CN107236707A - 用于制备神经干细胞的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种用于制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，包括神经组织保存液、神经组织洗涤液、神经组织分解液、细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞消化液、继代细胞培养液、细胞冻存液；本发明的优点是：提供的试剂盒进行神经干细胞的培养更加方便，成本较低，神经干细胞的活性较强，培养过程中更加稳定，成功率较高，可以大批量培养神经干细胞。

Description

用于制备神经干细胞的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于制备神经干细胞的试剂盒。
背景技术
神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。根据分化潜能的时序分为：主要存在胚胎时期的神经管上皮细胞、放射状胶质神经元和神经母细胞，其中，放射状胶质神经元主要存在于幼年时期，可以分裂并同时产生神经元前体细胞或是胶质细胞；神经母细胞主要存在于成年动物体中，可以产生神经前体细胞、神经元和各类神经胶质细胞。根据部位主要分两类：神经嵴干细胞和中枢神经干细胞。目前将具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞都统称为神经干细胞。
在神经系统疾病的治疗方面，除了传统的药物、手术及康复治疗外 ，近年来细胞移植治疗神经系统疾病研究得到了广泛开展，主要包括骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞与神经干细胞移植等。2009年，研究者成功的将人胚胎干细胞注射到脊髓损伤的大鼠体内，从而使大鼠恢复了运动能力，但直接注射胚脂干细胞存在形成肿瘤的风险，经过大量实验证明，利用神经干细胞进行细胞移植治疗神经系统疾病是有效且安全的选择，神经干细胞不具有成瘤性，具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能；是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别，具有低免疫源性；其组织融合性好，可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活，是最理想的细胞移植材料。因此，业内一直致力于神经干细胞的临床应用研究。
神经干细胞可以由胚胎干细胞、诱导多能干细胞和其它干细胞分化而来。胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群和原始的生殖细胞着床前胚胎内细胞团中分离出来的一种全能性的多功能神经干细胞，这种细胞可以在体外进行扩增培养，因此，提供无致瘤性、且能够在体外快速增殖、稳定传代、大量培养神经干细胞成为目前的当务之急。
神经干细胞的体外培养一直是一个比较困难的课题，其难点在于两点，一是所需试剂和因子的浓度配比需要摸索，花费了大量的时间和精力才能达到最佳的配方；二是传统的神经干细胞体外培养是通过悬浮培养神经球，观察神经球数量倍增后，通过离心，扩瓶培养达到传代的目的。这种悬浮培养的方法，神经干细胞增殪缓慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很难收获大量的神经干细胞。因此这使得相关的科研工作者很难得到大量的神经干细胞来进行相关的研究工作。为解决传统的神经干细胞体外培养是通过悬浮培养神经球，观察神经球数量倍增后，通过离心，扩瓶培养达到传代的目的，这种悬浮培养的方法，神经干细胞增殖缓慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很难收获大量的神经干细胞等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备神经干细胞的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供了一种用于制备神经干细胞的试剂盒，包括神经组织保存液、神经组织洗涤液、神经组织分解液、细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞消化液、继代细胞培养液、细胞冻存液；其中，继代细胞培养液为神经干细胞的含血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、50～250ug/ml的胎牛血清、10～20ng/ml的bFGF、10～20ng/ml的EGF、0.5～2. 5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成，所述神经组织保存液为含有链霉素50～250ug/ml、青霉素50～250ug/ml的RPMI-1640、DMEM、Q-MEM、DMEM/F12中的一种或两种以上混合的培养基，神经组织洗涤液为含有青霉素50～250ug/ml、链霉素50～250ug/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks中的一种，神经组级分解液为含胶原酶I／胶原酶IV1～2mg/ml、脱氧核糖核酸10.1～0.2mg／ml的DMEM、DMEM/F12、MEM、RPMI-1640中的一种或两种以上混合的培养基 ，细胞洗涤液为PBS/D-Hanks，原代细胞培养液为神经干细胞的无血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、10～20ng/ml的bFGF、10～20ng/ml的EGF、15～25ug/ml的B27、10～15ug/ml的N2、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成，细胞消化液为含1.5～2.5mg/ml的胰蛋白酶、0.1～0.25mg/ml的EDTA的PBS ，细胞冻存液为含DMS0 50～200mg／ml的神经干细胞胎牛血清生长培养基。
本发明的优点是：提供的试剂盒进行神经干细胞的培养更加方便，成本较低，神经干细胞的活性较强，培养过程中更加稳定，成功率较高，可以大批量培养神经干细胞。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描迷。
本发明所述的实施例为用于制备神经干细胞的试剂盒，包括神经组织保存液、神经组织洗涤液、神经组织分解液、细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞消化液、继代细胞培养液、细胞冻存液；继代细胞培养液为神经干细胞的含血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、50ug/ml的胎牛血清、lOng／ml的bFGF、lOng／ml的EGF、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0. 5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成。继代细胞培养液为获得的神经干细胞贴壁培养液，使神经干细胞得以贴壁培养，具有更强的活性。
所述的神经组织保存液为含有链霉素50ug/ml、青霉素50ug／ml的RPMI-1640、DMEM、a-MEM、DMEM/F12中的一种或两种以上混合的培养基。神经组织保存液的作用是保证神经组织在取样后的活性以及灭菌。
神经组织洗涤液为含有青霉素50ug/ml、链霉素50ug/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks中的一种。神经组织洗涤液的作用是洗涤神经组织并除去血液以及灭菌。
神经组织分解液为含胶原酶I／胶原酶IVlmg／ml、脱氧核糖核酸IO. Img／ml的DMEM、DMEM/F12、MEM、RPMI-1640中的一种或两种以上混合的培养基。神经组织分解液的作用是消化神经组织，获得单细胞悬液。
细胞洗涤液为PBS/D-Hanks。细胞洗涤液的作用是洗涤获得的干细胞去除各种液体残留。
原代细胞培养液为神经干细胞的无血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、lOng／ml的bFGF、lOng／ml的EGF、15ug/ml的B27、lOug／ml的N2、0. 5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成。原代细胞培养液为无血清生长培养基，用于悬浮神经干细胞形成神经球。
细胞消化液为含1.5mg/ml的胰蛋白酶、0.Img／ml的EDTA晌PBS。细胞消化液的作用是细胞传代时，消化贴壁的神经干细胞。
细胞冻存液为含DMS0 50mg/ml的神经干细胞胎牛血清生长培养基。细胞冻存液的作用是冻存获得的神经干细胞。
本发明提供的试剂盒中所选用的各种试剂都是经过实验室长期实验确定下来的，本发明提供了一种培养神经干细胞的最佳配方，使用该试剂盒，可在较短时间获得大量神经干细胞，并且具有低成本、易操作、效率高等特点，将在干细胞相关研究及其临床试验中发挥重要作用，具有非常好的发展前景。
经过试验得知，使用实施例提供的试剂盒约2cff13的脑组织，可以在3周内(21天)获得Pl代神经干细胞2.3×10 7个，至P3代可得1×109个神经干细胞，因此可以表明利用本试剂盒可以在短时间内获得大量的神经干细胞。

