KR101907801B1 - 유전자 전달용 그래핀 옥사이드―폴리에틸렌이민 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그래핀 옥사이드―폴리에틸렌이민 복합체의 유전자 전달 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 그래핀 옥사이드-폴리에틸렌이민 복합체를 포함하는 유전자 전달체, 이를 이용한 유도(역분화) 만능 줄기세포의 제조방법, 이로부터 제조된 만능 줄기세포 및 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 GO-PEI 복합체는 역분화 만능 줄기세포를 유도하는 전사인자의 RNA와 안정적으로 결합하여 세포 내로 효과적으로 도입될 수 있으며, 일정한 세포 증식 후에는 세포 내 함량이 미미하여, 역분화 만능 줄기세포의 안전하고 효율적인 생성 방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 일반적인 유전자 도입 방법을 대체하여 다양한 세포주들에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현시스템으로 활용될 수 있다.

Description

유전자 전달용 그래핀 옥사이드―폴리에틸렌이민 복합체 및 이의 용도{Graphene oxide-polyethylenimine complex for gene delivery and uses thereof}

본 발명은 그래핀 옥사이드―폴리에틸렌이민 복합체의 유전자 전달 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 그래핀 옥사이드-폴리에틸렌이민 복합체를 포함하는 유전자 전달체, 이를 이용한 유도(역분화) 만능 줄기세포의 제조방법, 이로부터 제조된 만능 줄기세포 및 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

배아줄기세포는 포유류 포배기 배아(blastocyst)의 내부 세포덩어리(inner cell mass)에서 유래하는 것으로, 인간의 장기로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 유지하면서 무한히 증식하는 특성을 지니고 있다. 1981년 세계 최초로 톰슨에 의해서 생쥐 배아줄기세포가 확립된 후, 배아줄기세포 연구가 급격히 발전되었으며, 1984년에는 생식선 키메라 생산을 통하여 배아줄기세포의 전능성이 직접적으로 확인되었다. 이들 줄기세포로부터 다양한 조직세포로 분화가 가능하여, 질병이 발생한 조직과 기관을 재생 또는 대체할 수 있는 새로운 세포를 만들어낼 수 있으며, 이를 활용하여 당뇨병, 심장병, 알츠하이머병, 암 등 난치성 질환에 대한 줄기세포 치료법을 개발하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 동물 복제와 인간 배아 줄기세포 기술의 혼합은 개개인의 환자로부터 줄기세포를 생산하여 임상적으로 사용하는 맞춤형 치료법 개발을 촉진시켜 왔으며, 이러한 줄기세포는 동종 배아줄기세포로부터 유도된 세포 이식에 대한 면역 거부반응을 극복할 수 있고 복합적인 인간 질병들을 연구하는 실험 모델로도 사용될 수 있다.

그러나 이러한 방법들이 인간의 질병 치료에 응용되는 데는 윤리적 기술적인 한계가 있으므로, 줄기세포를 사용하기보다는 체세포를 재프로그램화 (reprogramming)하여 다양한 세포로 분화시키는 방법들이 연구되고 있다. 또한 역 분화 만능 줄기세포(iPSCs; induced pluripotent stem cells)는 배아세포를 둘러싼 윤리 논란을 불식시키고 치료용 맞춤 줄기세포를 연구할 수 있는 계기를 마련하였다. 최초로 2006년 8월 일본 교토대 야마나카 교수팀은 레트로바이러스(retrovirus)를 이용해서 마우스의 피부세포에 Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4를 삽입하여 배아줄기세포와 유사한 원시세포를 생성하였으며, 이 세포를 유도(또는 역분화) 만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPSCs)라고 명명하였다. 이러한 연구는 배아 파괴나 난자 제공과 같은 윤리적 문제없이 환자별/질환별 맞춤식 역 분화 만능 줄기세포를 만들어낼 수 있는 기반을 제공하였다는 점에서 중요한 의미가 있다. 역 분화 만능 줄기세포는 질병의 발병 메커니즘 이해와 약물의 효능 및 안전성 검사에 활용될 수 있다. 그러나 DNA를 기반으로 한 iPSCs의 제작은, DNA를 받아들이는 세포의 게놈에 DNA가 삽입(integration)될 확률이 높고, 이를 통한 유전자의 변이가 유도되어 암이나 다른 질환이 발생할 수 있는 문제점이 있다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 위와 같은 유전자 삽입이 발생하지 않도록 하면서, 도입되는 유전자를 단기간 발현시켜 재프로그램화하는 효율적인 iPSCs 제작 방법의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 그래핀 옥사이드-폴리에틸렌이민(Graphene oxide-Polyethylenimine) 복합체를 이용하여 안정적으로 RNA를 세포 내로 도입할 수 있는 방법을 개발하고, 이를 통해 iPSCs 를 제작한 후 그 다양한 세포로의 분화능이 매우 안정적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 그래핀 옥사이드(Graphene oxide, GO)는 그래핀의 전구체로써, 쉬운 합성, 높은 콜로이드 안전성, 생체 적합성 등의 여러 장점으로 인해 최근 다양한 생물학적 응용에 유용한 물질로 주목받고 있다.

