CN105363072A - 骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。神经修复材料的原料是由骨髓基质干细胞、含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠培养基组成，其制备方法是首先将骨髓基质干细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培养基中培养得到培养物；然后将培养物置于含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠液体培养基中培养；得到神经修复材料。将神经修复材料注入患病受体内，从而促进消化道肠神经系统大量神经再生和胃肠动力的恢复。

Description

骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用

技术领域

本发明涉及神经修复材料领域，具体地指一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。

背景技术

肠神经系统(entericnervoussystem，ENS)是外周神经系统的一部分，它在消化系统的多项基本生理功能，如胃肠道运动、消化吸收、分泌及血流中，发挥重要调控作用。特别的，ENS对消化道功能的调节具有相对独立性，能在脱离中枢的条件下对器官实施局部整合，因而也被称为“肠脑”。

多种因素,包括基因、药物(刺激性泻剂)、炎症以及年龄的老龄化等可引起ENS的损伤，表现为神经变性、神经节细胞缺失；神经递质合成、含量、分泌异常及其受体系统表达上调或下调最终导致胃肠道运动、感觉、分泌功能紊乱等。ENS功能的异常或退化可以引起先天性肠神经系统动力障碍，如先天性巨结肠，同样亦能够引起多种后天消化道运动功能障碍疾病，包括贲门失弛缓症、胃食管反流病、胃排空延迟、糖尿病胃轻瘫以及便秘等。这类疾病发病率高，症状顽固，反复出现，严重影响病患的生活质量。由于胃肠道生理功能调控的复杂性，肠神经系统损伤及退行性变引起的胃肠功能紊乱相关疾病目前尚缺乏有效的治疗手段。

骨髓基质干细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSC)是来源于中胚层具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。相较于其它干细胞，骨髓基质干细胞自身具有良好的易获得、易分离、易扩增、易修饰、特别是免疫赦免的特性，而在基因工程领域受到关注。比如，神经干细胞虽被报道对神经损伤具有一定的修复作用，但由于其难获得，移植排斥反应导致移植细胞局部存活率低、移植后表达神经标记物的细胞是否真具有神经细胞的功能、远期效果不确定等诸多问题尚有待解决。目前BMSC在ENS损伤修复中的作用尚未见报道。不同的研究团队关于BMSC对中枢神经系统损伤修复效果及机制的研究结果也参差不齐，各有争议。干细胞的干预条件不同是导致修复结果不同的重要原因。BMSC的多向潜能性也就导致了其可塑性，如何选择最适合的预处理条件、修复条件将对于有效提高BMSC神经损伤的修复效率有重要意义。目前对于BMSC在ENS损伤中最佳修复条件的探索尚未见报道。

发明内容

本发明的目的针对ENS功能障碍相关疾病还没有形成有效治疗体系的缺陷，提供了一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。它将骨髓基质干细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSC)和含有神经胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)的胎肠培养基(fetalgutconditionmedium，FGCM)共同培养预处理，得到神经修复材料，并将神经修复材料注入患病受体内，从而促进消化道肠神经系统大量神经再生和胃肠动力的恢复。

为实现上述目的，本发明提供的一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。

为实现上述应用过程，本发明还提供了一种用于治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料，它的原料是由骨髓基质干细胞、含有碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,BFGF)的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠培养基组成，其中，所述DMEM低糖液体培养基的配方为1000mg/L的葡萄糖，15％的胎牛血清，2mmol/L的L-谷氨酰胺，110mg/L的丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；

所述胎肠培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)取胚胎发育15天的SD孕鼠，45mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射常规麻醉大鼠；

2)无菌条件下取出8～10条胎肠，用无Ca²⁺，Mg²⁺的PBS清洗2～3次；

3)再用1mg/mL的胶原酶常温消化15min；

4)PBS洗2次，反复吹打研磨，加入含有20μg/mL纤连蛋白的DMEM低糖液体培养基，并接种于培养瓶中；

5)3天后收集培养液，84g离心5min，取上清过滤，即得到FGCM原培养基；

6)使用时，将FGCM原培养基与DMEM低糖液体培养基按体积比1∶1混合，并调整pH值为7.4，即得到胎肠培养基。

作为优选方案，所述DMEM低糖液体培养基中碱性成纤维细胞生长因子的含量为6～16ng/mL,最优选为：碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL；胎肠培养基中神经胶质细胞源性神经营养因子的含量为8～14ng/mL，最优选为：神经营养因子的含量为10ng/mL。

作为优选方案，所述骨髓基质干细胞含量是约1.0×10⁶个/mL。

上述神经修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)首先将骨髓基质干细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培养基中，培养12～36h；得到培养物；最佳培养时间为24h；

2)将步骤1)得到培养物置于含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠培养基中培养10～15d，最佳培养时间为10d，得到神经修复材料；其中，每3天更换培养基。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的神经修复材料用于治疗肠神经系统功能缺失或障碍，该神经修复材料是由骨髓基质干细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSC)、含有碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,BFGF)的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的胎肠培养基(FGCM)共同培养预处理，得到神经修复材料注入患病受体内，从而促进消化道肠神经系统大量神经再生和胃肠动力的恢复。说明经过预处理的BMSC可以用于ENS功能缺失或障碍相关疾病的治疗。

2)本发明神经修复材料中共同培养(预处理)的BMSC可以导致有效神经再生，没有经过培养预处理的BMSC没有发现有效神经再生现象。体内外实验表明BMSC可能通过影响神经胶质细胞源性的神经营养因子正反馈机制促进神经再生。

