JP2018508216A - 神経幹細胞を作製する方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
いくつかの実施形態によって、誘導神経幹細胞(iNSC)を産生する方法が本明細書に提供され、その方法は、体細胞を提供するステップと;前記体細胞にSox2をコードしている核酸を導入し(例えば、トランスフェクトまたは形質導入による)、それにより前記細胞にSox2を発現させるステップと;その後前記体細胞を分化転換させ(例えば、神経前駆細胞用培地中で細胞を成長させることによる)、それにより前記誘導神経幹細胞を作製するステップとのうちの1つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、分化転換は、1〜10日間、1〜5日間、1〜3日間、または12〜24時間もしくは48時間実施される。
Description
[関連出願]
本出願は、2015年3月4日出願の米国特許仮出願第62/128,247号の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
本出願は、2015年3月4日出願の米国特許仮出願第62/128,247号の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
脳のがんは、依然として処置が最も難しい腫瘍の1つである。毎年10000人以上の患者が、最も一般的な原発性脳腫瘍である膠芽腫(GBM)と診断される。GBMは、手術および化学放射線治療で一般に処置されるが、現在の処置の選択肢の下では残念ながら疾患は通常致命的である。再発までの平均期間は、わずか6カ月であり、GBM患者は、平均12〜15カ月間しか生存できない。
神経幹細胞(NSC)は、固形およびびまん性GBM沈着物へホーミングする固有の生来の能力を有しており、様々な細胞毒性物質により処理されたNSCが、GBM異種移植片を70〜90%減少させ、担腫瘍マウスの生存を有意に延長することが示されている。脳内にはわずかな数のNSCが天然に存在しているが、それらは皮質内の深部にある。
細胞再プログラムの出現は、細胞治療に新たな道を切り開いたが、制約がある。例えば、繊維芽細胞の、誘導多能性幹細胞(iPSC)への脱分化、その後の所望の治療用細胞型への再分化は時間のかかる過程であり、iPSC生成の効率は低く、移植したiPSCまたはその派生細胞によるがん性奇形腫の形成の点で安全に重大な懸念が残る。
分化転換(TD)は、細胞を、中間iPSC段階を経ることなく異なる系統の分化した体細胞へと直接変換する方法である。TDによるこの直接変換は、iPSC状態と関連する安全上の懸念を取り除き、所望の治療用細胞型をより速く生成できるようになる。
神経幹細胞はTDによって作製され、誘導神経幹細胞(iNSC)と称されてきた。2012年に、Matsuiらは、4つの山中因子を使用してヒト繊維芽細胞をiPSCへと部分的に再プログラムすることにより、h−iNSC生成を20日間で達成し得ることを実証した。h−iNSC生成は、繊維芽細胞においてSox2を発現させることによっても実現されたが、この戦略は、増殖および継代用としてのh−iNSCを得るのに特定のフィーダー細胞上で40日間培養する必要があった。
細胞ベースの治療における使用のために操作されたNSCを、迅速に提供し得る別の方法が依然として必要である。
いくつかの実施形態によって、誘導神経幹細胞(iNSC)を産生する方法が本明細書において提供され、その方法は、以下の1つまたは複数のステップを含むことができる:体細胞を提供するステップと;前記体細胞にSox2をコードしている核酸を(例えば、トランスフェクトまたは形質導入により)導入するステップと、それにより前記細胞にSox2を発現させ;その後、前記体細胞を(例えば、神経前駆細胞用培地中で細胞を成長させることにより)分化転換させるステップと、それにより前記誘導神経幹細胞を作製する。いくつかの実施形態において、分化転換は、1〜10日間、1〜5日間、1〜3日間、または12〜24時間もしくは48時間実施される。
いくつかの実施形態において、前記細胞は、他の分化転換因子をトランスフェクトまたは形質導入されない。
いくつかの実施形態において、前記体細胞は繊維芽細胞(例えば、皮膚繊維芽細胞)である。
いくつかの実施形態において、本方法は、前記体細胞に、Sox2をコードしている前記核酸を含むレンチウイルスベクターを形質導入するステップを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、誘導神経幹細胞に治療薬またはレポータ分子を導入するステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、誘導神経幹細胞を、ヒドロゲルもしくは生分解性足場マトリックスに封入するか、または足場上に播種するステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、それを必要とする対象(例えば、ヒト対象)に前記誘導神経幹細胞を投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって同種異系である。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって同系である。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態において、対象は脳がんの処置を必要としている。
いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって自己由来であり、前記投与は、体細胞を提供する前記ステップの1、2、3または4〜7、10、14または21日後に実施される。
本明細書に教示される誘導神経幹細胞の、脳がんを処置するための使用が、更に提供される。本明細書に教示される誘導神経幹細胞の、脳がんの処置薬の調製における使用も提供される。
本明細書に引用される特許文献の開示の全ては、本明細書に示される開示と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では本発明および添付の請求項の説明において使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上別途明らかな指示がない限り、複数形も同様に含むものとする。
本明細書で使用される「神経幹細胞」とは、ニューロン、アストロサイトおよび/またはオリゴデンドロサイト等の中枢神経系細胞に分化できる多能性細胞のことを指す。
「分化転換」または「分化転換する」は、分化した体細胞が、多能性幹細胞(iPSC)段階を経ることなく異なる系統の分化した体細胞または中間的な多能性体細胞に直接変換される方法である。分化転換は、1つまたは複数の分化転換因子に細胞を曝露するおよび/または所望の細胞型への分化転換を促進する培地中で細胞を成長させることによって実施できる。分化転換の監視は、分化した体細胞および/または幹細胞の指標となるマーカー発現を監視する等、当業者に公知の方法を使用して実行できる。
分化した体細胞は、組織、体液(例えば、血液、尿)等、任意の利用しやすい供給源から採取することができる。いくつかの実施形態において、体細胞は、皮膚繊維芽細胞等の繊維芽細胞である。例えば、皮膚細胞は、例えば同時に行う外科的手順の間に術創の縁から、または独立した手順である伝統的な皮膚パンチを使用して採取することができる。皮膚は、頭皮または前腕由来の収集を含むがこれに限定されない任意の領域から採取することができる。
本明細書に教示されるいくつかの実施形態において、分化転換は、1、2もしくは3〜8、9もしくは10日間、1、2もしくは4〜5、6もしくは7日間、1もしくは2〜3日間、または12〜24、48もしくは72時間実施される。
本明細書では「分化転換因子」は、ある体細胞型の、別の型への直接変換を促進する転写因子等のタンパク質である。例としては、Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Ascl1、Brn2、Myt1l、Olig2、Zic1等があるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、分化転換の方法は、分化転換因子を1つだけ使用する単一因子分化転換である。
「Sox2」は、転写因子であるSoxファミリーのメンバーであり、神経管内の発達細胞および中枢神経系の増殖性前駆細胞において発現される。いくつかの実施形態において、Sox2は、教示される方法において分化転換因子として使用される。いくつかの実施形態において、Sox2を使用して、単一因子分化転換が実施される。
「ネスチン」は、中枢神経系の幹細胞において顕著に発現し、その発現は、分化した中枢神経細胞には一般に存在しない。「GFAP」または「グリア線維性酸性タンパク質」は、アストロサイトを含めた中枢神経系細胞により発現される中間フィラメントタンパク質である。「Tuj−1」または「βIIIチューブリン」は、神経マーカーである。
「Nanog」および「OCT3/4」は、公知の幹細胞マーカーである。
本明細書に教示されるいくつかの実施形態において、分化転換は、フィーダー細胞を使用せずに、例えば神経前駆細胞用培地中で実施される。当業者に公知の通り、フィーダー細胞とは、しばしば細胞成長を支持するための層(例えば、培養ディッシュ上のマウス繊維芽細胞層)として同じ培養ディッシュまたは容器内で成長される追加の細胞である。
