DE2155658B2

DE2155658B2 - Verfahren zum nachweis und zur bestimmung von einem hapten oder dessen antikoerper

Info

Publication number: DE2155658B2
Application number: DE19712155658
Authority: DE
Inventors: Antonius Hermanus Wilhelmus Maria Dr.; Weemen Bauke Klaas van; Oss Schuurs (Niederlande)
Original assignee: N. V. Organon, Oss (Niederlande)
Priority date: 1970-11-10
Filing date: 1971-11-09
Publication date: 1976-08-05
Also published as: NL7016396A; US3850752A; SE451162B; FI54033C; AU468060B2; IT986829B; FI54033B; ES396741A1; DE2155658A1; ZA717192B; DK140268B; CA967464A; BE775187A; DE2155658C3; AU3508271A; FR2113733A5; NL154598B; BR7107459D0; DK140268C; CH617774A5

Description

25

Zum Nachweis und zur Bestimmung niedermolekularer Substanzen, die in geringen Konzentrationen vorliegen, wie Steroidhormonen in Körperflüssigkeiten, wurden Verfahren entwickelt, bei denen Proteine verwendet werden, die fähig sind, die nachzuweisende 3» Substanz spezifisch zu binden. Diese Verfahren beruhen auf der Konkurrenz zwischen der nachzuweisenden Substanz in der Probe und einer bekannten Menge der gleichen Substanz, die radioaktiv markiert ist, mit einer begrenzten Menge des spezifischen bindenden Proteins. Durch die unbekannte Menge der bindungsfähigen Substanz wird bestimmt, welcher Anteil der radioaktiv markierten Substanz an das spezifische bindende Protein gebunden wird.

Es ist auch möglich, mit Hilfe dieser Verfahren, eine unbekannte Menge eines spezifischen bindenden Proteins durch Umsetzung einer Probe, die eine unbekannte Menge des spezifischen bindenden Proteins enthält, mit einer bestimmten Menge einer bindungsfähigen radioaktiv markierten Substanz zu bestim- +5 men.

In der Literatur ist es üblich, diese Bestimmungsverfahren, je nach Art des verwendeten spezifischen bindenden Proteins ⁷u unterscheiden, obwohl das grundlegende Prinzip all dieser Bestimmungen das gleiche ist. So wird z. B. von »konkurrierenden Protein-Bindungsversuchen« gesprochen, wenn Rezeptor- oder Transportproteine verwendet werden, die im Körper vorkommen und von »radioimmunologischen Bestimmungen«, wenn Antisubstanzen verwendet werden.

Für beide Arten von Bestimmungen sind radioaktiv markierte Substanzen erforderlich. Das Arbcilen mit diesen Substanzen erfordert das Vorhandensein präziser Meßvorrichlungcn, gut ausgerüstete Laboratoneu und ein qualifiziertes Personal. Diese hohen Anforderungen machen eine allgemeine Anwendung dieser Bcslimmungsverfahren besonders in kleineren Laboratorien unmöglich.

Aus der USA.-Patentschrift 35 05 019 ist ein \ erfahren /ur Bestimmung von Vitamin 13 12 in einer wäßrigen Probe bekannt, bei dem ein wasserunlösliches Polymer, an das Intrinsicfaktor gebunden ist.

mit der zu untersuchenden Probe und radioaktiv markiertem B 12 zusammengebracht wird. In BuU. Soc. Chem. Biol., 50, 1968, Nr. 5/6, S. 1169 bis 1178 ist angegeben, daß es möglich ist, ein Antigen mit einem Enzym zu markieren und dann mit dem entsprechenden Antikörper auszufällen. In Science, VoI. 168, 1970, S. 1347 und 1348 ist ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Morphin bekannt, bei dem Morphin mit einem Protein gekuppelt und das Konjugat mit einem radioaktiv markierten Antikörper ausgefällt und die Radioaktivität des Niederschlages gemessen wird.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper zu entwickeln, das einfach und bequem durchgeführt werden kann, kein Arbeiten mit radioaktiven Substanzen erfordert und in kurzer Zeit zu zuverlässigen reproduzierbaren Ergebnissen führt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper unter Ausnutzung der für derartige Substanzen bekannten Bindungsaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bestimmung mit einer bestimmten Menge eines Kopolungsprortuktes aus derr Hapten und einem Enzym und einem in unlösliche Form gebrachten Bestandteil der Reaktion Hapten-Antikörper durchgeführt wird und die Enzymaktivität in der flüssigen oder festen Phase bestimmt wird.