3)本发明制备神经修复材料的方法提供了一种治疗胃肠道肠神经系统疾病的手段，该方法可以有效地运用于其它神经损伤相关疾病修复的应用中。

附图说明

图1为BMSC培养鉴定图

图1A(a～f)为BMSC培养图：a-c为第一代BMSC按时间培养(第1天、第3天，第7天)的细胞观察图；d-f为第二代(P2)、第四代(P4)、第六代(P6)培养的细胞观察图；

图1B为BMSC流式鉴定图；

图1C为第六代(未处理)BMSC表面表达神经元细胞标记物的免疫荧光图，其中纵坐标的中文含义为未处理的BMSC；

图2为BMSC分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的染色图

图中，图A为脂肪细胞(Adipocytes)、

图B为骨细胞(Osteoblasts)、

图C为软骨细胞(Chondrocytes)；

图3为经过预处理后的BMSC表现为神经元样细胞的免疫荧光图

其中，图A～C为经过神经修复材料处理后BMSC表面表达神经元细胞标记物(PGP9.5,NSE,Tuj1,HuC/D，nNOS)的荧光图，

图D为对照组(未处理)BMSC表面表达神经元细胞标记物的荧光图，

图E-I表示为经神经修复材料处理后表面阳性表达神经细胞标记物BMSC的百分比(纵坐标为神经细胞表面标记物PGP9.5,NSE,Tuj1,HuC/D，nNOS及其阳性表达的百分比)；

图4为胃幽门部去神经支配动物模型建立图

图中，图A为胃部解剖结构示意图；

图B为观察假手术组(SHAM)和0.5％BAC处理胃幽门部去神经后PGP9.5阳性神经细胞含量的组化图；

图C为从蛋白质印迹法验证使用0.5％BAC处理胃幽门部去神经支配动物后幽门部组织神经细胞表面标记物PGP9.5表达含量的条带，并用柱状图表示相对表达量，纵坐标的中文为相对的PGP9.5含量水平；

图5为不同浓度BAC处理胃幽门部去神经支配动物模型免疫组化图

图中，图A为假手术组(对照组；Sham)；

图B为0.1％BAC处理胃幽门部去神经后神经元表面标记物PGP9.5表达含量图；

图C为0.3％浓度BAC处理胃幽门部去神经后神经元表面标记物PGP9.5表达含量图；

图D为0.5％浓度BAC处理胃幽门部去神经后神经元表面标记物PGP9.5表达含量图；图E-H是A-D图片相对应的放大图；

图6为神经修复材料注入胃部后在胃部分布的荧光观察图

图中，图A为注入后第1天，第7天，神经修复材料以及对照组(SHAM)的BMSC在胃中的分布情况；

图B-a为移植后第28天，神经修复材料在胃中的分布情况；B-b为再生的神经元表面表达PGP9.5含量图；B-c，d和f说明大部分注入的神经修复材料在胃黏膜下层并表达神经元表面标记物PGP9.5；

图B-d，e说明神经元表面标记物PGP9.5阴性的神经修复材料分布在黏膜层；图B-e,f,g是图d中矩形的放大图；

图7为神经修复材料的注入导致大量胃幽门部神经元再生的荧光图

图中，图A为注入神经修复材料的去神经支配大鼠模型，在移植28天后，胃幽门壁可以观察到大量新生的神经元表面标记物的荧光表达情况；图A-a为HuC/D，图A-b为Tuj1，图A-c为nNOS表达情况；

图B为与假手术组(SHAM)相比，肌层中再生的PGP9.5阳性的神经元结构形态学特征；

图C为从蛋白质印迹法反映注入神经修复材料后神经元表面标记物HuC/D、Tuj1和nNOS表达情况，纵坐标的中文为相对表达量水平；

图8为注入GFP标记的神经修复材料表面神经元标记物PGP9.5表达含量图；

图中，图A为GFP标记的神经修复材料荧光图；

图B为神经元表面标记物PGP9.5表达含量图；

图C为移植GFP标记的神经修复材料神经表面元标记物PGP9.5表达含量图；

图D为图C局部放大图；

图9为注入未处理的BMSC荧光观察图；

图中，图A和图E为BBM标记的BMSC；

图B和图F为PGP9.5表达含量图；

图C为光学显微镜下BMSC形态结构图；

图D为图A和B合成图；

图G为图E和F的合成图；

图10为肌层中再生的PGP9.5阳性神经元结构排列形态学特征图；

图中，图A～E分别表示再生的PGP9.5阳性神经元不同排列及不同形态学特征图；

图11为神经修复材料注入能够显著恢复幽门去神经支配后的肌肉松弛程度图；

图中，图A为假手术对照组(SHAM)、BAC处理组以及BAC+神经修复材料处理组后肌紧张收缩曲线形态图；

图B为图A肌张力统计图；图C为上述三组肌松弛曲线形态图；

图D为图C的统计图。在BAC去神经支配并注入神经修复材料组中，我们可以观察到随着肌电刺激频率的逐级增加，幽门环形肌恢复了明显的频率依赖性的松弛现象。

图E说明NOS抑制剂L-NAME能够完全阻断神经修复材料所起的作用；图中纵坐标的中文含义为肌张力。

图12为未经预处理的BMSC移植后不能诱导有效ENS神经元再生；

图中，图A为蛋白质印迹法反映未经处理的BMSC和神经修复材料注入后神经元表面标记物表达含量图；图B为图A柱状统计图；

图13为内源性GDNF的表达存在一个潜在的正反馈机制结构示意图；

图14为神经修复材料的“GDNF正反馈”图；

图中，图A为神经修复材料内源性表达低水平的GDNF柱状图；

图B为加入神经修复材料后GDNF表达含量图。纵坐标的中文含义为相对GDNF蛋白含量表达。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

