CN102839154A - 神经干细胞培养扩增方法及所用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞培养扩增方法，包括将不同来源的神经干细胞用本发明所述培养液培养、添加营养补充液、更换新鲜培养液、挑选一定大小的神经球传代等步骤，还提供了相关的培养液、营养补充液等组合物的配方。本发明所述方法显著提高了静态培养下神经干细胞的增殖效率，并且不使用抗生素，成本较低，适合工业化生产。

Description

神经干细胞培养扩增方法及所用培养基

技术领域

本发明涉及细胞培养扩增领域。本发明特别涉及用于神经干细胞培养扩增的培养基以及使用所述培养基培养扩增神经干细胞的方法。

背景技术

神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎和成体脑、脊髓等神经组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。

神经干细胞通常的分离提取方法是，采用化学或机械方法将胚胎或成体的脑、脊髓等神经组织分散成单细胞后，或者对培养的干细胞进行定向诱导分化后，对获得的细胞混合液初步培养一段时间，由于神经干细胞具有形成神经球的特性，可以通过挑选神经球的方法从中分离获得少量神经干细胞。

神经干细胞通常的培养扩增方法是，将用前段所述方法获得的神经球作为初始种子，接种入含血清或不含血清的培养液，置于5％CO₂、37℃条件下培养，每培养到一定程度就挑选合适的神经球进行消化传代，实现细胞数量扩增，以满足研究或测试需求的数量和质量。(《人胚神经干细胞的分离培养和鉴定》，罗树伟，谢常青，卢光，中南大学学报(医学版)，2004，29(2)：129-131；《早期人胚神经干细胞分布及分离培养》，吕海侠，翟伟，刘勇等，西安交通大学学报(医学版)，2003年4月第24卷第2期：97-100；《胎鼠脊髓源性神经干细胞分离培养与鉴定》，李勇，敬晓棋，窦忠英，中国生物工程杂志，2005，25(6)：25-30；《诱导人脐血神经干细胞向神经细胞分化的研究》，季旭东，高超，杨月景，河南医学研究，2005年9月第14卷第3期：215-219；《异体和自体骨髓源神经干细胞周围神经移植实验研究》，李贵涛，徐如祥，姜晓丹等，中国矫形外科杂志，2007年7月第13卷第14期，1087-1089；《人和小鼠神经干细胞的体外培养的分化研究》，吴益民，喻红，林丽珠等，复旦学报(自然科学版)，2002年2月第41卷第1期，57-62)。

由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，虽然有血清时培养扩增效率较高，然而无血清培养仍然成为发展趋势，目前一般采用添加了生长因子、抗生素等成分的DMEM或者DMEM/F12培养液作为神经干细胞的无血清培养液(《体外血清预培养促进神经干细胞增殖》，万虹，历俊华，张绍东，中国临床康复，2006，10(45))。

神经干细胞有静态培养和动态培养两种方式，前者是用细胞培养瓶放在温箱中静态条件下培养，在无血清条件下扩增效率较低(《哺乳动物神经干细胞扩增技术研究进展》，董良，齐瀚实，生物技术，2005，15(4))；后者是利用细胞培养生物反应器在旋转等动态条件下培养，扩增效率较高，然而生物反应器价格昂贵，并且部分情况下为了实验的方便或由于实验条件的要求，神经干细胞不适合用生物反应器进行培养扩增。

此外，目前神经干细胞培养还需要添加抗生素，有可能对神经干细胞的进一步应用造成影响。

发明内容

本发明提供了一种新的神经干细胞培养扩增方法，其对神经球的挑选、培养液的配方和换液时机等接种培养工艺进行了改进，实现了在静态培养条件下神经干细胞10-15天的扩增效率达到7-14倍，并且本发明所述方法不需要添加抗生素，更好的满足科研和工业化生产的需要。

在一个方面，本发明提供了一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括：

(a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12或DMEM培养基中培养；

(b)2、3或4天后在培养基中添加5-20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的N乙酰半胱氨酸(NAC)，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM/F12或DMEM培养基；

