CN109609459A - 一种小胶质细胞的培养方法 - Google Patents

一种小胶质细胞的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109609459A
CN109609459A CN201910001835.1A CN201910001835A CN109609459A CN 109609459 A CN109609459 A CN 109609459A CN 201910001835 A CN201910001835 A CN 201910001835A CN 109609459 A CN109609459 A CN 109609459A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microglia
culture
medium
cell
dmem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910001835.1A
Other languages
English (en)
Inventor
林丽
胡健
王雪
朱丽云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Biomedical Innovation Research Center
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Hangzhou Biomedical Innovation Research Center
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Biomedical Innovation Research Center, Wenzhou Medical University filed Critical Hangzhou Biomedical Innovation Research Center
Priority to CN201910001835.1A priority Critical patent/CN109609459A/zh
Publication of CN109609459A publication Critical patent/CN109609459A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种小胶质细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)分离大鼠新生鼠的大脑皮层组织，将组织剪碎、加HBSS离心分离、消化液消化、终止消化、过滤得到大脑皮层混合细胞；(2)将步骤(1)大脑皮层混合细胞铺板培养；(3)分离步骤(2)培养得到的小胶质细胞。本发明综合考虑体内小胶质细胞的生长环境，建立成纤维细胞与混合胶质细胞共培养的新的培养方法，再用温和胰酶法获得小胶质细胞，提高了小胶质细胞的产量，缩短了培养时间。