名字简写

简写	中文全称
		BMSC	骨髓基质干细胞
GDNF	神经胶质细胞源性神经营养因子
		FGCM	胎肠培养基
ENS	肠神经系统
		BFGF	碱性成纤维细胞生长因子
SD大鼠	Sprague Dawley大鼠
		DMEM低糖培养基	达尔伯克改良伊格尔低糖培养基
FBS	胎牛血清
		PGP9.5	神经元特异性蛋白PGP9.5
NSE	神经元特异性烯醇化酶
		nNOS	神经型一氧化氮合酶
Tuj1	βIII微管蛋白
		BAC	苯扎氯铵
ROI	感兴趣区
		BBM	双苯甲亚胺
TEMED	四甲基二乙胺
		TBS	Tris-HCl缓冲盐溶液

实施例1

1、动物材料

成年SD大鼠，10～12周龄，包括野生型(WT)和GFP转基因型，饲养于霍普金斯大学屏障动物实验中心或华中科技大学动物实验中心(25℃恒温，光照与黑暗12h交替)。

在本实验中动物饲养以及相应操作均符合NIH准则，动物实验研究方案得到霍普金斯大学和华中科技大学的ACUC批准。

在下述实验中，成年雄性大鼠(10～12周)用于BMSC的提取，成年雌性大鼠用于建立胃幽门部去神经支配模型以及作为BMSC注入的受体。

2、骨髓基质干细胞分离和培养

2.1细胞分离

1)将成年SD大鼠处死后，并用体积分数为75％的酒精浸泡5min，无菌条件下分离股骨，除去骨表面附着软组织，无菌PBS清洗干净后，置于无菌培养皿的DMEM培养基中；

2)采用眼科剪将两端干骺端切除，暴露骨髓腔；用5ml的注射器以DMEM低糖培养基反复冲洗骨髓腔，获得单细胞悬液；

3)将上述得到的骨髓单细胞悬液移入15ml离心管中，在1000rpm条件下离心5min，弃上清，用含体积分数为15％FBS的DMEM低糖培养基洗2次；

4)将最终收集的细胞悬液接种于25ml细胞塑料培养瓶中，记为P₀代，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养室培养。

2.2培养

1)将SD大鼠股骨中分离得到的BMSC置于培养在含有体积分数为15％FBS的DMEM低糖培养基中(包含2mM的谷氨酰胺、1％的青霉素和链霉素)；原代(P₀)细胞培养24h后换液，洗去未贴壁的细胞，以后每3～4d换液1次；

2)待细胞增殖融合至约80～90％时，0.25％(重量体积比g/mL)胰酶消化、传代培养；采用贴壁培养法，利用BMSC易于消化脱落的特点，严格控制细胞消化时间，纯化BMSC；实验选取6～8代的BMSC细胞。

如图1A可见，上述分离和培养出骨髓来源的贴壁细胞，在接种24h后，从大鼠骨髓中分离出来的细胞已贴壁生长在细胞培养瓶中。在接种后的3～7天内，细胞呈单克隆样生长，速度缓慢(图1A，a-c)；

当BMSC细胞长至第2～6代时，BMSC呈现典型的梭形(图1A，d-f)，它可以有效增殖至少至20代。

实施例2

1、BMSC的流式鉴定

1)选取原代培养第6代对数生长期BMSC细胞，行流式细胞术鉴定细胞表面抗原；0.25％(重量体积比g/mL)胰酶消化细胞，吹打制成单细胞悬液，离心收集，PBS洗涤1次；

2)每个样本取2只流式检测管，分别标记同型对照、检测，每管取约5×10⁵个细胞重悬于100μL无菌PBS中；

3)按照流式抗体说明书，取第6代的BMSC进行CD73、CD90、CD105和CD45流式鉴定分离得到的BMSC。

如图1B可见，将取生长至第6代的BMSC做流式检测，分析结果显示BMSC表面抗原CD90，CD73，CD105的阳性率高达95％以上，CD45(造血细胞表面抗原)阴性表达(图1B)；BMSC细胞高度纯化。

2、体外诱导BMSC向脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞分化

2.1成脂肪细胞诱导实验

1)取生长至第6代的BMSC细胞，当融合度达到80～90％时，用0.25％胰酶进行消化；

2)将消化下来的细胞按照2×10⁴cells/cm²的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2mL完全培养基；

3)将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养；

4)每3天更换一次完全培养基，直到细胞长至100％融合；

5)细胞融合度达100％后，继续用完全培养基培养；

6)3天后，将完全培养基轻轻吸走，每孔加入2mL成脂肪诱导培养基；

7)3天后，将成脂肪诱导培养基换作成脂肪维持培养基；

8)24h后，将成脂肪维持培养基换作成脂肪诱导培养基；

9)重复7～8的步骤3次；

10)重复更换成脂肪诱导培养基/脂肪维持培养基3次后，继续用成脂肪维持培养基培养7天，每3天更换培养基；

11)诱导结束后，吸走六孔板中的成脂肪维持培养基，用1×PBS冲洗1～2次；每孔加入2mL4％多聚甲醛溶液，固定30min；

12)吸走多聚甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次，用1ml的油红染色30min；

13)吸走油红染液，用1×PBS冲洗2～3次；

14)将培养板置于显微镜下观察成脂肪染色效果。

2.2成骨细胞诱导实验

1)取生长至第6代的细胞，当融合度达到80～90％时，用0.25％(重量体积比g/mL)胰酶进行消化；

2)将消化下来的细胞按照2×10⁴cells/cm²的细胞密度接种在预先包被0.1％明胶的六孔板中，每孔加入2mL完全培养基；

3)将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养；

4)当细胞融合度达到60～70％时，轻轻将孔内完全培养基吸走，加入2mL成骨诱导分化完全培养基，每隔3天更换一次成骨诱导分化完全培养基；

5)3周后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1×PBS冲洗1～2次；每孔加入2mL4％多聚甲醛溶液，固定30min；

