 pm.

Ved en pumpehastighet på 0,5 ml pr. minutt var etter 4 minutter 92% av det frie haptenet eluert.

Bestemmelsen av dif f underbart kortisol i jug pr. 100 ml ga

de følgende verdier under de forskjellige betingelser:

Disse verdier er i overensstemmelse med verdier som bestemmes ved konvensjonelle metoder slik som likevektsdialyse.

EKSEMPEL 6

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble også brukt for bestemmelse av testosteron. Den generelt fulgte arbeids-metode var den samme som er beskrevet for bestemmelse av kortisol overfor. Imidlertid ble 160 mg antistoff-gel anvendt, 1 ml inkubasjonsløsning ble sugd inn i kolonnene og proteinløsningen innført med 1580 pl '" 3H-testosteron-løsning på en konsentrasjon av 270 pg pr. 100 pl. Resul-tatet var en formal sensitivitet på 10 pg pr. ml.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte ved bestemmsle av ikke-bundne hormoner og farmasøytika karakterisert ved at en løsning som inneholder ikke-bundne hormoner, hormoner bundet til bindende proteiner og bindende proteiner bringes i kontakt med et immobilisert antistoff, det ikke bundne hormonet omsettes med antistoffet, hormonene som er bundet til bindende proteiner og de bindende hormoner elueres med en løsning som inneholder et markert hormon, det markerte hormonet omsettes med antistoffet, det markerte hormonet som ikke er omsatt med antistoffet elueres og det markerte hormonet bestemmes ved radiologisk iummuno-logisk måling.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender antistoffet innebygget i en polymergel.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat antistoffet anvendes innebygget i en akrylamidpolymer eller akrylamidkopolymer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at kontakten mellom løsningen av antistoffet får polymergelen til å svelle og de bundne og ikke-bundne proteiner til å separeres.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at svellingen finner sted over et tidsrom på minst ca. 1 minutt.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at elueringsløsningen og markert hormon holdes adskilt fra hverandre frem til addisjonen til polymergelen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakter i-l sert vedat det markerte hormonets reaksjon finner sted over et tidsrom på ca. 10 minutter.

8. Fremgangsmåten ifølge krav 2, karakterisert ved at bestemmelsen ved radiologisk immunologisk måling omfatter nøyaktig måling av mengden av anvendt markert hormon hvor målingen av mengde markert hormon måles i eluatet, mengden av markerthormon i polymergelen måles separat og de målte verdier sammenliknes med en kalibreringskurve som samtidig erholdes ved å underkaste kjente konsentrasjoner av hormoner uten protein til sammen trinnene.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at temperaturen holdes mellom ca -5°C og 5°C.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de ikke-bundne hormoner og farmasøy-tika bestemmes velges fra gruppen bestående av tyroidhor-moner, steroidhormoner, glykosider, vitaminer, antikoagu-lanter, analgetika og salysilater.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet immobiliseres i en matrise valgt fra gruppen bestående av agar, cellulose, glasspartikler, polyamider, polyakrylamider og kopolymerer av akrylamid og kopolymeriserbare monomere.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det anvendes en matrise med en pore-størrelse fra ca. 7Å til 10Å.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som markert hormon anvendes et radioaktivt markert hormon.