Description

一种小胶质细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种小胶质细胞的培养方法。
背景技术
Microglia(小胶质细胞)是脑内细胞重要组成之一，正常情况下，小胶质细胞占脑细胞总数的10％～20％左右,为脑中数量居第三位的重要的免疫细胞，在维持脑内环境的稳定性方面发挥重要的作用。小胶质细胞最显著的特点之一是对外界环境刺激非常敏感，几乎参与了所有中枢神经系统疾病如脑中风(Stroke)，阿尔兹海默病(AD)，多发性硬化症(MS)等的病理过程。原代小胶质细胞体外的培养是建立体外疾病模型的关键组成部分，目前主要通过前期培养新生鼠皮层混合胶质细胞，再采用“振荡法”或“温和胰酶消化法”从体外培养的混合胶质细胞中获得小胶质细胞。两种经典方法共同的缺点是小胶质细胞产量低，所需时间周期长。
发明内容
本发明提供了一种小胶质细胞的培养方法，该培养方法可以缩短细胞培养时间，提高小胶质细胞的产量。
一种小胶质细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)分离大鼠新生鼠的大脑皮层组织，将组织剪碎、加HBSS离心分离、消化液消化、终止消化、过滤得到大脑皮层混合细胞；
(2)将步骤(1)大脑皮层混合细胞铺板培养，过程如下：
一只新生鼠大脑皮层混合细胞铺一块六孔板，培养时，先采用DMEM/F12完全培养基，六孔板每孔加2ml培养基，将细胞放置于于5％CO2,37℃培养箱培养，每隔三天完全换液；培养至第九天换液时，用混合培养基代替原先DMEM/F12完全培养基进行培养，所述的混合培养基由DMEM/F12完全培养基和F-CM条件培养基制成；每三天完全换液，每孔加入2ml混合培养基，培养至第十二或第十四天进行分离；
(3)分离步骤(2)培养得到的小胶质细胞。
作为优选，步骤(1)中，消化液为0.25％不含EDTA的胰酶。
作为优选，步骤(2)中，每隔3天换液，第9天时换用混合培养基。
作为优选，步骤(2)中，DMEM/F12完全培养基和F-CM条件培养基的质量比为75：25。
作为优选，步骤(2)中，所述的F-CM条件培养基的制备方法如下：
培养3T3细胞至80-90％汇合，PBS清洗，换液，继续培养24h收集上层培养基，10min，3000g离心去除细胞碎片，得到所述条件培养基，-20℃贮存备用
作为优选，步骤(3)中，分离过程如下：
弃去培养基，用不含FBS的DMEM/F12清洗一次,每孔加入1ml消化液(0.25％含EDTA胰酶：DMEM/F12＝1:3)，放置于培养箱消化30min，等到上层细胞膜完全剥离加入完培终止消化，弃去上层含膜液体，加入完全培养基培养，贴壁细胞即为小胶质细胞。
同现有技术相比，本发明的有效效果体现在：本发明综合考虑体内小胶质细胞的生长环境，建立成纤维细胞与混合胶质细胞共培养的新的培养方法，再用温和胰酶法获得小胶质细胞，提高了小胶质细胞的产量，缩短了培养时间。
附图说明
图1为实施例1培养第13天的六孔板表面的显微镜(100X)照片；
图2为对比例1培养第13天的六孔板表面的显微镜(100X)照片；
图3为实施例1和对比例1培养第13天后的小胶质细胞的数量；
图4为实施例2和对比例2中小胶质细胞密度随时间变化的结果图。
具体实施方式
实施例1
1、取1-2天的大鼠新生鼠，浸入75％的酒精处死，断头分离出大脑放置预冷的HBSS(不含钙镁离子)中；
2、夹去脑干，分离出大脑皮层，用细镊子细剥离皮层表面的血膜；
3、轻微夹碎皮层，移入装有预冷HBSS的15ml离心管中，3min，1000rpm离心；
4、弃去上层清液，加入预热的0.25％不含EDTA的胰酶(六只大脑皮层加入5ml)，轻微摇晃使组织与消化液充分接触；
5、37℃消化20-30min，15min摇晃一次；
6、加入5ml DMEM/F12(10％FBS，1％P/S)完全培养基终止消化，3min，1000rpm离心，小心吸去上层清液及絮状物；
7、加入10ml DMEM/F12完全培养基,10ml移液管轻微吹打20次，换用5ml移液管轻微吹打20次，75μm滤网过滤，滤网用10ml培养基清洗一次；
8、以一只新生鼠一个六孔板，每孔2ml，将细胞铺板培养(六孔板不需包被)；
9、培养箱培养三天，期间不要频繁观察，第三天全部换液，继续培养，第六天观察有无细胞(主要为星形胶质细胞)贴壁生长；
10、每隔三天换液，第九天，换用混合培养基(75％DMEM/F12完培，25％F-CM)继续培养；(F-CM条件培养基的制备：培养3T3细胞至80-90％汇合，PBS清洗，换液，继续培养24h收集上层培养基，10min，3000g离心去除细胞碎片，条件培养基可-20℃贮存备用)；
11、第13天，用显微镜(100x)观察培养结果，如图1所示，六孔板细胞采用温和胰酶消化法分离小胶质细胞：弃去培养基，用不含FBS的DMEM/F12清洗一次,每孔加入1ml消化液(0.25％含EDTA胰酶：DMEM/F12＝1:3)，放置于培养箱消化30min，等到上层细胞膜完全剥离加入完培终止消化，弃去上层含膜液体，加入完全培养基培养，贴壁细胞即为小胶质细胞(上层细胞膜一定要消化干净，否则会有其他细胞污染，如果第12天产量一般，可换条件培养基培养至14天进行分离)；
12、小胶质细胞培养24h，待其恢复静息状态，可用于后续实验。统计一块六孔板的小胶质细胞的数量，结果如图3所示。
对比例1
实施例1的混合培养基替换成DMEM/F12完全培养基，其他条件与实施例1相同，第13天的显微镜(100x)照片见图2。同时，统计其中的小胶质细胞的数量，结果如图3所示。
由实施例1和对比例1的结果可知，从第九天开始采用混合培养基，明显提高了小胶质细胞的数量。
实施例2
1、取1-2天的大鼠新生鼠，浸入75％的酒精处死，断头分离出大脑放置预冷的HBSS(不含钙镁离子)中；
2、夹去脑干，分离出大脑皮层，用细镊仔细剥离皮层表面的血膜；
3、轻微夹碎皮层，移入装有预冷HBSS的15ml离心管中，3min，1000rpm离心；
4、弃去上层清液，加入预热的0.25％不含EDTA的胰酶(六只大脑皮层加入5ml)，轻微摇晃使组织与消化液充分接触；
5、37℃消化20-30min，15min摇晃一次；
6、加入5ml DMEM/F12(10％FBS，1％P/S)完全培养基终止消化，3min，1000rpm离心，小心吸去上层清液及絮状物；
7、加入10ml DMEM/F12完全培养基,10ml移液管轻微吹打20次，换用5ml移液管轻微吹打20次，75μm滤网过滤，滤网用10ml培养基清洗一次；
8、以一只新生鼠一个六孔板，每孔2ml，将细胞铺板培养(六孔板不需包被)；
9、培养箱培养三天，期间不要频繁观察，第三天全部换液，继续培养，第六天观察有无细胞(主要为星形胶质细胞)贴壁生长；
10、每隔三天换液，第九天开始，换用混合培养基(75％DMEM/F12完培，25％F-CM)继续培养；(F-CM条件培养基的制备：培养3T3细胞至80-90％汇合，PBS清洗，换液，继续培养24h收集上层培养基，10min，3000g离心去除细胞碎片，条件培养基可-20℃贮存备用)。统计六孔板中的小胶质细胞密度，培养至第17天，统计9～17天的小胶质细胞的密度，得到的结果如图4所示。
对比例2
实施例2的混合培养基替换成DMEM/F12完全培养基，其他条件与实施例2相同，统计9～17天的小胶质细胞的密度，得到的结果如图4所示。