(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；

(d)未挑中的直径小于所述阈值的剩余细胞保留在原培养基中，将培养基移除1/2-1/4体积，然后添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基继续培养；

(e)在(a)接种神经干细胞10、11、12、13、14或15天后通过合并(c)中收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。

本发明人发现通过本发明方法可以实现神经干细胞的高效扩增，10-15天的扩增效率达到7-14倍。本发明所述扩增效率是指扩增后细胞数与扩增前细胞数的比值。

本发明所述神经干细胞可以是不同动物例如哺乳动物例如灵长类动物例如人、啮齿类动物例如鼠等的神经干细胞，而且所述神经干细胞可以得自不同来源，例如可以是商购获得的神经球冻存液或神经干细胞细胞系，或者自行从动物神经组织或其他组织(如脐带血、脐带)中分离提取，或者是由其他细胞经诱导分化而来，比如体细胞(通过iPSC技术诱导)，间充质干细胞，胚胎干细胞(包括极小类胚胎干细胞)，亚全能干细胞，人类视网膜色素上皮细胞等。在一个实施方案中，所述神经干细胞是间充质干细胞向神经方向诱导获得的神经干细胞。

本发明(a)中所述的培养可以使用本领域已知的任何方法进行，例如参见(《干细胞原理、技术与临床》第21章第2节，赵春华主编，化学工业出版社，2006年5月第一版)。在一个实施方案中，所述培养基是包含bFGF和EGF的DMEM/F12培养基。所述培养基还可以包含其他本领域已知用于培养神经干细胞的物质，例如丙酮酸钠、谷氨酰胺、NAC和LIF。

在本发明的一个实施方案中，(a)中使用的培养基为包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，5-30ng/ml的bFGF，5-30ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12培养基。在一个实施方案中，(a)的培养基中所述bFGF的浓度为5-30ng/ml，例如20ng/ml。在一个实施方案中，(a)的培养基中所述EGF的浓度为5-30ng/ml，例如20ng/ml。

本发明中所用DMEM/F12或DMEM培养基是本领域熟知的培养基，可以购自任何商业来源。例如，所述培养基可以购自Invitrogen，其配方可以例如参见Invitrogen公司网站。例如，DMEM配方可参见http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.11.html；DMEM/F12配方可参见http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.59.html。

本发明所述的B27添加剂购自Invitrogen公司(货号17504-044)，其包含生物素，肾上腺皮质酮，孕酮，乙酸维生素A，人重组胰岛素，三碘甲腺原氨酸，维生素E，乙酸维生素E，还原谷胱甘肽，过氧化物歧化酶，盐酸肉碱，盐酸乙醇胺，D-半乳糖，盐酸腐胺，亚油酸，亚麻酸，牛血清白蛋白(无脂肪酸)，转铁蛋白，亚硒酸钠。

本发明所述的N2添加剂包含5mg/L胰岛素，20nM孕酮，100uM腐胺，30nM亚硒酸钠和100mg/L转铁蛋白。N2添加剂是培养神经干细胞的常用公知添加剂，例如可购自Invitrogen公司，其配方可以参见http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.166.html。

本发明所述N乙酰半胱氨酸(NAC，分子式：C₅H₉NO₃S，分子量：163.20)是一种氧自由基清除剂，具有抗氧化作用，可以保护细胞不受氧化损伤，阻止氧化张力诱导的细胞凋亡，促进脑损伤条件下神经细胞的存活。

本发明所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是本领域已知的一种细胞因子，其对成纤维细胞、血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞等多种细胞具有很强的促细胞分裂增殖活性。

本发明所述表皮生长因子(EGF)是本领域已知的一种细胞因子，其可刺激上皮细胞和多种细胞增殖。

本发明所述白血病抑制因子(LIF)是本领域已知的一种细胞因子，其属于IL-6家族细胞因子家族，能调节细胞增殖、分化和表型等。

本文所述培养是在本领域已知的任何合适的培养神经干细胞的条件下进行，例如30℃-37℃、5％CO₂以及100％的湿度。在一个具体实施方案中，所述神经干细胞在37℃、5％CO₂以及环境湿度下的培养箱中培养。