6)吸走多聚甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次；每孔中加入1mL茜素红染液染3～5min；

7)吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2～3次；

8)将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

2.3成软骨细胞实验

1)取生长至第6代的细胞，当融合度达到80～90％时，用0.25％胰酶进行消化，加入软骨非完全培养基终止消化；

2)将消化下来的细胞转至15mL离心管中；

3)室温，150g，离心5min，弃上清，用成软骨诱导分化非完全培养基重悬细胞；

4)室温，150g，离心5min，弃上清；

5)用成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度在5.0×10⁵cells/mL；

6)取0.5mL细胞在15mL离心管中，室温，在150g条件下离心5min；

7)离心后，旋松离心管盖，将细胞静置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养24h；

8)每2～3天更换一次培养基，每次加入0.5mL的新鲜成软骨诱导分化完全培养基，更换时注意不要触及离心管底部的细胞团块；

9)更换培养基后，轻轻地弹动管底，使细胞团块漂浮在培养基中，旋松离心管盖，将细胞静置于37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养

10)3周后，将培养的软骨团块用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片；

11)常规脱蜡处理后，用阿利新蓝染色30min；

12)自来水冲洗2min，蒸馏水漂洗；

13)将切片置于显微镜下观察，蓝色染色显示软骨细胞蛋白聚糖的合成。

如图2A-C所示：BMSC细胞能在特定的诱导条件下定向分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，说明BMSC细胞具有多向分化的潜能。

实施例3

1、胎肠培养基(FGCM)的制备

1)取胚胎发育15天的SD孕鼠，45mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射常规麻醉大鼠；

2)无菌条件下取出8～10条胎肠，用无Ca²⁺，Mg²⁺的PBS清洗2～3次；

3)再用1mg/mL的胶原酶常温消化15min；

4)PBS洗2次，反复吹打研磨，加入含有20μg/mL纤连蛋白的DMEM低糖液体培养基，并接种于培养瓶中；

5)3天后收集培养液，84g离心5min，取上清过滤，即得到FGCM原培养基；

6)使用时，将FGCM原培养基与DMEM低糖液体培养基按体积比1∶1混合，并调整pH值为7.4，即得到胎肠培养基。

2、利用BMSC制备神经修复材料

1)首先将骨髓基质干细胞置于含有10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖培养基中，培养24h；得到培养物；

2)将步骤1)得到培养物(骨髓基质干细胞含量是约1.0×10⁶个/mL)置于含有10ng/mLGDNF的胎肠培养基(FGCM)中培养10d；得到神经修复材料；其中，每3天更换培养基。

所述DMEM低糖液体培养基的配方1000mg/L的葡萄糖，15％的胎牛血清，2mmol/L的L-谷氨酰胺，110mg/L的丙酮酸钠，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。同理，根据上述方法制备对照组(未经预处理的BMSC)，将第六代的BMSC骨髓基质干细胞置于普通的DMEM培养基中培养。

3、验证神经修复材料中含有的BMSC分化成为神经元样细胞

上述方法制备得到的神经修复材料中含有BMSC分化成为神经元样细胞，大部分经过上述诱导条件培养的BMSC大量表达多种已被证实的神经元细胞表面标记物，包括PGP9.5(80.3±3.1％)、NSE(79.3±10.3％)、Tuj1(75.1±8.2％)、HuC/D(72.7±7.4％)(图3)。而在未经诱导的BMSC内，未见PGP9.5和nNOS的表达(图1C)。

如图3所示，神经修复材料中诱导后的BMSC表现为神经元细胞的表型，其中78.3±5.3％诱导后的BMSC也能表达nNOS，nNOS产生的NO在ENS中是一种重要的抑制性神经递质。而nNOS的表达进一步证明了诱导后BMSC的神经元样表型(图3)。

实施例4体内水平验证神经修复材料的作用

1、胃幽门部去神经支配动物模型的建立

在胃幽门部去神经支配模型中，以如下方法破坏大鼠胃幽门部位的黏膜下神经丛和肌间神经丛：

1)以45mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射常规麻醉大鼠，在腹部正中切开1cm的切口，将幽门部位从此切口处取出，用含有三种不同浓度的BAC(0.1％、0.3％和0.5％)(重量体重比g/mL)的纱布块以幽门部分为中心的3cm(包括在近端十二指肠和远端胃窦的各1.5cm)的环周区域，敷盖20min，具体见图4A的示意图。

2)假手术组用0.9％的生理盐水代替BAC。去神经支配的正中1cm的区域为ROI。接下来的所有实验分析，包括去神经支配的效率以及神经修复材料中的神经样BMSC细胞(以下均以“神经样BMSC细胞”简写)起始的修复，都仅限于ROI。

