JP2019511919A - がん幹細胞の作製およびその使用 - Google Patents

Abstract

がん幹細胞を作製するための方法、キットおよび組成物が提供される。【選択図】図１

Description

（関連出願情報）
本出願は、その全容を本明細書に援用するところの２０１６年２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２９８，６０３号に基づく優先権を主張するものである。

本発明は、分化がん細胞からがん幹細胞を作製する分野に関する。

がん幹細胞（ＣＳＣ）は、自己再生能を有し、腫瘍を含む多様な細胞を生じ、継続的に腫瘍源性を維持する腫瘍細胞のサブセットを表す。ＣＳＣは、異常なモードであるが、自己再生能（対称及び非対称分裂による）及び分化能をはじめとする、重要な特性を正常組織の幹細胞と共有する。ＣＳＣが存在することを示す最初の根拠は急性骨髄性白血病より得られたものであり、そこで全集団の０．０１〜１％を構成する小さなサブセットが免疫不全マウスに移植されると白血病を誘発できた。ＣＳＣは、最初の発がん性ヒットを受ける細胞型を具体的に指す、起源細胞とは異なっている。更に、ＣＳＣは、正常幹細胞の形質転換に必ずしも由来せず、限定前駆細胞（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）または自己再生能を獲得した、より分化した細胞から生じうる。

グリオーマ幹細胞（ＧＳＣ）は、固形がんから単離された最初のＣＳＣの１つであった。神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、自己再生する腫瘍原性がんのＣＳＣの小さな亜集団を含み、腫瘍浸潤、従来の治療法に対する耐性、および腫瘍再発に関与している。興味深いことに、ヒト腫瘍から単離されインビトロで培養されたＧＳＳは、正常な神経幹細胞（ＮＳＣ）と顕著な類似性を示し、ネスチン、Ｓｏｘ２、およびＯｌｉｇ２などの神経幹細胞／前駆細胞マーカーを発現し、誘導されるとニューロン又はグリア細胞マーカーを発現する細胞に分化できた。免疫不全マウスにＧＳＣを移植すると、親腫瘍と似た組織学的性質および全般的な遺伝子発現パターンを共有する腫瘍を生じた。これらの細胞の幹細胞性および発がん性に関連する機構の理解は、ＧＳＣを死滅させることができる治療アプローチの開発に不可欠であり、ＧＢＭ患者の新規な治療アプローチを開発するための基礎を与えうるものである。

親腫瘍の特性の多くをインビトロおよびインビボで再現できるインビトロがんモデルが依然として求められている。かかるインビトロの生理学的モデルは、新規な薬剤および別用途（リパーパシング）薬剤の高スループットスクリーニングに応用でき、標的臓器での毒性を評価でき、かつ疾患モデルでがん転移を調べるために用いることができる。更に、かかるインビトロモデルは、研究施設および製薬企業での動物モデルの使用を減らす一助となりうる。しかしながら、このモデルの確立に使用するためのＣＳＣの抽出および精製は困難かつ高価であり、患者によっては不可能である。ＣＳＣ、詳細には、患者のがんのすべてではないにしろその多くの側面を再現できるＣＳＣを作製する方法が強く求められている。

本発明は、分化がん細胞からがん幹細胞（ＣＳＣ）を作製する方法、ならびに抗がん治療を特定し、がんワクチンを作製するなどの目的でのその使用方法を提供する。

第１の態様によれば、がん幹細胞（ＣＳＣ）を作製するための方法であって、
ａ．分化がん細胞を与えることと、
ｂ．上記分化がん細胞をｐＨ５〜６．５の第１の培地中でインキュベートすることと、
ｃ．上記分化がん細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を添加した第２の培地中でインキュベートすること、
を含み、
それによりＣＳＣを作製する、方法が提供される。

特定の実施形態では、分化がん細胞は、対象由来の原発性腫瘍細胞、がん細胞株の細胞、対象の血液またはリンパ液由来の循環腫瘍細胞および培養物中で分化したがん細胞からなる群から選択される。

特定の実施形態では、第１の培地は５．８〜６．２のｐＨを有する。特定の実施形態では、上記第１の培地中でインキュベートすることは、１５〜１２０分間にわたり行われる。

特定の実施形態では、第２の培地は、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＣＴＧＦ、ＳＰＡＲＣ、およびＳＤＦ１からなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む添加物質が更に添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、ＴＧＦ−βが更に添加される。

特定の実施形態では、本方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、マクロファージ、ミクログリア、造血前駆細胞、および循環腫瘍細胞からなる群から選択される細胞との共インキュベーションを更に含む。特定の実施形態では、本方法は、羊水ＭＳＣ、脂肪ＭＳＣ、Ｍ２マクロファージ、およびミクログリアからなる群から選択される細胞との共インキュベーションを更に含む。

特定の実施形態では、ＭＳＣは、上記分化がん細胞に対して自家である。特定の実施形態では、第２の培地は、ヒト線維芽細胞、羊水ＭＳＣ、脂肪ＭＳＣ、もしくはミクログリアのいずれか１つからの条件培地またはエクソソームが更に添加される。

特定の実施形態では、第２の培地は、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ） 活性化因子、ヒストン修飾酵素阻害剤、およびヒストン修飾酵素活性化因子からなる群から選択される１種以上の小分子が更に添加される。

特定の実施形態では、第２の培地は、Ｙ−２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、トラニルシプロミン、ＰＭＡ、３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチレート、ＰＫＣα、ＰＫＣε、バルプロ酸およびインスリンからなる群から選択される１種以上の小分子が更に添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、Ｙ−２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、トラニルシプロマイン、ＰＭＡ， ３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチラート、ＰＫＣαおよびＰＫＣεからなる群から選択される１種以上の小分子が更に添加される。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３１３３、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−４８７、ｍｉＲ−４０９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−４３１、およびｍｉＲ−１５４からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を上記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、Ｌｉｎ−２８、ｍｉＲ−１８２、およびｍｉＲ−２１からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲまたはタンパク質を上記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−８３１、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−３１８８、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−３１４１、ｍｉＲ−１２０７、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−２８６１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−３１５５、ｍｉＲ−９２０、ｍｉＲ−４３１０、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−３１７６、ｍｉＲ−１８２５、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−１２３１、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−５０４、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−８９１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１２０８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−１２７５、２０ａ、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−６３６． ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲにハイブリダイズした少なくとも１種のポリヌクレオチド阻害剤を上記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲ−３１８０にハイブリダイズするポリヌクレオチド阻害剤を上記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＺＥＢ２ＮＡＴ、ＵＣＡ１、Ｚｆｈｘ２ａｓ、７ＳＬ、ａｎｔｉＰｅｇ１１、およびＨ１９からなる群から選択される少なくとも１種の長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を上記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、Ｌｉｎ−２８、ＳＴＡＴ３、ＮＦＫＢ、ＣＥＢＰ／Ｂ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＬＩＦ、ＣＯＸ２、ＲＵＮＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を上記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、上記分化がん細胞に放射線照射することを更に含む。

特定の実施形態では、（ｉｉ）上記第２の培地中でインキュベートすることは、低酸素状態でインキュベートすることを更に含む。特定の実施形態では、上記低酸素状態は２〜４％の酸素である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、上記分化がん細胞を接着性または非接着性プレート上でインキュベートすることと、初代スフェロイドを選択することとを更に含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、限界希釈により上記スフェロイドから細胞を再播種して二次スフェロイドを形成することを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＣＳＣを維持するためのものであり、作製されたＣＳＣを健康な細胞、そのエクソソーム、またはそれらの組み合わせと共に培養することを更に含む。特定の実施形態では、健康な細胞は、上記分化がん細胞と同じ原発組織由来である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、作製されたＣＳＣの発現されおよび分泌されるマーカーを分析することを更に含む。

別の態様によれば、抗がん治療を特定するための方法であって、
ａ．本発明の方法のいずれか１つによって作製されたＣＳＣを提供することと、
ｂ．ＣＳＣに目的の治療（例えば治療薬）を適用することと、
ｃ．ＣＳＣに対する目的の治療の少なくとも１つの効果を決定すること、を含み、
それにより抗がん治療を特定する、方法が提供される。

特定の実施形態では、上記効果は、ＣＳＣの生存率または転移能に対する負の効果である。特定の実施形態では、ＣＳＣは幹細胞レポーター遺伝子を発現する。特定の実施形態では、上記効果は、上記レポーター遺伝子の発現に対する負の効果である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、上記治療を適用する前にＣＳＣを免疫不全マウスに投与して異種移植片を作製することを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＣＳＣが一次がん治療に対して耐性を有する場合に二次がん治療を特定するためのものである。

特定の実施形態では、本発明の方法は、個別化がん治療を要する対象者に個別化がん治療を提供するためのものであり、ＣＳＣは対象者からの分化がん細胞から作製されるか、または対象者のがんと同じもしくは同様の変異を有する細胞から作製される。特定の実施形態では、対象者からのがん細胞は原発腫瘍細胞、または対象者の血液、ＣＳＦ、もしくは他の体液からの循環腫瘍細胞である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、治療の適用後にＣＳＣの発現されおよび分泌されるマーカーを分析することを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、個別化がん治療として目的の治療を対象者に処方することを更に含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、対象者に目的の治療を投与することにより対象者を治療することを更に含む。特定の実施形態では、対象者は、原発がんの治療後に再発がまだ生じていないか、または原発がんの治療後に再発が生じている。特定の実施形態では、対象者はがんの転移を有する。

別の態様によれば、がんワクチンを製造するための方法であって、
ａ．本発明の方法のいずれかによってＣＳＣを作製することと、
ｂ．樹状細胞を、ＣＳＣからのライセート、エクソソーム、または細胞外小胞の少なくとも１つと共にインキュベートすることと、
ｃ．樹状細胞を収集すること、
を含み、
それによりがんワクチンを製造する、方法が提供される。

特定の実施形態では、樹状細胞は、上記がんワクチンを要する対象者に対して自家または同種である。特定の実施形態では、本発明の方法は、がんワクチンを要する対象者にがんワクチンと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物を投与することを更に含む。

別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の各実施形態の実施または試験に用いることができるが、代表的な方法および／または材料は下記に記載する。矛盾が生じる場合、定義を含む本特許明細書が優先するものとする。更に、材料、方法、および実施例はあくまで説明を目的としたものであって、必ずしも限定することを目的としない。

Ｕ８７細胞および初代培養グリオーマ細胞における幹細胞性マーカーの相対的なｍＲＮＡ発現量の棒グラフである。 異なる細胞株からのＣＳＣ作製後に調べた視野当たりの腫瘍スフェアの数を示す棒グラフである。 脱分化されヌードマウスに注入されたＵ８７細胞および初代培養グリオーマ細胞の腫瘍体積の棒グラフである。 サイトカインの添加による（４Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（４Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大を示す棒グラフである。 サイトカインの添加による（４Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（４Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大を示す棒グラフである。 非がん性細胞との共培養による（５Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（４Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大、ならびに、単独で、ミクログリアとまたは羊膜ＭＳＣと培養した３つの神経膠芽腫多形分化試料におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、およびＣＤ４４のｍＲＮＡの発現量（５Ｃ）を示す棒グラフである。 非がん性細胞との共培養による（５Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（４Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大、ならびに、単独で、ミクログリアとまたは羊膜ＭＳＣと培養した３つの神経膠芽腫多形分化試料におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、およびＣＤ４４のｍＲＮＡの発現量（５Ｃ）を示す棒グラフである。 非がん性細胞との共培養による（５Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（４Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大、ならびに、単独で、ミクログリアとまたは羊膜ＭＳＣと培養した３つの神経膠芽腫多形分化試料におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、およびＣＤ４４のｍＲＮＡの発現量（５Ｃ）を示す棒グラフである。 小分子阻害剤および活性化剤の添加による（６Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大、および（６Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大を示す棒グラフである。 小分子阻害剤および活性化剤の添加による（６Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大、および（６Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大を示す棒グラフである。 ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤の添加による（７Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（７Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大を示す棒グラフである。 ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤の添加による（７Ａ）基本プロトコールに対する自己再生率の増大および（７Ｂ）Ｓｏｘ２発現量の増大を示す棒グラフである。