Haptene sind nach der Definition von K. Landsteiner proteinfreie Substanzen mit einem Molekulargewicht bis zu ungefähr 1500, die mit spezifischen Antikörpern reagieren, jedoch nicht selbst zur Bildung von Antikörpern führen können. Um jedoch trotzdem Antikörper zu Haptenen bilden zu können, müssen die Haptene, bevor sie dem Testtier injiziert werden, an Polypeptide gekuppelt werden. Daraus resultieren besondere Schwierigkeiten beim Arbeiten mit Haptenen. üa es bekannt ist, daß durch die Kupplung einer immunogenen Komponente, z. B. eines Antikörpers an ein unlösliches Polymer die Reaktionsfähigkeit einer solchen Komponente gegenüber dem entsprechenden Antigen vermindert wird, war zu befürchten, daß ein Antikörper der gegen das Kupplungsprodukt eines Haptens mit einem Protein (z. B. Albumin) gebildet worden ist und der anschließend durch Binden an ein unlösliches Polymer unlöslich gemacht worden ist, mit dem reinen Hapten nicht mehr reagieren würde.

Umso mehr mußte der Fachmann davon ausgehen, daß ein solcher unlöslich gemachter Antikörper mit einem Hapten, das auch noch an ein Enzym gekuppelt ist, nicht mehr reagieren würde. Da ein Hapten eine niedermolekulare Substanz und ein Enzym ein voluminöser Proteinkomplex ist, mußte angenommen werden, daß sowohl eine zu starke sterische Hinderung als auch besondere Schwierigkeiten beim Nachweis des Haptens eintreten würden. Das ist überraschenderweise nicht der Fall, sondern es hat sich gezeigt, daß durch Vet Wendung eines derartigen Hapten-Enzym-Komplexes cm sehr empfindliches genau reproduzierbares und einfaches Teslvcrfahrcn zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper möglich wird.

Bei der Bestimmung eines Haptens konkurriert dieses Hapien und sein Kopplungsprodukt mit einem Hnzvm um eine bestimmte Menge des unlöslichen spezifischen Antikörpers. .Ic mehr Hapten die Probe enthalt, um so geringe)· ist die Chance, für das

iflUDlun-sprodukt aus dem löslichen Enzym und dem Bestimmung von Antikörpern gegen Penicillin oder

u nten sich mit dem unlöslichen spezifischen Anti- zur Bestimmung des Intnnsik-Faktors.

™ /u verbinden und um so meh? des Koppl^gs Im Folgenden wird die Erfindung durch allgemeine

Produktes bleibt in der flüssigen Phase zuiück, in der und spezielle Beispiele naher erläutert,

^aktivität auf einfache Weise gemessen wer- ₅ ^^^^^

ιοί Bestimmung eines spezifischen Antikörpers durchgeführt werden, ^ge Haptene^n_nen schon

■t Λ_Ρη Bleichen Reagentien treten der zu bestimmende Gruppen besitzen, die mit reaktionatanigen^γ vv

Siehe An körper und der unlösliche Antikörper in an der Oberfläche des Enzyms vernetzt werden können

Skurrtz um eine bestimmte Menge des Kopp.ungs- „ während andere «^^gPg^^S

rnrfuktes aus dem Hapten und dem Enzym. Wenn sehe Reaktion erhalten ^mu.^

GeSt an Antikörper in der Probe höher ist, wird hch, daß die -prünghcher,

oder mehr¹⁵

den d. h. mit dem Enzym-Kopplungsprodukt und sitzt, kann ^dl- !^ΡΡ¹""«= ^, _{ind durch}eeführt

dm Hapten in unlöslicher Form. Die flüssige Phase » sie ^^^ ^ ^ Substanzen,

VT

fst, um so mehr Enzymaktivität bes.tzt d,e fluss.ge ^^'^J^i^^S^.erden angewandt zur Her-

"SJ Hilfe einer Bestimmungskurve für ein bestimm- ,teUung von .^ ^mSsSü""E^

tes System, bei dem der zunehmende Gehalt an dem 3o sie ko."^^^"s mit einem En,>m ange-

_zu bestimmenden Hapten oder Ant.korper gegen die '«"BJP'^" ^d _d V_ür ^P _das „findungsgemaBe Ver-

Befundene Enzymaklivitat, vorzugsweise in der flus.- vv_t ndl ^s\^e™^e"·

_g Phase, aufgetragen ,st, kann die Menge des m fahren wie ^ _{das eine Kompo}„ente für

der Probe enthaltenen Haptcns oder Antikörpers fur Die ^h- d« tn > ^^ _Fn7ym ^^

Sen gefundenen Wert für die Enzymakuv.tat abge- 35 ^oppjuntsprodu^ ^ P^ _{spezjfischen Akt;}.