本明細書において、「神経前駆細胞用培地」は、神経幹細胞(「誘導」神経幹細胞)への体細胞の分化転換(TD)を促進する1または複数の培地である。いくつかの実施形態において、神経前駆細胞用培地は、成長促進因子および/または栄養混合物を含有する細胞培養培地(例えば、DMEM/F12、MEM/D−バリン、ニューロベーサル培地等、その混合物を含める);ホルモン類、タンパク質、ビタミンおよび/またはアミノ酸を含有する培地補助剤(例えば、N2補助剤、B27補助剤、非必須アミノ酸[NEAA]、L−グルタミン、Glutamax、BSA、インスリン、全てのトランスレチノイン酸等、その混合物を含める);ならびに任意選択で小分子阻害剤(例えば、SB431542[BMP阻害剤]、LDN193189[TGF−β1阻害剤]、CHIR99021[GSK3β阻害剤]等、その混合物を含める)から選択される成分の1つまたは複数を含む。成分は、β−メルカプトエタノール、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、およびcAMPのうちの1つまたは複数を含むこともできる。これら成分のそれぞれの適当な濃度は、当業技術者に公知であり、および/または経験的に決定することができる。成分の濃度例は、以下の実施例2においても提供される。いくつかの実施形態において、神経前駆細胞用培地は、STEMdiff(商標) Neural Induction Medium(STEMCELL[商標] Techologies、Vancouver、British Columbia、カナダ)等、あらかじめ作製された培地である。
いくつかの実施形態において、神経幹細胞にTERT(テロメラーゼ逆転写酵素)を導入して、その寿命を促進し、および/または細胞培養により、増殖による拡大を受ける能力を強化する。いくつかの実施形態において、TERTは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(「hTERT」)である。
本明細書では「処置する」または「処置」とは、がん、神経変性障害または神経外傷等の疾患もしくは障害に罹患した患者に、患者の状態(例えば、1つまたは複数の症状)の改善、疾患の進行の遅延、疾患の出現または再発の遅延等を含めた利益をもたらす任意の型の処置のことを指す。
本発明は、主にヒト対象の処置に関するが、本発明は、動物対象、特に獣医学的目的、ならびに薬物スクリーニングおよび/または薬物開発目的のためにマウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜およびウマ等の哺乳動物対象に実施することもできる。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、対象にとって同種異系または自己由来である。
処置しようとするがんには、脳がんが含まれ、脳がんは原発性であっても続発性であってもよい。「原発性脳がん」は、中枢神経系細胞の頭蓋内がんである。脳がんのタイプには、膠腫(例えば、膠芽腫または多形膠芽腫[GBM])、髄膜腫、髄芽腫、下垂体腺腫および神経鞘腫瘍があるが、これに限定されない。「続発性脳がん」は、身体の他の領域から転移した細胞、例えば、乳がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん等を含む中枢神経系に位置するがんである。
いくつかの実施形態において、本明細書に教示される神経幹細胞に、治療薬、レポータ分子および/または同じものを発現できる核酸を導入(load)する(すなわち、含有させる)。いくつかの実施形態において、治療薬は、タンパク質毒素(例えば、細菌エンドトキシンまたは外毒素)、腫瘍崩壊性ウイルス(例えば、条件付きに複製可能な腫瘍崩壊性アデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス[例えば、HSV1716]、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス等)またはアポトーシス促進性薬剤(例えば、分泌可能な腫瘍壊死因子[TNF]関連アポトーシス誘導リガンド[S−TRAIL])である。例えば、Weissら、WO 19940/16718;Shahら、WO 2014/018113;Martuzaら、WO 2009/148488;Subbiahら、米国特許出願公開第2009/0175826号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、治療薬はインターロイキン、サイトカインまたは抗体等の炎症誘発性タンパク質である。
いくつかの実施形態において、治療薬は、酵素/プロドラッグ治療に有用な酵素(例えば、チミジンキナーゼ[例えば、ガンシクロビルプロドラッグと]、カルボキシルエステラーゼ[例えば、CTP−11と]、シトシンデアミナーゼ等)である。
いくつかの実施形態において、治療薬は、miRNAまたはsiRNA等のRNAi分子である。
いくつかの実施形態において、神経幹細胞に、ナノ粒子/薬物コンジュゲートが導入される。
レポータ分子は当業者に公知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子があるが、これに限定されない。例えば、Pomperら、米国特許出願公開第2013/0263296号を参照のこと。
神経幹細胞への導入は、細胞に、治療用またはレポータタンパク質を産生できる核酸をトランスフェクトする、細胞にウイルスベクターを形質導入する、細胞に治療薬および/またはレポータ分子を脂質に基づいてもしくはポリマーによって導入する等、当業者に公知の方法を使用して達成することができる。
「トランスフェクトする」は、細胞への異種遺伝物質の移入であり、しばしばベクター(すなわち、別の細胞へ外来遺伝物質を運ぶ媒体として使用される分子)を介して行う。真核細胞にトランスフェクトする方法は公知であり、エレクトロポレーション、陽イオン性リポソームに基づく試薬の使用、ナノ粒子ポリマーリポソーム等があり得るが、これに限定されない。
「形質導入する」は、ウイルスによる細胞への異種遺伝物質の移入である。そのようなウイルスベクターは公知であり、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等があり得るが、これに限定されない。
神経幹細胞の投与は、当業者に公知の方法を使用して実行できる。例えば、細胞の頭蓋内投与、好ましくは腫瘍内投与を脳がんの処置に実行することができ、または脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後に腔内投与を実行することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒドロゲルマトリックス(例えば、合成細胞外マトリックス)等のマトリックスに封入される、および/または足場上に播種され、その後その細胞を、例えば頭蓋内に投与または移植することができる。例えば、Shah、PCT特許出願公開WO 2014/035474;Shah、米国特許出願公開第2014/0086907号を参照のこと。それぞれ参照により本明細書の一部をなすものとする。
本発明は、以下の非限定的な例においてより詳細に説明される。
[実施例1:ヒト皮膚細胞の迅速な分化転換]
ヒト皮膚からh−iNSCを迅速に生成する能力により、がんを処置するための患者特異的治療が可能になり得る。他の細胞再プログラム戦略よりもiNSC生成の効率が有意に高く、このことは、多数のh−iNSCを少量の皮膚から生成できることを示唆している。患者特異的派生物は、免疫拒絶を回避して、腫瘍死滅を最大化し、処置を持続させることができる。
ヒト皮膚からh−iNSCを迅速に生成する能力により、がんを処置するための患者特異的治療が可能になり得る。他の細胞再プログラム戦略よりもiNSC生成の効率が有意に高く、このことは、多数のh−iNSCを少量の皮膚から生成できることを示唆している。患者特異的派生物は、免疫拒絶を回避して、腫瘍死滅を最大化し、処置を持続させることができる。
急速進行性がんの患者を処置するには、細胞ベースの薬物担体は速やかに生成されなければならず、h−iNSCは数週間で作製することができる。また、iPSCとは異なり、h−iNSCは、移植後に奇形腫を形成しない。
本研究において、TD由来h−iNSC治療の潜在性を、ヒト患者に対する自己由来GBM治療として調査した。これらの方法は、これまでの方法より6倍速くヒト皮膚をh−iNSCに変換することができ、時間は、GBM患者治療にとって優先事項であることから、これは重要である。この戦略を使用して、細胞毒性物質および光学的レポータで操作した第1のh−iNSCを作製した。リアルタイム分子イメージング、3次元細胞培養および複数のヒトGBM異種移植片モデルの組み合わせを使用して、固形ならびに外科的に切除したGBMに対するh−iNSC治療の運命、腫瘍特異的ホーミングおよび有効性を調査した。
[材料および方法]
<細胞株>
U87、GBM8、GBM4、293Tおよびヒト繊維芽細胞(CCD−1099Sk、他)を、これまでに記載されている通り成長させた(Hingtgenら、Stem Cells 28、832〜841頁、2010年;Wakimotoら、Canser Res 69、3472〜3481頁、2009年)。hTERTおよびSox2をコードしているレンチウイルスベクター(LV)を、Addgene(Cambridge、MA、USA)から購入した。全てのcDNAは、テトラサイクリンプロモーターの制御下にあった。
<細胞株>
