CN109652374A - 一种用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种神经干细胞的无血清培养基，其成分包括基础培养基、营养添加剂、生长因子、细胞因子和抗氧化剂。细胞因子为LIF和IL‑6中的至少一种；抗氧化剂为抗坏血酸。上述培养基配方简单、成本低廉，能用于神经干细胞的体外培养，显著地降低神经干细胞体外培养时的细胞凋亡率，提高神经干细胞的增殖速率，有效降低体外培养时的细胞凋亡率，可以用于维持神经干细胞较长时间的体外培养，维持神经干细胞的干性以及长时间体外培养后的自我更新能力。

Description

一种用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及干细胞培养的方法，具体为神经干细胞的无血清培养基。
背景技术
神经干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，存在于哺乳动物中枢神经系统内，可以通过对称分裂和非对称分裂这两种方式来生成中枢神经系统内大多数的细胞类型：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
在大脑发育过程中，神经干细胞可以分化为新的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可构建大脑结构与功能单元；在大脑发育成熟后，神经干细胞依然具有有限的再生能力，为大脑损伤修复提供可能。
神经干细胞作为生物医学工程以及体外模型研究中的种子细胞，需要将其在体外进行扩大培养，而如何维持神经干细胞的体外培养便成为了医学研究的重点。目前培养神经干细胞常用的基础培养基一般是商品化的DMEM/F12medium和Neurobasal medium。培养神经干细胞最常用的配方是：DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF。其中DMEM/F12为常用的基础培养基，负责提供细胞生长必须的无机盐、维生素、氨基酸、葡萄糖、有机物等物质；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和上皮细胞生长因子(EGF)是生长因子，负责调控相关的信号通路来维持细胞的自我更新能力；是N2和B27常用的营养添加剂，负责提供细胞生长必须的蛋白、激素、微量元素等成分。B27成分复杂，含有牛血清白蛋白，能支持神经干细胞的生长；N2虽然含有胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和硒酸钠五种成分，但是缺乏一些细胞生长需求物，不能长期支持神经干细胞的生长。
现有的神经干细胞培养基存在细胞贴壁性差、增殖能力有限、自发分化比较严重等问题，不能很好地维持神经干细胞的培养，因此，需要提供一种新型的能够维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，以解决上述问题。
发明内容
针对现有技术上的不足，本发明旨在提供一种维持神经干细胞体外培养的无血清培养基。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下。
一种用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基、营养添加剂、生长因子、细胞因子和抗氧化剂。所述的营养添加剂为N2和B27中的至少一种，所述的细胞因子为LIF和IL-6中的至少一种；所述的生长因子为表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种。
优选的，所述的营养添加剂为N2和B27。
优选的，所述的基础培养基为DMEM/F12。
优选的，所述的生长因子为表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，且表皮生长因子的含量为5～25ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的含量为5～25ng/ml。。
更优选，表皮生长因子的含量为5～15ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的含量为5～15ng/ml。进一步，表皮生长因子的含量为8～12ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的含量为8～12ng/ml。
优选的，所述的细胞因子为LIF和IL-6，且LIF的含量为1～10ng/ml，IL-6的含量为5～25ng/ml。更优选的，LIF的含量为2～8ng/ml，IL-6的含量为5～15ng/ml。进一步，LIF的含量为4～6ng/ml，IL-6的含量为8～12ng/ml。
优选的，所述的抗氧化剂为抗坏血酸，含量为5～20μg/ml，更优选为8～15μg/ml。
本发明的一个优选方案中，培养基以DMEM/F12为基础培养基，并添加营养添加剂为N2和B27、10ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、5ng/ml LIF、10ng/ml IL6和8～12μg/ml抗坏血酸。
一种含有神经干细胞的体外培养物，含有上述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基。
一种培养神经干细胞的方法，使用上述无血清培养基。具体为，在35℃～39℃、3％～8％CO2条件下，使用上述无血清培养基，贴壁培养神经干细胞。若培养时间超过1天时，每1～3天更换培养基。优选的，每2天更换培养基。
本发明所提供的无血清培养基，能够维持神经干细胞的体外培养，不仅提高细胞的生长速度，促进细胞增殖，还可以在神经干细胞体外增殖时维持其干性，并促进神经干细胞形成神经球。此外，该培养基还能够显著维持神经干细胞体外培养时的自我更新能力，可增加细胞体外培养时间；并且即使经过多代体外培养，也能够维持干性，并且形成神经球的效果好，能产生更多的神经球。