Claims (6)

1.一种小胶质细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离大鼠新生鼠的大脑皮层组织，将组织剪碎、加HBSS离心分离、消化液消化、终止消化、过滤得到大脑皮层混合细胞；
(2)将步骤(1)大脑皮层混合细胞铺板培养，过程如下：
一只新生鼠大脑皮层混合细胞铺一块六孔板，培养时，先采用DMEM/F12完全培养基，六孔板每孔加2ml培养基，将细胞放置于5％CO2,37℃培养箱培养，每隔三天完全换液；培养至第九天换液时，用混合培养基代替所述的DMEM/F12完全培养基进行培养，所述的混合培养基由DMEM/F12完全培养基和F-CM条件培养基制成；每三天完全换液，每孔加入2ml混合培养基，培养至第十二或第十四天进行分离；
(3)分离步骤(2)培养得到的小胶质细胞。
2.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，消化液为0.25％不含EDTA的胰酶。
3.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的混合培养基中，DMEM/F12完全培养基和F-CM条件培养基的质量比为75：25。
4.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的F-CM条件培养基的制备方法如下：
培养3T3细胞至80-90％汇合，PBS清洗，换液，继续培养24h收集上层培养基，10min，3000g离心去除细胞碎片，得到所述条件培养基，-20℃贮存备用。
5.根据权利要求1所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，分离过程如下：
弃去培养基，用不含FBS的DMEM/F12清洗一次,每孔加入1mL消化液放置于培养箱消化30min，等到上层细胞膜完全剥离加入完全培养基终止消化，弃去上层含膜液体，加入完全培养基培养，贴壁细胞即为小胶质细胞。
6.根据权利要求5所述的小胶质细胞的培养方法，其特征在于，所用的消化液由0.25％含EDTA胰酶和DMEM/F12组成，质量比为1：3。
CN201910001835.1A 2019-01-02 2019-01-02 一种小胶质细胞的培养方法 Pending CN109609459A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910001835.1A CN109609459A (zh) 2019-01-02 2019-01-02 一种小胶质细胞的培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910001835.1A CN109609459A (zh) 2019-01-02 2019-01-02 一种小胶质细胞的培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109609459A true CN109609459A (zh) 2019-04-12