U87、GBM8、GBM4、293Tおよびヒト繊維芽細胞(CCD−1099Sk、他)を、これまでに記載されている通り成長させた(Hingtgenら、Stem Cells 28、832〜841頁、2010年;Wakimotoら、Canser Res 69、3472〜3481頁、2009年)。hTERTおよびSox2をコードしているレンチウイルスベクター(LV)を、Addgene(Cambridge、MA、USA)から購入した。全てのcDNAは、テトラサイクリンプロモーターの制御下にあった。
ヒトiNSC(h−iNSC)を、単一因子Sox2、およびフィーダーを含まない方法にしたがって生成した。簡潔には、ヒト繊維芽細胞200000個を6ウェルプレートに播種し、硫酸プロタミン(5μg/mL、Sigma)を含有する培地中にhTERTおよびSox2を含有するLVカクテルを形質導入した。感染2日後に、培地を、ドキシサイクリン(10μg/mL、Sigma、St.Louis、MO、USA)を含有するSTEMdiff(商標) Neural Induction Medium(STEMCELL Technologies、Vancouver、カナダ)と交換した。培地を、3日毎に交換した。神経幹細胞塊形成を、低付着性フラスコ内での培養により誘導した。
<レンチウイルスベクター>
再プログラムベクターに加えて、レンチウイルスベクター:LV−GFP−FL、LV−GFP−RLuc、LV−mC−FL、LV−sTR、LV−diTRおよびLV−mRFP−hRLuc−ttkを、本研究に使用した。GFP−RLucおよびGFP−FLを、ルシフェラーゼ−pcDNA3およびpAC−hRluc(Addgene)ベクターを使用してウミシイタケルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼをコードしているcDNAを増幅することにより、それぞれ構築した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をBglIIおよびSalIで消化し、BglII/SalI消化したpEGFP−C1(Clontech、Mountain View、CA、USA)にフレームを一致させてライゲートした。GFP−FLまたはGFP−RLuc断片をAgeI(平滑化)およびSalIで消化し、BamHI(平滑化)およびXhoIで消化したpTK402(Tal Kafri博士、UNC Gene Therapy Center、により提供された)にライゲートして、LV−GFPFLまたはLV−GFP−RLucを作製した。同様に、mCFLを、ルシフェラーゼ−pcDNA3からホタルルシフェラーゼをコードしているcDNAを増幅し、BglII/SalI消化したmCherry−C1(Clontech)にライゲートし、平滑/XhoI部位を使用してpTK402 LV骨格にmC−FL断片をライゲートすることにより作製した。LV−sTRおよびLV−diTRを作製するために、sTRまたはdiTRをコードしているcDNA配列を、注文合成したオリゴヌクレオチド鋳型(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用してPCR増幅した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をBamH1およびXhoIで消化し、BamH1/XhoI消化したpLVXプラスミドにフレームを一致させてライゲートした。LV−sTRとLV−diTRの両方は、骨格中にIRES−GFP(内部リボソーム侵入部位−緑色蛍光タンパク質)エレメントおよびCMV駆動されるピューロマイシンエレメントを有する。全てのLV構築物を、これまでに記述されている通りヘルパーウイルスを含まないパッケージング系(Sena−Estevesら、Journal of virological methods 122、131〜139頁、2004年)を使用して293T細胞にLVベクターとしてパッケージングした。h−iNSCおよびGBM細胞を、5μg/mL硫酸プロタミン(Sigma)を含有する培養培地中でビリオンをインキュベートすることにより様々な感染多重度(MOI)で、LVを形質導入し、細胞を、蛍光顕微鏡により蛍光タンパク質発現について可視化した。
再プログラムベクターに加えて、レンチウイルスベクター:LV−GFP−FL、LV−GFP−RLuc、LV−mC−FL、LV−sTR、LV−diTRおよびLV−mRFP−hRLuc−ttkを、本研究に使用した。GFP−RLucおよびGFP−FLを、ルシフェラーゼ−pcDNA3およびpAC−hRluc(Addgene)ベクターを使用してウミシイタケルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼをコードしているcDNAを増幅することにより、それぞれ構築した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をBglIIおよびSalIで消化し、BglII/SalI消化したpEGFP−C1(Clontech、Mountain View、CA、USA)にフレームを一致させてライゲートした。GFP−FLまたはGFP−RLuc断片をAgeI(平滑化)およびSalIで消化し、BamHI(平滑化)およびXhoIで消化したpTK402(Tal Kafri博士、UNC Gene Therapy Center、により提供された)にライゲートして、LV−GFPFLまたはLV−GFP−RLucを作製した。同様に、mCFLを、ルシフェラーゼ−pcDNA3からホタルルシフェラーゼをコードしているcDNAを増幅し、BglII/SalI消化したmCherry−C1(Clontech)にライゲートし、平滑/XhoI部位を使用してpTK402 LV骨格にmC−FL断片をライゲートすることにより作製した。LV−sTRおよびLV−diTRを作製するために、sTRまたはdiTRをコードしているcDNA配列を、注文合成したオリゴヌクレオチド鋳型(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用してPCR増幅した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をBamH1およびXhoIで消化し、BamH1/XhoI消化したpLVXプラスミドにフレームを一致させてライゲートした。LV−sTRとLV−diTRの両方は、骨格中にIRES−GFP(内部リボソーム侵入部位−緑色蛍光タンパク質)エレメントおよびCMV駆動されるピューロマイシンエレメントを有する。全てのLV構築物を、これまでに記述されている通りヘルパーウイルスを含まないパッケージング系(Sena−Estevesら、Journal of virological methods 122、131〜139頁、2004年)を使用して293T細胞にLVベクターとしてパッケージングした。h−iNSCおよびGBM細胞を、5μg/mL硫酸プロタミン(Sigma)を含有する培養培地中でビリオンをインキュベートすることにより様々な感染多重度(MOI)で、LVを形質導入し、細胞を、蛍光顕微鏡により蛍光タンパク質発現について可視化した。
<細胞生存率および継代数>
改変したならびに未改変のh−iNSCの増殖および継代数を評価するために、GFP−FL、sTRを発現しているh−iNSCまたは未改変の細胞を、96ウェルプレートに播種した。細胞生存率を、CellTiter−Glo(登録商標)luminescent cell viability kit(Promega)を使用して播種2、3、4、5、8および10日後に評価した。最大継代数を、iNSC、iNSC−sTRまたはWT−NSCが、形態、成長速度もしくは形質導入効率を変えずに二次培養された回数を監視することにより評価した。
改変したならびに未改変のh−iNSCの増殖および継代数を評価するために、GFP−FL、sTRを発現しているh−iNSCまたは未改変の細胞を、96ウェルプレートに播種した。細胞生存率を、CellTiter−Glo(登録商標)luminescent cell viability kit(Promega)を使用して播種2、3、4、5、8および10日後に評価した。最大継代数を、iNSC、iNSC−sTRまたはWT−NSCが、形態、成長速度もしくは形質導入効率を変えずに二次培養された回数を監視することにより評価した。
<免疫組織化学およびインビトロ分化>
h−iNSC分化に対するLV導入の効果を決定するために、h−iNSCをLV−GFP−FLまたはLV−sTRを形質導入した。改変したまたは未改変の細胞を固定し、透過化処理し、抗ネスチンポリクローナル抗体(Millipore、MAB353、1:500、Billerica、MA、USA)と1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、適当な二次抗体(Biotium、Hayward、CA、USA)と1時間インキュベートした。細胞を、その後洗浄し、封入し、蛍光共焦点顕微鏡を使用して撮像した。分化の場合、改変操作したまたは形質導入していないh−iNSCを、ドキシサイクリン、EGFおよびFGFを除いたN3培地中で12日間培養した。細胞を、ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;Millipore、MAB3405、1:250)、またはTuj−1(Sigma、T8578、1:1000)に対して作った抗体でその後染色し、適当な二次抗体(Biotium)で検出した。核を、ヘキスト33342で対比染色し、結果を、FV1200レーザー共焦点顕微鏡(Olympus、Center Valley、PA)を使用して分析した。