本発明は、特定の実施形態において、分化がん細胞からがん幹細胞（ＣＳＣ）を作製するための方法を提供する。本発明は更に、特定の実施形態において、抗がん治療を特定するための方法であって、本発明の方法にしたがってがん幹細胞（ＣＳＣ）を作製することと、目的の治療を上記ＣＳＣに適用することと、上記ＣＳＣに対する上記治療の少なくとも１つの効果を決定することを含む、方法を提供する。

ＣＳＣを作製する方法
一態様によれば、本発明は、ＣＳＣを作製するための方法であって、分化がん細胞を与えることと、上記分化がん細胞をｐＨ５〜６．５の第１の培地中でインキュベートすることと、上記分化がん細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を添加した第２の培地中でインキュベートすることを含み、それによりＣＳＣを作製する、方法に関する。

ＣＳＣは、当業者に周知の多くのマーカーにより識別できる。これらのマーカーとしては、これらに限定されるものではないが、細胞内ＡＬＤＨ活性を有する細胞（ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ細胞）を単離するためのＢＯＤＩＰＹアミノアセトアルデヒド（Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ基質）などの蛍光に基づく基質；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２蛍光色素の排出に基づくｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）分析、還元型２６Ｓプロテアソーム活性、またはＦＡＣＳによる表面マーカー識別が挙げられる。

ＣＳＣのマーカーの非限定的な例としては、
グリオーマでは、ネスチン、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、
乳癌では、ＣＤ２４−／ｌｏｗ、ＣＤ４４＋、ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１３３、ＣＤ２２１、
結腸癌では、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ１６６＋、Ｌｇｒ５＋、ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ、
肝癌では、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４４＋、ＣＤ１３＋、ＳＰ、
肺癌および肺転移では、ＣＤ４４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ８７＋、ＳＰ、ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ、
卵巣癌では、ＳＰ、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ１１７＋、ＥｐＣＡＭ＋、ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ、
膵臓癌では、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋／ ＥＳＡ＋、ＣＤ１３３＋、ｃ−Ｍｅｔ＋、ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ、
前立腺癌では、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋／α２β１ｈｉｇｈ、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋／ＡＢＣＧ２＋／ ＣＤ２４−、ＰＳＡ−／ｌｏｗ／ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ４４＋／α２β１＋、
頭頸部癌では、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋、ＡＬＤＨｂｒｉｇｈｔ、ＳＰ、ＧＲＰ７８＋、ｃ−Ｍｅｔ＋
が挙げられる。

本明細書で使用される用語「分化」および「分化した」は、原始段階から、とりわけ特徴的な細胞表面抗原マーカー群の発現をともなう成熟構造への細胞の発生を指す。細胞個体発生に関連して、形容詞「分化した」および「分化する」は、相対的な用語である。「分化した細胞」は、比較される細胞よりも発生経路の更に下流まで進んだ細胞である。分化は、それにより細胞が特殊化した表現型を取る（例えば、他の細胞型と異なる１以上の特徴または機能を獲得する）発生プロセスである。本明細書で使用される、「分化がん細胞」は、がん幹細胞でないがん性細胞を指す。こうした細胞は腫瘍のすべての細胞を再生できず、また、それは複数の幹細胞マーカー（例えば本明細書に列記されるマーカー）を発現しない。

特定の実施形態では、分化がん細胞は、対象者由来の原発性腫瘍細胞、がん細胞株の細胞、対象者の血液またはリンパ液由来の循環腫瘍細胞、および培養物中で分化したがん細胞からなる群から選択される。特定の実施形態では、分化がん細胞は、対象者から誘導されるかまたは得られる。特定の実施形態では、分化がん細胞は、細胞株の細胞である。特定の実施形態では、分化がん細胞は、循環腫瘍細胞である。

本明細書で使用される用語「循環腫瘍細胞」は、原発腫瘍から分離して血流またはリンパ系によって移動する癌細胞を指す。循環腫瘍細胞を抽出する方法は当該技術分野で周知であり、かかる抽出を行うためのキットは、例えばＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ社より購入できる。

特定の実施形態では、ＣＳＣを作製する方法は、腫瘍試料が入手できない場合、またはＣＳＣが入手可能な腫瘍試料から直接収集できない場合である。特定の実施形態では、本方法は、がん幹細胞の特徴、ならびに初代培養の、親腫瘍の、および特定の変異を有する細胞株の遺伝子異常を再現するＣＳＣを作製する。

特定の実施形態では、異なる腫瘍から、必要に応じて異なる変異を有する「オン・ザ・シェルフ」（ｏｎ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）ＣＳＣ細胞を作製するための方法が提供される。

特定の実施形態では、本発明の方法は、酸性の第１の培地中での分化がん細胞の第１のインキュベーションを含む。特定の実施形態では、第１の培地は、４．６〜６．５、４．８〜６．５、５．０〜６．５、５．２〜６．５、５．４〜６．５、５．６〜６．５、５．８〜６．５、６．０〜６．５、４．６〜６．４、４．８〜６．４、５．０〜６．４、５．２〜６．４、５．４〜６．４、５．６〜６．４、５．８〜６．４、６．０〜６．４、４．６〜６．３、４．８〜６．３、５．０〜６．３、５．２〜６．３、５．４〜６．３、５．６〜６．３、５．８〜６．３、６．０〜６．３、４．６〜６．２、４．８〜６．２、５．０〜６．２、５．２〜６．２、５．４〜６．２、５．６〜６．２、５．８〜６．２、６．０〜６．２、４．６〜６．１、４．８〜６．１、５．０〜６．１、５．２〜６．１、５．４〜６．１、５．６〜６．１、５．８〜６．１、４．６〜６．０、４．８〜６．０、５．０〜６．０、５．２〜６．０、５．４〜６．０、５．６〜６．０、または５．８〜６．０のｐＨを有する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。

特定の実施形態では、本方法は、上記分化がん細胞をｐＨ５〜６．５の第１の培地中でインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、本方法は、上記分化がん細胞をｐＨ５．８〜６．２の第１の培地中でインキュベートすることを含む。

特定の実施形態では、第１の培地中でインキュベートすることは、１０〜１８０、１０〜１５０、１０〜１２０、１０〜９０、１０〜６０、１５〜１８０、１５〜１５０、１５〜１２０、１５〜９０、１５〜６０、２０〜１８０、２０〜１５０、２０〜１２０、２０〜９０、２０〜６０、２５〜１８０、２５〜１５０、２５〜１２０、２５〜９０、２５〜６０、３０〜１８０、３０〜１５０、３０〜１２０、３０〜９０、または３０〜６０分間のいずれか１つにわたって行われる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。特定の実施形態では、第１の培地中でインキュベートすることは、１５〜１２０分間にわたり行われる。

がん細胞およびがん幹細胞のインキュベーションに使用される培地は、当業者に周知である。非限定的な例としては、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ１２、ＩＭＤＭ、およびＭＥＭが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法のインキュベーション培地のいずれか１つは、低グルコース濃度を有する。特定の実施形態では、インキュベーション１またはインキュベーション２またはその両方の培地は、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、または０．５ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を有する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。

特定の実施形態では、第２の培地は、少なくとも１、２、５、７、１０、１２、または１５ｎｇ／ｎｌの濃度のＥＧＦが添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、最大で５、７、１０、１２、１５、２０、または２５ｎｇ／ｎｌの濃度でＥＧＦが添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、１〜２０、２〜２０、５〜２０、７〜２０、１０〜２０、１２〜２０、１〜１５、２〜１５、５〜１５、７〜１５、１０〜１５、１２〜１５、１〜１２、２〜１２、５〜１２、７〜１２、または１０〜１２ｎｇ／ｎｌの濃度でＥＧＦが添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、５〜２０ｎｇ／ｎｌの濃度でＥＧＦが添加される。

特定の実施形態では、第２の培地は、少なくとも１、２、５、７、１０、１２、または１５ｎｇ／ｎｌの濃度でＦＧＦが添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、最大で５、７、１０、１２、１５、２０、または２５ｎｇ／ｎｌの濃度でＦＧＦが添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、１〜２０、２〜２０、５〜２０、７〜２０、１０〜２０、１２〜２０、１〜１５、２〜１５、５〜１５、７〜１５、１０〜１５、１２〜１５、１〜１２、２〜１２、５〜１２、７〜１２、または１０〜１２ｎｇ／ｎｌの濃度でＦＧＦが添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、５〜２０ｎｇ／ｎｌの濃度でＦＧＦが添加される。

特定の実施形態では、第２の培地中でインキュベートすることは、１０〜１８０、１０〜１５０、１０〜１２０、１０〜９０、１０〜６０、１５〜１８０、１５〜１５０、１５〜１２０、１５〜９０、１５〜６０、２０〜１８０、２０〜１５０、２０〜１２０、２０〜９０、２０〜６０、２５〜１８０、２５〜１５０、２５〜１２０、２５〜９０、２５〜６０、３０〜１８０、３０〜１５０、３０〜１２０、３０〜９０、または３０〜６０分間にわたって行われる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。

特定の実施形態では、第２の培地中でインキュベートすることは、低酸素状態でインキュベートすることを更に含む。特定の実施形態では、低酸素状態は、４．５％、４％、３．５％、３％、または２．５％以下の酸素である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。特定の実施形態では、低酸素状態は３％以下の酸素である。

特定の実施形態では、低酸素状態は、１〜４．５％、１〜４％、１〜３．５％、１〜３％、１．５〜４．５％、１．５〜４％、１．５〜３．５％、１．５〜３％、２〜４．５％、２〜４％、２〜３．５％、２〜３％、２．５〜４．５％、２．５〜４％、２．５〜３．５％、または２．５〜３％の酸素である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。特定の実施形態では、上記低酸素状態は２〜４％の酸素である。

無酸素または低酸素状態でのインキュベーションは、当業者に周知である。特別な低酸素インキュベーターチャンバーをこの目的で使用でき、これらは組織培養チャンバーの製造業者により販売されている。

特定の実施形態では、本発明の方法は、分化がん細胞を接着性または非接着性プレート上でインキュベートすることと、初代スフェロイドを選択することとを更に含む。かかるスフェロイドは、腫瘍スフェアとしても知られている。分化がん細胞は接着性プレートに接着する傾向があり、したがって接着せずにスフェアを形成する細胞はＣＳＣである。特定の実施形態では、本方法は、限界希釈によりスフェロイドから細胞を再播種して二次スフェロイドを形成することを更に含む。

接着性および非接着性プレートは、当業者に周知である。接着性プレートはしばしば、接着性を高めるためにコーティングが施され、または細胞接着性の高いプラスチックで形成される。かかるプレートの例としては、これらに限定されるものではないが、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社および他社により販売されるものなどの従来の組織培養プレート、ゼラチンコーティングプレート、およびコラーゲンコーティングプレートが挙げられる。非接着性プレートは、スフェロイドの培養に広く用いられるものなどの低接着性プレートも指す。

本明細書で使用される用語「限界希釈」は、各試料中に高い確率で１個のみの細胞が存在するように培地中の細胞の濃度を希釈することを指す。特定の実施形態では、限界希釈は、ディッシュの各ウェル中に播いた場合にウェル２個ごと、ウェル３個ごと、ウェル５個ごと、またはウェル１０個ごとに１個のみの細胞が存在するように細胞を希釈することを指す。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。

特定の実施形態では、本発明の方法は、分化がん細胞に放射線照射することを更に含む。細胞照射は、当業者に周知である。特定の実施形態では、照射の線量は少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０グレイ（ｇｙ）である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。特定の実施形態では、照射は単一線量の照射である。特定の実施形態では、照射は、１週間以下、５日間以下、３日間以下、１日以下の時間にわたって複数回の線量で行われる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。特定の実施形態では、照射は非イオン化照射である。特定の実施形態では、照射はイオン化照射である。特定の実施形態では、照射はγ線照射である。