-Äigste Reagens für dieses Best.mmung, ^^-^^e^vS^nd Sffi^

verfahren ist das Kopplungsprodukt aus dem Hapten Empf.ndhckhe, _{Dje Bcstimmung ei}„_es

und einem Enzym, im folgenden auch Enzym-Kopp- der^Best.tnnlunt > _d,_{u kata}|_yslCrt. bc. der

lun,gsprodukt genannt, das einerse.ts mit dem spez.fi- 4o Enzyms, das emc ^ _{vcrschwinde t}

sehen Antikörper über das Hapten reagieren kann und gefa bte ^joc _colorimetrische Bestimmungen konandererseits Enzymaktiv.tät bes.tzt Dieses Reagens einfach üe^ _aulomatisiert werden,

wird nach einem für ähnliche Produkte beschriebenen nen auj e^ t ^ ^ _mög,_{ichi E} _{mc zu}

Verfahren hergestellt. Das zweite Reagens, die unlo - E^unfe^ _Umw._andIungen katalysieren, be, denen

Phase neben einer flüssigen Phase. ^ma"?1 _die Herstellune der Kopplungsprodukte sind Die Enzymaktivität einer Frakt.on des Reakuons- 5» Pu^d.^ Her« _Peroxidase, ^Glukuronidase, gemisches kann bestimmt werden, indem diese Frak- enzyme wie ^_D._Galactosidase, Urease GIu-Sn mit einem Substrat und anderen Substanzen zur J-D-C hgosulase ^ _{xidase gee}ignet, bevor-Durchführung einer Enzymreakuon inkub.er v.rd^ kos ο dase ^ _{Oxidoreddktasen} Besonders geeignet ist dabei eine R^akt.on bt der zug ^ _h spezifische Antikörper oder das uneine gefärbte Verbindung geb.ldet oder entfernt wird e uij_U; _ _. ^ _{erfindungsgern}aßen Bederen Absorption auch leicht quantitativ gemessen Jf^^^w^det werden, können auf bekannte werden kann. Vorzugsweise wird als Enzym eineOx.do- stimrnunt erwc^ ^ _{Vernet7ung mit} chlor-amcsenreduktase verwendet. Surc-atnvlcster. durch kovalcntc Bindung nut unlos-Haptenc, die nach dem neuen Vcrfah.cn na.h^ ame ·> , Acarosc. Vemct/ung mi Dcx.an

wicscS werden können sind / H. S.croidc. \ ι an ,n ' _: οφ p,c, oder durch physikalische Kopplung

B₁.,. Folinsiiure. Th>roxin und Tnjodo hvu . η .- _; du ^₁ ^.^ _{KunslslüflCi} hergestellt

le-isinc laclors Histamin. Serotonin und andei, hui- ^n um

gene Amine. Digoxin. Digit^in, l'ros,agland,ne \drc- ^uWn. ^^ _{R micn vcrwC}ndei -culcn

für Hantcne kann angeuaiuii sNcrden. /. h. /m

streifen, der mit dem Kopplungsprodukt imprägniert ist, verwendet werden.

Die unlösliche Komponente kann in Form von Teilchen verschiedener Form, wie Körner, Kugeln und Stäbchen oder in Form eines Streifens des einen oder anderen Trägermaterials gebracht werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Testpackung verwendet werden, die hauptsächlich besteht aus:

a) einer bestimmten Menge des Kopplungsproduktes aus einem Hapten und einem Enzym;

b) einer entsprechenden Menge einer der Komponenten des Reaktionssystems in unlöslicher Form;

c) einem Substrat zur Bestimmung der Aktivität des verwendeten Enzyms.

Wenn erforderlich, kann die Testpackung auch die notwendigen Hilfsmittel zur Herstellung einer Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Probe für eine quantitative Bestimmung, wie Reagenzgläser, Pipetlen und Kolben mit Verdünnungsmittel, enthalten.

