CN109385398A - 一种化学成分确定的细胞培养基及其应用 - Google Patents

一种化学成分确定的细胞培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种化学成分确定的培养基及其应用。本发明提供了一种培养基添加物，并提供了含有该添加物的化学成分确定的培养基，实验结果表明，本发明提供的添加物能够替代血清，且在促进细胞生长方面更有优势。其适用于培养多种细胞，特别适合用于培养神经细胞，从而避免神经细胞与血清接触，做大限度的模拟体内细胞生长环境，还适用于培养成纤维细胞，从而避免成纤维细胞在转化医学应用时刺激机体产生抗体的可能。本发明提供的添加物性质稳定，4℃环境可稳定保存3～4个月。

Description

一种化学成分确定的细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种化学成分确定的细胞培养基及其应用。
背景技术
使用添加血清的培养基进行细胞培养已有漫长历史。血清中含有细胞培养所需的多种营养成分和因子，但是，目前，市面上的血清种类繁多，例如，根据血源产地，可分为：国产血清、进口血清(澳洲来源、新西兰来源等)；根据种属，可分为：牛血清、马血清等；根据动物的年龄，例如，可分为：胎牛血清、小牛血清等。实际应用中，面对多种商品化的血清很难确定哪一种更加适用；并且，由于血清品质受到血源物种的身体状况影响，即便同一种来源的血清也存在不同批次组分差异较大的现象，从而导致实验难以很好的重复；另外，有些商品化的血清会因特殊疾病疯牛病引起血清的进口受限等。尽管血清存在缺点，但使用血清有诸多益处，因此，它们已广泛存在许多细胞培养的应用之中。
对科学研究及临床研究而言，实验条件的稳定性与可控性是实验成功与否的关键因素。血清来源广，成分复杂且不明确，批次间差异大，对实验目标的影响无法确定，使科研及临床研究重复性差，影响实验结果。
由于血脑屏障的存在，有些细胞在生物体内实际是不与血清接触的，例如：神经细胞；神经细胞包括神经元(neurons)和星形胶质细胞(astrocytes，AST)，在中枢神经系统活动中发挥重要作用。体外培养神经细胞是对大脑功能研究的重要手段。但这些细胞在进行体外培养研究时，如采用含有血清的培养基进行培养，虽然能够保证其具有较高的活性，但却无法真实的模拟体内的环境。
皮肤成纤维细胞不仅在创伤修复方面发挥着重要的功能，由成纤维细胞重编程得到诱导多能干细胞，可诱导分化成多种细胞，例如：神经细胞、心肌细胞等，为疾病的治疗提供了新途径。对转化医学而言，血清中存在的多种抗原，使用添加血清培养基培养出来的细胞进行在体实验时，存在刺激机体产生抗体的可能，使科研成果应用到临床遥不可及。
使用化学成分确定的培养基的益处包括：减少血清批次间差异造成的实验批间差异，最大程度地增加实验条件的稳定性与可控性。因此，本领域需要一种化学成分确定的细胞培养基，使细胞培养的效果不劣于添加血清培养基，且能够使实验条件更加严格可控，对脑内神经细胞的研究可能会有重大改变，成纤维细胞在转化医学各方面的应用更加安全。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种化学成分确定的细胞培养基及其应用；本发明提供的添加物用于细胞的培养，能够取得优于或相当于添加血清进行培养的效果。
本发明提供的添加物包括如下质量份的：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 2.5×10-4～2.5×10-2份。
本发明提供的添加物在细胞培养中的应用。
本发明提供的添加物化学成分明确，能够避免血清对培养细胞造成的一系列不利影响，例如：血清对细胞的毒性作用，使细胞发生基因改变等；使用该添加物能够使实验条件更加稳定、可控，从而使因血清选择及批次间差异而造成的实验可重复性差的弊端得以消除。
本发明提供的添加物可为粉末状固体，也可以溶液形式存在，本发明对此不做限定。其中各组分皆可于市场购得。当其以溶液形式存在时，每5ml溶液中包括：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 2.5×10-3mg。
实验表明，本发明提供的添加物能够代替血清，与使用血清进行培养的细胞相比，使用本发明添加物培养细胞生长、增殖速度更快，表明本发明提供的添加物在促进细胞生长方面更有优势。
本发明中，进行实验的细胞为神经细胞或皮肤细胞。
其中，所述神经细胞为星形胶质细胞，所述皮肤细胞为成纤维细胞。