添加物質
特定の実施形態では、第２の培地は、少なくとも１種のサイトカインを含む添加物質が添加される。特定の実施形態では、サイトカインは、炎症性サイトカイン、ケモカイン、および繊維化促進サイトカインからなる群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＣＴＧＦ、ＳＰＡＲＣ、およびＳＤＦ１からなる群から選択される。

特定の実施形態では、サイトカインは、０．１〜１００、０．１〜９０、０．１〜８０、０．１〜７０、０．１〜６０、０．１〜５０、０．１〜４０、０．１〜３０、０．１〜２０、０．１〜１０、１〜１００、１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２５〜１００、２５〜９０、２５〜８０、２５〜７０、２５〜６０、または２５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αは２５〜８０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。特定の実施形態では、ＩＬ−６は１０〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。特定の実施形態では、ＳＰＡＲＣは１０〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。特定の実施形態では、ＣＴＧＦは１〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。特定の実施形態では、ＳＤＦ１は１〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、ＴＧＦ−βが更に添加される。特定の実施形態では、ＴＧＦ−βは０．１〜３０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。

特定の実施形態では、第２の培地は、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ活性化剤、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ） 活性化剤、ヒストン修飾酵素阻害剤、およびヒストン修飾酵素活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の小分子を含む添加物質が更に添加される。

特定の実施形態では、阻害剤は、タンパク質または複合体の発現または機能を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％低下させる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。当業者であれば、各小分子は、その分子に固有の濃度で、かつ阻害を生じるのに充分な濃度で細胞に投与されることを理解されよう。本明細書において下記で特に指定されないかぎりは、これらの小分子を添加する際には製造者のガイドラインに従う必要がある。

特定の実施形態では、活性化剤は、タンパク質または複合体の発現または機能を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％高める。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。当業者であれば、各小分子は、その分子に固有の濃度で、かつ活性化を生じるのに充分な濃度で細胞に投与されることを理解されよう。本明細書において下記で特に指定されないかぎりは、これらの小分子を添加する際には製造者のガイドラインに従う必要がある。

ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＨＯ関連プロテインキナーゼを阻害し、当該技術分野で周知である。非限定的な例としては、Ｙ−２７６３２、チアゾビビン、ファスジル、およびＧＳＫ４２９２８６Ａが挙げられる。ＧＳＫ阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３Ａ、３Ｂ、および３Ｃを阻害し、当該技術分野で周知である。非限定的な例としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ケンパウロン、ＳＢ−２１６７６３、インジルビン、ヒメニジン、アロイニンＡ、および塩化リチウムが挙げられる。ＭＡＯ阻害剤は、モノアミンオキシダーゼＡおよびＢを阻害し、当該技術分野で周知ある。非限定的な例としては、トラニルシプロミン、２−プロピナール、クロルギリン塩酸塩、ホモバニリン酸エチル、フェネルジン硫酸塩、ラサギリン、およびピンプリニンが挙げられる。

プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）αおよびεは、ＰＫＣシグナル伝達複合体を構成するシグナル伝達分子であり、この複合体の活性化剤は当該技術分野で周知である。非限定的な例としては、ＰＫＣα、ＰＫＣε、１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、α−アミロイド前駆タンパク質、ホルボール−１２，１３−ジブチレート、メゼレイン、インゲノール３−アンゲレート、およびホルボール１２， １３−ジヘキサノエートが挙げられる。ＥＲＫ活性化もＰＫＣを活性化すると知られる。特定の実施形態では、ＥＲＫ活性化剤はセラミドＣ６である。

ヒストン修飾酵素としては、これらに限定されるものではないが、ヒストンアセチル基転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、ヒストンメチル基転移酵素、ヒストン脱メチル化酵素、ヒストンリン酸化酵素、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンスモイラーゼ、ヒストンＡＤＰリボシラーゼ、およびヒストンデイミナーゼが挙げられる。これらの酵素の阻害剤および活性化剤は当該技術分野で周知であり、これらに限定されるものではないが、 ３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチラート、ＴＣ−Ｈ１０６、バルプロ酸、インスリン、およびＳＩＲＴ１アクチベータ３が挙げられる。

特定の実施形態では、第２の培地は、Ｙ−２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、トラニルシプロミン、ＰＭＡ、３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチレート、ＰＫＣα、ＰＫＣε、バルプロ酸、およびインスリンからなる群から選択される小分子が更に添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、Ｙ−２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、トラニルシプロミン、ＰＭＡ、３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチレート、ＰＫＣαおよびＰＫＣε活性化剤または過剰発現からなる群から選択される小分子が更に添加される。

特定の実施形態では、小分子は、０．１〜１００、０．１〜９０、０．１〜８０、０．１〜７０、０．１〜６０、０．１〜５０、０．１〜４０、０．１〜３０、０．１〜２０、０．１〜１０、１〜１００、１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２５〜１００、２５〜９０、２５〜８０、２５〜７０、２５〜６０、または２５〜５０ｎｍの濃度で添加される。特定の実施形態では、ＰＭＡは１〜５０ｎｍの濃度で添加される。

特定の実施形態では、小分子は、０．１〜１００、０．１〜９０、０．１〜８０、０．１〜７０、０．１〜６０、０．１〜５０、０．１〜４０、０．１〜３０、０．１〜２０、０．１〜１０、１〜１００、１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２５〜１００、２５〜９０、２５〜８０、２５〜７０、２５〜６０、または２５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。

共培養
特定の実施形態では、第２のインキュベーションは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、マクロファージ、ミクログリア、造血前駆細胞、患者血清からのまたは患者腫瘍から抽出された循環腫瘍細胞および循環ＭＳＣからなる群から選択される細胞との共インキュベーションを更に含む。特定の実施形態では、第２のインキュベーションは、羊水ＭＳＣ、脂肪ＭＳＣ、Ｍ２マクロファージ、およびミクログリアからなる群から選択される細胞との共インキュベーションを更に含む。

本明細書で使用される用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、複数の間葉系細胞系列中で分化した細胞、詳細には骨芽細胞、脂肪細胞、筋原細胞、および軟骨芽細胞を生じることが可能な細胞を指す。一般的に、間葉系幹細胞は以下の特性：分裂後の２個の娘細胞が異なる表現型を有しうる非同期的または対称的複製を行う能力；大きな自己複製能力；および、間葉系幹細胞、例えば骨髄の非造血細胞が存在する組織のクローン再生、の１つ以上も有する。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、胎盤の羊膜および絨毛膜、歯髄、ならびに臍帯を含む、複数の組織に由来しうる。特定の実施形態では、ＭＳＣは、分化がん細胞に対して自家である。特定の実施形態では、ＭＳＣは、分化がん細胞に対して同種である。

造血前駆細胞は、細胞表面でのＣＤ３４の発現によって特徴付けられる。こうした細胞は循環血液から抽出できる。これらの細胞は、造血細胞系列のいずれの細胞にも分化する能力を有している。特定の実施形態では、造血前駆細胞は、分化がん細胞に対して自家である。特定の実施形態では、造血前駆細胞は、分化がん細胞に対して同種である。

本明細書で使用される「Ｍ２マクロファージ」は、サイトカインおよび他の因子（オルニチンなど）の放出により局所炎症を低減し、組織修復を促す抗炎症性マクロファージを指す。特定の実施形態では、Ｍ２マクロファージは腫瘍関連マクロファージである。特定の実施形態では、マクロファージは、分化がん細胞に対して自家である。特定の実施形態では、マクロファージは、分化がん細胞に対して同種である。

特定の実施形態では、ミクログリアは脳腫瘍からの分化がん細胞と共培養される。特定の実施形態では、ミクログリアは、分化がん細胞に対して自家である。特定の実施形態では、ミクログリアは、分化がん細胞に対して同種である。

本明細書に述べられる共培養細胞はいずれもパラクリン因子を分泌することが知られている。特定の実施形態では、第２の培地は、上に述べた細胞からの条件培地またはエクソソームが更に添加される。特定の実施形態では、第２の培地は、ヒト線維芽細胞、羊水ＭＳＣ、脂肪ＭＳＣ、もしくはミクログリアからの条件培地またはエクソソームが更に添加される。

本明細書で使用される用語「条件培地」は、その中で細胞が予め一定期間増殖された培地を指す。この培地は、これらに限定されるものではないが、培地中に溶解した酵素、増殖因子、サイトカインおよびホルモンを含む分泌因子を有するが、それらは条件培地を新しい細胞に移すことによって移行できる。当業者は条件培地の調製に精通しており、培地を調整するためのインキュベーション時間は、培地中で増殖する細胞の種類および培地内の細胞の濃度に応じて１〜５日間の範囲でありうる。

本明細書で使用される用語「エクソソーム」は、粒径５０〜１００ｎｍを有するエンドサイトーシスにより生じる小さな細胞外小胞を指す。エクソソームは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ＤＮＡフラグメント、およびタンパク質を含有でき、これらはドナーからレシピエント細胞へと運搬される。エクソソームは、それらががん細胞間の発がん性タンパク質の移行を媒介することが示されているので、腫瘍微小環境での情報の交換に重要な役割を担っていると考えられる。一方で、エクソソームは、抗腫瘍反応を引き起こすように免疫系をプログラムすることも示されている。

異所性ＲＮＡおよびタンパク質発現
特定の実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３１３３、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−４８７、ｍｉＲ−４０９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−４３１、およびｍｉＲ−１５４、および／またはＬｉｎ−２８からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

本明細書で使用される用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、１８〜２５個のヌクレオチドを含み（通常は２０〜２３個、最も一般的には２２個）、少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに結合してそのＲＮＡからのタンパク質発現を阻害する、低分子ノンコーディングＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲは当業者に周知であり、しばしば多くのｍＲＮＡを標的とするが特定のｍｉＲのすべての標的はまだ分かっていない。特定の実施形態では、ｍｉＲは、ｍＲＮＡによって生成されるタンパク質を少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減させる。それぞれの可能性は、本発明の異なる実施形態を示す。

本明細書で使用される用語「発現」または「発現する」は、遺伝子産物またはノンコーディングＲＮＡの転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物またはノンコーディングＲＮＡの生合成を指す。したがって、核酸分子の発現は、核酸フラグメントの転写（例えばｍＲＮＡまたは他の機能性ＲＮＡを生じる転写）および／またはＲＮＡの前駆または成熟タンパク質（ポリペプチド）への翻訳を指す場合もある。

細胞内での遺伝子または核酸の発現は当業者に周知である。それは、多くの方法のなかでも特に、トランスフェクション、ウイルス感染、または細胞のゲノムの直接的な変更によって行うことができる。特定の実施形態では、遺伝子またはＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクターなどの発現ベクター中に存在する。

特定の実施形態では、ＲＮＡ分子（すなわちｍｉＲ）は、ベクターに組み込まれることなく、細胞内にトランスフェクト、ヌクレオフェクトまたは他の形で導入される。特定の実施形態では、ｍｉＲは一本鎖である。特定の実施形態では、ｍｉＲはＲＮＡ二本鎖である。特定の実施形態では、ｍｉＲはベクター中にある。

ベクターの核酸配列は一般的に、少なくとも、細胞内で増殖するための複製開始点と、場合により、異種ポリペプチド配列、発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデニン配列などの、更なる要素を含む。

ベクターは、非ウイルスの方法によりまたはウイルス的手法によって導入されるＤＮＡプラスミドであってよい。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであってよい。プロモーターは、哺乳動物細胞中で活性であってよい。プロモーターは、ウイルスのプロモーターであってよい。

特定の実施形態では、遺伝子はプロモーターへ機能的に連結される。用語「機能的に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、１乃至複数の調節エレメントに、ヌクレオチド配列の発現を可能にするような形で連結されることを意味すると意図される（例えば、インビトロの転写／翻訳系で、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞で）。