Die Erfindung wird durch die folgenden speziellen Beispiele noch näher erläutert:

Beispiel 1

Bestimmung von Testosteron
A) Herstellung von Testosteron-3-HRP

100 mg Testcsteron-3-(O-carboxymethyl)-oxim und 0,143 ml Tri-n-butylamin wurden in 5ml Dioxan gelöst. Die Lösung wuide auf 2 C abgekühlt und dann wurden 0,03 ml lsobutylchlorcarbonat zugegeben. Nach 30 min wurde die Lösung zu 100 mg HRP (Meerrettichperoxidase) in einem Gemisch von 9 ml Wasser und 6 ml Dioxan zugegeben und mit 0.1 η NaOH auf einem pH-Wert von 9 eingestellt. Diese Lösung wurde 4 h bei 2 C gerührt und über Nacht dialysiert. Der Niederschlag, der nach Einstellung des Dialysats auf einen pH-Wert von 4.6 erhalten worden war, wurde nachdem er über Nacht stehengelassen worden war, zentrifugiert, in 10 ml Wasser su>pendicrt und mit Hilfe von Natronlauge gelöst. Das Material wurde dreimal mit 15 ml Aceton bei einem pH-Wert von 4,5 ausgefällt, in 15 ml Wasser, das mit Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7.8 einge- +5 stellt war, gelöst, dialysiert und schließlich lyophilisiert.

B) Herstellung von Testosteron-3-BSA

Dieses Kopplungsprodukt wurde auf die gleiche Weise wie das Testosteron-3-HRP hergestellt, wobei jedoch als Ausgangsmaterial 50 mg Testosteron-3-(O-carboxymethyl)-oxim und 150 mg BSA (Rinderserumalbumin) verwendet wurden.

C) Herstellung von Antikörpern gegen Testosteron-3-BSA

5 Kaninchen wurden intramuskulär zunehmende Dosen von Testosteron-3-BSA in vollständigem Freund'schen Adjuvans (0,5, 1 und 2 mg) in Intervallen von 3 Wochen injiziert. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden den Tieren intravenös 2 mg Antigen in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Eine Woche danach wurde den Tieren Blut abgenommen. Die gegen BSA gebildeten Antikörper wurden entfernt, indem das Serum anteilweise mit BSA-m-aminobenzyloxymethylcellulose. die nach dem Verfahren von Gurvich (siehe D) hergestellt worden war, behandelt wurde.

D) Herstellung von Aniitestosteroneellulose

Diese Substanz wurde entsprechend dem von Gurvich in Biokhimiya 26,934 (1961) beschriebenen Vcrfahren hergestellt.

1. Herstellung von »Aminoccllulose«:

50 g Whatman Cellulose, die mehrfach gewaschen und dekantiert worden war, wurden in 100 ml

ίο einer 0,7"„igen Natriumacetatlösung suspendiert, die 2 g N(m-Nitrobcnzoxy)-inethylpyridin enthielt. Das Gemisch wurde bei 60 bis 80 C getrocknet und 40 min auf 125 C erhitzt. Das entstehende Produkt wurde gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, bei 80 C getrocknet, mit Benzol gewaschen und erneut getrocknet. 50 g des getrockneten Produktes wurden durch Suspension in 300 ml einer 15",',igen Na₂S.,O₄-Lösung reduziert und 31) min bei 50 bis 60 C gerührt. Das

ao Produkt wurde filtriert und nacheinander mit

destilliertem Wasser, 30%iger Essigsäure und wieder mit destilliertem Wasser gewaschen.

2. Behandlung: mit ammoniakalischer Kupferlösung:

40 ml 10",,!.scr Schwefelsäure, 20 ml 50"„iger Salpetersäure und 140 ml destilliertes Wasser wurden unter Rühren auf 90 C erhitzt. Anschließend wurden 5.9 g CuO in kleinen Anteilen zugegeben. D e Lösung wurde 2 h zum Sieden erhitzt und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt. 80 ml dieser Lösung wurden in ein Eisbad gegeben urd unter Rühren zu 160 ml kalter 4 η NaOH zugegeben. Nach 30minütigem Rühren wurde der Niederschlag zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 80 ml 25"„igem Ammoniak gelös:. Zu dieser Lösung wurde nach und nach 1 g »Aminocellulose« zugegeben. Das Gemisch wurd: IV₂ h gerührt und anschließend wurden 4C ml siedendes Wasser zugegeben und die Lösung: schnell auf 0 C abgekühlt. Die Lösung wurde mit 10'!„igcr Schwefelsäure neutralisiert, worauf die Aminoccllulose ausflockte. Sie wurde mit kaltem destillierten Wasser gewaschen.

