NO781473L - Polymermatriks basert paa akrylamid. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en polymermatrise basert på akrylamid for å immobilisere antistoffer i radioimmunologiske bestemmelser av hormoner og farmaseutika.

I den radiologiskimmunologiske bestemmelse av hormoner og framaseutika reagerer hormoner eller farmaseutika med et antistoff. Reaksjonens spesifitet avhenger av de immunologiske komplementære forhold, dvs. en kryssreaktivitet kan eksistere med ensubstand som har en lignende kjmisk konfigurasjon. I et østriol-Cg-konjugat er østriolet til stedet i en immunobestemt konfigurasjon hvor nesten alle de viktige funksjonelle gruppene til Østriolen ér eksponert mot antistoffets bindingsområde. Til tross for dette er Østriol-konjungatet med sulfat eller glukuronidresten som opptar posisjon-en ved det fenoliske C^, bundet i en betraktlig grad til antistoffet. Dette er uheldig for bestemmelsen av steroider, spesielt hvis konjugatkonsentrasjonén overskrider steroidekonsentrasjonen med flere størrelses ordner som er tilfelle for østroger i serumet hos gravide kvinner.

Av foran nevnte grunner ble hovedsaklig metoder anvendt hvor spesifiteten ble sikret ved løsningsmiddel ekstraksjonen før den radiologiskimmunologiske måling. Løsningsmiddelekstraksjonen intefrererer imidlertid med kontinuerlig og mekanisert prøve-behandling.

I ekprimenter for å forenkle radiologiskimmunologiske metoder ved hjelp fast faseteknikker ble antistoffet kokovalent bundet til forskjellige matriser som f.eks. agar, cellulose,glasspartikler, polyamider og polyakrylamider, se f.eks. U.S. 3.793.445. Fordel-en med antistoffer som er innbygget i en matrise består i at inter-ferene molekyler med høyere molekylvekt utelukkes, pipetterings-; pg sentrifugeringstrinn unngås og de immobiliserte antistoffer er stabilere ved romtemperatur.

Det ble funnet at bindingsspesifienten til antistoffet ved imm-obilisering på kjent'måte i en matrise ikke i ønskelig grad til-fredstiller kravene.

Det er derfor formålet for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en polymermatrise som er i stand til å øke bindingsspesifiteten til antistoffet som er innebygget i matrisen og således å forhindre optreden av uønskede kryssreaksjoner.

Det er overaskende funnet at en variasjon av økning i bindings-spesifitet av antistoffet kan oppnås anvendelse av polymermatriser som dannes av copolymere av akrylamid. Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er derfor en polymermatrise basert på en copolymer av akrylamin for å imobilisere antistoffer i den radioimmunologiske bestemmelse av hormoner og farmaseutika. De spesifike copolymere er dannet ved polymetisering av akrylamid og en eller flere copolymiserbare forbindelser som akfylsyre,metakrylsyre, metakrylamid, derivater derav og salter av akrylsyre eller metakrylsyre.

Polymermatrisens mikromiljø påvirkes ved copolymerisasjonen av akrylamid med forbindelser som er copolymeriserbare med dette akrylamidet. De hydrobe og hydrofile virkningene og elektrostat-iske virkninger innenfor polymermatrisen er funnet å være avhengi av akrylamid-copolymeret og gi den spesielle ønskede bindingsspes-if itet.

Ved å variere polymermatrisen ved copolymisasjonen er det mulig

å oppnå en betydelig økning i bindingsspesifiteten til antistoffet og undertrykke uønskede kryssaktiviteter. Polymermatrisen varieres ved en hensiktsmessig copolymerisasjon for å sikre en spesifik reaksjon av haptenene med det immobiliserte antistoffet og forhindre reaktivitet av haptener. Pga. den økede spesifiteten tillater polymermatrisene ifølge oppfinnelsen direkte målninger i det ikke-ekstraherte serum.

I !

Ved hjelp av polymermatrisen ifølge oppfinnelsen er meget nøyak- jtige radiologiskimmunologiske bestemmelser av hormoner og I £armaseutika mulig, fordi fluktasjonen av de bestemte verdiene så skyldes ikke spesifike bindinger mellom steroide molekylen og matrisen minimaliseres ved coprolymerisasjonen.