特定の実施形態では、ベクターは細胞内に、エレクトロポレーション（例えば、Ｆｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ５８２４ （１９８５）に記載される）、ヒートショック、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子の基質内にまたはその表面上に核酸を有する小粒子による高速弾道貫通（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２７． ７０−７３ （１９８７））などを含む標準的な方法によって導入される。

本明細書で使用される用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周囲にかたまって存在する一群の転写制御モジュールを指す。プロモーターは個別の機能的モジュールで構成され、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、かつ転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質に対する１以上の認識部位を有する。

特定の実施形態では、核酸配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩおよびＰｏｌ ＩＩ）により転写される。ＲＮＡＰＩＩは真核生物にみられる酵素である。ＲＮＡＰＩＩは、ＤＮＡの転写を触媒してｍＲＮＡならびに多くのｓｎＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡの前駆体を合成する。

特定の実施形態では、哺乳動物の発現ベクターとして、これらに限定されるものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より販売される、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社より販売されるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社より販売されるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より販売されるｐＴＲＥＳ、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。

特定の実施形態では、レトロウイルスなどの真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明で使用される。Ｓｖ４０ウイルスは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。特定の実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バール・ウイルス由来のベクターはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の代表的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの支配下でタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが挙げられる。

特定の実施形態では、水平感染およびターゲティング特異性などの利点を有する組換えウイルスベクターが、インビボ発現に用いられる。一実施形態では、水平感染は例えばレトロウイルスの生活環に特有であり、それにより１個の感染細胞が、出芽して隣接細胞に感染する多数の子孫ビリオンを生じる過程である。一実施形態では、その結果、その大部分が最初のウイルス粒子によって初期には感染していなかった広い領域が速やかに感染される。一実施形態では、水平拡散できないウイルスベクターが作製される。一実施形態では、この特性は、所望の目的が特定の遺伝子を一定数の局在する標的細胞のみに導入することである場合、有用でありうる。

さまざまな方法を用いて本発明の発現ベクターを細胞内に導入できる。こうした方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９， １９９２）， ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ． （１９８９）， Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， Ｍｉｃｈ． （１９９５）， Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ． （１９９５）， Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ． （１９８８） および Ｇｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ． ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４ （６）： ５０４−５１２， １９８６］に一般的に記載されており、例えば、安定的または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターによる感染を含む。更に、ポジティブセレクション、ネガティブセレクション法については米国特許第５，４６４，７６４号、および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。

一実施形態では、植物の発現ベクターが用いられる。一実施形態では、ポリペプチドコーディング配列の発現は多数のプロモーターによって誘導される。特定の実施形態では、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４ （１９８４）］、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１ （１９８７）］が用いられる。別の実施形態では、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０ （１９８４）； ａｎｄ Ｂｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３ （１９８４）］、またはヒートショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：５５９−５６５ （１９８６）］ などの植物プロモーターが用いられる。一実施形態では、コンストラクトはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび当業者に周知の他の方法を用いて植物細胞中に導入される。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ， ｐｐ ４２１−４６３ （１９８８）］を参照されたい。当該技術分野で周知である、昆虫および哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系も、本発明により使用できる。

挿入されたコーディング配列（ポリペプチドをコードしたもの）の転写および翻訳に必要なエレメントを含む以外に、本発明の発現コンストラクトは、発現されるポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するように操作された配列を含んでよいことが認識されるであろう。

遺伝子は、上に述べた任意の適当な投与方法を用いて個人に投与される核酸コンストラクトから発現されてもよいことが、当業者に認識されるであろう（すなわちインビボ遺伝子治療）。一実施形態では、核酸コンストラクトは、適当な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、トランスダクション、相同組換えなど）および必要に応じて発現系によって適当な細胞内に導入されその後、改変された細胞が培養中で増殖されて個人に戻される（すなわちエクスビボ遺伝子治療）。

特定の実施形態では、本発明の方法は、Ｌｉｎ−２８、ｍｉＲ−１８２、およびｍｉＲ−２１からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲまたはタンパク質を分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１種のｍｉＲにハイブリダイズされてこのｍｉＲの機能を阻害する少なくとも１種のポリヌクレオチド阻害剤を分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含み、上記ｍｉＲは、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−８３１、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−３１８８、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−３１４１、ｍｉＲ−１２０７、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−２８６１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−３１５５、ｍｉＲ−９２０、ｍｉＲ−４３１０、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−３１７６、ｍｉＲ−１８２５、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−１２３１、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−５０４、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−８９１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１２０８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−１２７５、２０ａ、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−６３６． ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７からなる群から選択される。

本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド阻害剤」は、ｍｉＲにハイブリダイズしｍｉＲの機能を阻害する、すなわちその標的ｍＲＮＡによるタンパク質生成を低減させるｍｉＲの能力を阻害する、核酸分子を指す。ｍｉＲのポリヌクレオチド阻害剤の非限定的な例としては、アンタゴｍｉｒ、ｍｉｃｒｏＲＮＡアゴｍｉｒ、およびＭＩＳＳＩＯＮ合成ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤が挙げられる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド阻害剤は、ｍＲＮＡの翻訳のｍｉＲによる抑制を少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減させる。それぞれの可能性は、本発明の異なる実施形態を示す。特定の実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲ−３１８０のポリヌクレオチド阻害剤を分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＺＥＢ２ＮＡＴ、ＵＣＡ１、Ｚｆｈｘ２ａｓ、７ＳＬ、ａｎｔｉＰｅｇ１１、およびＨ１９からなる群から選択される長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、ＲＮＡ分子（すなわちｌｎｃＲ）は、ベクターに組み込まれることなく、細胞内にトランスフェクト、ヌクレオフェクトまたは他の形で導入される。特定の実施形態では、ｌｎｃＲは一本鎖である。特定の実施形態では、ｌｎｃＲはＲＮＡ二本鎖である。特定の実施形態では、ｌｎｃＲはベクター中にある。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＳＴＡＴ３、ＮＦＫＢ、ＣＥＢＰ／Ｂ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＬＩＦ、ＣＯＸ２、ＲＵＮＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、第２のインキュベーションのプレートを、ＳＰＡＲＣ、抗ＣＤ４４抗体、ＲＴＶＰおよびＲＴＶＰ−１ｂからなる群から選択される分子でコーティングすることを更に含む。

異所性タンパク質発現は、当業者に周知である。特定の実施形態では、異所性タンパク質を、本発明の細胞がタンパク質と接触するように培地に添加する。特定の実施形態では、本発明の細胞は、タンパク質を培地から細胞内に輸送する。特定の実施形態では、異所性タンパク質発現は、細胞内のタンパク質をコードするｍＲＮＡの異所性発現を含む。特定の実施形態では、この発現は一過性である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞ゲノムへのＤＮＡの組み込みなどにより、安定に発現される。細胞内で遺伝子を異所的に発現させる方法については、上に述べた。

使用の方法
特定の実施形態では、ＣＳＣを維持するための本発明の方法は、作製されたＣＳＣを健康な細胞、そのエクソソーム、またはそれらの組み合わせと共に培養することを更に含む。特定の実施形態では、ＣＳＣを維持することに用いられる本発明の方法は、作製されたＣＳＣを健康な細胞、そのエクソソーム、またはそれらの組み合わせと共に培養することを更に含む。本明細書で使用される「健康な細胞」は、非がん性細胞を指す。特定の実施形態では、健康な細胞は、分化がん細胞と同じ原発組織由来である。

特定の実施形態では、ＣＳＣを維持するための本発明の方法は、作製されたＣＳＣを、分化がん細胞および健康な細胞と共に培養することを更に含む。特定の実施形態では、ＣＳＣを維持することに用いられる本発明の方法は、作製されたＣＳＣを健康な細胞、そのエクソソーム、またはそれらの組み合わせと共に培養することを更に含む。ＣＳＣ、分化がん細胞、および健康な細胞の３次元である場合のこのような組み合わせは、本明細書ではオルガノイドと称する。かかるオルガノイドは、それらがいずれか１つの細胞型単独と比較してインビボ腫瘍をより正確に模倣することから、がん治療を試験するためのモデルとして有用である。

がん幹細胞／腫瘍スフェアの作製に加えて、本発明は、作製された細胞を、３Ｄスフェロイド培養中単独で、または腫瘍の微小環境を形成する細胞の組み合わせとともに増殖する方法も提供する。特定の実施形態では、これらの他の細胞は、内皮細胞、間質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、および免疫細胞からなる群から選択されるか、またはこれらの細胞からのエクソソームもしくは条件培地から選択される。これは、より高い関連性での薬剤のスクリーニングを可能にする。特定の実施形態では、本発明は、複数のパラメータを共に、細胞運命、細胞死、幹細胞性、分化、間葉形質転換、およびシグナル伝達経路の活性化を同時に分析することを可能にする２重蛍光ルシフェラーゼレポーターを用いて生細胞中で分析する方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明のＣＳＣを免疫不全マウスに投与して異種移植片を作製する。がん異種移植片もまた、マウス中で完全に組み込まれた腫瘍が形成するので、がん治療を試験するうえで有用なモデルである。

本明細書で使用される用語「投与する」、「投与」および同様の用語は、有効な医療行為において、有効成分を含む組成物を、治療効果が得られるような形で対象者に投与する任意の方法を指す。本発明の主題の一態様は、それを必要とする患者への本発明の主題の組成物の治療上の有効量の経口投与を提供する。他の適当な投与経路としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内投与が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、作製されたＣＳＣの発現され分泌されるマーカーを分析することを更に含む。特定の実施形態では、分析されるＣＳＣは培養物中のものである。特定の実施形態では、分析されるＣＳＣは腫瘍スフェア中のものである。特定の実施形態では、分析されるＣＳＣはオルガノイド中のものである。特定の実施形態では、分析されるＣＳＣは異種移植片中のものである。

特定の実施形態では、発現され分泌されるマーカーは、タンパク質、特異的ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよび他のノンコーディングＲＮＡであってよい。特定の実施形態では、発現され分泌されるマーカーは、培地またはエクソソームまたはタンパク質の細胞外小胞から単離される。特定の実施形態では、発現され分泌されるマーカーは、疾患の存在および進行の分析のため、ならびに特定の治療に対する細胞の応答について用いられる。特定の実施形態では、分析は、異なる体液（血液、血清、血漿、尿、ＣＳＦ、唾液）から循環バイオマーカーを単離するために後で行うことができる。特定の実施形態では、本方法は、疾患の進行、再発、および治療に対する応答を分析および予測するための非侵襲性の手技である。

別の態様によれば、抗がん治療を特定するための方法であって、本発明の方法のいずれかによってＣＳＣを与えることと、目的の治療をＣＳＣに適用することと、ＣＳＣに対する目的の治療の少なくとも１つの効果を決定すること、を含み、これにより抗がん治療を特定する、方法が提供される。

本明細書で使用される用語「目的の治療」は、がんを治療するもしくは改善することができる、または治療するもしくは改善すると予想される任意の治療または薬剤を指す。かかる治療または薬剤は、既知のがん治療であってよい。かかる治療または薬剤は、がんの治療効果があることが予想されるだけであってよい。かかる治療または薬剤は、異なる疾患または状態の治療に使用される治療薬であってよいが、がん治療における副次的な治療用途を有してもよい。