本发明还提供了一种化学成分确定的细胞培养基，其包括基础培养基和本发明所述的添加物。
本发明所述的基础培养基为DMEM培养基和NB培养基的混合物，其中，DMEM培养基与NB培养基的体积比为0.75:1.25～1.25:0.75。
具体实施例中，DMEM培养基与NB培养基的体积比为1:1。
本发明提供的化学成分确定的培养基中，葡萄糖的浓度为5.5mM～25mM。本发明实施例中，制得化学成分确定的培养基中葡萄糖的浓度为12.5mM；培养基的pH值为7.49±0.04。
本发明提供的化学成分确定的培养基中还包括青霉素和链霉素。
所述青霉素的浓度为50U/mL～100U/mL；所述链霉素的浓度为50μg/mL～100μg/mL。
本发明一些实施例中，每500mL本发明提供的化学成分确定的培养基包括：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 2.5×10-4～2.5×10-2mg。
一个具体实施例中，每500mL本发明提供的化学成分确定的培养基包括：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 2.5×10-3mg。
本发明还提供了一种细胞培养方法，该方法以本发明提供的化学成分确定的细胞培养基培养细胞。
本发明添加物适用的细胞包括神经细胞或皮肤细胞。
本发明中，进行实验的细胞为神经细胞或皮肤细胞。
其中，所述神经细胞为星形胶质细胞，所述皮肤细胞为成纤维细胞。
具体的，本发明提供的星形胶质细胞的培养方法包括：
将神经细胞接种于本发明所述的化学成分确定的细胞培养基，培养15min后，去掉上清液，添加新鲜的本发明所述的化学成分确定的细胞培养基；培养4天后，半量换液，此后每隔2-3天半量换液；培养至汇合度为80％～90％，传代。
所述培养的条件为37℃，5％CO2。
所述神经细胞为新鲜分离的神经细胞。经过本发明培养基培养后，神经细胞中的星形胶质细胞得到大量的增殖，而其他细胞则不见增殖。
所述培养的容器经过包被，所述包被采用多聚赖氨酸、明胶、Matrigel胶、胶原蛋白、纤连蛋白中至少一种。本发明实施例采用聚-L-赖氨酸对容器进行包被。
原代培养的星形胶质细胞的获得方式为：将脑组织块切碎至约1mm3大小；然后用本发明提供的化学成分确定的细胞培养基制成细胞悬液，差速贴壁15min，去掉上清液，获得原代星形胶质细胞。所述传代包括：将细胞以胰酶消化至表面皱缩，加大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰酶消化作用，用足量的新鲜培养基，制成细胞悬液，将细胞接种至本发明化学成分确定的培养基，培养至汇合度为80％～90％，再次传代。
本发明实验表明，采用本发明提供的培养基进行星形胶质细胞的原代培养和传代培养时，只需通过15分钟差速贴壁，即可最大程度地减少细胞碎片并使大多数的星形胶质细胞贴壁生长。而本发明方法中适宜的半量换液的频率能够保证细胞获得充分的营养，从而迅速生长。
本发明还提供了一种成纤维细胞的培养方法包括：
以本发明所述的化学成分确定的细胞培养基培养皮肤组织，培养4天后，半量换液，此后每隔2～3天半量换液；培养至汇合度为80％～90％，传代。
具体的，成纤维细胞的培养方法包括：
将皮肤组织剪成2mm×2mm的小块，将皮肤组织块表皮层朝上真皮层朝下，贴到细胞培养板上。接种于本发明所述的化学成分确定的细胞培养基，培养4天后，半量换液，此后每隔2～3天半量换液，培养至汇合度为80％～90％，传代。若细胞为冻存细胞，离心后去冻存液，DPBS洗后用新鲜培养基重悬，接种于本发明化学成分确定的细胞培养基，培养至汇合度为80％～90％，传代。
所述培养的条件为37℃，5％CO2。
所述培养的容器经过包被，所述包被采用多聚赖氨酸、明胶、Matrigel胶、胶原蛋白、纤连蛋白中至少一种。本发明实施例采用聚-L-赖氨酸对容器进行包被。
所述传代包括：将细胞以胰酶消化至表面皱缩，加大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰酶消化作用，用足量的新鲜培养基，制成细胞悬液，将细胞接种至本发明化学成分确定的培养基，培养至汇合度为80％～90％，再次传代。
本发明提供了培养基添加物，并提供了含有该添加物的化学成分确定的培养基，实验结果表明，本发明提供的添加物能够替代血清，且在促进细胞生长方面更有优势。其适用于培养多种细胞，特别适合用于培养神经细胞，从而避免神经细胞与血清接触，做大限度的模拟体内细胞生长环境；还适用于培养成纤维细胞，避免了使用添加血清培养基培养出来的细胞进行在体实验时刺激机体产生抗体的可能。本发明提供的添加物性质稳定，4℃环境可稳定保存3～4个月。