3)在注入神经修复材料后的第1、7和28天，分别切取用各浓度BAC处理组和生理盐水处理的假手术组的ROI样本；每组样本包括4～6只大鼠。

如图4A所示，研究ROI(即经BAC作用的幽门部位的3厘米范围最中央的1厘米区域)来证实BAC诱导的去神经支配作用，并将幽门作为解剖学上的标记用以注入神经样BMSC细胞所发生的再神经化。

如图5所示，预实验确定胃幽门区BAC去神经化的最佳浓度(0.1％、0.3％和0.5％)。28天后，通过IF和IHC检测，0.1％和0.3％BAC组的PGP9.5阳性的神经细胞明显减少，但仍然存在，而0.5％BAC组的PGP9.5阳性神经细胞基本消失(图4B)。同时，0.5％BAC组的结果同样被蛋白印迹法证实：PGP9.5的表达在幽门区ROI中表达不明显[图4C(2.28±0.28vs.0.19±0.06；p<0.01)]，去神经化状态并可维持至少28天以上(图4和5)。

2、神经修复材料的注入

1)在神经修复材料的注入实验中，体外培养的PGP9.5阳性或者PGP9.5阴性的BMSC(作为对照组)以1μg/mL的BBM孵育24h作为荧光标记。

2)经过BBM处理的神经修复材料可以用于示踪BMSC。在注入前，将BBM标记的神经修复材料用DMEM洗3次，以去除多余的BBM。另外，从GFP转基因大鼠中提取的神经修复材料被用于移植后追踪神经修复材料的第二种方法。神经修复材料(BBM或者GFP标记)用PBS以每微升含10000个细胞的密度重悬，并置于冰上保存。

3)在BAC作用后的第三天，以22号针微量注射系统将50μL神经修复材料从浆膜层注射进入纵行平滑肌层(约1.0×10⁶个细胞)，对照组注射等体积的PBS。BAC处理的大鼠随机分成4组，神经修复材料注入组(n＝15)，假手术组(n＝15)，无神经修复材料注入组(n＝5)，GFP标记的神经修复材料注入组(n＝5)。

为检测神经修复材料注入的成功与否及新生神经的发育情况，在移植后不同时间点对胃幽门部位的ROI进行取材并连续切片分析，对比检测神经修复材料中神经元样BMSC的存活能力、位置及新生神经元的位置。

如图6所示，注入后第1天，浆膜下注射的神经修复材料只在浆膜层及浆膜下层存在(图6A,左图)。注入7天后，大部分神经修复材料迁移到了纵形/环形肌层(图6A,中图)。注入28天后(图6B-a)，注入的神经修复材料存活并明显聚集在黏膜下层。因此，随着时间的推移，注入的神经修复材料从浆膜层向黏膜层迁移。

绝大部分注入的神经修复材料保留了其神经元表型(PGP9.5/Tuj1/HuC/D/nNOS阳性)(图6B-d,f)，只有极少数细胞表现出PGP9.5阴性表型(图6B-d,e)。但这些PGP9.5阴性的细胞并不存在于黏膜下层(图6B-c,d,e)，而是接近黏膜层的位置((图6B-c,d,f)。

由上可知，同种异体注入神经修复材料28天后，注入神经修复材料不仅能够存活在于胃幽门壁上，且能维持类神经元表型。

注入神经修复材料的去神经支配大鼠在移植28天后，胃幽门壁可以观察到大量的新生神经元结构(图6B和图7A)。在注入神经修复材料的大鼠中，未能观察到相应的现象(图9)。这些再生的神经元结构表达多种神经元标记物，包括：PGP9.5NSETuj1和nNOS(图6B,图7，图8)。大多新生的神经元结构位于肌层，尤其是环形肌与纵形肌和环形肌的间隙(图6B,图7A)。与正常组相比，肌层中再生的PGP9.5阳性的神经元结构排列紊乱并具有更多的形态学特征(图7B,图8)。在再生的类神经元结构中并没有发现BMM标记的神经修复材料，这说明这些再生的神经元结构并非来源于注入的神经修复材料(图6B和图7A)。上述的结论在移植GFP标记的神经修复材料中也同样得到了证实(图8)。

如上可知，神经修复材料的注入可以导致大量神经元的再生，而再生的肠神经元结构并非来源于注入的神经修复材料。

3、等长收缩力的测量

3.1实验前准备

1)配制Kreb’s液

2)打开电脑、浴槽加热系统(37℃恒温)、数模转换器，用Kreb’s液冲洗器官浴槽，使器官浴槽及管道系统充满新鲜Kreb’s液

3)记录软件设置及调零

(1)打开LabChart7记录软件；

(2)设置软件参数：通过“设置”→“通道设置”打开通道设置窗口，设置内容包括通道数量、名称、采样速率(1k/s)、量程(10mV)、输入设置、滤波(低通10Hz)(参数设置可根据需要调整)；

(3)点击“开始”开始记录，在“设置”下选择“所以输入调零”；

(4)单位转换：调零后对每个通道进行单位转换(mV→g)。

3.2平滑肌条制备

1)取胃窦组织，用细针固定于硅胶平皿中充分展开，平皿中盛Kreb’s液并持续通混合气(95％O₂+5％CO₂)，用棉签及医用镊轻轻去除黏膜层(人体标本可以直接剪去粘膜层)；