I forskjellige bestemmelser som f.eks. av trioidhormoner, tyroskin og trijodtyronin anvendes kompetitive substanser som anilinaftol-sulfonsyre,mertoilat eller salizylate, for å fortrenge hormonene

fra deres bindinger med de forskjellige bindingsproteinene i serumet. Det er imidlertide kjent at ved høyere konsentrasjoner av disse kompetitive substansene påvirkes båndet mellom hormonet og antistoffet. Ved bruk av polymermatrise ifølge oppfinnelsen er det mulig å øke konsentrasjonene av de kompetitive substansene dvs. med en faktor på 100, uten å svekke hormon/antistoffbind-ingen . Uten sikkert å kunne fastslå årsaken til dette resultat-et antas det at det skyldes elektrostatisksamvirke.

Akrylamidcopolymeren ifølge foreliggende oppfinnelse kan frem-stilles ved følge kjente metoder for polymerisasjon av akrylamid monomer og andre copolymisajsonspolymerer. Fremstillingen av den ønskede copolymermatrise er beskrevet i nærmere detalj i det følgende.

Andelen av akrylamid i de copolymeren kan ligge mellom 1-99 mol-%, fortrinnsvis 5-95 mol-% og helst mellom 20 -80 mol-%. Særlig egnet er copolymer av akrylamid og metakrylsyre og, spesielt sådanne hvor andelen av metakrylsyre ligger mellom 20-60 mol-%. På den annen side gir metakrylsyren en hydrofomatrise og fører på den annen side til en ladningsefekt som muliggjør utstrakt eliminering av ikke-spesifikke bånd hos substansen som skal bestemmes.

Ved bruken av co-polymere ifølge oppfinnelsen som inneholder akrylsyre og/eller metakrylsyre eller salter derav kan en nøytraliser-ingsvirkning eller en buffervirkning nås for sure eller alkaliske løsninger. Dette er en betydelig fordel i mange bestemmelser.

De foretrukne salter av akrylsyre eller metakrylsyre er alkalie-eller jordalkaliesalter. Natrium- og kaliumsalter er spesielt jf oretrukket. Le foretrukne derivater av akrylsyre eller metakrylsyre er estere f.eks. metyl og metylsyre.

Foretrukne derivater av metakrylamid er f. eks. forbindelser

som er substituert på'nitrogenet som en hydroksymetylmetakrelamid.

Et eksempel på andre forbindelser som er i stand til å copolymis-eres med akrylamid er en N-merket dialkylvinsyrediamid.

Immobiliseringen av antistoffet finner sted ved innebygning i polymermatrisen og/eller kovalent fiksering i polymermatrisen på en kjent måte. En detaljert beskrivelse av den radiologiskimmunologiske målingen finnes f.eks. i Clinical Chemistry, vol. 19,No. 2 , 1973,p 145. I Clinical Chemistry, Vol. 21-,No. 7,1975,

p. 82 9 er radiologiskimmulogisk beskrevet hvor de mobiliserte antistoffer brukes.

Polymermatrisen ifølge oppfinnelsen er egnet for bestemmelse av forskjellige hormoner og farmaseutika som er tilstede i serum eller i plasma som delvis er bundet til spesifike eller ikke-spesifikke bindende proteiner. Hormonene kan bestå av tyroid-hormoner, spesielt hyroksyn og trijodtyronin,steroidhormonene som kortisol,terstosterone, progesterone, estron, estradiol, og estriol og hjerte-glykosidene som digitoksin og dioksin. Vitaminer, spesielt vitamin B12 og folinsyre, også framaseutika med sterke proteinbindinger som f.eks. anti-coagulanter, dicumarin, analgetika og salysilater kan vidre bestemmes. I tillegg til rad-iologiskeimmunologiske bestemmelser kommer også alternative bestem-melsers metoder som fluor og immunologiske bestemmmelser eller bestemmelser med en symatrisk markering i betraktning.

Syntesen av antigener, fremstillingen avantisera, f.eks. ved immunisering av antistoffer, er kjent(se f.eks. Clinical Chemestry Vol.19,No.2,1973, p. 146 ff.).

