JP6002581B2 - 細胞プログラミング - Google Patents
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Description
本発明は、哺乳動物体細胞の再プログラミング、特に、哺乳動物成熟体細胞の再プログラミングに関する。
本明細書全体にわたる従来技術に関する記述は、それらの従来技術が公知であること、または当該分野の一般的な知識の一部を成すものであることを認めるものではない。
予想外にも、哺乳動物成熟体細胞(例えば哺乳動物成熟線維芽細胞)を、複能性系統特異的前駆細胞に直接再プログラミングできることが明らかになった。この再プログラミングは、人工多能性幹(iPS)細胞で必要とされるような、細胞の遺伝子プロファイルを多能性状態に再プログラミングする必要がなく、特定の組み合わせの系統特異的転写因子が体細胞に送達されることによって、体細胞が運命決定された(すなわち系統特異的)複能性前駆細胞に再プログラミングされることを示している。
a)1つまたはそれ以上の因子を該体細胞に送達し(ここで、該1つまたはそれ以上の因子は該前駆細胞の系統特異性を決定する);そして
b)該体細胞を、該系統特異的前駆細胞の培養が可能な条件下で培養する
段階を含む。
本明細書においては、以下の用語を以下のように定義する。
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、「含有する」、「含有し」などの単語は、排他的または網羅的な意味の対語としての、包括的な意味;すなわち、「包含するが、それに限定されない」と言う意味であると解釈される。
この用語が細胞に関して使用される場合、その最終分化状態に達した細胞、すなわち、もはやそれ以上分化する可能性がない細胞を示すものと解釈される。それらの細胞は、種々の発達段階(胚芽期、出生後期、または成体期など)に見られるが、認識されるように、最も便宜には成体を供与源とする。
この用語が神経系の細胞に関して使用される場合、「神経」細胞および「グリア」細胞を包含すると解釈される。
この用語が細胞系統に関して使用される場合、系統は、有糸分裂を通した関係にある細胞の系統である。
この用語が細胞に関して使用される場合、ある細胞がその特定の分化状態になるように運命決定されていることを意味する。
この用語が細胞に関して使用される場合、ある細胞系統の複数の細胞タイプおよび/または組織タイプに分化する能力がある細胞を意味する。
この用語が細胞に関して使用される場合、追加の(extra)胚性細胞タイプおよび/または組織タイプを除く、全ての細胞系統の細胞タイプおよび/または組織タイプに分化する能力のある細胞を意味する。
この用語が細胞に関して使用される場合、全ての細胞系統ではなく、複数の細胞系統の細胞タイプおよび/または組織タイプに分化する能力のある細胞を意味する。
この用語は、非多能性供与源または非複能性供与源(一般的には成熟体細胞)から、神経系統の細胞に特徴的なある種の遺伝子の発現を誘導することによって人工的に誘導された、あるタイプの多能性前駆細胞をさす。従って、iMNP細胞は、神経系の細胞タイプおよび/または組織タイプにしか分化できない。
幹細胞を用いる細胞移植療法は、脳疾患または脳損傷(例えばパーキンソン病、ハンチントン病、卒中、または脊髄損傷)患者にとって、疾患によって喪失した細胞を新たな細胞で置換することによる、実行可能な治療戦略となりうる。胚性幹細胞は、無制限に増殖する能力を有すると同時に、体内の全てのタイプの細胞を形成する能力を保持する。これらの特性から、ヒト胚性幹細胞は、種々の疾患および傷害(脳損傷および脳疾患など)に罹患した患者の治療に有用であり、再生医療に革命をもたらすことが期待されている。
本発明を代表する便宜なモデルとして、ヒト成熟皮膚線維芽(HDF)細胞をCell Applications社(米国サンディエゴ)から購入した。
タンパク質形質導入(実施例4)またはプラスミドトランスフェクション(実施例5)を行った後、HDF細胞をトリプシン処理によって回収し、6ウェルプレート(Nunc社、デンマーク)または24ウェルプレート(Nunc社)のいずれかに播種した。トランスフェクションまたは形質導入の3日後、細胞培養液を、以下を含有するNeurobasal A(NBA)増殖培地に交換した:Neurobasal-A(Invitrogen社)、1% D-グルコース(Sigma Aldrich社)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(Invitrogen社)、2% B27サプリメント(レチノイン酸含有)(Invitrogen社)、0.2% EGF(Peprotech社、米国)、0.08% FGF-2(Peprotech社)、0.2%ヘパリン(Sigma Aldrich社、米国)、およびバルプロ酸(Sigma Aldrich社)(1μM)。培地は週3回交換し、細胞を定期的に再播種し(最大週1回の再播種で、2-8回。コロニーが形成され始めると、いっそう定期的になった。)、再プログラミングされていない細胞を除去し、これをコロニーが広範に形成されるまで行った。