h−iNSC分化に対するLV導入の効果を決定するために、h−iNSCをLV−GFP−FLまたはLV−sTRを形質導入した。改変したまたは未改変の細胞を固定し、透過化処理し、抗ネスチンポリクローナル抗体(Millipore、MAB353、1:500、Billerica、MA、USA)と1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、適当な二次抗体(Biotium、Hayward、CA、USA)と1時間インキュベートした。細胞を、その後洗浄し、封入し、蛍光共焦点顕微鏡を使用して撮像した。分化の場合、改変操作したまたは形質導入していないh−iNSCを、ドキシサイクリン、EGFおよびFGFを除いたN3培地中で12日間培養した。細胞を、ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;Millipore、MAB3405、1:250)、またはTuj−1(Sigma、T8578、1:1000)に対して作った抗体でその後染色し、適当な二次抗体(Biotium)で検出した。核を、ヘキスト33342で対比染色し、結果を、FV1200レーザー共焦点顕微鏡(Olympus、Center Valley、PA)を使用して分析した。
<3次元組織培養>
3次元浮遊細胞培養は、Bio−Assembler Kit(Nano3D Biosciences、Houston、TX)を使用して行われた。コンフルエント状態のGBMまたはh−iNSCの6ウェルプレートを、磁気ナノ粒子アセンブリ(8μLcm−2細胞培養表面積または50μLmL−1培地、NanoShuttle[NS]、Nano3D Biosciences)とともに終夜インキュベーションして、ナノ粒子に細胞を結合させた。NSを、酸化鉄および細胞取り込みを促進するためのポリ−l−リシンと架橋した金ナノ粒子を混合することにより製作した。(Souza,G.R.ら 「Three−dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation」 Nat Nanotechnol 5、291頁、2010年)。処理したGBMおよびh−iNSCを、その後トリプシンで分離し、再懸濁し、培地2mLを含む超低付着6ウェルプレート中で異なる比(1:1および1:0.5)で混合した。6ウェルプレートおよびプラスチック中蓋インサート用に設計した磁界強度50Gを持つ6個のネオジム磁石の磁気駆動体をウェルプレートの上に置いて、気相液相界面に細胞を浮遊させた。4μg/mLのGCVを含有する培地を、GBMとttkを発現しているh−iNSCとの共培養に添加した。蛍光画像を経時的に撮影して、両方の集団(あらかじめ、異なる蛍光で標識した)の細胞生存率を追跡した。3次元細胞培養のBLIの場合、Fluc基質貯蔵試薬100μL/ウェルを培地に添加し、IVIS Kinetic Optical System(PerkinElmer)を使用して5分間の取り込み時間で撮像した。画像を処理し、光子放射を、LivingImageソフトウェア(PerkinElmer)を使用して定量化した。
3次元浮遊細胞培養は、Bio−Assembler Kit(Nano3D Biosciences、Houston、TX)を使用して行われた。コンフルエント状態のGBMまたはh−iNSCの6ウェルプレートを、磁気ナノ粒子アセンブリ(8μLcm−2細胞培養表面積または50μLmL−1培地、NanoShuttle[NS]、Nano3D Biosciences)とともに終夜インキュベーションして、ナノ粒子に細胞を結合させた。NSを、酸化鉄および細胞取り込みを促進するためのポリ−l−リシンと架橋した金ナノ粒子を混合することにより製作した。(Souza,G.R.ら 「Three−dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation」 Nat Nanotechnol 5、291頁、2010年)。処理したGBMおよびh−iNSCを、その後トリプシンで分離し、再懸濁し、培地2mLを含む超低付着6ウェルプレート中で異なる比(1:1および1:0.5)で混合した。6ウェルプレートおよびプラスチック中蓋インサート用に設計した磁界強度50Gを持つ6個のネオジム磁石の磁気駆動体をウェルプレートの上に置いて、気相液相界面に細胞を浮遊させた。4μg/mLのGCVを含有する培地を、GBMとttkを発現しているh−iNSCとの共培養に添加した。蛍光画像を経時的に撮影して、両方の集団(あらかじめ、異なる蛍光で標識した)の細胞生存率を追跡した。3次元細胞培養のBLIの場合、Fluc基質貯蔵試薬100μL/ウェルを培地に添加し、IVIS Kinetic Optical System(PerkinElmer)を使用して5分間の取り込み時間で撮像した。画像を処理し、光子放射を、LivingImageソフトウェア(PerkinElmer)を使用して定量化した。
<リアルタイムイメージングおよび運動分析>
遊走を、新規の2次元および3次元培養系で評価した。
遊走を、新規の2次元および3次元培養系で評価した。
<2次元遊走>
RFPを発現しているh−iNSCを、2チャンバー細胞カルチャーインサート(ibidi、Verona、WI、USA)を使用してガラスボトムマイクロウェルディッシュ(MatTek、Ashland、MA、USA)中のマイクロカルチャーインサートに播種した。GFPを発現しているU87膠腫細胞を隣接するウェル(0.5mm距離間隔)に平板培養したか、またはウェルを空のままにした。平板培養の24時間後に、細胞をVivaView生細胞イメージングシステム(Olympus)内に置き、平衡化させた。インサートを取り外し、細胞を、3つの独立した実験においてウェル当たり6箇所で(充分な細胞数を監視するため)、10×倍率で20分毎に36時間撮像した。NIH Imageをその後使用して動画を生成し、両方で遊走速度、遊走した総距離、および遊走の指向性を決定した。
RFPを発現しているh−iNSCを、2チャンバー細胞カルチャーインサート(ibidi、Verona、WI、USA)を使用してガラスボトムマイクロウェルディッシュ(MatTek、Ashland、MA、USA)中のマイクロカルチャーインサートに播種した。GFPを発現しているU87膠腫細胞を隣接するウェル(0.5mm距離間隔)に平板培養したか、またはウェルを空のままにした。平板培養の24時間後に、細胞をVivaView生細胞イメージングシステム(Olympus)内に置き、平衡化させた。インサートを取り外し、細胞を、3つの独立した実験においてウェル当たり6箇所で(充分な細胞数を監視するため)、10×倍率で20分毎に36時間撮像した。NIH Imageをその後使用して動画を生成し、両方で遊走速度、遊走した総距離、および遊走の指向性を決定した。
<3次元遊走>
GBMスフェロイドへのh−iNSC遊走を、上記の浮遊培養を使用してh−iNSCおよびGBMスフェロイドを作製することにより3次元培養系で評価した。h−iNSCおよびGBMスフェロイドを、浮遊系で共培養した。リアルタイムイメージングを実行して、浮遊培養でのh−iNSCによるGBMスフェロイドの侵入を可視化した。
GBMスフェロイドへのh−iNSC遊走を、上記の浮遊培養を使用してh−iNSCおよびGBMスフェロイドを作製することにより3次元培養系で評価した。h−iNSCおよびGBMスフェロイドを、浮遊系で共培養した。リアルタイムイメージングを実行して、浮遊培養でのh−iNSCによるGBMスフェロイドの侵入を可視化した。
<共培養生存率アッセイ>
sTRまたは対照GFP−RLを発現しているmNSC(5×103個)を、96ウェルプレートに播種した。24時間後に、U87−mC−FL、LN18−mC−FLまたはGBM8−mC−FLヒトGBM細胞(5×103個)を、ウェルに播種し、GBM細胞生存率を、定量的インビトロ生物発光イメージングにより24時間後に測定した。また、GBM細胞を、カスパーゼ3/7で活性化可能なケージドDEVD−アミノルシフェリン(カスパーゼ−Glo 3/7、Promega、Madison、WI、USA)により、18時間の時点でのカスパーゼ3/7活性について評価した。
sTRまたは対照GFP−RLを発現しているmNSC(5×103個)を、96ウェルプレートに播種した。24時間後に、U87−mC−FL、LN18−mC−FLまたはGBM8−mC−FLヒトGBM細胞(5×103個)を、ウェルに播種し、GBM細胞生存率を、定量的インビトロ生物発光イメージングにより24時間後に測定した。また、GBM細胞を、カスパーゼ3/7で活性化可能なケージドDEVD−アミノルシフェリン(カスパーゼ−Glo 3/7、Promega、Madison、WI、USA)により、18時間の時点でのカスパーゼ3/7活性について評価した。
<インビボでのh−iNSC生存および運命>
インビボでのh−iNSCの生存を決定するために、mCherryFLを発現しているh−iNSC(7.5×106個細胞/マウス)をPBSに懸濁し、マウスの右前頭葉において定位に移植した(n=7)。h−iNSC生存を、20日間実行した連続生物発光イメージングによって決定した。細胞の解像度でh−iNSCの運命を決定するために、動物を移植21日後に屠殺し、脳を摘出し、切片にした。組織切片を、ネスチン、GFAP、Tuj−1、Oct−4およびTRA−160に対する抗体で染色し、CF(商標)488で標識した二次抗体を使用して可視化した。
インビボでのh−iNSCの生存を決定するために、mCherryFLを発現しているh−iNSC(7.5×106個細胞/マウス)をPBSに懸濁し、マウスの右前頭葉において定位に移植した(n=7)。h−iNSC生存を、20日間実行した連続生物発光イメージングによって決定した。細胞の解像度でh−iNSCの運命を決定するために、動物を移植21日後に屠殺し、脳を摘出し、切片にした。組織切片を、ネスチン、GFAP、Tuj−1、Oct−4およびTRA−160に対する抗体で染色し、CF(商標)488で標識した二次抗体を使用して可視化した。