目的の治療または目的の治療薬としては、これらに限定されるものではないが、γ線照射、アビラテロン酢酸エステル、メトトレキサート、パクリタキセル・アルブミン安定化製剤、ＡＢＶＣ（ドキソルビシン塩酸塩、ブレオマイシン、ビンブラスチン硫酸塩、ダカルバジンの併用）、ＡＢＶＥ（ドキソルビシン塩酸塩、ブレオマイシン、ビンブラスチン硫酸塩、エトポシドの併用）、ＡＢＶＥ−ＰＣ（ドキソルビシン塩酸塩、ブレオマイシン、ビンブラスチン硫酸塩、エトポシド、プレドニゾン、シクロホスファミドの併用）、ＡＣ（ドキソルビシン塩酸塩、およびシクロホスファミドの併用）、ＡＣ−Ｔ（ドキソルビシン塩酸塩、シクロホスファミド、パクリタキセルの併用）、ブレンツキシマブベドチン、ＡＤＥ（シタラビン、ダウノルビシン塩酸塩、エトポシドの組み合わせ）、アド−トラスツズマブ エムタンシン、ドキソルビシン塩酸塩、フルオロウラシル、アファチニブマレイン酸塩、エベロリムス、イミキモド、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パロノセトロン塩酸塩、クロラムブシル、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、パミドロン酸二ナトリウム、エキセメスタン、ネララビン、三酸化ヒ素、オファツムマブ、エルウィニア・クリサンテミ・アスパラギナーゼ、ベバシズマブ、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ（ブレオマイシン、エトポシド、ドキソルビシン塩酸塩、シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、プロカルバジン塩酸塩、プレドニゾンの併用）、カルムスチン、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチンの併用）、ベバシズマブ、ベキサロテン、トシツモマブ、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、ビカルタミド、カルムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブｓ−リンゴ酸塩、ＣＡＦ（シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩、フルオロウラシルの併用）、イリノテカン塩酸塩、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ（カペシタビン、オキサリプラチンの併用）、カルボプラチン、カルボプラチン−タキソールの併用、カルフィルゾミブ、カルムスチンインプラント、ロムスチン、セリチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、組換えＨＰＶ二価ワクチン、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾンの併用、ＣＨＯＰ （シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、プレドニゾンの併用）、シスプラチン、シクロホスファミド、クロファラビン、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシルの併用）、ＣＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、プロカルバジン塩酸塩、プレドニゾンの併用）、ＣＯＰＰ−ＡＢＶ（シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、プロカルバジン塩酸塩、プレドニゾン、ドキソルビシン塩酸塩、ブレオマイシン、ビンブラスチン硫酸塩の併用）、ダクチノマイシン、クリゾチニブ、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、プレドニゾンの併用）、イフォスファミド、ラムシルマブ、シタラビン、シタラビンリポソーム、ダブラフェニブ、ダカルバジン、デシタビン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デクスラゾキサン塩酸塩、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、フルオロウラシル、ラスブリカーゼ、エピルビシン塩酸塩、オキサリプラチン、エルトロンボパグオラミン、エンザルタミド、ＥＰＯＣＨ（エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン硫酸塩、シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩の併用）、エリブリンメシル酸塩、ビスモデギブ、エルロチニブ塩酸塩、エトポシドリン酸塩、エトポシド、エベロリムス、ラロキシフェン塩酸塩、トレミフェン、フルベストラント、ＦＥＣ（フルオロウラシル、エピルビシン塩酸塩、シクロホスファミドの併用）、レトロゾール、フィルグラスチム、フルダラビンリン酸塩、フルオロウラシル、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩の併用）、ＦＯＬＦＩＲＩ−ベバシズマブの併用、ＦＯＬＦＩＲＩ−セツキシマブの併用、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、オキサリプラチンの併用）、ＦＯＬＦＯＸ （ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、オキサリプラチンの併用）、プララトレキサート、ＦＵ−ＬＶ （フルオロウラシル、ロイコボリンカルシウムの併用）、組換えＨＰＶ４価ワクチン、オビヌツズマブ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチンの併用、ゲムシタビン−オキサリプラチンの併用、ゲムツズマブ オゾガマイシン、イマチニブメシル酸塩、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、トラスツズマブ、トポテカン塩酸塩、ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ（シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、デキサメタゾンの併用）、イブリツモマブ・チウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシドの併用）、ポナチニブ塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イホスファミド、アキシチニブ、組換えインターフェロンα−２ｂ、イピリムマブ、イリノテカン塩酸塩、ロミデプシン、イクサベピロン、ルキソリチニブリン酸塩、パリフェルミン、ペムブロリズマブ、ラパチニブトシル酸塩、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド酢酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、プロカルバジン塩酸塩、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、トラメチニブ、メルカプトプリン、メスナ、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ＭＯＰＰ（メクロレタミン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、プロカルバジン塩酸塩、プレドニゾンの併用）、プレリキサフォル、ビノレルビン酒石酸塩、ネララビン、ソラフェニブトシル酸塩、ニロチニブ、タモキシフェンクエン酸塩、ロミプロスチム、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマセタキシンメペスクシナート、ペグアスパラガーゼ、ＯＥＰＡ（ビンクリスチン硫酸塩、エトポシド、プレドニゾン、ドキソルビシン塩酸塩の併用）、ＯＦＦ（オキサリプラチン、フルオロウラシル、ロイコボリンカルシウムの併用）、ＯＰＰＡ（ビンクリスチン硫酸塩、プロカルバジン塩酸塩、プレドニゾン、ドキソルビシン塩酸塩の併用）、パクリタキセル、ＰＡＤ（ボルテゾミブ、ドキソルビシン塩酸塩、デキサメタゾンの併用）、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パゾパニブ塩酸塩、ペグインターフェロンα−２ｂ、ペンブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、ペルツズマブ、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、シプリューセル−Ｔ、塩化ラジウム２２３、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、プレドニゾンの併用）、Ｒ−ＣＶＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、プレドニゾンの併用）、レゴラフェニブ（ｒｅｆｏｒａｆｅｎｉｂ）、リツキシマブ、ロミデプシン、ルキソリチニブリン酸塩、タルク、シルツキシマブ、シプリューセル−Ｔ、ソラフェニブトシル酸塩、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ（メクロレタミン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ブレオマイシン、エトポシド、プレドニゾンの併用）、スニチニブリンゴ酸塩、サリドマイド、ＴＡＣ（ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、シクロホスファミドの併用）、テモゾロミド、テムシロリムス、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、ＴＰＦ（ドセタキセル、シスプラチン、フルオロウラシルの併用）、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ（ビンクリスチン硫酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、メトトレキサート、プレドニゾンの併用）、ＶｅＩＰ（ビンブラスチン硫酸塩、イホスファミド、シスプラチンの併用）、ビンブラスチン硫酸塩、ベムラフェニブ、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ（エトポシド、イホスファミド、シスプラチンの併用）、ビスモデギブ、ボリノスタット、ＸＥＬＯＸ（カペシタビン、オキサリプラチンの併用）、ｚｉｖ−アフリベルセプト、ゾレドロン酸、またはこれらの組み合わせが挙げられる。

特定の実施形態では、目的の治療は、これらに限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルス、レンチウイルス、または遺伝子発現を調節できる当該技術分野で周知の他の任意のウイルスベクターなどの、任意の適当な遺伝子治療も含む。目的の治療は、これらに限定されるものではないが、小分子、ペプチド、別用途（リパーパシング）薬剤、がん遺伝子ｓｉＲＮＡ、腫瘍サプレッサーの過剰発現、特定のｌｎｃＲＮＡの過剰発現またはサイレンシング、変異体タンパク質のアレル特異的ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、ｍｉＲに結合するポリヌクレオチド阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、またはプロドラッグを用いる細胞治療も更に含む。

特定の実施形態では、目的の治療の少なくとも１つの効果は、ＣＳＣの生存率または転移能に対する負の効果である。特定の実施形態では、効果は、ＣＳＣの生存率の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％ ８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の低下である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。

特定の実施形態では、転移能は、マウスにおける足場非依存性コロニー形成（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、遊走、浸潤、転移の形成の少なくとも１つを測定することにより決定される。特定の実施形態では、効果は、転移の可能性の測定される上記決定因子の少なくとも１つの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％ ８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の低下である。

特定の実施形態では、ＣＳＣは、３Ｄ培養での薬剤スクリーニングのための方法で使用できる。これらの実施形態では、提案されるがん治療をＣＳＣを含む３Ｄ培養に適用できる。ＣＳＣは、原発腫瘍試料、初代腫瘍培養、がん細胞株／ヌードマウスで増殖された細胞株、または動物モデルを樹立するためのこれらの培養のいずれかから誘導された異種移植片から得られる任意の適当なＣＳＣであってよい。特定の実施形態では、目的の治療は、ＣＳＣと反応して、腫瘍スフェアのサイズを減少すること、間葉表現型を減少すること、幹細胞性を減少すること、アポトーシスを誘導するまたはオートファジーを誘導すること、細胞分化を誘導するまたは他の治療に対する高い応答性を誘導すること、細胞遊走および浸潤を減少すること、またはこれらの組み合わせを含むさまざまな効果を生じる。

特定の実施形態では、ＣＳＣは幹細胞レポーター遺伝子を発現する。かかるレポーター遺伝子、またはレポーターコンストラクトは、幹細胞特異的プロモーターと機能的に連結される異所性遺伝子である。かかるコンストラクトの例は当該技術分野で周知であり、その非限定的な例としては、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＭｙｃプロモーターの制御下のＧＦＰまたはＲＦＰなどの蛍光遺伝子が挙げられる。かかるレポーターは、幹細胞のみをマークし、顕微鏡法またはＦＡＣＳを含む（ただしこれらに限定されない）各種のアッセイによる幹細胞の観測を可能にする。特定の実施形態では、目的の治療の少なくとも１つの効果は、レポーター遺伝子の発現に対する負の効果である。特定の実施形態では、効果は、レポーター遺伝子の発現の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％ ８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の低下である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、腫瘍特異的な、薬剤応答に関連する腫瘍マーカーの特定のために用いることができる。細胞性および分泌性のルシフェラーゼおよび蛍光タグの複数のレポーターを有するＣＳＣを作製することにより、さまざまな表現型、細胞応答、およびシグナル伝達経路の高スループットのスクリーニングを同時に行うことができる。特定の実施形態では、異なるがん治療に対する正および負の応答を決定するために、がん治療の適用後にＣＳＣ中の異なる細胞および分子機構を分析できる。特定の実施形態では、薬剤によって活性化されるシグナル伝達経路、すなわち薬剤耐性に寄与するシグナル伝達経路の特定のために、およびレスキュー機構を活性化する細胞を分析するためにＣＳＣを用いることができる。特定の実施形態では、耐性細胞を選別し、蛍光レポーターおよびタグを用いて更に分析できる。特定の実施形態では、可能性のある治療を、再発腫瘍に対して、さらに腫瘍が再発する前に、または再発が生じた場合にいつでも治療が行えるように特定できる。更に、有効ながん治療の組み合わせを、どの組み合わせが腫瘍スフェアに影響するかにより、ならびに治療に対するその後の反応によって決定できる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、二次がん治療を特定するためであり、ここで上記ＣＳＣは一次がん治療に対して耐性である。特定の実施形態では、本発明は、がん細胞におけるレスキュー機構を特定する方法も提供する。特定の実施形態では、本方法は、ＣＳＣの３Ｄ培養に目的の治療を適用することと、シグナル伝達経路の変化（活性化または阻害）またはタンパク質、遺伝子、およびノンコーディングＲＮＡの発現の変化を検出することと、これらの変化に拮抗しかつレスキュー機構が機能し治療に対して細胞を耐性にすることを防止する適当ながん治療を決定すること、を含む。これは、この機構が、腫瘍再発の場合にまたは疾患の最小ステージの段階で標的とされることを可能にする。

特定の実施形態では、本発明の方法は、個別化がん治療を要する対象者に個別化がん治療を提供するためであり、ここでＣＳＣは対象者からの分化がん細胞から作製されるか、または対象者のがんと同じもしくは同様の変異を有する細胞から作製される。特定の実施形態では、本発明の方法は、個別化がん治療を要する対象者に個別化がん治療を提供することにおいて使用するためであり、ここでＣＳＣは対象者からの分化がん細胞から作製されるか、または対象者のがんと同じもしくは同様の変異を有する細胞から作製される。

特定の実施形態では、対象者からのがん細胞は原発腫瘍細胞、または対象者の血液、ＣＳＦもしくは他の体液からの循環腫瘍細胞である。特定の実施形態では、対象者からの原発腫瘍細胞は入手できず、ＣＳＣは対象者のがんと同じもしくは同様の変異を有する細胞から作製される。腫瘍の遺伝子解析は、当業者に周知である。同じまたは同様の変異を有するがんが入手できない特定の実施形態では、特定の細胞株のがん細胞を、同じまたは同様の変異を有するように変異させることができる。特定の実施形態では、同様の変異は、これらに限定されるものではないが、同じファミリーのタンパク質の変異、および同じ表現型（すなわち、遺伝子の過剰発現またはサイレンシング）を生じる変異を指す。