附图说明
图1示使用实施例1化学成分确定的细胞培养基培养星形胶质细胞，差速贴壁15min后，上清液和差速贴壁后星形胶质细胞分别培养3天后的状态，其中A示上清液培养3天的生长状态；B示差速贴壁后星形胶质细胞培养3天的生长状态；
图2示使用实施例1化学成分确定的细胞培养基培养原代星形胶质细胞的生长状态，其中，A、B、C依次示原代星形胶质细胞生长至第3天、第5天、第7天的生长状态；
图3示使用实施例1化学成分确定的细胞培养基传代培养星形胶质细胞培养至第3天的生长状态；
图4示使用实施例1化学成分确定的细胞培养基和有血清细胞培养基分别培养原代星形胶质细胞效果，其中A示使用实施例1化学成分确定的细胞培养基培养第7天的生长状态、B示使用有血清细胞培养基培养第7天的生长状态；
图5示使用实施例1化学成分确定的培养基和有血清培养基分别培养原代星形胶质细胞，进行GFAP细胞免疫荧光染色结果，其中A示实施例1化学成分确定的细胞培养基培养细胞的染色效果、B示有血清培养基培养细胞的染色效果；
图6示使用不同成分的化学成分确定的细胞培养基对星形胶质细胞培养的生长状态，其中A、B、C、D、E依次示A组、B组、C组、D组、E组培养基培养第7天的生长状态；
图7示使用实施例1化学成分确定的细胞培养基和有血清细胞培养基培养原代成纤维细胞的生长状态，其中A、B、C依次示实施例1化学成分确定的细胞培养基培养成纤维细胞第3天、第5天、第7天的生长状态；D、E、F依次示有血清细胞培养基培养成纤维细胞第3天、第5天、第7天的生长状态。
具体实施方式
本发明提供了一种化学成分确定的细胞培养基及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明中提到的培养细胞的容器可来自Corning公司、Hyclone公司等，可以是96孔板、24孔板、6孔板等多种规格的培养板、35mm,60mm,100mm等多种规格的培养皿或者25cm2、75cm2、150cm2等多种规格的培养瓶等培养细胞的容器。如无特殊说明，本发明中提到的培养瓶为Corning公司75cm2培养瓶。
本发明涉及的消化细胞的胰酶为0.25％胰酶，包括但不限于此。可为0.05％～1％范围内的任意浓度的含有EDTA或者不含有EDTA的胰酶。
本发明涉及的终止胰酶消化作用的大豆胰蛋白酶抑制剂可购得商品化产品，本发明实施例中使用浓度为100μg/mL，包括但不限于此，据商家说明书进行操作。
本发明涉及的添加物中所有成分，如无特殊说明，均可购得商品化产品：可为成品液体，也可为粉末状固体等，据商家说明书进行操作。可从本发明说明书提到厂家购买，但不限于此。其中：
丙酮酸钠是糖酵解过程中的中间产物，可以直接进出细胞。添加到培养基中不仅为细胞提供能量，还为合成代谢提供碳源。本发明添加物中，丙酮酸钠的质量份为5.5～110份；优选为40份～70份；具体为40份、45份、50份、55份、60份、65份或70份；一些具体实施例中，丙酮酸钠的质量份为55份。
本发明采用的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，为谷氨酰胺的二肽形式，商品名为GlutaMax。谷氨酰胺是脑内兴奋性神经递质谷氨酸合成的重要原料，在星形胶质细胞的培养中，谷氨酰胺为合成代谢提供碳源。使用GlutaMax(谷氨酰胺二肽形式)替代谷氨酰胺，增加培养基稳定性，最大程度降低有毒性氨的聚集，减少细胞毒性而对细胞生长的不利作用。本发明添加物中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的质量份为21.7～434份；优选为54.25份～434份；具体为54.25份、108.5份、217份、325.5份或434份；一些具体实施例中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的质量份为217份。
孕酮，又称黄体酮(progesterone)或黄体激素，研究表明，其能够营养神经并对神经具有保护作用。本发明添加物中，孕酮的质量份为3×10-3～0.3份；优选为0.015份～0.045份；具体为0.015份、0.02份、0.025份、0.03份、0.035份、0.04份或0.045份；一些具体实施例中，孕酮的质量份为0.03份。