2)按纵、环行肌纤维走向制备纵、环行肌条，肌条两端用细丝线结扎；

3)剩余组织于4℃冰Kreb’s液中，持续通混合气(95％O₂+5％CO₂)，备用。

3.3肌条收缩活动记录：采用等长收缩法观察肌条收缩活动

1)将制作好的肌条一端固定在支架底部，另一端与张力传感器相连，肌条纵向悬于装满25或10mLKrebs液的组织浴槽中，保持浴槽内37℃恒温，浴槽内持续通混合气体(95％O₂+5％CO₂)；

2)悬挂肌条后，调节张力旋钮，给予肌条1.0g初始负荷；

3)每20min更换新鲜Kreb’s液一次，待肌条在浴槽中达到平衡，选取自发性收缩活动稳定、规则的肌条进行后续实验；

4)根据实验设计，分别记录肌条基线水平收缩活动以及加入不同干预制剂后的收缩活动，同一肌条在接受一组干预后需换液洗脱，待肌条收缩再次平衡后，方可进行下一组干预；

5)实验完成后保存数据，并清洗器官浴槽及管道系统。

3.4数据分析方法

采用的分析方法是积分法，即计算收缩曲线下面积法，能综合反映平滑肌整体收缩反应，包括频率、振幅和张力等变化。

以基线水平的5min肌条收缩AUC为对照值(F₀)，以加入各干预制剂后的5min肌条收缩AUC为效应值(F)，按照以下方程计算AUC变化百分数(％variation)：

AUC变化百分数＝(F-F₀)/F₀×100％

如图可知，与对照组相比，BAC去神经支配大鼠来源的肌条表现出明显地肌紧张增加和不规则的峰值。而神经修复材料的注入可以明显减少这些异常表现，包括减少曲线形态的异常(图11A,B)和收缩张力的异常(图11C,D)。

在假手术组中，我们可以观察到，随着肌电刺激频率的逐级增加(图11C)，幽门环形肌表现出频率依赖性的松弛现象，然而BAC组中则未能观察到此现象。但是在BAC去神经支配并注入神经修复材料组中，我们可以观察到随着肌电刺激频率的逐级增加，幽门环形肌恢复了明显的频率依赖性的松弛现象(图11C,D)。并且，利用NOS抑制剂L-NAME能够完全阻断这个恢复过程(图11E)。

由上可知，神经修复材料注入能够显著恢复幽门去神经支配后的肌肉松弛程度。

实施例5、分子水平验证神经修复材料的作用

1、RT-PCR

1.1RNA提取

1)称取50mg冻存胃组织，每个标本中加入1mLTrizol，冰上匀浆(胃组织)/冰上吹打(细胞)；

2)将所得裂解液转移至1.5mLEp管中，加入预冷氯仿0.2mL/管，用力振荡15s，室温静置15min，在4℃和12000rpm条件下离心15min；

3)离心后所得液体共分为三层：无色透明的最上层为含RNA液层，白色DNA中间层以及红色蛋白质底层，小心吸取RNA液体转移至一新的EP管中；

4)加入等体积预冷异丙醇，约0.5mL，小心混匀，-20℃静置30min，在4℃和12000rpm条件下离心10min；

5)离心后去上清，沉淀中加入预冷75％乙醇1mL，小心振荡30s，在4℃和12000rpm条件下离心5min；

6)去上清，Ep管中沉淀精致干燥5min，加入20μL无菌ddH₂O，取其中2μL，用于RNA浓度测定，其余置于-70℃冰箱备用。

1.2RNA浓度测定

取RNA样品2μL加入98μL无菌ddH₂O中稀释(1∶50)后，紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸光度，计算所提取RNA样品的浓度及纯度。

样品RNA浓度＝50×A260×40μg/mL。以A260/A280的比值作为RNA纯度，正常值在1.8～2.0范围内。

1.3逆转录

1)建立20μL体系用于约5μg总RNA行逆转录，使用M-MLV逆转录酶进行第一链；

2)cDNA的合成

(1)于微量离心管中将所提取总RNA约5μg、10mMdNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP均为10mM，pH为中性)1μL、Oligo(dT)181μL，加入无菌ddH₂O中至12μL混匀；

(2)上述混合物于PCR仪中65℃加热5min，迅速置于冰上冷却1min；

(3)短暂离心，加入5×第一反应链缓冲液4μL、0.1MDTT2μL以及RNaseOUTTM核酸酶抑制剂(40U/μL)1μL混匀；

(4)PCR仪中37℃孵育2min；

(5)室温下加入1μL(200单位)M-MIV逆转录酶混匀；

(6)PCR仪中37℃孵育50min，70℃加热15min；

(7)置于-20℃冰箱中保存。

1.4Real-timePCR

1)于Real-timePCR8连管中加入CDNA1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、SYBR10μL、ddH₂O7μL至终体积20μL，混匀；

2)Real-timePCR反应条件：预变性95℃10min变性95℃30s退火60℃1min延伸72℃30s共40个循环，循环结束后72℃延伸10min，β-actin作为内参照，每个标本均做副管PCR反应；

3)Real-timePCR结果分析：RNA相对表达量计算公式：相对表达量＝2-△△Ct；其中△Ct＝Ct目的基因-Ct内参，△△Ct＝△Ct模型组-△Ct对照组。

所用到的引物序列：

GDNFRT-PCR：

5’-TGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3’；

5’-GCCGCTTGTTTATCTGGTGA-3’；

内参β-actin

5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；

5’-ACCCACGGAAGGAAGGCT-3’。

2、蛋白印迹法(Westernblotting)