3. Herstellung von v-Globulin:

Zu Kaninchen Antitcstosteronserum wurden 180 mg Na₂SO₁ pro ml Serum zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und der entstehende Niederschlag zentrifugiert, zweimal mit einer 18%igen Na₂SO₄-Lösung gewaschen und in so viel 0,05 m Natriumborat mil einem pH-Wert von 8,6 aufgenommen, daß di« Proteinkonzentration ungefähr 10 mg/ml betrug

4. Bindung des y-Globulins an Aminocellulose:

350 mg »Aminocellulose« wurden in 50 ml destil liertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurd auf 0 C abgekühlt. 10 ml 36°_oige Salzsäure wur den zugegeben und anschließend 10 ml 10°_oig NaNO₂-Lösung zugetropft. Die Suspension wurd zentrifugiert, mit kaltem destillierten Wasser un anschließend mit 0,05 m Natriumborat mit einer pH-Wert von 8,6 gewaschen. Die Cellulose wurd in 43 ml 0,05 m Natriumborat mit einem pH-Wei von 8,6 suspendiert. Zu dieser Suspension wurde 7 ml der wie oben hergestellten y-Globulinlösun zugegeben. Das Gemisch wurde 26 h bei 4 C gi rührt, zentrifugiert und mit 0,02 m Phosphatpufff

35

40

mit einem pH-Wert von 6.0 gewaschen. Von dem Antisemit! jedes der 5 immunisierten Kaninchen wurde eine Celluloscsuspcnsion hergestellt (A bis E).

) Bestimmung von Testosteron mit Hilfe von Testosteron-3-HRP und Antitestoslcroneellulose

Das folgende System wurde aufgebaut:
) Immunreaktion

0.5 ml einer Probe, enthaltend Testosteron, 0,2 ml Testosleron-3-HRP (100 mg/ml) und 0.3 ml einer Antilestosteroncellulosc-Suspension wurden 2 h bei Raumtemperatur rotiert und dann 5 min mit 1000 g zentrifugiert.

Die Immunreaktion fand in 0,02 m Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,0, enthaltend 2"„ Schafserum, statt.

11) Enzymrcaktion

0.5 ml der überstehenden Flüssigkeit wurden bei Raumtemperatur mit 1,5 ml Substrat 30 min inkubiert. Die Extinktion wurde bei 460 nm gemessen.

Das Enzymsubstrat enthielt 10 ul, 30"Jgcs Wasserstoffperoxid und 20 mg 5-A.minosalicylsäure in 150 ml 0,02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6.2.

Die Fig. 1 zeigt Meßwerte, bei denen Testosleron-3-HRP an die Antitestostcroncellulose-Zubcreitungcn gebunden worden ist. In diesem Falle wurde nur Puffer als Probe in dem Tesisystem zugegeben. Wenn Cellulose an Stelle von Antitestoslcroneellulose z.ugegeben wird, bleiben mehr als 95",, der Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit enthalten. Die Zubereitungen B, D und E zeigten, daß fast kein Tcstosteron-3-HRP gebunden worden war. jedoch bei den Zubereitungen A und C.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Inkubation einer Testosteron Verdünnungsreihe mit Testosteron-3-HRP bei vier verschiedenen Konzentrationen von Antistestostcronccllulose C.

mg/ml (1), 2 mg/ml (II), 4 mg/ml (111) und 16 mg ml (IV). Es ist offensichtlich, daß mit diesem System eine Menge von ungefähr 10 ng Testosteron gezeigt werden kann.

Beispiel 2
Bestimmung von Östradiol

östradiol-17-succinyl-HR.P wurde hergestellt durch die in Beispiel 1 A) beschriebene gemischte Anhydrid-Methode, wobei 50 mg Östradiol-17-hemisuccinat und 50 mg HRP als Ausgangsmaterialien verwendet wurden.

D) Antiöstradioleellulosc wurde auf die in Beispiel I D) für Antitestosteroncellulose beschriebene Weise hergestellt. Von jedem der immunisierten Kaninchen wurde eine Cellulosezubereitung hergestellt, die mit 16 bis einschließlich 20 numeriert wurden.

E) Die Untersuchung wurde analog derjenigen für Testosteron in Beispiel 1 E) durchgeführt.

Die Fig. 3 und 4 zeigen einige Ergebnisse. Die Fig. 3 zeigt, daß drei \erwendbare Antisera durch die Immunisierung erhalten wurden, on denen 17 den höchsten Titel besitzt. Die Fig. 4 zeigt das Testsyslem, bei dem Antiöstradiolccllulose 17 in einer Konzentration von 8 mg/ml verwendet wurde. Das System unterscheidet nicht zwischen Östron und 17 p'-Östradiol, 17 «-Östradiol, besonders Östriol, zeigen eine geringere Kreuzreaktion. Testosteron und Progesteron beeinflussen das System nur in sehr hohen Konzentrationen.

