JP2012507264A - 神経幹細胞製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
なお本明細書で、「遺伝子」「cDNA」などの用語無しに、「Sox2」、「Oct3/4」、「Klf4」、「c-Myc」というように因子名のみで用いられた場合、これらの遺伝子由来の遺伝子産物であるタンパク質を指すこととする。
本発明の一実施態様は、神経幹細胞の製造方法であって、
(i)体細胞に脱分化因子を導入する工程と、
(ii) 前記脱分化因子が導入された体細胞を増殖因子の存在下で浮遊培養して、ニューロスフェアを製造する工程とを含む。ここで、体細胞に脱分化因子を導入したあと、2〜14日培養することが好ましい。Sox2、Oct3/4、およびKlf4のような脱分化因子を体細胞に導入してもよいが、さらにc-Mycを含ませてもよい。また、前記脱分化因子が導入された体細胞は、LIFおよびFGFのような増殖因子の存在下で培養してもよい。さらに、前記工程(ii)において、cAMPの存在下で、前記脱分化因子が導入された体細胞を培養してもよいが、NAC (N-acetyl-L-cycteine) の非存在下で、培養することが好ましい。前記体細胞が哺乳動物由来、特にマウスまたはヒト由来であることが好ましく、皮膚または肝臓由来であることが好ましく、線維芽細胞または肝細胞であることがさらに好ましい。
本出願は、2009年11月5日に出願された米国仮出願US61/198,365に対する優先権の利益を主張し、ここに援用するものとする。
体細胞から神経幹細胞を製造するために、まず、体細胞に脱分化因子を導入する。
次に、上記のように処理した体細胞を、増殖因子の存在下で浮遊培養することによって、ニューロスフェアとして神経幹細胞を分化誘導することができる。用いる培地は、グルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを添加したDMEM:ハムF−12培地(F−12)等の無血清培地が好ましい。また、培地に添加する増殖因子は、その体細胞をニューロスフェアに分化誘導することができる因子、あるいは、その組み合わせであれば特に制限がないが、FGF、LIF、B27、またはそれらの組み合わせであることが好ましい。FGFは、FGF−2、FGF−8が好ましく、培地中のFGF濃度は5〜50ng/mlでよいが、10〜40ng/mlが好ましい。培地中のLIF濃度は約1000U/mlが好ましい。B27はInvitrogen社のマニュアル通り、約50倍希釈で使用すればよい。培養は、5%CO2条件下、35〜40℃で行うのが好ましく、37℃であることがさらに好ましい。また、培地に、約100μMのcAMPを添加することにより、ニューロスフェアへの分化誘導効率が著しく増加する。この際、N−アセチル−L−システイン(NAC)の非存在下で行うことがより好ましい。なお、浮遊培養のための培養皿は、特に限定されないが、コートされていない、バクテリア培養用プラスティック培養皿が望ましい。
このようにして得られた一次ニューロスフェア及び二次ニューロスフェアは、神経幹細胞としての機能を有する。例えば、通常の分化培地で培養すれば、ニューロンのみならず、グリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞など)が分化する。ここで分化誘導培地としては、グルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを含むDMEM:F12培地、(すなわち、神経幹細胞増殖用培地からFGFとヘパリンを除いた培地)を用いるのが好ましい。このとき、ソニックヘッジホッグ(Sonic hedgehog)タンパク質は存在しても、存在しなくてもよい。培養は5%CO2条件下、35〜40℃で、5〜7日間行うのが好ましい。
本実施例では、本発明に係る神経幹細胞製造方法によって、線維芽細胞から神経幹細胞を分化誘導できることを示す。
マウスの皮膚からの線維芽細胞樹立のため、頸椎脱臼した成体マウス(8週齢ICRマウス♂)の体毛を除き、腹部の皮膚を採取した。単離した皮膚をペニシリン/ストレプトマイシン(50U、50mg/ml)、0.6%グルタミンを含有したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4回洗浄した後、この単離した皮膚から真皮を除去した。この真皮を細胞培養用プラスティック皿に載せ、カバーガラスで覆い、初代細胞スターティング培地(東洋紡社)で培養した。
ヒト皮膚組織から採取した真皮からマウスと同様の方法で10%FBS含有DMEM、37℃、5%CO2条件下で線維芽細胞を得た。組織片から増殖させた線維芽細胞をトリプシン処理にて播種し、初代線維芽細胞として増殖させた。そして、レトロウイルスの感染効率を高めるため、この初代線維芽細胞に、Slc7a1発現レンチウイルス(Takahashi and Yamanaka, Cell 2006 vol.126 p.663-676)を一晩感染させた後、増殖させることにより、初代線維芽細胞に、レトロウイルスの受容体であるSlc7a1を発現させ、得られた線維芽細胞を以後の実験に用いた。