在将神经干细胞接种在(a)中所述培养基中培养2、3或4天后，向该神经干细胞培养物中加入5-20％例如5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％体积的营养补充液，所述营养补充液是DMEM/F12或DMEM培养基，其包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF。在一个实施方案中，添加10％体积的所述营养补充液。

在一个实施方案中，所述营养补充液是DMEM/F12培养基，其包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF。

在一个实施方案中，所述营养补充液中bFGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。在一个实施方案中，所述营养补充液中EGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

本发明所述监测神经球直径可以在(a)至(e)的整个培养扩增期间中的任何阶段进行。在优选的实施方案中，在添加所述营养补充液后监测培养液中形成的神经球直径，当60％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球并消化、收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。在一个实施方案中，当70％、75％、80％、85％、90％或95％以上神经球直径达到阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球。在一个实施方案中，所述阈值为250μm。在一个实施方案中，所述阈值为300μm。在一个实施方案中，所述阈值为350μm。而未挑中的小于所述阈值的剩余细胞则留在培养基中。

本发明中测量神经球直径的方法可以使用本领域所已知的任何合适方法进行，例如使用解剖镜、显微镜测量方法。在本发明的一个实施方案中，所述神经球直径使用解剖镜测量。

可以使用本领域已知的合适方法分离具有所需直径例如大于200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或者500μm的神经球，例如使用吸管、移液管、微量移液器将神经球吸取出以进行分离。在本发明的一个实施方案中，使用微量移液器分离直径大于250μm、300μm或者350μm的神经球。

本文中，消化神经干细胞可以使用本领域已知的任何合适方法，例如酶消化法，例如使用胰蛋白酶、Dnase I进行消化。

本文中，所述“收获”细胞可以使用本领域已知的任何收获神经细胞的合适方法进行。例如，收获细胞可以使用离心的方法，例如在1000rpm离心10分钟，然后去除上清，获得细胞沉淀，再根据需要将细胞沉淀溶解于培养液、生理盐水、冻存液或其他溶液中而获得培养扩增的细胞，以用于继续培养扩增、鉴定测试、诱导分化、注射动物、冻存保藏或者其他目的。

在一个实施方案中，在添加营养补充液继续培养2、3或4天后分离大于阈值的神经球。在一个实施方案中，在添加营养补充液继续培养3天后分离大于阈值的神经球。在一个实施方案中，在添加营养补充液继续培养2天后分离大于阈值的神经球。

所述未挑中的小于所述阈值的并被留在培养基中的剩余细胞在将培养液移除1/2-1/4体积、例如1/3体积或者30％的体积并添加与移除体积相同体积的(a)中所述包含bFGF和EGF的培养基后继续培养。

本文中所述“将培养液移除”可以采用本领域已知的任何方法进行，例如可以利用神经干细胞密度比培养液大、一般沉在培养瓶底部的原理将培养瓶竖起后小心吸去部分上清液。

在(a)接种10、11、12、13、14或15天后通过合并(c)中所述通过消化神经球获得的细胞和(d)中所述继续培养小于所述阈值的剩余细胞所得的细胞而收获细胞。在一个实施方案中，在(a)接种后10-13天收获细胞。在一个实施方案中，在(a)接种后11天收获细胞。在一个实施方案中，在(a)接种后12天收获细胞。

本发明方法扩增的细胞可以使用本领域任何方法计数。例如，在一个实施方案中，细胞计数时用台盼蓝染色，活细胞染色后用细胞计数仪扫描是透亮的圈，死细胞染成蓝色不透亮，从而用细胞计数仪计数活细胞。在本发明中，除非另外说明，计数的细胞数均是活细胞数。

根据本发明方法获得的神经干细胞可以通过本领域已知方法检测其细胞性质，例如用细胞计数仪对细胞浓度数量进行测定，用ICC(免疫细胞化学)、IHC(免疫组化)、RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)、染色体核型检测等方法检测细胞的种类、类型，用PCR法(聚合酶链式反应)或DNA荧光染色法检测支原体污染情况，用鲎试验检测内毒素，用直接接种法检测无菌性。