<共培養生存率アッセイ>
3次元浮遊培養を、3つの別々のインビトロ細胞毒性研究に使用した。2つの異なる細胞毒性物質を発現しているh−iNSCを使用して、確立したGBM細胞株(U87)1つと、患者由来のGBM株(GBM4、GBM8)2つを処置した。1)TRAIL治療の細胞毒性を決定するために、h−iNSC−sTRまたはh−iNSC−mCherryのスフェロイドを、iNSC:GBM比=1:2または1:1で、U87−GFP−FLucスフェロイドと浮遊状態で共培養した。GBMスフェロイドの生存率を、FLucイメージングにより48時間後に決定した。2)患者由来GBMに対するプロドラッグ酵素治療の細胞毒性を決定するために、h−iNSC−TKスフェロイドを、患者由来GBM4−GFP−FLucスフェロイドと浮遊状態で共培養、またはスフェロイド形成前にGBM細胞と混合した。スフェロイドを、ガンシクロビル(GCV)の存在下または不在下で培養し、GBMスフェロイド生存率を、FLucイメージングによりプロドラッグ添加0、2、4または7日後に決定した。3)sECMに封入されたiNSCプロドラッグ/酵素治療の細胞毒性を決定するために、h−iNSC−TKをsECM内に封入し、患者由来GBM8−GFP−FLucスフェロイドと共に浮遊培養系に置いた。生存率を、FLucイメージングにより決定した。
3次元浮遊培養を、3つの別々のインビトロ細胞毒性研究に使用した。2つの異なる細胞毒性物質を発現しているh−iNSCを使用して、確立したGBM細胞株(U87)1つと、患者由来のGBM株(GBM4、GBM8)2つを処置した。1)TRAIL治療の細胞毒性を決定するために、h−iNSC−sTRまたはh−iNSC−mCherryのスフェロイドを、iNSC:GBM比=1:2または1:1で、U87−GFP−FLucスフェロイドと浮遊状態で共培養した。GBMスフェロイドの生存率を、FLucイメージングにより48時間後に決定した。2)患者由来GBMに対するプロドラッグ酵素治療の細胞毒性を決定するために、h−iNSC−TKスフェロイドを、患者由来GBM4−GFP−FLucスフェロイドと浮遊状態で共培養、またはスフェロイド形成前にGBM細胞と混合した。スフェロイドを、ガンシクロビル(GCV)の存在下または不在下で培養し、GBMスフェロイド生存率を、FLucイメージングによりプロドラッグ添加0、2、4または7日後に決定した。3)sECMに封入されたiNSCプロドラッグ/酵素治療の細胞毒性を決定するために、h−iNSC−TKをsECM内に封入し、患者由来GBM8−GFP−FLucスフェロイドと共に浮遊培養系に置いた。生存率を、FLucイメージングにより決定した。
<インビボでのh−iNSC治療の抗GBM有効性>
異なる3つの異種移植片研究を実行して、h−iNSC治療の抗GBM効果を評価した。h−iNSC−sTRおよびh−iNSC−TK治療を、固形(U87)、患者由来のびまん性(GBM8)、および外科的に切除した患者由来(GBM4)異種移植片モデルに対して試験した。
異なる3つの異種移植片研究を実行して、h−iNSC治療の抗GBM効果を評価した。h−iNSC−sTRおよびh−iNSC−TK治療を、固形(U87)、患者由来のびまん性(GBM8)、および外科的に切除した患者由来(GBM4)異種移植片モデルに対して試験した。
1)固形ヒトU87腫瘍に対するh−iNSC−TRAILの治療効果を決定するために、h−iNSC−TRAILまたはiNSC−GFP−RLuc(7.5×105個細胞/マウス)の組み合わせを、U87−mC−FL細胞(1×106個細胞/マウス)と一緒にマウスの右前頭葉において定位に移植した(n=7)。治療応答を、前述の通りFL生物発光イメージングで腫瘍体積を追跡することによりその後決定した。簡潔には、マウスにD−ルシフェリン(生理食塩水150μL中に4.5mg/マウス)を腹腔内注射し、5分後に光子放射を、IVIS Kinetic Optical System(PerkinElmer)を使用して5分間の取り込み時間で決定した。画像を処理し、光子放射を、LivingImageソフトウェア(PerkinElmer)を使用して定量化した。更に、マウスを、生存について経時的に追跡した。
2)侵襲性の患者由来GBMに対するh−iNSCプロドラッグ/酵素治療の有効性を調査するために、マウスに、mC−FLを発現しているGBM8細胞(1.5×105個細胞/マウス)を右前頭葉において定位に移植した。3日後に、h−iNSC−TK(n=7、7.5×105個細胞/マウス)またはh−iNSC−mRFP−hRLuc(n=7、7.5×105個細胞/マウス)を、腫瘍移植部位に移植した。GCVを、100mg/kgの用量で2週間毎日腹腔内に注射した。腫瘍体積の変化を、上記の通りFLucイメージングにより評価し、マウスを生存について経時的に追跡した。
3)術後のわずかなGBMに対するh−iNSC治療の有効性を決定するために、これまでに報告されている戦略にしたがってマウスにおいて画像誘導GBM切除を実行した。患者由来GBM8−GFP−FLucを、80%集密度で回収し、右前頭葉において定位(ブレグマの横2mmおよび硬膜から0.5mm)に移植した(5×105個細胞)。定位枠に固定した後、マウスを、Olympus MVX−10顕微鏡下に置いた。手術中の顕微白色光、GFPおよびRFP画像を、Hamamatsu ORCA 03G CCD(高分解能)カメラおよびソフトウェア(Olympus)を使用して手順の全体を通じて取り込んだ。正中切開を、頭蓋骨上の皮膚に加え、マウスの頭蓋を露出させた。頭蓋内異種移植片を、GFP蛍光を使用して同定した。腫瘍を覆っている頭蓋骨のごく一部を、骨ドリルおよび鉗子を使用して外科的に除去し、被っている硬膜を、皮質表面から穏やかにはがし、腫瘍を露出させた。GFP蛍光下で、GBM8−GFPFL腫瘍を、外科的切開と吸引の組み合わせを使用して外科的に切除し、GFPの画像を継続的に取り込んで、GFP誘導外科的切除の精度を評価した。腫瘍除去後、得られた切除腔を十分に洗い流し、皮膚を7−0バイクリル縫合糸で閉じた。手順に関連する死亡数は観察されなかった。全ての実験プロトコルは、ノースカロライナ大学Chapel Hillの動物実験委員会により承認されており、マウスの飼育は、米国国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針、USDA規則、および米国獣医師会により示される基準にしたがった。外科的切除の後、h−iNSC−TKまたはh−iNSC−mC−FL(5×105個細胞)を、ヒアルロン酸sECMヒドロゲル(Sigma)に封入し、手術後のGBM腔に移植した。GBMの再発を、上記の通りFLucイメージングにより可視化し、マウスを生存について追跡した。
<組織処理>
最後のイメージングセッションの直後に、マウスを屠殺し、ホルマリンで潅流し、脳を摘出した。組織を、ホルマリンに直ちに浸漬した。30μmの冠状切片を、振動ミクロトーム(Fisher Waltham、MA、USA)を使用して生成した。ネスチン、GFAPおよびTuj−1染色の場合、切片を、ブロッキング溶液(0.3%BSA、8%ヤギ血清および0.3%トライトンX−100)中で、室温で1時間インキュベートし、その後ブロッキング溶液に希釈した一次抗体(1)抗ヒトネスチン(Millipore)、(2)抗GFAP(Millipore)、(3)抗TRAIL(ProSci、Poway、CA)および(4)抗Tuj−1(Sigma)と4℃で終夜インキュベートした。切片を、PBSで3回洗浄し、適当な二次抗体中でインキュベートし、共焦点顕微鏡(Olympus)を使用して可視化した。
最後のイメージングセッションの直後に、マウスを屠殺し、ホルマリンで潅流し、脳を摘出した。組織を、ホルマリンに直ちに浸漬した。30μmの冠状切片を、振動ミクロトーム(Fisher Waltham、MA、USA)を使用して生成した。ネスチン、GFAPおよびTuj−1染色の場合、切片を、ブロッキング溶液(0.3%BSA、8%ヤギ血清および0.3%トライトンX−100)中で、室温で1時間インキュベートし、その後ブロッキング溶液に希釈した一次抗体(1)抗ヒトネスチン(Millipore)、(2)抗GFAP(Millipore)、(3)抗TRAIL(ProSci、Poway、CA)および(4)抗Tuj−1(Sigma)と4℃で終夜インキュベートした。切片を、PBSで3回洗浄し、適当な二次抗体中でインキュベートし、共焦点顕微鏡(Olympus)を使用して可視化した。
[結果]
<ヒト繊維芽細胞の、h−iNSCへの迅速な分化転換>
h−iNSC治療の迅速かつ効果的な生成は、侵襲性がんの患者を処置するために必須である。新たな戦略として、ヒト繊維芽細胞に、Sox2を形質導入し、フィーダー細胞なしでh−iNSC生成を実行した。次いで、光学的レポータを発現する診断用h−iNSCまたは異なる細胞毒性物質を発現する治療用h−iNSCを生成した(図1A)。最初に、フィーダーを含まない/Sox2戦略を使用してh−iNSCを生成する動態を評価した。ヒト繊維芽細胞に、Sox2を形質導入し、NSC誘導培地中で培養した(図1B)。細胞形態の変化を、Sox2発現を活性化している48時間内で観察した。更に、広範なネスチン発現を検出し、h−iNSCは神経幹細胞塊形成を形成することができた。定量化は、h−iNSCにおけるネスチン発現が、2日目から10日目まで一定のままであることを示した(図1C)。分化を誘導したとき、h−iNSCは、アストロサイトマーカーGFAPおよび神経マーカーTuj−1を発現した。染色により、細胞が、多能性マーカーTRA−160またはOCT4を発現しないことが明らかになった(図1D)。これらの発見を、RT−PCR分析により確認した(図1E)。h−iNSCは、親繊維芽細胞またはヒトiPSC(h−iPSC)にはない高レベルのネスチン発現を示した。Sox2過剰発現を使用してh−iNSCとh−iPSCの両方の細胞株を生成したので、Sox2発現は、h−iNSCとh−iPSC両方で高かった。h−iPSCとは異なり、h−iNSCは、多能性マーカーNanogまたはOCT3/4を高レベルで発現しなかった。全体として、これらのデータは、単一因子Sox2発現を使用して48時間以内に多能性h−iNSCを作製する能力を実証している。