本发明的无血清培养基，配方简单、成本低廉，用于神经干细胞的体外培养，可显著地降低神经干细胞体外培养时的细胞凋亡率，提高神经干细胞的增殖速率，有效降低体外培养时的细胞凋亡率，可以用于维持神经干细胞较长时间的体外培养，维持神经干细胞的干性以及长时间体外培养后的自我更新能力。
附图说明
图1为实施例1、2用传统培养基和实验组培养基分别培养的神经干细胞凋亡情况(A)和增殖情况(B)。
图2为实施例3用传统培养基和实验组培养基分别培养神经干细胞后，NESTIN和SOX2双阳性细胞比例(A)和NESTIN和PAX6双阳性细胞比例(B)。
图3为实施例4用传统培养基和实验组培养基分别培养的神经干细胞后，所形成的神经球数量及尺寸。
图4为实施例5用实验组培养基及含不同细胞因子培养基分别培养神经干细胞32代后，所形成的神经球数量及尺寸。
具体实施方式
实施例1检测神经干细胞的凋亡情况
将神经干细胞分为两组，对照组神经干细胞采用传统培养基(培养基1)：DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF；实验组的神经干细胞采用新型培养基(培养基2)：DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF+5ng/ml LIF+10ng/ml IL6+10ug/ml抗坏血酸(Ascorbic acid)。
细胞培养方法如下：
(1)将神经干细胞分为两组，对照组神经干细胞采用传统培养基：DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF，实验组的神经干细胞采用新型培养基：DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF+5ng/ml LIF+10ng/ml IL6+10μg/ml抗坏血酸；
(2)两组细胞分别培养24h后(置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育)，细胞计数，取106个细胞于5ml流式管中，1000r/min离心5min，弃培养基。
(3)加入PBS缓冲液洗涤一次，500-1000r/min离心5min，弃PBS。
(4)用5μl Annexin V/FITC(20ug/ml)溶液重悬细胞，室温避光孵育10-15min。
(5)接着加入5μl PI(20ug/ml)溶液，在4℃下孵育20min，避光并不时震动。
(6)最后加入400μl结合缓冲液，放入流式细胞仪检测。流式细胞仪激发光波长用488nm，用515nm的波长检测FITC荧光，用560nm的波长检测PI。
(7)用同样的方法分别检测2种培养基培养的神经干细胞2、3、4天后的细胞凋亡情况。
如图1A所示，培养基1为传统培养基(对照组)，培养基2为新型培养基(实验组)，前2天对照组和实验组细胞凋亡率差异不大，但是第3天和第4天实验组神经干细胞的凋亡率明显低于对照组(*p<0.05)，这表明新型培养基可以有效降低神经干细胞体外培养时的细胞凋亡率。
实施例2检测神经干细胞的增殖状况
采用与实施例1相同的对照组和实验组培养基，方法如下：
(1)神经干细胞计数后，每孔按3×103个将神经干细胞接种至96孔板中，设置5个复孔，对照组加入100μL传统培养基，实验组加入100μL新型培养基，置于细胞培养箱中培养24h(37℃，5％CO2)。
(2)每个孔加入10μl CCK8，置入培养箱中孵育30min-1h后，用酶标仪测波长为450nm的OD值。
(3)用同样的方法分别检测2种培养基培养的神经干细胞1、2、3、4天后的细胞的增殖情况。
如图1B所示，对照组(培养基1)和实验组(培养基2)在培养24h之后神经干细胞增殖情况无差异，但是2-5天内实验组的神经干细胞增殖加快，尤其是第5天实验组神经干细胞与对照组相比，增殖率显著提高(**p<0.01)，这表明新型培养基可以显著促进神经干细胞的体外增殖。
实施例3检测维持神经干细胞体外增殖时的干细胞标志物
(1)针对两种不同培养基的神经干细胞(对照组加入传统培养基，实组加入验型新培养基)，分别在体外培养1周、2周3周和4周后(置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育，每两天更换一次培养基)，将灭菌的细胞爬片用镊子夹到24孔板内，每组做2个复孔，细胞计数后取20000个细胞种到24孔板的细胞爬片上，置于细胞培养箱中培养。
(3)24h后待细胞贴壁，吸出培养基，加入PBS缓冲液，置于摇床上200转5min，漂洗3次，洗去细胞碎片和多余的培养基。
(4)吸干净PBS缓冲液，每孔加入200μ4％多聚甲醛，上下摇晃均匀，静置10min。
(5)弃免疫染色固定液，加入PBS缓冲液，置于摇床上200转5min，漂洗3次。
(6)之后吸干净PBS缓冲液，每孔加入200μl0.5％Triton(用PBS将100％的Triton稀释为0.5％，稀释比例为1:200)，上下摇晃均匀，静置20min。
(7)弃0.5％Triton，加入1mLPBS缓冲液，置于摇床上200转5min，漂洗3次。
(8)吸干净PBS缓冲液，每孔加入200μl 5％BSA封闭液(称取BSA固体溶于PBS中)，静置1h。
(9)回收5％BSA封闭液，每孔分别加入200μl SOX2一抗、PAX6一抗、NESTIN一抗，上下摇晃均匀，放于4℃过夜(或室温孵育12h)。
(10)第二天回收一抗，加入PBS缓冲液，置于摇床上200转5min，漂洗三次。
(11)每孔加入200μl携带荧光的二抗，锡箔纸包裹24孔板，上下摇晃均匀，放于避光处室温孵育90-105min。
(12)弃二抗，加入1mLPBS缓冲液，置于摇床上200转5min，漂洗三次。
(13)吸干净PBS，每孔加入200μl DAPI染色液，上下摇晃均匀，静置4min。
(14)弃DAPI染色液，加入PBS缓冲液，置于摇床上200转5min，漂洗三次。