对于培养扩增后收获的神经干细胞的鉴定可以通过本领域技术人员熟知的任何方法进行，例如通过检测神经干细胞特异性抗原nestin(巢蛋白)的表达进行特异性鉴定，通过对细胞进行诱导分化然后检测β-Tubulin(β-微管蛋白，神经元细胞特异性标志)、GFAP(胶质纤维酸性蛋白，星形胶质细胞特异性标志)、O4抗原(一种细胞表面抗原，少突胶质细胞早期特异性识别标志)的表达情况鉴定细胞的多向分化潜能。在本发明的一个实施方案中，检测了用本发明所述扩增的神经干细胞的巢蛋白表达情况和诱导分化后β-微管蛋白、GFAP、O4抗原表达情况，检测结果表明本发明方法收获的细胞表达巢蛋白抗原，经诱导后可分化成神经元、星形胶质细胞等神经细胞，符合神经干细胞特征。

在另一个方面，本发明提供了一种用于培养神经干细胞的组合物，其是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，5-30ng/ml的bFGF，5-30ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基。在一个实施方案中，所述用于培养神经干细胞的组合物中bFGF的浓度为5-30ng/ml，例如20ng/ml。在一个实施方案中，所述用于培养神经干细胞的组合物中EGF的浓度为5-30ng/ml，例如20ng/ml。

在另一个方面，本发明还提供了一种营养补充组合物，其是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基。在一个实施方案中，所述营养补充组合物中bFGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。在一个实施方案中，所述营养补充组合物中EGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

在一个实施方案中，上述用于培养神经干细胞的组合物或者营养补充组合物中L-谷氨酰胺的浓度为1.6-2.4mM，例如2mM。在一个实施方案中，上述两种组合物中丙酮酸钠的浓度为0.8-1.2mM，例如1mM。在一个实施方案中，上述两种组合物中NAC的浓度为0.8-1.2mM，例如1mM。在一个实施方案中，上述两种组合物中LIF的浓度为8-12ng/ml，例如10ng/ml。

在本发明的一个实施方案中，所述用于培养神经干细胞的组合物是包含B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)以及LIF(10ng/ml)的DMEM/F12培养基。

在本发明的一个具体实施方案中，所述营养补充组合物是包含B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及LIF(10ng/ml)的DMEM/F12培养基。

在本发明的一个具体实施方案中，所述营养补充组合物是包含B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及LIF(5ng/ml)的DMEM/F12培养基。

本发明所述的组合物可以是液体、固体粉末等任何本领域通常使用的形式。当本发明所述组合物是液体形式时，其可以配制为原液，在使用时稀释为所需的浓度。当本发明的组合物是固体粉末形式时，其可以通过添加溶剂例如水而形成所需浓度的液体形式。

除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。

除非特别指出，本文列出的浓度是在周围环境条件(即25℃和大气压)下的浓度。

附图说明

图1：该图为采用本发明方法对神经干细胞培养扩增后所收获的细胞巢蛋白(神经干细胞标志物)表达情况的免疫检测结果，1a中的荧光表示抗巢蛋白抗体结合的位置，1b中的荧光表示细胞核的位置。

图2：该图为采用本发明方法所收获的细胞经诱导分化后O4抗原(少突胶质细胞早期分化标志物)的免疫检测结果，2a中的荧光表示抗O4抗体结合的位置，2b中的荧光表示细胞核的位置。

图3：该图为采用本发明方法所收获的细胞经诱导分化后GFAP(星型胶质细胞标志物)的免疫检测结果，3a中的荧光表示抗GFAP抗体结合的位置，3b中的荧光表示细胞核的位置。

图4：该图为采用本发明方法所收获的细胞经诱导分化后β-微管蛋白(神经元细胞标志物)的免疫检测结果，4a中的荧光表示抗β-微管蛋白抗体结合的位置，4b中的荧光表示细胞核的位置。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例

本发明使用的试剂除NAC购自SIGMA外，其余试剂均购自Invitrogen。

实施例1

I培养液组成：

培养液A组成为：DMEM/F12溶液，含有B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)以及LIF(10ng/ml)。