特定の実施形態では、腫瘍スフェアは、対象者から最近摘出されたものでなくとも、同じ変異を有する同じ腫瘍からの腫瘍細胞株から樹立されたものである。特定の実施形態では、個人から末梢血を採取して循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から腫瘍スフェアを形成する。特定の実施形態では、腫瘍スフェアは、特定の変異を有する異なる初代培養細胞株から樹立でき、これらの患者についての薬剤スクリーニングのための「オン・ザ・シェルフ」培養として使用できる。特定の実施形態では、腫瘍細胞株のＣＳＣへの脱分化によって、異なる腫瘍から、異なる変異を有する「オン・ザ・シェルフ」ＣＳＣ様細胞を作製できる。特定の実施形態では、本発明の方法は、現在、抗がん剤スクリーニングで使用されている広く受け容れられたＮＩＨ細胞株で実施される。

特定の実施形態では、本発明の方法は、治療の適用後のＣＳＣの発現され分泌されるマーカーを分析することを更に含む。特定の実施形態では、発現され分泌されるマーカーは、タンパク質、特異的ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよび他のノンコーディングＲＮＡであってよい。特定の実施形態では、発現され分泌されるマーカーは、培地またはエクソソームまたはタンパク質の細胞外小胞から単離される。

特定の実施形態では、発現され分泌されるマーカーは、疾患の存在および進行の分析のため、ならびに特定の治療に対する細胞の応答用に用いられる。特定の実施形態では、分析は、異なる体液（血液、血清、血漿、尿、ＣＳＦ、唾液）から循環バイオマーカーを単離するために後で行うことができる。特定の実施形態では、本方法は、疾患の進行、再発および治療に対する応答を分析および予測するための非侵襲性の手技である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、目的の治療を、対象者に個別化がん治療として処方することを更に含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、上記対象者に上記目的の治療を投与することにより上記対象者を治療することを更に含む。特定の実施形態では、目的の治療は、ＣＳＣの生存率、転移能、またはレポーターコンストラクトの発現を低下させ、かつ個別化がん治療として対象者に処方される。特定の実施形態では、目的の治療は、ＣＳＣの生存率、転移能、またはレポーターコンストラクトの発現を低下させ、かつ個別化がん治療として対象者に投与される。

特定の実施形態では、対象者は、原発がんの治療後に再発がまだ生じていないか、または原発がんの治療後に再発が生じている。特定の実施形態では、対象者はがんの転移を有している。特定の実施形態では、対象者は一次治療後に再発を生じている。特定の実施形態では、対象者は一次治療後に再発を生じていない。

特定の実施形態では、本発明は、がん治療のスクリーニングを行うための個別化薬剤を提供する方法を提供する。目的の治療を、ＣＳＣまたは腫瘍スフェアを含む３Ｄ培養に適用できる。特定の実施形態では、ＣＳＣまたは腫瘍スフェアは、本発明の方法を個々の患者の生検からの細胞に適用することおよびそれを個々の患者のがんに特異的にがん治療を適合させるために３Ｄ培養（スフェロイドを単独で、または腫瘍微小環境を模倣できるそれぞれの腫瘍型に関連した細胞とともに）で用いることにより直接得ることができる。特定の実施形態では、本方法は、増殖および自己再生能の阻害によって腫瘍スフェアのサイズを減少させ、間葉表現型を減少させ、幹細胞性を減少させ、アポトーシスを誘導するもしくはオートファジーを誘導し、細胞分化を誘導するもしくは他の治療に対する高い応答を誘導することが具体的に示され、細胞遊走もしくは浸潤、またはこれらの組み合わせを減少する、治療を提供する。どのがん治療がＣＳＣと反応して、増殖および自己再生能の阻害によって腫瘍スフェアのサイズを減少させ、間葉表現型を減少させ、幹細胞性を減少させ、アポトーシスを誘導するもしくはオートファジーを誘導し、細胞分化を誘導するもしくは他の治療に対する高い応答を誘導し、細胞遊走もしくは浸潤、またはこれらの組み合わせを減少するかを観察することによる。特定の実施形態では、治療はがんを罹患する個人に投与される。特定の実施形態では、治療は、がんを治療し、がんの転移を予防するために投与される。本発明の方法は、個人のＣＳＣから作製された異種移植片を用いる動物モデルにおけるインビボで行うこともできる。

薬剤スクリーニングでＣＳＣを使用することにいくつかの利点がある。ＣＳＣは腫瘍細胞の大半を生じる。ＣＳＣは親腫瘍の遺伝子異常を維持する。ＣＳＣは多数の増殖にわたって安定な表現型および遺伝子型を維持できる。ＣＳＣはヌードマウスで増殖させることができる。ＣＳＣは患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を作製することによりインビボで分析できる。調べることができる治療の数に制限がない。特定の実施形態では、ＰＤＸは、腫瘍スフェアを含むオルガノイドと、同じ患者からの羊膜ＭＳＣもしくは循環ＭＳＣとの共培養を用いて作製できる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、新規かつ別用途（リパーパシング）の薬剤をスクリーニングするため、遺伝子および細胞治療、ならびに遺伝子編集分析のためである。数多くの分析を生体および非生体アッセイの両方で行うことができる。特定の実施形態では、関連する細胞型の共培養を分析でき、かつ細胞・マトリックス相互作用を行うことができる。

特定の実施形態では、がんは、これらに限定されるものではないが、乳癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、前立腺癌、白血病、肉腫、甲状腺癌、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、グリオーマ、子宮内膜癌、および腎臓癌などの、任意の種類のがんである。特定の実施形態では、がんは、これらの原発腫瘍のいずれかからの転移である。

特定の実施形態では、本発明は、耐性細胞に対して有効であることが示されるスクリーニングで選択されたがん治療を適用することにより転移を治療する方法も提供する。特定の実施形態では、有効ながん治療は、スクリーニングにおいて、腫瘍スフェアのサイズを減少させ、間葉表現型を減少させ、幹細胞性を減少させ、アポトーシスを誘導するもしくはオートファジーを誘導し、細胞分化を誘導するもしくは他の治療に対する高い応答を誘導することが示され、細胞遊走もしくは浸潤、またはこれらの組み合わせを減少しなければならない。転移は原発腫瘍細胞とは異なる特性を有してよく、異なる治療に対するそれらの応答は異なりうる。特定の実施形態では、ＭＳＣまたは腫瘍スフェアは、本方法を行うために転移および原発腫瘍から作製される。

がんワクチン
別の態様によれば、がんワクチンを製造するための方法であって、本発明の方法のいずれかによりＣＳＣを作製することと、樹状細胞（ＤＣ）をＣＳＣからのライセート、エクソソーム、または細胞外小胞の少なくとも１つとインキュベートすることと、上記樹状細胞を収集すること、を含み、それによりがんワクチンを製造する、方法が提供される。特定の実施形態では、ＤＣは、がんワクチンを要する対象者に対して自家または同種である。

本明細書で使用される用語「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫性を高めるか、または特定の疾患に対して免疫系を活性化する組成物を指す。本明細書で使用される用語「がんワクチン」は、がんに対する免疫性を高めるか、またはがん細胞に対して免疫系を活性化する組成物を指す。特定の実施形態では、がんワクチンは、免疫系を刺激してがんの細胞を攻撃するように適合される。

特定の実施形態では、ＣＳＣを腫瘍ワクチンの作製に用いることができる。ＣＳＣは分化腫瘍細胞を生じることができ、そのため幹細胞および分化腫瘍細胞の両方の無限のプールを与えることができる。特定の実施形態では、培養物中のこれらの細胞に由来するエクソソームおよび他の細胞外小胞を、循環バイオマーカーを予測するためおよび腫瘍ワクチンを作製するために用いることができる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、がんワクチンを要する対象者にがんワクチンと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物を投与することを更に含む。特定の実施形態では、組成物を投与することは、がんを発生するリスクを有する対象者においてがんを発生するリスクを低減する。特定の実施形態では、組成物を投与することは、がんを有する対象者においてがんを治療または改善する。特定の実施形態では、がんを発生するリスクを有する対象者において、がんを発生するリスクが、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％低減される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を示す。

本発明は、樹状細胞（ＤＣ）（対象者または対象者とハプロタイプが一致しているもののいずれかからの）をがん幹細胞／腫瘍スフェアのライセートとインキュベートすることによる、およびそれによりがんワクチンを得る、がんワクチンを製造する方法も提供する。特定の実施形態では、ワクチンは、任意の適当な医薬的に許容される賦形剤を含むアジュバント設定で対象に投与することができる。

特定の実施形態では、ＣＳＣおよび腫瘍スフェア由来のエクソソームおよび他の細胞外小胞を、自家または同種（ハプロタイプ一致）の樹状細胞（ＤＣ）をＣＳＣまたは腫瘍スフェア由来のエクソソームおよび他の細胞外小胞でパルスすることにより腫瘍ワクチンとして用いることができる。特定の実施形態では、エクソソームおよび他の細胞外小胞は、ＤＣによって取り込まれ、ＤＣ中でＣＤ１１ｃ、ＭＨＣＩＩおよびＩＬ１２を含むがこれらに限定されない分子の発現を誘導する。

医薬組成物
本明細書で使用される用語「担体」または「賦形剤」は、有効成分でない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される用語「医薬的に許容される担体」は、任意の種類の非毒性の、不活性な固体の、半固体の、液体の充填剤、希釈剤、封入材料、製剤助剤、または単純に生理食塩水などの、滅菌水性媒質を指す。医薬的に許容される担体として機能しうる材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン類、セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース誘導体；トラガカント末；麦芽、ゼラチン、タルク；カカオバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；ピーナツ油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油および大豆油などのオイル；プロピレングリコールなどのグリコール類、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張生理食塩水、リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤中で用いられる他の非毒性の適合物質である。本明細書において担体として機能しうる物質の非限定的な例としては、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、トラガカント末、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、カカオバター（坐剤基剤）、乳化剤、ならびに他の医薬製剤中で用いられる他の非毒性の医薬的に適合した物質が挙げられる。湿潤剤およびラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、ならびに着色剤、着香剤、賦形剤、安定化剤、酸化防止剤、および防腐剤も存在してよい。任意の非毒性で、不活性な、かつ有効な担体を用いて本明細書で想到される組成物を配合できる。この点に関して適当な医薬的に許容される担体、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、以下の文献、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｕｄａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．（２００１）； ｔｈｅ ＣＴＦＡ （Ｃｏｓｍｅｔｉｃ， Ｔｏｉｌｅｔｒｙ， ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００４）； およびｔｈｅ ’’Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ，’’ Ｕ．Ｓ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ （ＦＤＡ） Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＣＤＥＲ） Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ， に記載されるものなどであり、これらの文献はいずれもその全容にわたって本明細書に援用される。本組成物において有用な、医薬的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、およびＤＭＳＯが挙げられる。これらの更なる不活性成分、ならびに有効な配合および投与手順は、当該技術分野で周知であり、それぞれがその全容にわたって本明細書に援用されるＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （１９９０）； および Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ｓｔ Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， （２００５）などの標準的な教科書に記載される。本明細書に記載される組成物は、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放性粒子、および血清中のペプチドまたはポリペプチドの半減期を延ばす他のビヒクルなどの人工的に形成された構造体中に包含されてもよい。リポソームとしては、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられる。本明細書に記載されるペプチドと使用するためのリポソームは、一般的に中性および負に帯電したリン脂質とコレステロールなどのステロールとを含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、リポソームの粒径および血液中での安定性を考慮して決定される。リポソームを調製するためのさまざまな方法があり、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに概説される。米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号も参照されたい。