Beispiel 3

Bestimmung von Antikörpern gegen Penicillin Pcnicilloyl-Katalase

30 mg Bcnzylpenicillinsäurc wurden in 5 ml 96 " J gern Äthanol gelöst und zu 200 mg Katalase in 45 ml 0.1 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 zugetropft. Die Reaktion wurde 2 h fortgesetzt, wobei der pH-Wert mit 0.5 η NaOH zwischen 7.2 und S.2 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde gegen 6-31 0.02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 dialysiert.

Auf die gleiche Weise wurden 250 mg Benzylpenicillinsäurc an 5 g m-Aminobenzyloxymcth\lccllulose. die nach dem Verfahren von Gurvich (Biokhimiya 26, 934 [1961]) hergestellt worden war. gekoppelt. Das Kopplungsprodukt wurde jedoch nicht dialysiert. sondern auf einem Glasfilter gewaschen.

Eine Überempfindlichkeit von Menschen gegenüber Penicillin konnte auf folgende Weise gezeigt werden:

0.2 ml einer Probe von niclu-hämolysieriem Serum wurden mit 0,5 ml einer Lösung von Penieilloyl-Katalasc (!800) vermischt. Nach 30 min wurden 10 mg Pcnicilloyl-m-aminohcnzyloxymeihylcellulose zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min rotiert und anschließend die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, indem 0.02 ml dieser Flüssigkeit zu 2,S ml 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 zugegeben wurden, der 1.2 μΐ 30",,JgCS H₂O₂ enthielt und anschließend die Abnahme der Extinktion bei 240 nm gemessen wurde. Im Serum von Patienten, die gegenüber Penicillin überempfindlich waren, wurde eine geringere Enzymaktivität in der Flüssigkeit gefunden als bei Kaninchenserum. Die Werte für Menschen, die nicht überempfindlich waren, wichen nichi wesentlich von denjenigen mit Kaninchenserum ab.

35

40

45

Östradiol-H-succinyl-BSA wurde nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen gemischten Anhydrid-Methode hergestellt, wobei 100 mg Östradiol-17-hcmisuccinat und 150 mg BSA als Ausgangsmaterialien verwendet wurden.

C) 7\n Herstellung der Antikörper jictcn Östradiol-17-succinyl-B^A wurden 5 Kaninchen nach dem in Beispiel 1 C) beschriebenen Schema immunisiert Die Sera wurden mit BSA-m-Aminobcnzylo\\ mei In !cellulose absorbiert.

Beispiel 4

Bestimmung von Folinsäure A) Herstellung von Folatglukoseoxidase

200 mg Glukoseoxidase (140 lL'/mg) wurden 11 10 mg PBS (mit Phosphat gepufferte Salzlösung eine phosphathaltige physiologische Kochsah lösung) mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst. 30 m 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimi (MCDl) wurden zugegeben und anschließen 24 mg Folinsäure. Die Reaktion dauerte 2 h un anschließend wurde eine soigfältige Dialyse gege PBS mit einem pH-Wert von 7,0 durchgefühlt.

609 532/4C

B) Herstellung von Folat-MBSA (methyliertes Rinderserumalbumin) Folat-MBSA wurde hergestellt nach dem von Ricker und Slollar beschriebenen Verfahren (Biochemistry 6, 2001 [1967]). 25 mg MCDI wurden zu 50 mg BSA in 50 ml Wasser zugegeben und anschließend 20 mg l-olinsäure. 2 h später hatte sich ein gelber Niederschlag gebildet. Schließlich wurde das ganze Reaktionsgemisch eine beträchtliche Zeil gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.

C) Herstellung von Antiserum gegen Folat-MBSA

Am Tage 0. 21 und 42 wurden jeweils 4 Kaninchen intramuskulär 2 mg Folat-MBSA in vollständigem Frcund'schen Adjuvans und am Tage 35 intravenös 2 mg Folat-MBSA in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Am Tage 49 wurde den Tieren Blut abgenommen.

D) Antifolatcellulose wurde entsprechend dem in Beispiel I D) beschriebenen Verfahren hergestellt.