本发明使用的亚硒酸盐为亚硒酸钠，对细胞具有保护作用。本发明添加物中，亚硒酸钠的质量份为2×10-3～0.2份；优选为0.005份～0.035份；具体为0.005份、0.01份、0.015份、0.02份、0.025份、0.03份或0.035份；一些具体实施例中，亚硒酸钠的质量份为0.03份。
牛血清白蛋白，是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，分子量为66.446KDa，等电点为4.7。本发明添加物中，牛血清白蛋白的质量份为5～500份；优选为40份～60份；具体为40份、42份、44份、46份、48份、50份、52份、54份、56份、58份、60份；一些具体实施例中，牛血清白蛋白的质量份为50份。
转铁蛋白又名运铁蛋白(transferrin，TRF，siderophilin)是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。能够促进细胞的生长。本发明添加物中，转铁蛋白的质量份为5～500份；优选为40份～60份；具体为40份、42份、44份、46份、48份、50份、52份、54份、56份、58份、60份；一些具体实施例中，转铁蛋白的质量份为50份。
腐胺是生物胺的一种，可参与调节细胞的许多功能。本发明添加物中，腐胺的质量份为0.8～80份；优选为4份～12份；具体为4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份；一些具体实施例中，腐胺的质量份为8份。
本发明采用的半胱氨酸是N-乙酰-L-半胱氨酸，可防止神经细胞凋亡。半胱甘酸还是合成有抗氧化作用和解毒作用的谷胱甘肽的原料之一。本发明添加物中，半胱氨酸的质量份为0.25～25份；优选为0.5份～4.5份；具体为0.5份、1.0份、1.5份、2.0份、2.5份、3.0份、3.5份、4.0份、4.5份；一些具体实施例中，半胱氨酸的质量份为2.5份。
胰岛素的主要功能是调节代谢过程，不仅调节细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进对脂肪的合成和储存，还能促进细胞对氨基酸的摄取，调节蛋白质的合成，抑制蛋白质的降解。本发明添加物中，胰岛素的质量份为2.5×10-4～2.5×10-2；优选为0.5×10-3份～4.5×10-3份；具体为0.5×10-3份、1.0×10-3份、1.5×10-3份、2.0×10-3份、2.5×10-3份、3.0×10-3份、3.5×10-3份、4.0×10-3份、4.5×10-3份；一些具体实施例中，胰岛素的质量份为2.5×10-3份。
肝素-表皮生长因子样生长因子，英文简写HB-EGF，是表皮生长因子家族成员之一，通过促进细胞分裂发挥促进细胞增殖的作用。本发明添加物中，HB-EGF的质量份为2.5×10-4～2.5×10-2；优选为0.5×10-3份～4.5×10-3份；具体为0.5×10-3份、1.0×10-3份、1.5×10-3份、2.0×10-3份、2.5×10-3份、3.0×10-3份、3.5×10-3份、4.0×10-3份、4.5×10-3份；一些具体实施例中，HB-EGF的质量份为2.5×10-3份。
本发明中，添加添加物包括如下质量份的：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 0.5×10-3～4.5×10-3份。
一些实施例中，添加物包括如下质量份的：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 4.5×10-3份。
一些实施例中，添加物包括如下质量份的：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 0.5×10-3份。
一些实施例中，添加物包括如下质量份的：
肝素-表皮生长因子
样生长因子 2.5×10-3份。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
化学成分确定的培养基，成分及用量如表1：
表1培养基配方
化学成分确定的培养液配制方法是，在超净工作台内，将DMEM培养基与NB培养基混合，加入青霉素-链霉素、丙酮酸钠、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、预混液1、孕酮、亚硒酸盐。