Family

ID=66016678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910001835.1A Pending CN109609459A (zh) 2019-01-02 2019-01-02 一种小胶质细胞的培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609459A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846277A (zh) * 2019-11-14 2020-02-28 南通大学 一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1及其建立方法和应用
CN111925989A (zh) * 2020-09-14 2020-11-13 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种小胶质细胞的培养方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040029269A1 (en) * 2002-05-07 2004-02-12 Goldman Steven A Promoter-based isolation, purification, expansion, and transplantation of neuronal progenitor cells, oligodendrocyte progenitor cells, or neural stem cells from a population of embryonic stem cells
KR20120118407A (ko) * 2011-04-18 2012-10-26 고려대학교 산학협력단 태반유래세포에 조건화된 배양 배지, 및 이를 이용한 무동물 및 무지지세포 줄기세포 배양 방법
CN102839154A (zh) * 2011-06-23 2012-12-26 上海安集协康生物技术有限公司 神经干细胞培养扩增方法及所用培养基
CN105363072A (zh) * 2015-08-13 2016-03-02 华中科技大学同济医学院附属协和医院 骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用
CN106620653A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 温州医科大学 一种用于治疗皮肤创面的组合物及其制备方法
CN107513519A (zh) * 2017-09-30 2017-12-26 北京再生生物科技研究院有限公司 一种雪旺细胞的培养方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040029269A1 (en) * 2002-05-07 2004-02-12 Goldman Steven A Promoter-based isolation, purification, expansion, and transplantation of neuronal progenitor cells, oligodendrocyte progenitor cells, or neural stem cells from a population of embryonic stem cells
KR20120118407A (ko) * 2011-04-18 2012-10-26 고려대학교 산학협력단 태반유래세포에 조건화된 배양 배지, 및 이를 이용한 무동물 및 무지지세포 줄기세포 배양 방법
CN102839154A (zh) * 2011-06-23 2012-12-26 上海安集协康生物技术有限公司 神经干细胞培养扩增方法及所用培养基
CN105363072A (zh) * 2015-08-13 2016-03-02 华中科技大学同济医学院附属协和医院 骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用
CN106620653A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 温州医科大学 一种用于治疗皮肤创面的组合物及其制备方法
CN107513519A (zh) * 2017-09-30 2017-12-26 北京再生生物科技研究院有限公司 一种雪旺细胞的培养方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAYEONG JEONG ET AL.: "Effect of Concentrated Fibroblast-Conditioned Media on In Vitro Maintenance of Rat Primary Hepatocyte", 《PLOS ONE》 *
JIAN HU ET AL.: "Fibroblast-Conditioned Media Enhance the Yield of Microglia Isolated from Mixed Glial Cultures", 《CELLULAR AND MOLECULAR NEUROBIOLOGY》 *
李锐 等: "不同分离纯化法原代培养小胶质细胞的生物学差异", 《细胞与分子免疫学杂志》 *
杨俊 等: "成纤维细胞条件培养基对雪旺细胞生长和增殖的影响", 《中国临床康复》 *
聂菁等: "一种改良小胶质细胞的培养方法", 《江西医学院学报》 *
项正兵等: "一种新的小胶质细胞分离纯化方法", 《江西医学院学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846277A (zh) * 2019-11-14 2020-02-28 南通大学 一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1及其建立方法和应用
CN110846277B (zh) * 2019-11-14 2023-01-13 南通大学 一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1及其建立方法和应用
CN111925989A (zh) * 2020-09-14 2020-11-13 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种小胶质细胞的培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112005003001B4 (de) Aus humanem Fettgewebe abgeleitete multipotente Stammzellen und diese enthaltende Zelltherapeutika
DE102004017473A1 (de) Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Zellen, die ein pankreatisches Hormon produzieren
CN107858327A (zh) 一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法
CN109609459A (zh) 一种小胶质细胞的培养方法
EP1289574A2 (de) Verfahren zur kultivierung von knorpelersatz und biomatrix nach diesem verfahren hergestellt
DE10134667A1 (de) Verfahren zur Herstellung isolierter Zellkulturen, Kulturmedium zur Kultivierung von Zellkulturen und Zellkultur
DE69919531T2 (de) Aus normalem menschlichem hautgewebe immortalizierte zellinien
Uhlenhuth The form of the epithelial cells in cultures of frog skin, and its relation to the consistency of the medium
CN104017771B (zh) 一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基及其使用方法
CN106244521A (zh) 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途
CN109517784B (zh) 一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用
CN102994452A (zh) 一种高效分离和培养神经元的方法
CN102994451A (zh) 一种神经元分离和培养的改进型方法
CN102978162A (zh) 一种神经元分离和培养方法及试剂
CN105907701A (zh) 一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
CN1590541A (zh) 角膜缘干细胞组织工程复合体及其制备方法
CN112481216A (zh) 一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途
CN101597592A (zh) 人角膜内皮细胞培养液及其制备方法和应用
WO2006037579A1 (de) Verwendung von fibroblasten zur differenzierung in fett-, knochen-und knorpelzellen
CN105907707A (zh) 一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法
EP2162530B1 (de) Isolierte proliferierende zellen mit stammzelleigenschaften aus adultem gewebe von wechselwarmen wirbeltieren, stabile zellkulturen davon und verfahren zu deren herstellung
CN115651907A (zh) 一种混合胶质细胞共培养体系模型的构建方法与应用
CN107164325B (zh) MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒
CN108774630A (zh) 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
CN108359633A (zh) 一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190412