E) Bestimmung von Folinsäure

100 μΙ der zu untersuchenden Probe und 700 μΐ einer Antifolatccllulose-Suspcnsion wurden 3 h rotiert. 200 μΙ Folatglukoseoxidase (1:1500) wurden zugegeben. Das (Jemisch wurde nochmals 3 h rotiert und zentrifugiert und anschließend die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt. Diese Bestimmung wurde durchgeführt durch Vermischen von 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit mit einer Lösung von 50 mg Glukose, 10 μg HRP und I mg 5-Aminosalicylsäure in 2,5 ml 0.05 η Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und Messung der Extinktion nach 30 min bei 460 um.

Fig. 5 zeigt den Prozentsatz des gebundenen Enzyms gegen die Konzentration der Antifolatcellulose.

Fig. 6 zeigt die Empfindlichkeit des Testsystems in einer Ariiifoiatceliuiose-Koiuentraiion von 2 mg/ml und die Wirkung von Glycin, Asparagin, Alanin und Glutaminsäure.

Beispiel 5
Bcstimmuna von Diaoxin

Herstellung von Digoxin-HRP

Zu 22 mg Digoxin, in 1 ml abs. Äthanol suspendiert, wurde unter Rühren 1 ml 0,1 m Natriummetap-vjodat zugetropft. Nach 25 min wurden 0,3 ml 0,1 m Äthylenglykol zugegeben. 5 min später wurde dieses Gemisch unter Rühren zu einer Lösung von 32 mg Meerrettichperoxidase (HRP) in 1 ml destilliertem Wasser zugetropft, das mit 5"„iger K₂CO₃-Lösung auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt war. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zugabe 5^o;,iger K₂CO₃-LoSUnC auf 9 bis 9,5 gehalten. Als der pH-Wert stabil war, wurden 15 mg NaBH₄ in 1 ml destilliertem Wasser zugegeben. Nach 3 h wurde der pH-Wert mit 1 m Ameisensäure auf 6,5 eingestellt. 1 h später wurde 1 m NH₄OH zugegeben, bis ein pH-Wert von 8,5 erreicht war. Das Gemisch vvurde über Nacht gegen kaltes fließendes Wasser dialysiert. Schließlich wurde der pH-Wert mit 0,1 η Salzsäure auf 4.5 eingestellt. Das Gemisch wurde I h bei Raumtemperatur und 4 h bei 4 C stehengelassen, um einen Niederschlag zu erhalten, der I h bei 1000 g zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde in 5 ml 0,1 m NaHCO-, gelöst, gründlich dialysiert und gefriergetrocknet.

B) Herstellung von Digoxin-BSA

Diüxin-Rindcrserumalhumin (BSA) wurde auf die gleiche Weise, wie sie oben für Digoxin-HRP angegeben ist, hergestellt, wobei jedoch von 436 mg Digoxin und 560 mg BSA ausgegangen wurde und die Mengen der anderen Reagenzen in gieichem Verhältnis erhöht wurden wie das Dioxin.

C) Herstellung von Antikörpern gegen Dioxin

5 Kaninchen wurden 400, 800 bzw. 1600 ug Dioxin-BSA im Absland von 14 Tagen injiziert. Das Immunogen wurde mit vollständigem Freund"-schen Adjuvans vermischt und intramuskulär verabreicht. 14 Tage nach der letzten Injektion wurde den Tieren intravenös SOO μg Digoxin-BSA in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. 10 Tage später wurde den Tieren das Blut entnommen. Das Serum wurde mit BSA-m-Aminbenzyloxymethvlcellulosc adsorbiert.

D) Herstellung von Antidigoxincellulose

Antidigoxincellulose wurde nach dem Gurvich-Verfahrcn, wie unter 1 D) beschrieben, hergestellt.

E) Bestimmung von Digoxin

Eine Verdünnungsreihe wurde mit Digoxin in 0,1 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7.5 hergestellt, enthaltend 0,9"„ NaCl. 0.5 "_o Twcen-20 und 1,0°,, BSA. Die Verdünnungsreihe ging von 0.1 bis 100 ng,ml. 1 ml einer Üigoxin-Lösung wurde mit 0,1 ml Digoxin-HRP in einer geeigneten Verdünnung vermischt und anschließend wurden 2 mg Antidigoxincellulose, die in 0.4 ml Puffer suspendiert war, zugegeben. Das Gemisch wurde 6 h hei Raumtemperatur rotiert und anschließend zentrifugiert und die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt.

Zugabe von 0.8 ng Digoxin führte zu einer meßbaren Zunahme der Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit. Digoxin allein zeigte eine geringe Kreuzreaktion in dem System während Cholesterin, Cortisol. Östradiol. Testosteron und Progesteron keine Kreuzreaktion in deir System zeigten.