(15)将载玻片放在锡箔纸上，载玻片上滴一滴荧光萃取液，并做好细胞种类的标记，将PBS洗干净，用钩子和镊子将爬片取出，有细胞的一面与荧光萃取液接触(爬片倒扣在载玻片上)，立即将最外层的锡箔纸包好，并在锡箔纸外层做好标记。
如图2A所示，两种培养基培养2、3、4周后与对照组相比，实验组NESTIN和SOX2双阳性细胞明显增加(*p<0.05)，表明新型培养基可以显著维持神经干细胞体外增殖时的神经干细胞标志物NESTIN和SOX2。如图2B所示2、3、4周后，实验组标志物NESTIN和PAX6双阳性细胞与对照组相比明显增多(*p<0.05)，这表明新型培养基可以显著维持神经干细胞体外增殖时的干细胞标志物NESTIN和PAX6。
实施例4检测两种培养基培养神经干细胞自我更新能力
(1)神经干细胞计数后，每孔按1000个将神经干细胞接种至96孔板中，设置2个复孔，对照组加入传统培养基(DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF)，实验组加入新型培养基(DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF+5ng/ml LIF+10ng/ml IL6+10ug/ml Ascorbic acid)，置于细胞培养箱中培养(置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育，每两天更换一次培养基，神经球形成后根据培养情况每4-5天消化一次)。
(2)培养4周后统计孔内神经球的个数。
如图3所示，神经干细胞在两种不同培养基体外培养4周后，实验组20-50μm的神经球和51-80μm的神经球多于对照组(*p<0.05)，尤其是81-110μm的神经球，实验组远远多于对照组(**p<0.01)，这表明新型培养基可以显著维持人神经干细胞体外培养时(培养4周后)的自我更新能力。
实施例5检测含有不同细胞因子的培养基培养神经干细胞自我更新能力
用以下培养基分别将神经干细胞培养32代，并按照实施例4的方法进行神经球形成实验。
培养基2(实验组的新型培养基)：
DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF+5ng/ml LIF+10ng/ml IL6+10μg/ml抗坏血酸；
培养基3：
DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF+5ng/ml LIF；
培养基4：
DMEM/F12+N2+B27+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF+10ng/ml IL6；
结果如图4所示，培养基2效果显著高于培养基3和4(*P<0.05)。结果证明，新型培养基能够使神经干细胞在体外培养时，干性维持更长时间；与其他培养基相比，用新型培养基经过多代培养的神经干细胞，在进行神经球形成的实验中，具有更好的效果，能形成更多数量的神经球。

Claims (10)

1.一种用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基、营养添加剂、生长因子、细胞因子和抗氧化剂，所述的营养添加剂为N2和B27中的至少一种，所述的细胞因子为LIF和IL-6中的至少一种；所述的生长因子为表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，所述的生长因子为表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；且表皮生长因子的含量为5～25ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的含量为5～25ng/ml。
3.根据权利要求1所述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，所述的细胞因子为LIF和IL-6，且LIF的含量为1～10ng/ml，IL-6的含量为5～25ng/ml。
4.根据权利要求1或2所述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，表皮生长因子的含量为5～15ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的含量为5～15ng/ml。
5.根据权利要求1或3所述用于所述维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，所述的细胞因子为LIF和IL-6，且LIF的含量为2～8ng/ml，IL-6的含量为5～15ng/ml。
6.根据权利要求1或3所述用于所述维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，LIF的含量为4～6ng/ml，IL-6的含量为8～12ng/ml。
7.根据权利要求1所述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，所述的抗氧化剂为抗坏血酸，含量为5～20μg/ml。
8.根据权利要求1所述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基，其特征在于，所述的营养添加剂为N2和B27，所述的基础培养基为DMEM/F12。
9.一种含有神经干细胞的体外培养物，其特征在于，含有权利要求1～8任一项所述用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基。
10.一种培养神经干细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1～8任一项所述的无血清培养基。
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