Claims (1)

1.一种用于制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，包括神经组织保存液、神经组织洗涤液、神经组织分解液、细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞消化液、继代细胞培养液、细胞冻存液；其中，继代细胞培养液为神经干细胞的含血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、50～250ug/ml的胎牛血清、10～20ng/ml的bFGF、10～20ng/ml的EGF、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成，所述神经组织保存液为含有链霉素50～250ug/ml、青霉素50～250ug/ml的RPMI-1640、DMEM、a-MEM、DMEM/F12中的一种或两种以上混合的培养基，神经组织洗涤液为含有青霉素50～250ug/ml、链霉素50～250ug/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks中的一种，神经组织分解液为含胶原酶I／胶原酶IV1～2mg/ml、脱氧棱糖核酸10.1～0.2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM、RPMI-1640中的一种或两种以上混合的培养基，细胞洗涤液为PBS/D-Hanks，原代细胞培养液为神经干细胞的无血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、10～20ng／ml的bFGF、10～20ng/ml的EGF、15～25ug/ml的B27、10～15ug/ml的N2、0.5～2.5mmol／ml的谷氨酰胺、0.5～2. 5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成 ，细胞消化液为含1.5～2. 5mg／ml的胰蛋白酶、0.1～0.25mg／ml的EDTA的PBS ，细胞冻存液为含DMS050～200mg/ml的神经干细胞胎牛血清生长培养基。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109652374A (zh) * 2019-02-27 2019-04-19 赛璟生物医药科技(上海)有限公司 一种用于维持神经干细胞体外培养的无血清培养基

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