Fremstillingen av polymermatriser ifølge oppfinnelsen med de immobiliserte antistoffer kan f.eks. finne sted ved å tilsette en løsning av antistoffene til monimerblandingen. Utgangsbland-ingen polymeriseres f.eks. ved fri radikal polymerisasjon og den i i erholdte polymer knuses, vaskes og tørkes. Valget og masseforholdene til copolymerene som settes til akrylamidet bestemmes av polymermatrisens ønskede egenskaper med hensyn til spesifiteten. Spesifitehten kan influeres over et brett område ved å endre matrisens ladning og hydrofobe, egenskaper . Tilsetningen av metylakrylamidet øker hydrofobien. Tilsetningen av akrylsyre eller metakrylsyre eller salter derav varier-er matrisens ladning. Det er mulig både og tilsette saltene av

akrylsyre eller metakrylsyre direkte til monomerblandingen eller alternativt polymerisere syrene og etterpå danne saltene i polymermatrisen ved utbytting av ioner.

Monomerkonsentrasjonen varieres for å gi en hensiktsmessig pore-størrelse i polymermatrisen. En monomerkonsentrasjon i området rundt 20 % resulterer i en porestørrelse rundt 7-10 å.

En hensiktmessig copolymer består for eksempel av akrylamid og 20-60 mol-% akrylsyre og/eller metakrylsyre fremstilt fra en rundt 20% monomerløsning hvor i det minste deler av syregruppene overføres i de tilsvarende alkali eller jordalkaliesalter.

Oppfinnelsen skal nå forkalare i nærmere detalj- ved hjelp av eksempler.

Eksempel 1

I dette eksempel demonstreres virkningen av polymermatrisen oå kryssreaktiviteten (K) av estriol -3-glucuonid og esteriol-3-sulfat.

Kryssreaktiviteten K beregnes fra 100 ganger mengden av massen

- ...av det tilsvarende hapten for y=50 med den nødvendige masse

for det kryssreagerende hapten for y=5 0. Verdien er beregnet på basis av ID,-q.

Det valgt antiestriol antistoff har høy kryssreaktivitet for 3-glucuronid konjugatet og 3-sulfatkonjugatet.

For hver polymerisasjonsblanding ble konsentrasjonen justert slik at den totale monomerkonsentrasjonen kom opp til 2,9 mol-%. For en blanding f.eks. ble 5 gr akrylamid og 1,25 gr N,N'.metylbisakry1-amid oppløst i et begerglass i 24 ml av fosfat-buffer med ph 7,2. Etter tilsetningen av antistoffet i 1 ml fosfat-buffer ble reak-sjonen igangsatt med o,15 gr riboflavin og 0,10 ml N,N,N',N'-tet-rametylendiamin og bestrålet med UV-lys. Den gule blokken ble så knust og vasket med destilert vann og tørket.

22 mg tørt antiestriol antistoffgen ble veiet i små kolonner og

rørt med 0,15o ml av en inkubasjonsløsning. Denne inkubasjons-løsningen inneholdt<3>K-estriol og umarkert hapten (estriol,estriol-3-glucuronid eller eskstriol-3-sulfat). Reaksjonstempera-turen ble holdt konstant under 0°C. Etter en inkuberingsperiode på 30 min. ble det free haptenet separert fra det haptenet som var bundet til antistoffet ved eluering med fos fat-buffer som inneholdt albumin. Eluate ble oppsamlet i et scintillasjons-glass og fortynnet med 15 ml av en scintillasjons-væske og radioaktiv-iteten målt i en væske scentillator. Konsentrasjonen av det free indikator hapten<3>H-estriol ble beregnet fra impulsene.

Resultatene av bestemmelsene i det vandigesystemet og ved bruk av polymermatrisene av akrylamid og akrylamid copolymerene er sammenfattet i den følgende tabell. De angitte verdier er verdier for kryssreaktiviteten ifølge de foregående definisjoner. J Resultatene viser at ved anvendelse av copolymerene ifølge opp-i finnelsen oppnås en betydelig økning av bindingsspesifiteten sammenlignet med vandige systemer av akrylamid homopolymerer som ligger utenfor foreliggende oppfinnelse. Ved hensiktsmessig valg av copolymeren,kan en økning gi spesifitet med en faktor på 15 oppnås sammenlignet med vandigesytemer og med en faktor på 7 med hensyn til at akrylamid-homopolymeret. Dette er vist ved en sammenligning av verdiene for det vandigesystemet og akrylamid-homopolymerene med en 40/60 copolymer av metakrylsyre og akrylamid.