蛍光R-フィコエリトリンタンパク質(PE)をOz Bioscience社またはSigma-Aldrich社のいずれかから購入した。タンパク質形質導入を最適化するために、5x104のHDF細胞を、形質導入の24時間前に24ウェルプレートに播種した。形質導入の1時間前に、線維芽細胞増殖培地を除去し、あらかじめ加温した血清未含有D-MEMで置換した。蛍光R-フィコエリトリンタンパク質(PE;1μg)を、ProDeliverIn(Oz Bioscience社、フランス)またはProteofectene(Biontex社、米国)のいずれかと、1:1、1:2、および1:3(m/v)で混合し、20分間インキュベートして複合体を形成させ、それぞれ、HDF細胞に添加した。3時間後に、形質導入培地を通常の線維芽細胞増殖培地で置換した。タンパク質形質導入効率を更に最適化するために、HDF細胞を、PE-タンパク質形質導入複合体と共に、通常の線維芽細胞増殖培地中で48時間インキュベートした。形質導入の24時間後、PEの取り込みを落射蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse TE2000U(Nikon社)使用)およびフローサイトメトリー分析(BD LSR-II(Becton Dickinson社、米国))によって分析した。コントロール実験は、形質導入試薬を使用せずにPEを細胞に添加して行った。
ProDeliverInまたはProteofecteneのいずれかを用い、タンパク質:形質導入試薬=1:2の比率で成熟HDFにタンパク質を形質導入した結果、蛍光PEタンパク質の細胞取り込みが起こったが、形質導入試薬を使用せずにPEを細胞に添加したコントロール実験では、細胞内にPEは観察されなかった(図2A-C)。
組換えSox2-TATタンパク質をPreprotech社から購入した。組換えPax6タンパク質はAbnova社から購入した。Sox2-TAT(Peprotech社)およびPax6(Abnova社、台湾)の完全長タンパク質の共形質導入を行うため、5x105の密度の成熟HDFを、コーティングしたまたはしていない6ウェルプレート中、5μgのタンパク質混合物およびProDeliverIn(1:2(m/v))と共に、線維芽細胞増殖培地中で48時間インキュベートした。48時間後、タンパク質形質導入培地をNBA増殖培地(1μMバルプロ酸含有)で置換し、更に24時間培養した。タンパク質形質導入を4サイクル、HDF細胞に行った後、完全に1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地に交換した。培地は2-3日ごとに交換し、週1回再播種し、広範なコロニーが観察されるまでこれを行った。その後、コロニーを単離し、PCRまたは免疫細胞化学分析を行った(図7および8)。
Sox2およびPax6のcDNAをAddgene社およびInvitrogen社から購入し、それぞれを、pDNAバックボーンのCMVプロモーター制御下にクローニングした(図4参照)。これらのプラスミドを増幅させ、PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit(Invitrogen社)を用いて精製した。トランスフェクションはLipofectamine LTX試薬(invitrogen社)で行い、ウェル当たり5x105のHDF細胞を未コーティングの6ウェルプレートに播種し、24時間後にトランスフェクションを行った。Plus Reagent (Invitrogen社)を1μgの各pDNAとOptimem培地(Invitorogen社)中で混合した後、LTX遺伝子送達試薬を6:1(v/m)の比率で添加して、遺伝子導入複合体を形成させた。細胞をトランスフェクション混合物と共に5時間インキュベートし、その後、フレッシュな線維芽細胞増殖培地に交換した。3日後、細胞に1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地に交換した。コロニーが観察されるまで、培地を2-3日毎に交換し、定期的に再播種を行った。コロニーを単離し、PCRおよび免疫細胞化学分析を行った(図7および8)。コントロール実験は、eGFPコントロールプラスミドを用いて行った。
FACS分析では、上記のようにLTX試薬を用いた場合には12%の細胞がeGFPでトランスフェクトされ、トランスフェクションを行っていない細胞では0%であった(図5B)。蛍光eGFPプラスミドの細胞取り込み(緑色)を図5Aに示す。
HDF細胞を実施例5に記載するようにトランスフェクトし、トランスフェクションの3日後に1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地に交換し、実施例2に記載するように培養した。30日以内にコロニーが形成された。その後、一群のコロニーを、スクレイピングおよび機械的破砕によって5-10個の細胞コロニーに分離し、コロニーの自己再生能力および2次コロニー形成能力を評価した。分離したコロニーを、未コーティングの6ウェルプレート(Nunc社)に播種し、1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地中で培養した。5-10個の細胞コロニーが14日間で2次コロニーを形成した。2次コロニーの直径(サイズ)を測定し、測定されたコロニーのパーセンテージとして、4つの時点-分離前(「pre diss.」)、分離6日後、分離10日後、および分離14日後-に対してプロットした。
1次iMNPコロニーが、Sox2/Pax6トランスフェクション後7日以内に形成され始めた。トランスフェクションの約30日後に広範なコロニーが形成されるまで、定期的な再播種によって、再プログラミングされていない細胞を除去した(図6AおよびB)。最も重要なことに、コロニー形成は、フィーダー細胞層の存在を必要としなかった。本発明者の推定によれば、コロニー形成効率は、播種した総HDFの約0.05%である。
PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen社)を使用して、iMNP細胞および正常成熟HDF細胞から総RNAを抽出した。Superscript逆転写酵素(invitrogen社)を使用し、製造者のプロトコルに従って、総RNAからcDNAを生成させた。神経前駆細胞および未成熟神経マーカーの発現が、RT-PCRによって検出された(Taq DNAポリメラーゼ(New England社)および表1に示すプライマーを使用)。
Sox2/Pax6 iMNPコロニーは、神経前駆細胞遺伝子、Hes1、Sox3、Sox2、およびPax6の全長を恒常的に発現した(図7)。更に、コロニーが、未成熟神経マーカー、Ngn2およびMash1を発現しているのが観察された(図7)。神経前駆細胞遺伝子および未成熟神経マーカー遺伝子の発現は、プラスミド・トランスフェクションまたはタンパク質形質導入のいずれによって形成されたコロニーでも観察された。コントロール(GFPでトランスフェクトした、またはPEを形質導入した)コロニーでは、Hes1、Sox3、Sox2、Pax6、Ngn2、またはMash1の発現が、場合によって検出された(図7;細胞系統11および細胞系統8)。これは、成熟HDF細胞を1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地中で培養するだけで、神経前駆遺伝子の誘導を促進するのに十分でありえることを示唆している。しかしながら、図7に示す結果から明らかなように、広範な神経前駆細胞遺伝子および未成熟神経マーカー遺伝子を恒常的に誘導するためには、成熟HDF細胞のSox2およびPax6でのトランスフェクションまたは形質導入が必要である。
コロニーを4%パラホルムアルデヒドで固定し、標準的な2重蛍光標識免疫細胞化学法を、未成熟神経マーカー、Mash1/Ashl1(Chemicon社)およびNeuroginin2(Chemicon社、米国)に対するヒト特異的抗体を用いて行った。DAPIを細胞核の対比染色剤として使用した。未処理のHDF細胞をネガティブコントロールとして使用した。標準的な蛍光免疫細胞化学法は、例えば“Immunocytochemical Methods and Protocols” Series: Methods in Molecular Biology, Constance OliverおよびMaria Celia Jamur編, 第3版, 2010 Humana Press(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に報告されている。
Sox2/Pax6 iMNPコロニー集団は、未成熟神経マーカー、Mash1およびNgn2を発現していることが観察された(図8)。図8CおよびFに示すように、Mash1を発現しているコロニー内の個々の細胞は、Ngn2も発現していた。これは、iMNPコロニー内の細胞集団が未成熟神経系統に再プログラミングされたことを示している。
Claims (11)
- 哺乳動物成熟体細胞を、再プログラミングされた複能性(multi-potent)神経前駆細胞へ再プログラミングする方法であって、
a)Sox 2 およびPax 6転写因子、またはSox 2およびPax 6をコードする核酸、を前記体細胞に送達し、ここで前記転写因子の組合せは哺乳動物成熟体細胞から複能性神経前駆細胞への転換を誘導するものであり;そして
b)ステップa)で得られた前記体細胞を、前記複能性神経前駆細胞の培養が可能な条件下で培養する
段階を含む、上記方法。 - 前記哺乳動物成熟体細胞が、肺線維芽細胞、腎線維芽細胞、心臓線維芽細胞、間質線維芽細胞、包皮線維芽細胞、または皮膚線維芽細胞から選択される哺乳動物成熟線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記哺乳動物成熟体細胞がヒト成熟皮膚線維芽細胞である、請求項1または2記載の方法。
- 前記哺乳動物成熟体細胞が、神経学的疾患および傷害であって組織再生がその治癒の一部である疾患および傷害から選択される状態にある患者から過去に採取された細胞である、請求項1から3のいずれかに記載される方法。
- 前記複能性神経前駆細胞が、Pax6、Sox2、Hes1、Hes5、Sox1、Sox3、Mash1/Ashl1、およびneurogenin 2から成る群から選択される少なくとも1つの神経細胞系統マーカーを発現する、請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。
- 前記Sox 2 およびPax 6転写因子を前記体細胞に送達する前記段階が、前記Sox 2 およびPax 6転写因子を、タンパク質形質導入を介して、または非ウイルスベクターもしくはウイルスベクターからのタンパク質発現を介して送達することを含む、請求項1から5のいずれかに記載される方法。
- 前記体細胞を培養する前記段階が、前記神経前駆細胞の増殖を支持する能力を有する培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項1から6のいずれかに記載される方法。
- 前記培地が、クロマチンの脱アセチル化を阻害するクロマチン修飾剤を含有する、請求項7記載の方法。
- 前記クロマチン修飾剤がバルプロ酸であり、該バルプロ酸を1μMの濃度で使用する、請求項8記載の方法。
- 請求項1から9のいずれかに記載される方法によって生成される、再プログラミングされた複能性神経前駆細胞。
- 前記複能性神経前駆細胞が、Pax6、Sox2、Hes1、Hes5、Sox1、Sox3、Mash1/Ashl1、およびneurogenin 2から成る群から選択される少なくとも1つの神経細胞系統マーカーを発現する、請求項10記載の再プログラミングされた複能性神経前駆細胞。
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