营养补充液组成为：DMEM/F12溶液，含有B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及LIF(10ng/ml)。

上述试剂NAC购自SIGMA公司，其余试剂均购自Invitrogen公司。

II培养步骤

复苏人胎儿神经干细胞冻存产品(Cyagen公司，货号HUXNF-01001)1.0×10⁶个细胞(冻存管包装，干冰运输)获得8.2×10⁵个细胞。以1.0×10⁵个细胞/ml的密度接种到2个含有4ml培养液A的T25cm²培养方瓶中，37℃、5％CO₂条件下体外培养48小时。添加0.5ml营养补充液，继续培养72小时后70％神经球直径大于300μm，分离直径大于300μm神经干细胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化、计数，该细胞可以冻存或以1.0×10⁵个细胞/ml的密度接种于新鲜培养液A另行培养。未挑中的直径小于300μm的细胞留在原培养液中，移除30％体积(1.5ml)原培养液，加入同样体积新鲜培养液A后继续培养。6天后收获培养液中继续培养的神经干细胞并计数，两次计数共计获得同一代次的神经干细胞7.1×10⁶个。11天实现神经干细胞扩增8.66倍。

将上述收获的细胞以2.0×10⁵个细胞/ml的密度接种于含有36ml培养液A的T175cm²培养方瓶中在37℃、5％CO₂条件下培养48小时。添加3.6ml营养补充液，继续在37℃、5％CO₂条件下培养72小时后70％神经球直径大于300μm，分离直径大于300μm神经干细胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化、计数，该细胞可以冻存或以2.0×10⁵个细胞/ml的密度接种于新鲜培养液A另行培养。未挑中的直径小于300μm的细胞留在原培养液中，移除1/3体积(12ml)原培养液，加入同样体积新鲜培养液A后继续培养。7天后收获培养液中继续培养的神经干细胞并计数，两次计数共计获得同一代次的神经干细胞7.9×10⁷个。12天实现神经干细胞数量扩增10.97倍。

实施例2

I培养液组成：

培养液A组成为：DMEM/F12溶液，含有B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)以及LIF(5ng/ml)。

营养补充液组成为：DMEM/F12溶液，含有B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及LIF(5ng/ml)。

上述试剂NAC购自SIGMA公司，其余试剂均购自Invitrogen公司。

II培养步骤

从人脐带血(上海血液中心脐带血库)中用密度梯度离心法分离单核细胞层，然后贴壁培养获得间充质干细胞，诱导分化成为神经干细胞(通过在细胞培养基中添加生长因子EGF和bFGF各20ng/ml诱导)，经计数细胞数量5.0×10⁵个细胞。以1.0×10⁵/ml个细胞接种在含有5mL培养液A的T25cm²培养方瓶中，37℃、5％CO₂条件下体外培养48小时。添加0.5ml营养补充液，继续在37℃、5％CO₂条件下培养72小时后观测到70％神经球直径大于250μm，分离直径大于250μm神经干细胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化、计数，该细胞可以冻存或以1.0×10⁵个细胞/ml的密度接种于新鲜培养液A中另行培养。未挑中的直径小于250μm的细胞留在原培养液中，移除30％体积(1.5ml)原培养液，加入同样体积新鲜培养液A后继续培养。6天后收获培养液中继续培养的神经干细胞并计数，两次计数共计获得同一代次的神经干细胞4.14×10⁶个。11天实现神经干细胞数量扩增8.28倍。

实施例3

I培养液组成：

培养液A组成为：DMEM溶液，含有B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)以及LIF(10ng/ml)。

营养补充液组成为：DMEM溶液，含有B27添加剂(1×)、N2添加剂(1×)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、NAC(1mM)、bFGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及LIF(10ng/ml)。