Eksempel 2

Dette eksempelet viser bruken av polymermatrisen ifølge oppfinnelsen i en total bestemmelse av tyroksin ved en symatrisk hydrolyse med pepsin.

Polymermatrisen til antistoffgenen bestod av en copolymer akrylamid og 40 mol-% av natriumsaltet som for metakrylsyren var fremstilt fra en 20% monomerløsning. 10 jxl serum med tyroksininnhold på 18 y- g pr 100 ml ble fortynnet med 16 0 /x. 1 av en ensymløsning hvor den ensymløsningen bestod av 2 mg/ml pepsin oppløst i o,l n saltsyre.

Enzymreaksjonen ble utført ved romtemperatur i 30 min.

Til disse 170 p. 1 sattes deretter 150 p.1 trace løsning med et innhold på 5,2 ng/ml radioaktivt markert tyroksin.

Hele løsningen ble.så plassert på 60 mg antistoffgen. Inkuber-ingsperioden var 30 min. temp. 22°C.

Bestemmelen resulterte i en ekstraordinær høy gjenvinningsgrad på 98%.

. Eksempel 3

Dette eksempelet demonstrerer polymermatrisen ifølge oppfinnelsen i total bestemmelsen av kortisol.

Polymermatrisen av antistoffgenen bestod av en copolymer av akrylamid og 40% av en blanding av natrium og kaliumsalter av metakrylsyre fremstilt av en 20% monomer-løsning.

10.^.1 serum eller plasma med kortisol-innhold på 15 ^ g pr 100 ml

ble fremstilt. Dertil sattes 500 al av en tracer-løsning bestående av<1>25J-kortisol i en vandig sentralt-buffer med pH 3,5.

Hele løsningen ble så anbrakt på 100 mg antistoffgel. Inkuber-ings-perioden var 2 0 min. temperaturen 2 5°C.

Bestemmelsen viste en ekstraordinært høy gjenvinningsgrad på 99%.

Eksempel 4

Dette eksempelet viser bruken av polymermatrisen ifølge oppfinnelsen i bestemmelsen av tyroksin ved anvendelsen av kompetitive substanser.

Polymermatrisen av antistoffgel bestod av en copolymer av akrylamid og 40 mol-% av et blandet kalsiumnatriumsalt av metakrylsyre fremstilt fra en 20% monomerløsning.

125

En tracerløsning (500 ^.1) bestående av J-tyroksin i en fosfat buffer med pH 9,6 ble plasert på 80 mg av antistoffgelen.

Vidre ble 500 av den samme tracerløsningen som inneholdt 6 mg /ml anilinonaftolsulfonsyre plasert på 80 mg antistoffgelen.

Begge prøvene ble inkubert ved en temperatur på 2 8°C i 2 0 min.

, Bestemmelsene viste ingen påvirkning av tyroksinets binding med

antistoffet til tross for den høye konsentrasjonen av tilstede-j værende kompetitive substans, nemlig anilinosaftolsulfonsyre. !

Claims (4)

1. Polymermatrise på basis av akrylamid for immobiliser-ing av antistoffer ved radiologiskimmunologisk bestemmelse av hormoner og farmaseutika,karakterisert vedat polymermatrisen består av en copolymerisat av akrylamid.

2. Polymermatrise ifølge krav 1, karakteris-é r t ved at den består av et copolymerisat av akrylamid og en eller flere av forbindelsene akrylsyre, metakrylsyre, metakrylamid, deres derivater og salter av akrylsyre eller metakrylsyre.

3. Polymermatrise ifølge krav 1 eller 2karakterisert vedat den består av en copolymerisat av akrylamid og 20 - 60 mol-% metakrylsyre.

4. Polymermatrise ifølge et av kraven 1- 3,karakterisert vedat den består av et copolymerisat av akrylsyre og et alkali eller jordalkaliesalt av akrylsyre eller metakrylsyre.