2.1蛋白提取

1)称取约50mg冻存的胃组织，置于玻璃匀浆器中，无菌PBS洗涤2次，沉淀细胞转移至1.5mLEp管中(细胞)；

2)加入约300μLRAIPA裂解液与蛋白酶抑制剂混合液(100∶1)置于冰上充分匀浆、研磨裂解，点震荡裂解30s×5次，间隔5min，冰上孵育30min；

3)在4℃，12000rpm条件下离心10min，取上清，即为所提取蛋白液；

4)取其中3μL用于检测蛋白浓度，其余上清液按照4∶1的体积比例加入5×SDS蛋白上样缓冲液，于PCR仪中100℃10min变性，置于-70℃保存备用。

2.2蛋白含量测定：标准曲线的制作

1)按照BCA蛋白定量试剂盒说明书：将A、B液按50∶1的比例混匀配置工作液，BSA稀释至2mg/mL，备用；

2)取8个1.5mLEp管，分别做好编号，制备浓度梯度BSA标准液：

3)混匀后，37℃温箱孵育30min，于实验室酶标仪中(取波长为592nm)测各孔OD值；

4)以蛋白含量(μg)为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。

2.3检测样品蛋白含量

1)取适量的1.5mLEp管，稀释待测标本至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，每管加入A&B工作液至200μL，充分混匀，37℃孵育30min；

2)标准曲线0号管做参比，混匀后放置2min作为空白样品；

3)将空白样品放置在对照槽，按照酶标仪操作程序操作，即可用于检测OD值；

4)根据所测样品的OD值，通过所得标准曲线获得相应的蛋白含量，除以标本稀释液总体积，再乘以标本稀释倍数即为标本浓度。

2.4Western-blot技术

2.41SDS-PAGE电泳

1)清洗玻璃板：

洗洁精冲洗，无水酒精棉球擦洗，最后双蒸水冲洗，晾干备用；

2)灌胶与上样：

(1)两玻璃上下左右对齐封紧，装好电泳装置板，防止漏胶；

(2)按照配方配制12％分离胶，最后加入TEMED立即混匀灌胶。然后再轻轻加一层蒸馏水，避免空气氧化，同时使凝胶更快；

(3)当胶和蒸馏水之间形成一条折射线时，说明胶已凝固，即可倒去分离胶上层蒸馏水并用吸水纸将水吸干；

(4)按前面方法配制5％的浓缩胶，加入TEMED后立即混匀灌胶。使剩余空间灌满浓缩胶，梳子小心插入胶中，防止气泡产生，根据凝胶情况补胶，待胶凝固后，捏住梳子的两边向上小心将其竖直拔出；

(5)采用蒸馏水冲洗浓缩胶各槽道，打开下板，放入电泳槽；

(6)据蛋白浓度标准曲线计算上样量为60μg(组织)/40μg(细胞)时各标本的上样体积；

(7)加入足量电泳缓冲液，开始上样。注意：防止上样时吸入气泡，同时，加下一个样本之前，保证已将加样器用电泳缓冲液洗涤干净，防止蛋白样品交叉污染。

3)电泳：一般采用恒压电泳：100V较好，电泳时间2.5h。

2.4.2转膜

电泳完毕，撬掉玻璃板，小心剥落分离胶，根据上样标本及目的蛋白位置进行切割，膜材料为硝酸纤维素膜(NC膜)，按照“海绵—3层滤纸—凝胶—NC膜—3层滤纸—海绵”的顺序装置，注意小心赶出层面间的气泡。将夹子放入转移槽中，使夹子黑面对应槽的黑面。转膜条件一般设置为恒电流200mA，电泳50min，电泳槽边放置冰水混合物以降温。

2.43免疫反应

1)用TBS将NC膜浸湿后，移至含封闭液的平皿中，于室温下摇床上摇动封闭1h；

2)将膜放入含TBST稀释的一抗大小与膜相似的塑料袋中，封口，摇床上摇动孵育1h，置4℃冰箱孵育过夜；

3)次日将NC膜室温下摇床上复温30min，用TBST摇床上摇动洗涤3次，每次10min；

4)将膜放入含TBST稀释的相对应的二抗的大小与膜相似的塑料袋中，封口，摇床上摇动孵育1h；

5)将膜取出，TBST摇床上摇动洗涤3次，每次10min。

2.44化学发光，显影，定影

1)将A和B两种显色底物按照1∶1的体积比例混匀，将NC膜置于底物混合液中充分接触1min，然后将膜移至另一塑料袋中，去尽残留底物混合液，赶尽气泡，包好后，放入暗室X-光片中；

2)视信号强弱曝光一定时间后，打开X-光片夹，将X-光片迅速浸入显影液中，出现明显条带后，即终止显影；

3)显影完毕，将X-光片迅速浸入定影液中，定影时间一般约5min，定影完毕后，自来水冲洗干净X-光片，室温下晾干。

2.45凝胶图象分析

将所得胶片进行扫描，凝胶图像处理软件Quantity-one分析各目的条带光密度值。

3、免疫组化实验

1)焙片：将载玻片放入烤箱中，60min，60℃；

2)室温冷却载玻片；

3)脱蜡：二甲苯浸洗2次，每次15min；

4)水化：梯度乙醇水化，100％-85％-75％，每次5min；

5)蒸馏水浸洗3次，每次5min；

6)抗原修复：玻片浸泡于0.1mmoL/L、pH＝6.0枸橼酸修复液中，保鲜膜覆盖，微波炉高中低档各加热5min，室温冷却10～20min，补液，上述步骤循环4次；