上述预混液1配制方法是，在超净工作台内，将配方量的腐胺、牛血清白蛋白、转铁蛋白、N-乙酰-L-半胱氨酸、肝素-表皮生长因子样生长因子、胰岛素溶解在NB培养基中混匀，制成预混液1。
孕酮、亚硒酸盐可用NB培养基或者DMEM培养基配制成溶液，需现用现配，避免重复使用。本实施例中孕酮、亚硒酸盐用NB培养基配制成溶液。
配置好的培养基可以在4℃稳定保存3-4个月。
实施例2：本发明化学成分确定的细胞培养基用于星形胶质细胞原代培养和传代培养。
(1)培养瓶用聚-L-赖氨酸预处理：将聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich，P-1524)约0.3-3ml加入到培养瓶铺匀，静置约5分钟，无菌水冲洗2次，将多余的液体吸去，静置约2小时备用。
(2)新鲜分离的神经细胞用5ml实施例1的化学成分确定的细胞培养基重悬，接种于培养瓶中。此时，细胞记为P0代。
(3)将培养瓶放置于培养箱中，培养条件为37℃，5％CO2。
(4)差速贴壁：15分钟后，将上清去掉，添加实施例1的化学成分确定的细胞培养基。
(5)4天后，半量换液，以后每隔2～3天半量换液。
(6)第5天～7天，细胞培养至汇合度约80％～90％，开始消化收集细胞，或者消化细胞，进行传代培养。
(7)将培养瓶中实施例1的化学成分确定的细胞培养基吸走弃掉。
(8)用足量的DPBS覆盖表面(可购自Sigma-Aldrich，货号D4031)洗一次，去除残留的死亡细胞及细胞碎片。
(9)向培养瓶中加足量0.25％胰酶，覆盖在表面，放在细胞培养箱中孵育。
(10)当星形胶质细胞开始皱缩，加100ug/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(可购自BiologicalIndustries，货号03-048-1)终止胰酶消化作用，离心后用足量的新鲜培养基重悬，制成细胞悬液。
(11)将获得的细胞平均分成两份-三份，转移到细胞培养瓶中，轻轻摇动培养瓶使细胞悬液均匀分布。此时，细胞记为P1。在37℃，5％CO2培养箱中培养。培养至细胞汇合度约80％-90％时，可再次进行传代。
结果表明，上述步骤(4)中上清液吸出后，培养3天结果见图1中A图，差速贴壁后的星形胶质细胞培养3天后见图1中B图；可见差速贴壁能有效将细胞碎片清除，且较大程度保留星形胶质细胞。
使用本发明培养基培养的原代星形胶质细胞生长迅速，培养第3天结果见图2中A图、第5天结果见图2中B图、第7天结果见图2中C图，可见在第5天～7天，细胞培养至汇合度约80％～90％。
传代星形胶质细胞培养第3天结果见图3，可见细胞培养至汇合度约30％～40％；在第5天～7天，细胞培养至汇合度约80％～90％。
实施例3：本发明化学成分确定的细胞培养基和有血清细胞培养基培养原代培养星形胶质细胞对比
采用有血清细胞培养基作为对照，验证本发明化学成分确定的细胞培养基的效果，有血清细胞培养基为添加10vol％血清的DMEM培养基。
(1)培养瓶用聚-L-赖氨酸预处理：将聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich，P-1524)约0.3-3ml加入到培养瓶铺匀，静置约5分钟，无菌水冲洗2次，将多余的液体吸去，静置约2小时备用。
(2)新鲜分离的神经细胞分别用实施例1制备的化学成分确定的细胞培养基和有血清细胞培养基重悬，接种于培养瓶中。
(3)将培养瓶放置于培养箱中，培养条件为37℃，5％CO2。
(4)15分钟后，将上清去掉，分别添加实施例1的化学成分确定的细胞培养基和有血清细胞培养基。
(5)4天后，半量换液，以后每隔2-3天半量换液。
结果表明，第5天～7天，实施例1制备的化学成分确定的细胞培养基培养出的星形胶质细胞培养结果见图4中A图，可见细胞汇合度约80％～90％，第5天～7天，有血清细胞培养基培养的星形胶质细胞培养结果见图4中B图，可见细胞汇合度约50％～60％。实验结果表明，使用本发明化学成分确定的培养基培养星形胶质细胞的生长状态优于有血清细胞培养基培养的星形胶质细胞。
对实施例1制备的化学成分确定的细胞培养基和有血清细胞培养基培养的星形胶质细胞分别进行GFAP细胞免疫荧光染色，分别见图5中A图、B图，可见实施例1制备的化学成分确定的细胞培养基培养的星形胶质细胞呈多角星形，更接近在体星形胶质细胞形态，使用有血清培养基培养的星形胶质细胞呈成纤维细胞样。
实施例4：不同成分的化学成分确定的细胞培养基对星形胶质细胞生长的影响