各脱分化因子DNAを含んだ組換え発現ベクターpMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-c-Myc(全てaddgene社)を用い、4因子(Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc)、3因子(c-Mycなし、Oct3/4、 Sox2、 Klf4)、または3因子(Klf4なし、Oct3/4、 Sox2、c-Myc)の組み合わせを発現するレトロウイルスを含む培地を作製した。一方、形質転換の指標、および、因子挿入群に対する陰性対照群として、pMX-GFP(Cell biolabs社)を用いてGFPを含む培地を、以下のように作製した。なお、ベクターの作製方法は、Takahashi and Yamanaka, Cell 2006 vol.126 p.663-676にも詳細に記載されており、この文献を援用することにより、本明細書に含めるものとする。
上記のように培養した、脱分化因子導入線維芽細胞を、0.25%トリプシンEDTAで洗浄して解離させ、LIF(組み替えヒトLIF;ケミコン社 100U/ml)およびFGF(ペプロテック社 20ng/ml)を添加したDMEM/F−12無血清培地(1:1、Invitrogen社、0.6%D−グルコース、5mMヘペス、3mM NaHCO3、2mMグルタミン、25μg/mlインスリン、100μg/mlトランスフェリン、20nMプロゲステロン、60μMプトレスシン、30nMセレン酸ナトリウムを含む)10mlに50細胞/μlの細胞密度でバクテリア用プラスティック培養皿に播種し、37℃、5%CO2条件下で、14日毎に培地を交換しながら、浮遊培養した。浮遊培養途中、培養3日目および培養20日目の細胞の状態を観察した。
次に、このようにして得られたニューロスフェアが、神経幹細胞としての性質を有することを示す。
本実施例では、実施例1に記載の神経幹細胞製造方法において、cAMPの存在下で脱分化因子導入線維芽細胞を培養することにより、ニューロスフェアへの分化誘導効率が著しく増加することを示す。
細胞死阻害剤であるN−アセチル−L−システイン(NAC、1mM、Sigma社)及び膜透過性cAMPアナログ、8−クロロフェニルチオ-cAMP(pCPT−cAMP、100μM、Sigma社)によるニューロスフェア分化誘導の効率改善を調べるため、実施例1に記載の浮遊培養において、どちらか一方または両方を添加した培地を用いた。その他の工程は実施例1と同様に行い、培養20日目のニューロスフェアの数を測定した。
本実施例では、Oct4−GFPのトランスジーンを有するトランスジェニックマウスの胚と成体を用いてニューロスフェアを作製し、未分化細胞で発現するOct4遺伝子の発現を指標にニューロスフェアの分化段階を調べた。
Claims (10)
- 神経幹細胞の製造方法であって、
(i)体細胞に脱分化因子を導入する工程と、
(ii)前記脱分化因子が導入された体細胞を増殖因子の存在下で浮遊培養して、ニューロスフェアを製造する工程と
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記工程(i)において、体細胞に脱分化因子を導入したあと、2〜14日培養することを特徴とする方法。 - 前記工程(i)において、脱分化因子として、Sox2、Oct3/4、およびKlf4が体細胞に導入されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(i)において、さらにc-Mycが体細胞に導入されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記工程(ii)において、前記脱分化因子が導入された体細胞が、LIFおよびFGFの存在下で培養されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記工程(ii)において、前記脱分化因子が導入された体細胞が、cAMPの存在下で培養されることを特徴とする方法。 - 請求項6に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記工程(ii)において、前記脱分化因子が導入された体細胞が、NACの非存在下で、培養されることを特徴とする方法。 - 請求項1から7のいずれかに記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記体細胞がマウスまたはヒト由来であることを特徴とする方法。 - 請求項8に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記体細胞が、皮膚または肝臓由来であることを特徴とする方法。 - 請求項8に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記体細胞が線維芽細胞または肝細胞であることを特徴とする方法。
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