7)PBS洗5min*3次；8)封闭：1％驴血清封闭30min，室温；

9)孵育一抗：1％BSA配制一抗，37℃1h，或者4℃过夜(放于湿盒内，以防干燥)；

10)第二天将玻片从冰箱中取出，室温复温30min；

11)PBS洗5min*3次；

12)孵育二抗：1％BSA配制HRP-二抗，37℃30min(放于湿盒内)，

13)PBS洗5min*3次；14)DAB显色：配制DAB显色液，A、B、C液各一滴(避光)，现用现配，滴加至玻片组织上，显微镜下观察染色程度，及时用蒸馏水终止染色；

15)苏木精复染1下，用水冲洗；

16)1％盐酸酒精浸泡4秒，蒸馏水泡5min；

17)脱水：梯度酒精脱水75％→85％→100％，各3分钟；

18)透明：将玻片放入二甲苯透明，观察组织透亮，无气泡；

19)中性树胶封片。

滴加适量中性树脂于玻片上，盖上盖玻片，避免气泡出现。

4.免疫荧光实验

1)冰冻切片室温晾干15分钟；

2)PBS洗5min×3；

3)0.1％TritonX-100破膜并15％BSA室温封闭60min；

4)PBS洗5min×3；

5)分别滴加一抗(稀释比例按相应抗体说明书)，室温摇床60min；

6)切片置于湿盒内，4℃过夜；

7)第二天切片复温60min；

8)PBS洗5min×3；

9)分别滴加二抗(稀释比例按相应抗体说明书)，室温摇床60min；

10)PBS洗5min×3；

11)染核：1μg/mlHoechst33342染色10min；

12)PBS洗5min×3；

13)荧光淬灭剂封片；

14)荧光共聚焦显微镜下观察或-20℃避光保存与荧光结果一致。(图6和图7)，WB检测结果显示(图7C)，与假手术组相比，注入神经修复材料的去神经支配大鼠幽门部位的神经元标记物(PGP9.5,NSE,Tuj1)和一种主要的肠神经递质(nNOS)表达显著升高3倍以上。

由上可知，经过神经修复材料注入后可使多种神经元标记物显著升高。

荧光结果显示，在注入未经预处理的BMSC的大鼠中，未能观察到明显的神经元再生(图9)。WB结果也显示：未经预处理的BMSC注入去神经支配的大鼠后与预处理组相比，这些神经元标记表达几乎没有改变(图12)。

由上可知，未经预处理的BMSC注入后不能诱导有效ENS神经元再生。

作为神经生长因子，GDNF在ENS的生长发育过程中发挥了很重要的作用。将BMSC打入大鼠体内，我们发现内源性GDNF的表达存在一个潜在的正反馈机制(图13)。BMSC可以内源性地表达低水平的GDNF蛋白，然而，人为加入外源性GDNF以后，发现BMSC中内源性的GDNF表达显著升高(图14A，B)。此外，注入BMSC的大鼠与对照组的大鼠相比，可产生一种持续稳定高表达的GDNF，长达28天之久。

由上可知，在体内外实验中均可观察到BMSC的“GDNF正反馈”现象，这一现象可能是预处理后的BMSCs作为一种神经修复材料高效导致神经再生的重要原因。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。

2.一种用于治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料，其特征在于：它的原料是由骨髓基质干细胞、含有碱性成纤维细胞生长因子BFGF的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠培养基组成，其中，所述骨髓基质干细胞含量是约1.0×10^5～7个/mL。

3.根据权利要求2所述的神经修复材料，其特征在于：所述胎肠培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)取胚胎发育15天的SD孕鼠，45mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射常规麻醉大鼠；

2)无菌条件下取出8～10条胎肠，用无Ca²⁺，Mg²⁺的PBS清洗2～3次；

3)再用1mg/mL的胶原酶常温消化15min；

4)PBS洗2次，反复吹打研磨，加入含有20μg/mL纤连蛋白的DMEM低糖液体培养基，并接种于培养瓶中；

5)3天后收集培养液，84g离心5min，取上清过滤，即得到FGCM原培养基；

6)使用时，将FGCM原培养基与DMEM低糖液体培养基按体积比1∶1混合，并调整pH值为7.4，即得到胎肠培养基。

4.根据权利要求2所述的神经修复材料，其特征在于：所述DMEM低糖液体培养基的配方1000mg/L的葡萄糖，15％的胎牛血清，2mmol/L的L-谷氨酰胺，110mg/L的丙酮酸钠，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

5.根据权利要求2或3或4所述的神经修复材料，其特征在于：所述DMEM低糖液体培养基中碱性成纤维细胞生长因子的含量为6～16ng/ML。

6.根据权利要求5所述的神经修复材料，其特征在于：最优选为：碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL。

7.根据权利要求2或3或4所述的神经修复材料，其特征在于：所述胎肠液体培养基中神经胶质细胞源性神经营养因子的含量为8～14ng/mL。

8.根据权利要求7所述的神经修复材料，其特征在于：所述胎肠液体培养基中神经胶质细胞源性神经营养因子的含量为10ng/mL。

9.根据权利要求1或3所述的神经修复材料，其特征在于：所述骨髓基质干细胞含量是约1.0×10⁶个/mL。

10.一种权利要求2所述神经修复材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)首先将骨髓基质干细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培养基中，培养12～36h；得到培养物；

2)将步骤1)得到培养物置于含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠液体培养基中培养10～15d；得到神经修复材料；其中，每3天更换培养基。