担体は、全体で、約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％の本明細書に示される医薬組成物を含んでよい。

分子および細胞生化学における一般的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）； Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄ． （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）； Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）； Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）； Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ｉ． Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）； およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書に見ることができる。

本発明を更に説明するのに先立って、本発明は記載される特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、本発明は無論のこと、幅広く異なりうる。本明細書で使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明するためのものであり、限定することを目的としたものではないことも理解されるべきであり、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。

値の範囲が与えられる場合、文脈上、そうでない旨が明らかに示されないかぎり、下限値の単位の１／１０までの値、その範囲の上限値と下限値との間のそれぞれの間の値、およびその記載された範囲内の他のすべての記載された値または間の値は、本発明に包含されると理解されたい。これらのより狭い範囲の上限値および下限値は、そのより狭い範囲に独立して含まれてよく、記載される範囲内のすべての具体的に除外された範囲を除き、本発明にやはり包含される。記載される範囲が一方または両方の限界値を含む場合、これらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。

本明細書では、「約」なる語がその前に付された数値によって特定の範囲が示される。本明細書で用いる語「約」は、この語が付される数値そのものだけでなく、この語が付される数値に近い数値、またはおよそのその数値に対する文字どおりの支持を与えるためのものである。ある数値が具体的に記載される数値に近いかまたは概ねその数値であるかどうかを決定するうえで、その近い、または概ねの記載されていない数値は、それが示される文脈において、具体的に記載される数値と実質的に同等の値を与える数値でありうる。

別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書において、また付属の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明確に示されないかぎり、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」への言及は複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」への言及は１以上のポリペプチドおよび当業者に周知のその同等物への言及を含む、などである。請求項は、あらゆる任意選択的な要素を除外するように起草される場合もあることにも留意されたい。この点、この記載は、請求項の要素の記載と併せて「〜だけの」、「〜のみ」などの除外的な語の使用に対する、または「否定による」限定の使用に対する先行詞としての役割を有するものである。

説明を分かりやすくする目的で別々の実施形態に関連して記載される本発明の特定の要素は、単一の実施形態として組み合わせて提供することもできる。その反対に、説明を簡単にする目的で単一の実施形態に関連して記載される本明細書の異なる要素は、個別に、または任意の適当な部分的組み合わせとして提供することもできる。発明に関する各実施形態のすべての組み合わせは本発明によって明確に包含されており、恰もあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているのと同様にして本明細書に開示される。更に、異なる実施形態およびそれらの要素の部分的な組み合わせのすべても、本発明によって明確に包含されており、恰もあらゆるそのような部分的な組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているのと同様にして本明細書に開示される。

本発明の更なる目的、効果、および新規な特徴は、限定を目的としない以下の実施例を検討することで当業者には明らかとなろう。更に、上に述べ、以下の特許請求の範囲の項で特許請求される本発明の異なる実施形態および態様のそれぞれについて、以下の実施例で実験的な支持を与える。

実施例
一般的に、本明細書で使用する命名法および本発明で用いられる実験手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。かかる技術は文献で充分に説明される。例えば以下を参照されたい：’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’’ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）； ’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’ Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ． Ｍ．， ｅｄ． （１９９４）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８９）； Ｐｅｒｂａｌ， ’’Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’’， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）； Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ’’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ’’， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） ’’Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ’’， Ｖｏｌｓ． １−４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）； 米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載される方法；’’Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ’’， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （１９９４）； ’’Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ − Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ’’ ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９９４）， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ； ’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’ Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （１９９４）； （ｅｄｓ）， ’’Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’ （８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ （１９９４）； Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ （ｅｄｓ）， ’’Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）； 利用可能なイムノアッセイは、特許文献および科学文献に広く記載される。例えば以下を参照されたい：米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；’’Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’’ Ｇａｉｔ， Ｍ． Ｊ．， ｅｄ． （１９８４）； ’’Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ’’ Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ． （１９８５）； ’’Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ’’ Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ． （１９８４）； ’’Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ’’ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ． Ｉ．， ｅｄ． （１９８６）； ’’Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ’’ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）； ’’Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’’ Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， （１９８４） ａｎｄ ’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’’ Ｖｏｌ． １−３１７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； ’’ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）； Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．， ’’Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ’’ ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）；これらの文献をいずれも援用する。他の一般的な参考文献は本文書全体を通じて示される。

実施例１ 各種の腫瘍からのがん幹細胞の作製
天然の腫瘍細胞は、特定の条件下で幹細胞特性を獲得でき、その中に上皮／間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔ）（ＥＭＴ）と呼ばれるプロセスがある。腫瘍細胞は、下に述べるような様々な条件下で幹細胞様細胞へと能動的に「脱分化」もされうる。

スフェロイドを作製し、分化した腫瘍細胞にがん幹細胞表現型を獲得させる様々な方法が知られている。機械的なアプローチは、細胞反発性基材上に細胞を播くこと、回転式細胞培養容器またはスピナーフラスコ中で継続的に揺動しながら培養すること、および生物学的に不活性な３Ｄゲル中に捕捉することを含む。更に、ハンギングドロップ法を含む市販の培養システムがある。

更に、自然に存在するがん幹細胞（ＣＳＣ）を腫瘍試料から分離し精製できる。これらの細胞は、低接着性プレートで増殖因子の添加を伴う培養で増殖させることができる。

ＣＳＣをインビトロで作製するため、初代培養分化がん細胞（初代培養グリオーマ細胞）およびがん細胞株（Ｕ８７細胞）からの細胞を得た。グリオーマ細胞およびＵ８７細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＣＳ含有培地で３回洗った。細胞を次いでｐＨ６．０にした培地中に再懸濁し、ローテータ−に載せて４５〜９０分インキュベートした。細胞をその後、ＥＧＦおよびＦＧＦを添加した培地中でインキュベートした。細胞をこの２回目のインキュベーションの間、必要に応じて軽度の低酸素条件下（２〜３％酸素）に維持しその後細菌プレート上に播種した。

腫瘍スフェアが１週間以内にこれらのプレート上に形成し、それらをディッシュに付着した細胞から分離した。腫瘍スフェアをばらばらにし、細胞を限界希釈により再播種して二次スフェロイドを形成させた。二次腫瘍スフェアをその後、ＣＳＣ特異的マーカー、自己再生能および親腫瘍を再現する腫瘍を形成する能力について特性評価した。

図１に見られるように、ｐＨ６で１時間インキュベートした後、酸素濃度３％で表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦＢ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２回目のインキュベーションを行った細胞は、幹細胞マーカーＳｏｘ２、Ｏｃｔ４およびＫｌｆ４の発現が上昇した二次腫瘍スフェアを形成した。２人の異なる対象者からの初代培養グリオーマ細胞を使用し、３群のＣＳＣのすべてがコントロールの非処理細胞と比較して少なくとも３倍の発現上昇を示した（ｐ＜０．００１）。

同様の処理を次いで、９種類の他のがん細胞株で繰り返した。脳、乳房、甲状腺、肺、および膵臓を含む、異なる組織からの細胞株を使用した。転移株および非転移株、ならびにｐ５３陽性および陰性細胞株を使用した。すべての良好な細胞株が、二次腫瘍スフェアの形成によって示されるＣＳＣを生じた（図２）。

実施例２ 作製されたＣＳＣはマウスで腫瘍を再現できる
新たに作製されたＣＳＣが、自然に存在するＣＳＣと同様に新しい腫瘍を形成できるかどうかを調べるため、２つの神経膠芽腫細胞株と２つの初代培養グリオーマ細胞の試料を上で述べたように処理してＣＳＣ二次腫瘍スフェアを作製した。各ＣＳＣ培養物からの、および非処理細胞培養物からの２００，０００個の細胞をヌードマウスの頭蓋内に移植した。移植３０日後に腫瘍体積を測定した（図３）。結果を、各非処理試料により形成された腫瘍のサイズを１に標準化して、示す。ＣＳＣを移植したマウスでコントロール細胞と比較して有意に大きな腫瘍が認められ（ｐ＜０．００１）、Ｕ８７細胞および初代培養試料の一方の両方で５倍よりも大きな腫瘍を生じた。

実施例３ ＣＳＣを作製するための更なる因子：サイトカイン
ＣＳＣを作製するための基本プロトコール（酸、ＥＧＦ／ＦＧＦ、および２回のスフェア形成）が成功したことを踏まえ、このプロトコールへのいくつかの改変を検討した。第一に、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＭｙｃプロモーターの制御下でＧＦＰまたはＲＦＰなどの幹細胞レポーターコンストラクトで細胞をトランスフェクトまたは形質移入した後ＦＡＣＳ選別を行うことがＣＳＣの純度を高めるうえで有用であることが見出された（データは示さず）。第二に、ＥＧＦおよびＦＧＦを含有する培地に添加された場合に、生じるＣＳＣの数を増やすことによりまたは生じるＣＳＣの幹細胞性を高めることにより、上記のプロトコールの効率を高める、さまざまな因子が見つかった。

７種類の異なるサイトカインを、第２のインキュベーション培地への添加物質として試験した。７種類（ＴＧＦＢ、ＴＮＦＡ、ＩＬ６、ＣＴＧＦ、ＳＰＡＲＣ、ＳＤＦ１）のうちの６つが、基本プロトコールと比較して、得られるＣＳＣの自己再生率を高めた（図４Ａ）。６種類すべてが少なくとも４０％、自己再生率を高めた。これらの同じ６種類は、Ｓｏｘ２の全発現量も少なくとも２倍高めた（図４Ｂ）。ＩＬ６は、それが自己再生率の６０％よりも大きな増加、およびＳｏｘ２の発現量の５倍よりも大きな増加を生じたため、最も効果的であるとわかった。いずれの場合も、基本プロトコールは依然として有効であったが、抗炎症性サイトカインＩＬ１０のみ効果が見られなかった。

実施例４ ＣＳＣを作製するための更なる因子：共培養
次に、第２のインキュベーションにおいて他の健康な非がん性細胞との共培養が基本プロトコールを改善するかどうか試験した。第２のインキュベーションを、羊膜または脂肪組織由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはＭ２ミクログリア細胞の存在下で行った。３つの共培養すべては自己再生率を少なくとも４０％高め、脂肪ＭＳＣが最も高い効果を有した（図５Ａ）。ＭＳＣおよびマクロファージの両方がＳｏｘ２の発現量を増大させることも見出され、脂肪ＭＳＣとの共培養はほぼ７倍の増大を生じた（図５Ｂ）。

更に、３つの神経膠芽腫多形分化細胞の試料を、単独で、ミクログリアとまたは羊膜ＭＳＣとともに培養した。３つの試料すべてで、共培養は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、およびＣＤ４４ ｍＲＮＡの発現量の有意な増加をもたらした（図５Ｃ）。

ＭＳＣ、マクロファージ、およびミクログリアはいずれも、細胞をその微小環境下で支持する。更に、これらの細胞のすべては、隣接細胞に影響を及ぼす大きなセクレトームを有する。第２のインキュベーション工程を行うこと、または初代腫瘍スフェアもしくは二次腫瘍スフェアを０．４ミクロンのフィルターおよびこれらの異なる支持細胞を含むトランスウェル中で増殖させることも、基本プロトコールの有効性を高めるのに成功した（データは示さず）。このことは、エクソソームおよび他の分泌因子が、脱分化を促進するうえで重要であることを示唆する。更に、最初の分化がん細胞に対して自家であるＣＤ３４＋造血前駆細胞、循環腫瘍細胞、腫瘍関連線維芽細胞およびＭＳＣなどの他の幹細胞も、共培養した場合に効果的であった。

実施例５ ＣＳＣを作製するための更なる因子：小分子
いくつかの小分子を第２のインキュベーションに添加し、脱分化を促進するそれらの効果について評価した。Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Ｙ−２７６３２）、ＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（トラニルシプロミン）、プロテインキナーゼＣ （ＰＫＣ）活性化因子（ＰＭＡ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ活性化因子（セラミドＣ６）ならびにいくつかのヒストン修飾酵素活性化剤および阻害剤（３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチラート）を試し、すべてが異なる程度に自己再生率を高めることが見出された（図６Ａ）。バルプロ酸、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、およびインスリンも有効であることがわかった（データは示さず）。