Beispiel 6
Bestimmung von Cortisol

A) Herstellung von Cortisol-21-galactose-oxidase

50 mg Cortisol-21-hemisuccinat und 100 mi Galactoseoxidase wurden nach dem in Beispiel A) beschriebenen gemischten Anhydridverfahrei hergestellt.

B) Herstellung von unlöslichem Transcoi tin

100 mg Transcortin, das durch Chromatogra phie mit DEAE, Cellulose b/w. Hydroxylapat gercinigi worden war. wurden folgendermaße mit Hilfe des CNBr-Verfahrens an 3 g Sepharos 4 B gekoppelt: 3 g Scpharosc 4 B-Suspensio wurden aktiviert durch Vermischen mit 4 ml eine 2,5"„igen (Gewicht,Volumen) CNBr-Lösung i destilliertem Wasser und anschließend wurde dt pH-Wert mit 1 η NaOH auf 10 bis 11 cingestel

45

und 6 min auf diesem Wert gehalten. Die Sepharose wurde mit Eiswasser und 0,1 m NaHCO., gewaschen. Dann wurden 100 mg Transcoitin in 20 ml 0,1 m NaHCO₃ zugegeben und die Suspension 24 h bei 4' C geschüttelt. Dann wurde nacheinander mit 0,5 m NaHCO₃, 0,05 m Citratpuffer mit einem pH-Wert von 1,1 und 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6 gewaschen und die Sepharose in dem letzten Puffer gelassen, zu dem 0,1 "■„ Merthiolat zugegeben worden war.

C) Bestimmung von Cortisol

0,5 ml einer cortisolhaltigen Probe (Standard. Plasma oder Urin) wurden zweimal mit Melhylenchlorid extrahiert (2 ■ 3 ml). Die vereinigten Auszüge wurde zur Troekne eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und mit 0,2 ml Cortisol-21-galactosc-oxida.se in einer geeigneten Konzentration und 0,3 ml Transcortin-Scpharose-Suspension (5 mg nil) vermischt. Das Gemisch wurde 15 min bei 4 C rotiert und zentrifugiert. Anschließend wurde die Enzymak'tivität in der überslehcnden Flüssigkeit durch Zugabe von 0,5 ml dieser Flüssigkeit zu 1,5 ml eines Substrats bestimmt. Das Substrat bestand aus 100 mg D-Galaciosc, 20 mg 5-Aminosalicylsäure und IO μ« Pcroxidasc in 450 ml 0,02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6.0. 30 min später wurde die Lxtinklioi bei 460 um gemessen.

5 ng;inI Cortisol in der Probe führten zu eine meßbaren Zunahme der Enzymakliv ität in de überstehenden Flüssigkeit. Corticostcrin und Pro gcstcron beeinflussen das System nur. wenn gii" ßere Mengen zugegeben wurde. Testosteron um Aldostcron besaßen kaum einen Einfluß.

Beispiel 7

Bestimmung von Tnmseoriin

Die zur Bestimmung \on Cortisol, wie in Beispiel ( beschrieben, verwendeten Reagenlien winden ebeiiM zur Bestimmung von Transcorlin verwendet.

Von einer Verdünnungsreihe von Transcoitin von ( bis 1280 ng/ml wurden 0,5 ml 15 min bei 4 C mi 0.2 ml Cortisol-21-galnctosc-oxidase in einer einsprechenden Verdünnung mkubiert. Zu dieser Verdiiiv nungsreihe wurden 0.3 ml Transcortin-Scpharosi (15 mg ml) zugegeben und das Gemisch 15 min be 4 C roiicrl. Die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, gemessen.
Eine Probe, enthaltend 40 ng nil Transcoitin. zeigte eine meßbare Zunahme der Enzymaktiv ität in dci überstehenden Flüssigkeit, wahrend sich bei Gegenwart von 320 ng'ml die gesamte Enzymaktivität in dci überstellenden Flüssigkeit fand.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

i ·.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper unter Ausnutzung der für derartige Substanzen bekannten Bindungsaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mit einer bestimmten Menge eines Kopplungsproduktes aus dem Hapten und einem Enzym und einem in unlösliche Form gebrachten Bestandteil der Reaktion Hapten-Antikörper durchgeführt wird und die Enzym-Aktivität in der flüssigen oder festen Phase bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vitamin oder Hormon als Hapten verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch ] oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eineOxidoreduktase als Enzym verwendet wird. ao