<ヒト繊維芽細胞の、h−iNSCへの迅速な分化転換>
h−iNSC治療の迅速かつ効果的な生成は、侵襲性がんの患者を処置するために必須である。新たな戦略として、ヒト繊維芽細胞に、Sox2を形質導入し、フィーダー細胞なしでh−iNSC生成を実行した。次いで、光学的レポータを発現する診断用h−iNSCまたは異なる細胞毒性物質を発現する治療用h−iNSCを生成した(図1A)。最初に、フィーダーを含まない/Sox2戦略を使用してh−iNSCを生成する動態を評価した。ヒト繊維芽細胞に、Sox2を形質導入し、NSC誘導培地中で培養した(図1B)。細胞形態の変化を、Sox2発現を活性化している48時間内で観察した。更に、広範なネスチン発現を検出し、h−iNSCは神経幹細胞塊形成を形成することができた。定量化は、h−iNSCにおけるネスチン発現が、2日目から10日目まで一定のままであることを示した(図1C)。分化を誘導したとき、h−iNSCは、アストロサイトマーカーGFAPおよび神経マーカーTuj−1を発現した。染色により、細胞が、多能性マーカーTRA−160またはOCT4を発現しないことが明らかになった(図1D)。これらの発見を、RT−PCR分析により確認した(図1E)。h−iNSCは、親繊維芽細胞またはヒトiPSC(h−iPSC)にはない高レベルのネスチン発現を示した。Sox2過剰発現を使用してh−iNSCとh−iPSCの両方の細胞株を生成したので、Sox2発現は、h−iNSCとh−iPSC両方で高かった。h−iPSCとは異なり、h−iNSCは、多能性マーカーNanogまたはOCT3/4を高レベルで発現しなかった。全体として、これらのデータは、単一因子Sox2発現を使用して48時間以内に多能性h−iNSCを作製する能力を実証している。
<h−iNSCは、選択的にGBMへ遊走する>
固形および侵襲性GBM沈着物にホーミングする能力は、NSCに基づくがん治療で最も有益な特性の1つである。h−iNSCの腫瘍向性の性質を調査するために、ヒトGBM細胞と共培養したh−iNSCのリアルタイム運動分析を使用した(図2Aに概説した)。参照のために、h−iNSC遊走を、それを得たヒト親繊維芽細胞と比較した。h−iNSCが、共培養したGBM細胞の方へ迅速に遊走し、22時間で500μmの空隙を覆うことが判明した(図2B)。単一細胞の遊走経路分析は、GBM細胞の存在が、h−iNSCを共培養しているGBM細胞の方への選択的遊走に誘導することを示した(図2C)。対照的に、ヒト繊維芽細胞は、ごくわずかな遊走しか実証しなかった(図2B)。ヒト繊維芽細胞の単一細胞遊走分析では、共培養したGBM細胞の方へごくわずかに移動するランダムな遊走パターンしか確認されなかった(図2C)。h−iNSCの遊走の指向性を、完全な単一方向の運動が1.0の比を与え、完全に無指向性の運動が0.0の比を与えるようにユークリッド距離と全体の累積距離の比を算出することにより分析した。この分析を使用して、ヒト繊維芽細胞(0.28)よりh−iNSCで有意に高い(0.65)平均指向性比を算出した(図2D)。単一細胞遊走パターンの更なる分析により、ヒト繊維芽細胞(200μm)と比較してh−iNSCにより遊走された有意に増加した平均ユークリッド距離(340μm)が実証された(図2E)。h−iNSCによる平均細胞速度は、ヒト繊維芽細胞と比較してより低かった(0.4対0.62)(図2F)。最後に、3次元遊走アッセイを実行して、h−iNSCの、GBM病巣へのインビボ遊走を模倣した。mCherry+h−iNSCスフェロイドを、GFP+GBMスフェロイドと共培養し、両方の細胞型を、磁力を使用して浮遊させた(図2G)。h−iNSCが、播種の数時間以内にGBMスフェロイドに侵入し始めることを発見した。h−iNSCスフェロイドは、GBMスフェロイドに侵入し続け、8日以内に広範囲に共局在化した。全体として、これらの観察は、h−iNSCが腫瘍向性特性を保有し、GBM細胞にホーミングするという結論を支持している。
固形および侵襲性GBM沈着物にホーミングする能力は、NSCに基づくがん治療で最も有益な特性の1つである。h−iNSCの腫瘍向性の性質を調査するために、ヒトGBM細胞と共培養したh−iNSCのリアルタイム運動分析を使用した(図2Aに概説した)。参照のために、h−iNSC遊走を、それを得たヒト親繊維芽細胞と比較した。h−iNSCが、共培養したGBM細胞の方へ迅速に遊走し、22時間で500μmの空隙を覆うことが判明した(図2B)。単一細胞の遊走経路分析は、GBM細胞の存在が、h−iNSCを共培養しているGBM細胞の方への選択的遊走に誘導することを示した(図2C)。対照的に、ヒト繊維芽細胞は、ごくわずかな遊走しか実証しなかった(図2B)。ヒト繊維芽細胞の単一細胞遊走分析では、共培養したGBM細胞の方へごくわずかに移動するランダムな遊走パターンしか確認されなかった(図2C)。h−iNSCの遊走の指向性を、完全な単一方向の運動が1.0の比を与え、完全に無指向性の運動が0.0の比を与えるようにユークリッド距離と全体の累積距離の比を算出することにより分析した。この分析を使用して、ヒト繊維芽細胞(0.28)よりh−iNSCで有意に高い(0.65)平均指向性比を算出した(図2D)。単一細胞遊走パターンの更なる分析により、ヒト繊維芽細胞(200μm)と比較してh−iNSCにより遊走された有意に増加した平均ユークリッド距離(340μm)が実証された(図2E)。h−iNSCによる平均細胞速度は、ヒト繊維芽細胞と比較してより低かった(0.4対0.62)(図2F)。最後に、3次元遊走アッセイを実行して、h−iNSCの、GBM病巣へのインビボ遊走を模倣した。mCherry+h−iNSCスフェロイドを、GFP+GBMスフェロイドと共培養し、両方の細胞型を、磁力を使用して浮遊させた(図2G)。h−iNSCが、播種の数時間以内にGBMスフェロイドに侵入し始めることを発見した。h−iNSCスフェロイドは、GBMスフェロイドに侵入し続け、8日以内に広範囲に共局在化した。全体として、これらの観察は、h−iNSCが腫瘍向性特性を保有し、GBM細胞にホーミングするという結論を支持している。
<h−iNSCの残存およびインビボ運命>
次に操作したh−iNSCを利用して、脳内におけるインビボでのこれら細胞の生存および運命を調査した。GFPFLおよびmCFLによってh−iNSCを操作した後のインビトロ増殖に関する先行する研究は、操作していないh−iNSCと有意差を示さなかった(図3A)。インビボ研究の場合、mCFLで操作したh−iNSCを、マウスの脳内に定位に移植し、リアルタイム非侵襲イメージングを使用して、細胞生存を経時的に監視した。画像を定期的に取り込むことにより、h−iNSCが、移植後20日間より長く生存することが判明した(図3B)。事後IHCにより、h−iNSC−mCFLのおよそ半分が、NSCマーカーであるネスチンを発現しており(図3D)、他の半分が、ニューロンマーカーTuj−1に陽性である(図3D)ことが明らかになった。アストロサイトマーカーGFAPは観察されなかった。追加のIHCにより、移植したh−iNSCが、多能性マーカーOct−4およびTDR−160を発現していないことが検証された。
次に操作したh−iNSCを利用して、脳内におけるインビボでのこれら細胞の生存および運命を調査した。GFPFLおよびmCFLによってh−iNSCを操作した後のインビトロ増殖に関する先行する研究は、操作していないh−iNSCと有意差を示さなかった(図3A)。インビボ研究の場合、mCFLで操作したh−iNSCを、マウスの脳内に定位に移植し、リアルタイム非侵襲イメージングを使用して、細胞生存を経時的に監視した。画像を定期的に取り込むことにより、h−iNSCが、移植後20日間より長く生存することが判明した(図3B)。事後IHCにより、h−iNSC−mCFLのおよそ半分が、NSCマーカーであるネスチンを発現しており(図3D)、他の半分が、ニューロンマーカーTuj−1に陽性である(図3D)ことが明らかになった。アストロサイトマーカーGFAPは観察されなかった。追加のIHCにより、移植したh−iNSCが、多能性マーカーOct−4およびTDR−160を発現していないことが検証された。
<殺腫瘍性iNSCを使用する悪性および侵襲性GBMの有効な処置>
h−iNSCに基づくGBM処置の治療効果を調査するために、h−iNSCを先ず操作して、IRES−GFPエレメントの上流に、ガウシアルシフェラーゼとフレームが一致した、アポトーシス促進性分子TNFα関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL;diTR)の分泌性バリアント(iNSC−diTR)を発現させた。操作した細胞担体から送達された場合のTRAILの抗がん効果は、これまでに確立されており、したがってTRAILは、新たなh−iNSC送達媒体を特徴づけるのに理想的な殺腫瘍性分子である。GFPレポータの強力な発現が、h−iNSCの形質導入後に検出された(図4A)。h−iNSC−diTRは、浮遊状態で培養した場合に神経幹細胞塊を効率的に形成し(図4B)、未改変細胞と同等の増殖能および継代数を示すことを観察した(データ不掲載)。ネスチン発現および分化能力が、操作したおよび操作していないh−iNSCにおいて観察された以前のそれと同じであったことは、TRAILによるh−iNSCの修飾が幹細胞としてのその特性に干渉しないことを示唆している。