上述试剂NAC购自SIGMA公司，其余试剂均购自Invitrogen公司。

II培养步骤

从ICR鼠脑组织皮层获得密度为3.4×10⁷个细胞的P3代神经球悬液(参考文献：尹国才，架佐，屈素清等，新生鼠大脑皮层神经干细胞培养及其在同胞鼠的细胞替代作用，中华围产医学杂志，2005年7月第8卷第4期，255-258)，接种于含有170ml培养液A的CELLSTACK-636培养方瓶中(接种密度2.0×10⁵个/ml)。在37℃、5％CO₂条件下体外培养48小时。添加17ml营养补充液，继续在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后观测到70％神经球直径大于350μm，挑选分离直径大于350μm神经球，用胰蛋白酶和Dnase I消化，该细胞可以冻存或以2.0×10⁵个细胞/ml的密度接种于培养液A中继续培养。未挑中的直径小于350μm的剩余细胞留在原培养液中，移除1/3体积(57ml)原培养液，补充同样体积新鲜培养液A后继续培养。7天后收获培养液中继续培养的神经干细胞并计数，两次计数共计获得同一代次的神经干细胞4.4×10⁸个。11天实现神经干细胞数量扩增12.94倍。

将上面收获的细胞以2.0×10⁵个/ml分别接种于13个含有170ml培养液A的CELLSTACK-636中，37℃、5％CO₂条件下培养48小时。每瓶添加17ml营养补充液，37℃，5％CO₂条件下继续培养48小时后观测到70％神经球直径大于350μm，分离直径大于350μm神经干细胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化，该细胞可以冻存或以2.0×10⁵个细胞/ml的密度接种于新鲜培养液A中继续培养。未挑中的直径小于350μm的剩余细胞留在原培养液中，移除1/3体积(57ml)原培养液，补充同样体积新鲜培养液A后继续培养。8天后收获原培养液中的神经干细胞并计数，两次计数共计获得同一代次的神经干细胞6.2×10⁹个。12天实现神经干细胞数量扩增14.09倍。

实施例4：用实施例1-3方法获得的扩增的神经干细胞的鉴定

A.神经干细胞特异性抗原巢蛋白的检测

(1)用吸管取少量细胞悬液滴于经多聚赖氨酸包被的多孔板上，置37℃培养箱2h，使细胞粘附于载玻片上

(2)用4％多聚甲醛+0.3％戊二醛固定15min，计2次

(3)用PBS漂洗3次后，用含5％正常山羊血清的PBS(含0.1％TritonX-100)在37℃温育30min进行封闭

(4)吸去封闭液，加抗巢蛋白单克隆抗体(购自BD Pharmingen)，37℃温育3h后，用含0.1％Triton X-100的PBS漂洗3次，各10min

(5)加荧光标记第二抗体(购自Jackson)和DAPI染色液(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，一种细胞核染色剂)，37℃温育45min

(6)用PBS漂洗3次，用封片液封片，荧光显微镜下观察结果。

实验结果如图1所示，其中1a中的荧光表示抗巢蛋白抗体的结合位置，1b中的荧光表示细胞核的位置，实验结果说明细胞表达神经干细胞标志物巢蛋白。

B.多向分化潜能的鉴定

1、诱导分化：

取培养的神经干细胞接种于用多聚赖氨酸(PLL)包被的多孔板中，培养液为DMEM/F12+1×B27+20ng/ml bFGF，培养5-7天。

2、与抗O4抗体反应：

(1)移去培养液，每孔加鼠抗O4IgM抗体(购自Millipore)，室温反应30min

(2)移去抗O4抗体，每孔加PHEM固定液(60mM PIPES，25mMHEPES，10mM EGTA，2mM MgSO4，pH 7.0)，反应10min，移去PHEM固定液，用PBS洗涤3次

(3)每孔加入荧光标记的第二抗体(DyLight 549标记的猴抗鼠IgM(购自Jackson))，室温反应45min，移去第二抗体，用PBS洗涤5次

(4)每孔加入封闭血清，室温封闭1h，用PBS洗涤3次

(5)每孔加入DAPI染色液，室温反应1h，，用PBS洗涤5次

(6)用荧光倒置显微镜在不同波长下拍照，检测抗O4抗体结合情况和DAPI结合情况。

3、与抗GFAP抗体反应

(1)移去培养液，每孔加PHEM固定液(60mM PIPES，25mM HEPES，10mM EGTA，2mM MgSO4，pH 7.0)，反应10min，移去PHEM固定液，用PBS洗涤3次