ＰＫＣの活性化を更に調べ、ＰＭＡ、ＰＫＣα、およびＰＫＣεがいずれもＳｏｘ２の発現量を高めることがわかった。興味深いことに、ＰＫＣαおよびＰＫＣεはどちらもＰＭＡより有効であった（図６Ｂ）。

実施例５ ＣＳＣを作製するための更なる因子：ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ）などの低分子干渉ＲＮＡの、異所性発現またはこれらのＲＮＡのポリヌクレオチド阻害剤の発現のいずれかによる操作も、ＣＳＣを作製するための基本プロトコールへの有効な追加的手段であった。分化した細胞内の以下のｍｉＲ： ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３１３３、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−４８７、ｍｉＲ−４０９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−４３１、およびｍｉＲ−１５４の異所性発現または増大された発現は、幹細胞性に正の効果を有した。更に、分化した細胞内の以下のｍｉＲ：ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−８３１、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−３１８８、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−３１４１、ｍｉＲ−１２０７、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−２８６１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−３１５５、ｍｉＲ−９２０、ｍｉＲ−４３１０、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−３１７６、ｍｉＲ−１８２５、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−１２３１、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−５０４、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−８９１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１２０８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−１２７５、２０ａ、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−６３６． ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７のポリヌクレオチド阻害剤の発現も幹細胞性に正の効果を有した。図７Ａおよび７Ｂは、基本プロトコールと比較して自己再生率（７Ａ）およびＳｏｘ２の発現量（７Ｂ）を高めた３種類の過剰発現ｍｉＲ（Ｌｉｎ−２８、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−２１）と１種類のポリヌクレオチド阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３１８０）を示す。

いくつかの長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の発現も幹細胞性に対して正の効果を有した。分化した細胞中のＺＥＢ２ＮＡＴ、ＵＣＡ１、Ｚｆｈｘ２ａｓ、７ＳＬ、ａｎｔｉＰｅｇ１１、およびＨ１９の発現はいずれも基本プロトコールを改善した（データは示さず）。

実施例６ ＣＳＣを作製するための更なる因子：転写因子および分泌因子
最後に、幹細胞性またはがんの進行を促進することが知られているいくつかの転写因子および分泌因子を、第２のインキュベーション中に、または腫瘍スフェアの形成中に分化細胞中に導入した。これらの細胞中の、または細胞の培地中のＳＴＡＴ３、ＮＦＫＢ、ＣＥＢＰ／Ｂ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＷＮＴ５Ａ、ＬＩＦ、ＣＯＸ２、またはＲＵＮＸ２の発現は、標準プロトコールによってもたらされる脱分化の効率および浸透度を高めるのに役立った。

更に、分化細胞をＳＰＡＲＣ、抗ＣＤ４４抗体、ＲＴＶＰ１、またはＲＴＶＰ１ｂと接触させた。これは、上に列記した分子で組織培養プレートをコーティングすることにより行った。

実施例７ ３Ｄ培養およびオルガノイドの作製
作製されたＣＳＣを健康な細胞と共培養する実験は、腫瘍の微小環境のより正確な３Ｄモデルを確立するうえでの有用性を実証した。こうしたモデルは基本的には腫瘍オルガノイドであり、ＣＳＣをＭＳＣ、ＣＳＣの由来の組織からの健康な細胞、および腫瘍の分化細胞によって支持することにより、実際の微小環境を形成できる。こうしたオルガノイドは、高スループット薬剤スクリーニングのために、ならびに腫瘍内のシグナル伝達経路の分析および治療と関連するこれらの経路を変化させるうえで特に有用であった。

非がん性細胞の２Ｄ、３Ｄ培養およびオルガノイドも有用な薬剤スクリーニングモデルであった。神経幹細胞（ＮＳＣ）、星状細胞、ミクログリア、オリゴデンドロサイトおよび分化したニューロンなどの健康な細胞は、ｈＴＥＲＴのレンチウイルス発現によって不死化できる。これらの細胞は非発がん性であり、起源細胞の表現型および機能性を維持する。細胞を次に、ＭＳＣ、グリア細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む、支持細胞のさまざまな組み合わせと共培養する。場合により、これらの細胞を、可溶性因子だけを移行させる０．４ミクロンのフィルターを備えたトランスウェルプレートで増殖させる。

これらの細胞を、疾患状態を模倣するために更に変異／編集できる。これは、希少疾病およびレット症候群、家族性ＡＬＳ、パーキンソン病などのより一般的な神経疾患などの一遺伝子障害、または任意の他の単因子遺伝性疾患の研究に特に有用であった。疾患が一般に発現される既に分化した細胞を変異することにより、患者からのＥＳＣまたはｉＰＳＣを成熟ニューロン細胞に分化させる難点を回避できる。更に、ミクログリア細胞はＥＳＣまたはｉＰＳＣを用いて作製することが極めて困難である。

具体的な実施形態の上記の説明によって本発明の一般的な性質が詳らかに明らかとなるため、他者は現時点での知識を応用することで、これらの特定の実施形態を、不要な実験を行うことなく、また一般的概念から逸脱することなく、さまざまな用途に合わせて容易に改変および／または適合することが可能であり、したがって、かかる適合および改変は、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるはずであり、また、理解されることを意図している。本明細書で用いられる語句または用語は、説明を目的としたものであって限定を目的としたものではない点が理解されるべきである。さまざまな開示される機能を実行するための手段、材料、および工程は、発明から逸脱することなくさまざまな代替的形態を有しうる。

本発明をその具体的な実施形態との関連で説明したが、当業者にとって多くの代替例、改変例、および変更例が自明であるであろうことは明白である。したがって、付属の特許請求の範囲の趣旨および広義の範囲に含まれるそのような代替例、改変例、および変更例をすべて包含することが意図される。

Claims (38)

1. がん幹細胞（ＣＳＣ）を作製するための方法であって、
   ａ．分化がん細胞を与えることと、
   ｂ．前記分化がん細胞をｐＨ５〜６．５の第１の培地中でインキュベートすることと、
   ｃ．前記分化がん細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が添加された第２の培地中でインキュベートすること、
   を含み、
   それによりＣＳＣを作製する、方法。
2. 前記分化がん細胞が、対象者由来の原発性腫瘍細胞、がん細胞株の細胞、対象者の血液またはリンパ液由来の循環腫瘍細胞および培養物中で分化したがん細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の培地が、５．８〜６．２のｐＨを有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記第１の培地中でインキュベートすることが、１５〜１２０分間行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記第２の培地が、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＣＴＧＦ、ＳＰＡＲＣ、およびＳＤＦ１からなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む添加物質を更に添加される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記第２の培地が、ＴＧＦ−βを更に添加される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第２の培地でのインキュベーションが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、マクロファージ、ミクログリア、造血前駆細胞、および循環腫瘍細胞からなる群から選択される細胞との共インキュベーションを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記第２の培地でのインキュベーションが、羊水ＭＳＣ、脂肪ＭＳＣ、Ｍ２マクロファージ、およびミクログリアからなる群から選択される細胞との共インキュベーションを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ＭＳＣが、前記分化がん細胞に対して自家である、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記第２の培地が、ヒト線維芽細胞、羊水ＭＳＣ、脂肪ＭＳＣもしくはミクログリアからの条件培地またはエクソソームを更に添加される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記第２の培地が、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ活性化剤、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ） 活性化剤、ヒストン修飾酵素阻害剤、およびヒストン修飾酵素活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の小分子を更に添加される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記第２の培地が、Ｙ−２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、トラニルシプロミン、ＰＭＡ、３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチレート、ＰＫＣα活性化剤、ＰＫＣε活性化剤、セラミドＣ６、バルプロ酸およびインスリンからなる群から選択される小分子を更に添加される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記第２の培地が、Ｙ−２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、トラニルシプロミン、ＰＭＡ、３−デアザネプラノシンＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、４−フェニルブチレート、ＰＫＣα活性化剤およびＰＫＣε活性化剤からなる群から選択される小分子を更に添加される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３１３３、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−４８７、ｍｉＲ−４０９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−４３１、およびｍｉＲ−１５４からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を前記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. Ｌｉｎ−２８、ｍｉＲ−１８２、およびｍｉＲ−２１からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲまたはタンパク質を前記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−８３１、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−３１８８、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−３１４１、ｍｉＲ−１２０７、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−２８６１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−３１５５、ｍｉＲ−９２０、ｍｉＲ−４３１０、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−３１７６、ｍｉＲ−１８２５、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−１２３１、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−５０４、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−８９１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１２０８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−１２７５、２０ａ、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−６３６． ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲにハイブリダイズされる少なくとも１種のポリヌクレオチド阻害剤を前記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. ｍｉＲ−３１８０にハイブリダイズするポリヌクレオチド阻害剤を前記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. ＺＥＢ２ＮＡＴ、ＵＣＡ１、Ｚｆｈｘ２ａｓ、７ＳＬ、ａｎｔｉＰｅｇ１１、およびＨ１９からなる群から選択される長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を前記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. Ｌｉｎ−２８、ＳＴＡＴ３、ＮＦＫＢ、ＣＥＢＰ／Ｂ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＬＩＦ、ＣＯＸ２、ＲＵＮＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を前記分化がん細胞内で異所的に発現させることを更に含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記分化がん細胞に放射線照射することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. （ｉｉ）前記第２の培地中でインキュベートすることが、低酸素状態でインキュベートすることを更に含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記低酸素状態が、２〜４％の酸素である、請求項２１に記載の方法。
23. ｄ．前記分化がん細胞を非接着性プレートでインキュベートすることと初代スフェロイドを選択することとを更に含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 限界希釈で前記スフェロイドからの細胞を再播種して二次スフェロイドを形成することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
25. 作製されたＣＳＣを健康な細胞、それらのエクソソーム、またはそれらの組み合わせと共に培養することを更に含む、前記ＣＳＣを維持するための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記健康な細胞が、前記分化がん細胞と同じ原発組織由来である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記作製されたＣＳＣの発現されおよび分泌されるマーカーを分析することを更に含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 抗がん治療を特定するための方法であって、
    ａ．請求項１〜２７の方法のいずれか１つによって作製されたＣＳＣを提供することと、
    ｂ．前記ＣＳＣに目的の治療を適用することと、
    ｃ．前記ＣＳＣに対する前記目的の治療の少なくとも１つの効果を決定すること、
    を含み、
    それにより抗がん治療を特定する、方法。
29. 前記効果が、前記ＣＳＣの生存率または転移能に対する負の効果である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＣＳＣが、幹細胞レポーター遺伝子を発現する、請求項２８に記載の方法。
31. 前記効果が、前記レポーター遺伝子の発現に対する負の効果である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記治療を適用する前に前記ＣＳＣを免疫不全マウスに投与して異種移植片を作製することを更に含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記ＣＳＣが、前記対象者からの分化がん細胞からまたは前記対象者のがんと同じもしくは同様の変異を有する細胞から作製される、個別化がん治療を要する対象者に個別化がん治療を提供するための、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記対象者からの前記がん細胞が、原発腫瘍細胞または前記対象者の血液、ＣＳＦもしくは他の体液からの循環腫瘍細胞である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記治療の適用後に前記ＣＳＣの発現されおよび分泌されるマーカーを分析することを更に含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. がんワクチンを製造するための方法であって、
    ａ．請求項１〜２７の方法のいずれかによってＣＳＣを作製することと、
    ｂ．樹状細胞を前記ＣＳＣからのライセート、エクソソームまたは細胞外小胞の少なくとも１つと共にインキュベートすることと、
    ｃ．前記樹状細胞を収集すること、
    を含み、
    それによりがんワクチンを製造する、方法。
37. 前記樹状細胞が、前記がんワクチンを要する対象者に対して自家または同種である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記がんワクチンと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物をがんワクチンを要する対象者に投与することを更に含む、請求項３６または３７に記載の方法。
    

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