h−iNSCに基づくGBM処置の治療効果を調査するために、h−iNSCを先ず操作して、IRES−GFPエレメントの上流に、ガウシアルシフェラーゼとフレームが一致した、アポトーシス促進性分子TNFα関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL;diTR)の分泌性バリアント(iNSC−diTR)を発現させた。操作した細胞担体から送達された場合のTRAILの抗がん効果は、これまでに確立されており、したがってTRAILは、新たなh−iNSC送達媒体を特徴づけるのに理想的な殺腫瘍性分子である。GFPレポータの強力な発現が、h−iNSCの形質導入後に検出された(図4A)。h−iNSC−diTRは、浮遊状態で培養した場合に神経幹細胞塊を効率的に形成し(図4B)、未改変細胞と同等の増殖能および継代数を示すことを観察した(データ不掲載)。ネスチン発現および分化能力が、操作したおよび操作していないh−iNSCにおいて観察された以前のそれと同じであったことは、TRAILによるh−iNSCの修飾が幹細胞としてのその特性に干渉しないことを示唆している。
操作したh−iNSCの抗GBM有効性を評価するために、h−iNSC−diTRまたは対照iNSC−GFPRLを、mCherryおよびホタルルシフェラーゼ(mC−FL)を発現しているヒトGBM細胞と異なる比で共培養した。インビボ特性を模倣するために、GBMとh−iNSCを混合し、3次元浮遊系で48時間培養した。蛍光およびBLIにより、h−iNSC−sTRと共培養したGBMの生存率における有意な減少が明らかになった。より高いh−iNSC:GBM比を使用した場合、この減少は有意に一層大きかった(図4C)。
<アポトーシス促進性薬剤のh−iNSC分泌は、固形GBMを減少させる>
h−iNSC−sTRに基づく治療のインビボ有効性を試験するために、ヒト単独性GBMに対するh−iNSC−sTR処置の効果を決定した。mC−FLを発現しているヒトU87 GBM細胞を、iNSC−sTRまたは対照iNSC−GFPと一緒に頭蓋内移植し(図D)、腫瘍体積を、連続生物発光イメージングを使用して追跡した。h−iNSC−sTR処置は、3日目までに腫瘍成長の統計的に有意な減少を誘導し、24日目までにGBM体積を50分の1に低下させることが判明した(図4F)。加えて、対照動物は、わずか25日間でGBM成長のため死んだが、h−iNSC−sTR−処置動物は、51日間より長く生存した(図4G)。マウス脳のIHC検査は、2週間後にh−iNSC−sTRによるTRAILの強力な発現を示した。GBM中のh−iNSC−sTRは、ネスチンおよびTuj−1の発現について陽性であり、GFAPならびに多能性マーカーOct−4およびTRD−160について陰性であった(図4H)。
h−iNSC−sTRに基づく治療のインビボ有効性を試験するために、ヒト単独性GBMに対するh−iNSC−sTR処置の効果を決定した。mC−FLを発現しているヒトU87 GBM細胞を、iNSC−sTRまたは対照iNSC−GFPと一緒に頭蓋内移植し(図D)、腫瘍体積を、連続生物発光イメージングを使用して追跡した。h−iNSC−sTR処置は、3日目までに腫瘍成長の統計的に有意な減少を誘導し、24日目までにGBM体積を50分の1に低下させることが判明した(図4F)。加えて、対照動物は、わずか25日間でGBM成長のため死んだが、h−iNSC−sTR−処置動物は、51日間より長く生存した(図4G)。マウス脳のIHC検査は、2週間後にh−iNSC−sTRによるTRAILの強力な発現を示した。GBM中のh−iNSC−sTRは、ネスチンおよびTuj−1の発現について陽性であり、GFAPならびに多能性マーカーOct−4およびTRD−160について陰性であった(図4H)。
<殺腫瘍性iNSCを使用する悪性および侵襲性GBM CD133+の有効な処置>
患者由来CD133+ヒトGBM−始原細胞に対するh−iNSCプロドラッグ/酵素治療の有効性を決定するために、GFPおよびホタルルシフェラーゼを発現しているGBM4細胞(GBM4−GFPFL)を、Rluc、RFPおよびチミジンキナーゼ(TK)活性を含む三官能性キメラレポータを発現しているh−iNSCと共培養して、h−iNSC−TKを生成した。単純ヘルペスウイルスにコードされているチミジンキナーゼ(HSV−TK)は、細胞自殺遺伝子治療の原理の最初の証明に使用され、今なお臨床的および実験的適用において最も広く使用されている系の1つである。GBM4−GFPFLおよびh−iNSC−TKを、異なる2つのモデルで、3次元浮遊系で共培養した。第1のモデル(図5A)において、2つの細胞型を混合し、細胞生存を蛍光により経時的に監視した(図5B)。第2のモデルにおいて、2つの細胞型を並べて培養して、確立されたGBMの処置を模倣した(図5C)。細胞生存を、蛍光により経時的に監視した(図5D)。両方の場合において、GBM生存の有意な減少が経時的に観察され、混合したモデルにおいてより有意であった(図5E)。
患者由来CD133+ヒトGBM−始原細胞に対するh−iNSCプロドラッグ/酵素治療の有効性を決定するために、GFPおよびホタルルシフェラーゼを発現しているGBM4細胞(GBM4−GFPFL)を、Rluc、RFPおよびチミジンキナーゼ(TK)活性を含む三官能性キメラレポータを発現しているh−iNSCと共培養して、h−iNSC−TKを生成した。単純ヘルペスウイルスにコードされているチミジンキナーゼ(HSV−TK)は、細胞自殺遺伝子治療の原理の最初の証明に使用され、今なお臨床的および実験的適用において最も広く使用されている系の1つである。GBM4−GFPFLおよびh−iNSC−TKを、異なる2つのモデルで、3次元浮遊系で共培養した。第1のモデル(図5A)において、2つの細胞型を混合し、細胞生存を蛍光により経時的に監視した(図5B)。第2のモデルにおいて、2つの細胞型を並べて培養して、確立されたGBMの処置を模倣した(図5C)。細胞生存を、蛍光により経時的に監視した(図5D)。両方の場合において、GBM生存の有意な減少が経時的に観察され、混合したモデルにおいてより有意であった(図5E)。
GBM4−GFPFLがん細胞をマウスの実質に移植することにより、確立したGBM4に対するインビボでのh−iNSC−TK治療の有効性を次に決定した。3日後に、h−iNSC−TKまたは対照細胞を、確立した腫瘍に直接投与した(図5F)。連続生物発光イメージングは、h−iNSC−TK処置がGBM4腫瘍の進行を減衰させ、注射28日後には腫瘍負荷量を、対照と比較して9分の1に減少させたことを示した(図5G)。h−iNSC−TK処置動物が、対照処置マウスにおけるわずか37日間と比較して平均67日間生存したので、h−iNSC−TK治療は生存にも有意な延長をもたらした(図5H)。事後IHCにより、h−iNSC−TK注射による腫瘍体積の有意な減少が検証された(図5I〜5J)。全体として、これらの結果は、h−iNSC−TK治療が、悪性および侵襲性GBMに対して有意な治療効果を有し、坦腫瘍マウスの生存を著しく延ばすことを示している。
<腔内h−iNSC−TK治療は、外科的に切除したGBMの再発を阻害する>
外科的切除は、GBM患者に対する臨床的標準的ケアの一部である。GBMの再発を効果的に抑制するには、幹細胞の封入が、腔内治療に必要とされることを本発明者等はこれまでに発見した。合成細胞外マトリックス(sECM)に封入したh−iNSC治療の有効性を決定するために、GBM−8 GFPFL(患者由来CD133+ヒトGBM−始原細胞)を、HLAヒドロゲルに包埋したh−iNSC−TKと共培養した(図6A)。mCherry+h−iNSCが、sECMマトリックスから遊走し、3日以内にGFP+GBM8スフェロイドに定着することが判明した。更に、sECM/h−iNSC−TK治療は、3日目にGBM8スフェロイドの生存率を激減させた。
外科的切除は、GBM患者に対する臨床的標準的ケアの一部である。GBMの再発を効果的に抑制するには、幹細胞の封入が、腔内治療に必要とされることを本発明者等はこれまでに発見した。合成細胞外マトリックス(sECM)に封入したh−iNSC治療の有効性を決定するために、GBM−8 GFPFL(患者由来CD133+ヒトGBM−始原細胞)を、HLAヒドロゲルに包埋したh−iNSC−TKと共培養した(図6A)。mCherry+h−iNSCが、sECMマトリックスから遊走し、3日以内にGFP+GBM8スフェロイドに定着することが判明した。更に、sECM/h−iNSC−TK治療は、3日目にGBM8スフェロイドの生存率を激減させた。
外科的に切除したヒトGBM患者に対するh−iNSC治療を模倣するために、GBM切除のマウスモデルにおいて、高度にびまん性の患者由来GBM8細胞に対してh−iNSC−TK治療を試験した(図6D)。GBM摘除後に、HLA内に包埋したh−iNSC−TKを、外科的切除腔に移植した。連続生物発光イメージングは、h−iNSC−TK治療がGBM8腫瘍の再発を減衰させ、移植14日後には腫瘍負荷量を、対照と比較して350%減少させることを示した(図6E)。h−iNSC−TK処置動物が、対照処置マウスにおける46日間と比較して平均59日間生存したので、h−iNSC−TK治療は生存にも有意な延長をもたらした(図6E)。
[実施例2:ヒト皮膚細胞の迅速な分化転換のための代替培地]