(1)培养瓶用聚-L-赖氨酸预处理：将聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich，P-1524)约0.3-3ml加入到培养瓶铺匀，静置约5分钟，无菌水冲洗2次，将多余的液体吸去，静置约2小时备用。
(2)新鲜分离的神经细胞分别接种于培养瓶、96孔板中，实验分为5组，分别添加表2记载的不同成分的化学成分确定的细胞培养基，分别记为A～E组，培养基的配方如表2，96孔板中每组设3次重复。其中E组培养基即为实施例1中培养基。
表2不同成分的培养基配方
(3)将培养瓶放置于培养箱中，培养条件为37℃，5％CO2。
(4)15分钟后，将上清去掉，分别添加不同成分的化学成分确定的的细胞培养基。
(5)4天后，半量换液，以后每隔2-3天半量换液。
结果表明，第5天～7天，不同成分的化学成分确定的细胞培养基A-E对星形胶质细胞生长的影响见图6中A图-E图。每天以MTT法检测细胞活性，检测OD492的数值，间接反应存活细胞数，结果如表3：
表3各组细胞OD492值
实验结果表明，A组细胞不能存活和生长，B组有极少量细胞存活和生长，C、D、E组细胞有不同程度的生长，其中E组细胞生长状态最佳，其OD492与其他组(C组、D组)相比存在显著性差异，p<0.05。
实施例5：本发明化学成分确定的细胞培养基和有血清培养基培养原代大鼠成纤维细胞对比
采用有血清培养基作为对照，验证本发明化学成分确定的培养基的效果，有血清培养基为添加10vol％血清的DMEM培养基。
(1)培养瓶用聚-L-赖氨酸预处理：将聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich，P-1524)约0.3-3ml加入到培养瓶铺匀，静置约5分钟，无菌水冲洗2次，将多余的液体吸去，静置约2小时备用。
(2)将出生24小时内的动物皮肤组织取下2cm×2cm，用解剖刀轻轻将皮下脂肪组织去除，用眼科剪将皮肤组织剪成2mm×2mm的小块，将皮肤组织块表皮层朝上真皮层朝下，贴到细胞培养板上。
(5)加新鲜培养基1mL。
(3)将培养瓶放置于培养箱中，培养条件为37℃，5％CO2。
(4)4天后，半量换液，以后每隔2～3天半量换液。
结果表明，实施例1制备的化学成分确定的细胞培养基培养出的成纤维细胞，培养第3天结果见图7中A图、第5天结果见图7中B图、第7天结果见图7中C图，可见第5-7天汇合度约80％-90％；有血清培养基培养的成纤维细胞，培养第3天结果见图7中D图、第5天结果见图7中E图、第7天结果见图7中F图，可见第5～7天汇合度约80％～90％。实验结果表明，本发明化学成分确定的细胞培养基能用于成纤维细胞培养，其促进成纤维细胞存活和增殖的效果不劣于有血清培养基。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种添加物，其特征在于，包括如下质量份的：
2.权利要求1所述的添加物在细胞培养中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞为神经细胞或皮肤细胞。
4.一种化学成分确定的细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和权利要求1所述的添加物。
5.根据权利要求4所述的细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基和NB培养基的混合物，其中，DMEM培养基与NB培养基的体积比为0.75:1.25～1.25:0.75。
6.根据权利要求4所述的细胞培养基，其特征在于，其中还包括青霉素和链霉素。
7.一种细胞培养方法，其特征在于，以权利要求4～6任一项所述的细胞培养基培养细胞。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述细胞为神经细胞或皮肤细胞。
9.一种星形胶质细胞的培养方法，其特征在于，包括：
将神经细胞接种于权利要求4～6任一项所述的细胞培养基，培养15min后，去掉上清液，添加新鲜的权利要求4～6任一项所述的细胞培养基；培养4天后，半量换液，此后每隔2～3天半量换液；培养至汇合度为80％～90％，传代。
10.一种成纤维细胞的培养方法，其特征在于，包括：
以权利要求4～6任一项所述的细胞培养基培养皮肤组织，培养4天后，半量换液，此后每隔2-3天半量换液；培养至汇合度为80％～90％，传代。
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