(2)每孔加入封闭血清，室温封闭1h

(3)移去封闭血清，每孔加入400ul兔抗GFAP IgG抗体(购自Dako)，室温反应45min，用PBS洗涤三次

(4)每孔加入荧光标记的第二抗体(羊抗兔IgG(购自Invitrogen))和DAPI染色液，室温反应1h，用PBS洗涤五次

(5)用荧光倒置显微镜在不同波长下拍照，检测抗GFAP抗体结合情况和DAPI结合情况。

4、与抗β-微管蛋白抗体反应：

(1)移去培养液，每孔加PHEM固定液(60mM PIPES，25mM HEPES，10mM EGTA，2mM MgSO4，pH 7.0)，反应10min，移去PHEM固定液，用PBS洗涤3次

(2)每孔加入封闭血清，室温封闭1h

(3)移去封闭血清，每孔加入鼠抗β-微管蛋白IgG2b抗体(购自Sigma)，4℃反应12-16h，用PBS洗涤三次

(4)每孔加入荧光标记的第二抗体(羊抗鼠IgG2b(购自Invitrogen))和DAPI染色液，室温反应1h，用PBS洗涤五次

(5)用荧光倒置显微镜在不同波长下拍照，检测抗β-微管蛋白抗体结合情况和DAPI结合情况。

5、实验结果

如图2至图4所示，2a、3a、4a中的荧光部分分别表示抗O4抗体、抗GFAP抗体、抗β-微管蛋白抗体结合位置，2b、3b、4b中的荧光部分表示细胞核位置，实验结果表明诱导后的细胞表达少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元标志物O4抗原、GFAP和β-微管蛋白，分别说明细胞被诱导后向少突胶质细胞、星型胶质细胞和神经元细胞方向发生了分化。

Claims (22)

1.一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括：

(a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM或DMEM/F12培养基中培养2、3或4天；

(b)添加5-20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的N乙酰半胱氨酸(NAC)，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM或DMEM/F12培养基；

(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；

(d)留在原培养基中的直径小于所述阈值的剩余细胞在将培养基移除1/2-1/4体积并添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基后继续培养；

(e)在(a)接种神经干细胞后第10、11、12、13、14或15天通过合并(c)收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。

2.权利要求1的方法，其中(a)的培养基为包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，5-30ng/ml的bFGF，5-30ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM或DMEM/F12培养基。

3.权利要求2的方法，其中(a)的培养基中bFGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

4.权利要求2的方法，其中(a)的培养基中EGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中L-谷氨酰胺的浓度独立地为1.6-2.4mM，例如2mM。

6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中丙酮酸钠的浓度独立地为0.8-1.2mM，例如1mM。

7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中NAC的浓度独立地为0.8-1.2mM，例如1mM。

8.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中LIF的浓度独立地为8-12ng/ml，例如10ng/ml。

9.权利要求1-4任一项的方法，其中(b)的营养补充液中bFGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

10.权利要求1-4任一项的方法，其中(b)的营养补充液中EGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

11.权利要求1或2的方法，其中在(a)中神经干细胞在包含bFGF和EGF的培养基中培养2或3天。

12.权利要求1或2的方法，其中在(b)中添加营养补充液后继续培养2或3天后分离神经球。

13.一种组合物，其是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，5-30ng/ml的bFGF，5-30ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基。

14.权利要求13的组合物，其中bFGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

15.权利要求13的组合物，其中EGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

16.一种组合物，其是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基。

17.权利要求16的组合物，其中bFGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

18.权利要求16的组合物，其中EGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

19.权利要求13-18任一项的组合物，其中L-谷氨酰胺的浓度为1.6-2.4mM，例如2mM。

20.权利要求13-18任一项的组合物，其中丙酮酸钠的浓度为0.8-1.2mM，例如1mM。

21.权利要求13-18任一项的组合物，其中NAC的浓度为0.8-1.2mM，例如1mM。

22.权利要求13-18任一项的组合物，其中LIF的浓度为8-12ng/ml，例如10ng/ml。

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