ヒト皮膚細胞の分化転換を、実施例1において上記の通り実行したが、STEMdiff(商標)Neural Progenitor Basal Mediumの代わりに以下のN−2培地およびB−27培地の1:1混合物で実行した。化学薬品は、示した通りGibco(登録商標)(Invitrogen Corporation、Carlsbad、California)、Sigma(Sigma−Aldrich、St.Louis、Missouri)またはSelleck Chemicals(Houston、Texas)から購入した。
N−2培地:
DMEM/F12(Gibco[登録商標])
1×N2補助剤(Gibco[登録商標])
5μg/mLインスリン(Sigma)
1mM L−グルタミン(Gibco[登録商標])
1mM Glutamax(Gibco[登録商標])
100μM MEM非必須アミノ酸(NEAA)(Gibco[登録商標])
100M β−メルカプトエタノール(bME)
B−27培地:
ニューロベーサル培地(Gibco[登録商標])
1×B−27補助剤(Gibco[登録商標])
200mM L−グルタミン(Gibco[登録商標])
ヒト皮膚細胞の分化転換を、実施例1において上記の通り実行したが、STEMdiff(商標)Neural Progenitor Basal Mediumの代わりに以下のN−2培地およびB−27培地の1:1混合物で実行した。化学薬品は、示した通りGibco(登録商標)(Invitrogen Corporation、Carlsbad、California)、Sigma(Sigma−Aldrich、St.Louis、Missouri)またはSelleck Chemicals(Houston、Texas)から購入した。
N−2培地:
DMEM/F12(Gibco[登録商標])
1×N2補助剤(Gibco[登録商標])
5μg/mLインスリン(Sigma)
1mM L−グルタミン(Gibco[登録商標])
1mM Glutamax(Gibco[登録商標])
100μM MEM非必須アミノ酸(NEAA)(Gibco[登録商標])
100M β−メルカプトエタノール(bME)
B−27培地:
ニューロベーサル培地(Gibco[登録商標])
1×B−27補助剤(Gibco[登録商標])
200mM L−グルタミン(Gibco[登録商標])
1:1の混合物に、終濃度5μg/mLになるようにウシ血清アルブミン(BSA、Sigma)を添加した。
この培地を、終濃度10μMのSB431542(Selleck Chemicals);終濃度100nMのLDN193189(Selleck Chemicals);終濃度10μMの全トランスレチノイン酸(Sigma);および終濃度3μMのCHIR99021(Selleck Chemicals)で補充した。
この培地を使用して、Sox2形質導入と共に使用した場合に、ネスチン+iNSCを生成した。
培地は、インスリン(25μg/mL)、トランスフェリン(100μg/mL)、亜セレン酸ナトリウム(30nM)および/またはcAMP(100ng/mL)を含むように作製することもできる。
[実施例3:脳がんの処置におけるiNSCの使用]
患者が、脳がん(例えば、膠芽腫)と診断され、手術は、その後直ちに腫瘍を除去する予定である(例えば、1、2または3週間以内)。皮膚パンチを患者から取って、皮膚繊維芽細胞を得る。細胞を、本明細書に教示されるように誘導神経幹細胞へと分化転換させ、更に治療薬および/またはレポート分子を細胞に導入する。手術の間および腫瘍除去後に、導入を受けたiNSCを、腫瘍を除去して得られた腔内に投与する。iNSCは、残ったがん細胞の方へ遊走し、その治療薬/レポート分子の有効導入量を送達する。
患者が、脳がん(例えば、膠芽腫)と診断され、手術は、その後直ちに腫瘍を除去する予定である(例えば、1、2または3週間以内)。皮膚パンチを患者から取って、皮膚繊維芽細胞を得る。細胞を、本明細書に教示されるように誘導神経幹細胞へと分化転換させ、更に治療薬および/またはレポート分子を細胞に導入する。手術の間および腫瘍除去後に、導入を受けたiNSCを、腫瘍を除去して得られた腔内に投与する。iNSCは、残ったがん細胞の方へ遊走し、その治療薬/レポート分子の有効導入量を送達する。
前述は、本発明の解説であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の請求項により、そこに含まれる請求項の相当語句で定義される。
Claims (24)
- 体細胞を提供するステップと、
前記体細胞に、Sox2をコードしている核酸をトランスフェクトまたは形質導入し、それにより前記体細胞がSox2を発現するステップと、
その後、前記体細胞を分化転換させるステップと、ここで、前記分化転換が、神経前駆細胞用培地中で前記体細胞を成長させることにより実施され、それにより誘導神経幹細胞を作製する、
を含む、誘導神経幹細胞を作製する方法。 - 前記分化転換が、1〜10日間実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記分化転換が、1〜5日間実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記分化転換が、1〜3日間実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞が、繊維芽細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記体細胞が、皮膚繊維芽細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記誘導神経幹細胞が、ネスチンを発現し、かつ/または、NanogもしくはOCT3/4を発現しない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記誘導神経幹細胞が、神経/アストロサイト細胞に分化できる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記体細胞に、Sox2をコードしている前記核酸を含むレンチウイルスベクターを形質導入するステップを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分化転換が、フィーダー細胞なしで実施される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞用培地が、DMEM/F12、N2補助剤、インスリン、ニューロベーサル培地、B27補助剤、非必須アミノ酸、bME、L−グルタミン、Glutamax、SB431542、LDN193189、レチノイン酸、BSA、CHIR99021、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムおよびcAMPからなる群から選択される成分の1つまたは複数を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記体細胞に、TERT(例えば、hTERT)をコードしている核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップを更に含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記誘導神経幹細胞に治療薬および/またはレポータ分子を導入するステップを更に含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記導入が、前記誘導神経幹細胞に、治療薬を産生できる核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップを含み、前記治療薬が、酵素/プロドラッグ治療に有用なタンパク質毒素、腫瘍崩壊性ウイルス、アポトーシス促進性薬剤または酵素である、請求項13に記載の方法。
- 治療薬を産生できる前記核酸およびSox2をコードしている前記核酸が、同じベクター上に提供される、請求項14に記載の方法。
- 前記方法が、前記誘導神経幹細胞を増殖させて、誘導神経幹細胞の集団を形成するステップを更に含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、ヒドロゲルに前記誘導神経幹細胞を封入する、または足場上に前記誘導神経幹細胞を播種するステップを更に含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、それを必要とする対象に前記誘導神経幹細胞を投与するステップを更に含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記誘導神経幹細胞が、前記対象にとって同種異系、同系または自己由来である、請求項18に記載の方法。
- 前記対象がヒト対象である、請求項18または請求項19に記載の方法。
- 前記対象が、脳がんの処置を必要としている、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脳がんが膠芽腫である、請求項21に記載の方法。
- 前記投与が、脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後に腔内投与によって実施される、請求項21または請求項22に記載の方法。
- 前記誘導神経幹細胞が、前記対象にとって自己由来であり、前記投与が、体細胞を提供する前記ステップの1〜14日または21日後に実施される、請求項18〜23のいずれか1項に記載の方法。
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