미국특허문헌 20130095083A1

본 발명의 목적은 그래핀 옥사이드-폴리에틸렌이민 복합체를 이용한 유전자 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 이용하여 역분화 만능 줄기세포 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 이용하여 역분화 만능 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)와 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)이 결합되어 형성된 복합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복합체는, 폴리에틸렌이민 용액을 그래핀 옥사이드에 첨가하는 단계; 및 초음파 처리 후 교반하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 폴리에틸렌이민은 단독으로 세포에 전달될 경우 독성이 있기 때문에 세포를 죽인다는 사실이 종래부터 보고되었으며, 이에 따라 PEI가 유전자 전달체로 사용되기 위해서는 그 독성도를 줄이기 위하여 다른 생체적합 고분자가 복합적으로 사용될 필요가 있다. 본 발명에서는 위와 같은 용도로 그래핀 옥사이드를 사용하였으며, 그래핀 옥사이드를 함께 사용하였을 경우 PEI를 단독으로 사용한 경우와 달리 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 3). 또한, 그래핀 옥사이드는 음전하를 가지고 있기 때문에 복잡한 화학적 반응 없이 단순한 정전기적 인력으로 양전하를 띠고 있는 PEI와 쉽게 결합할 수 있는 장점이 있으며, 이에 따라 높은 양전하를 나타내는 핵산을 보다 효율적으로 결합시키고, 안정한 GO-PEI 복합체를 형성할 수 있다.

상기 유전자 전달체는 DNA 또는 RNA에 암호화되어 있는 목적 유전자를 세포 안으로 전달하기 위한 것으로, 상기 핵산 분자는 상기 GO-PEI 복합체에 결합되어 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 유전자는 역분화 만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPSCs)를 유도할 수 있는 다능성(pluripotency) 관련 유전자일 수 있다. 상기 다능성 관련 유전자의 예로는 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4 등이 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 역분화 만능 줄기세포를 유도하는 기능이 있는 유전자라면 제한 없이 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달체는 GO-PEI 복합체를 이용하여 다능성 관련 전사인자의 mRNA를 세포에 전달할 수 있다(도 4 및 5).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달체는 목적 유전자를 세포 내의 게놈 DNA로 삽입시키지 않는 특징이 있다. 즉, RNA를 사용하여 iPSCs를 제작할 경우, 외래 유전자가 genome으로 삽입(integration)될 가능성이 없으며, DNA 전달에 비해서 단백질로의 발현 속도가 빨라서, 보다 효율적으로 iPSCs를 제작할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 역분화 만능 줄기세포의 제조방법 및 이에 따라 제조된 줄기세포를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, Rat-ADSC 세포에 GO-PEI와 RNA 복합체를 도입한 후 역분화 만능 줄기세포 생성 유무를 관찰하기 위해 다능성 마커 유전자(Oct3/4, Sox2, Nanog, c-myc, Rex1, FGF4)를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과 다능성 마커 유전자가 생성된 역분화 만능 줄기세포에서 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었으며(도 6C), 면역 염색법(immunocytochemistry)을 이용한 방법에서도 줄기세포 특이 마커인 Oct3/4 와 SSEA-1이 모두 염색되는 것을 확인하였다(도 7). 상기 유전자 전달체를 이용한 역분화 만능 줄기세포 제조방법은 종래 알려져 있던 바이러스를 이용하는 방법보다 안전성이 높으며, 세포 내로 도입된 GO-PEI 또는 이들의 RNA 결합체는 세포가 증식함에 따라서 단일 세포 내 함량이 점점 감소하여, 일정한 세포 증식 후에는 세포 내 함량이 미미한 수준이 된다.

또한, 본 발명의 유전자 전달체는 전달하는 핵산의 종류를 바꿈으로써 iPSCs 제작뿐만 아니라, 다양한 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있는 줄기세포 분화 및 특정 기능 세포로의 직분화(direct differentiation or transdifferentiation or direct conversion) 등에 사용할 수 있으며, 일반적인 유전자 도입 방법을 대체하여, 다양한 세포주들에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현시스템으로 활용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 역분화 만능 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공할 수 있다. 상기 세포치료제는 심근세포, 뇌세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 간세포, 췌장베타세포, 혈관세포 또는 폐세포를 재생시키거나 보호하기 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 세포치료제는 투여를 위해서 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립가능하여야 하며, 그 예로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 GO-PEI 복합체는 역분화 만능 줄기세포를 유도하는 전사인자의 RNA와 안정적으로 결합하여 세포 내로 효과적으로 도입될 수 있으며, 도입된 복합체는 일정한 세포 증식 후에는 세포 내 함량이 미미하여 제작된 역분화 만능 줄기세포에는 영향이 없어, 역분화 만능 줄기세포의 안전하고 효율적인 생성 방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 일반적인 유전자 도입 방법을 대체하여 다양한 세포주들에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현시스템으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른, RNA 기반 역분화 만능 줄기세포를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 GO-PEI와 RNA의 복합체 형성을 위한 조건을 확립하기 위하여 gel retardation 어세이를 수행한 결과이다.
도 3은 GO-PEI 복합체의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 4는 GO-PEI와 RNA 복합체가 처리된 세포에서 RNA 발현이 안정적으로 유지되는지 확인한 결과이다.
도 5는 GO-PEI와 RNA 복합체가 처리된 세포에서 GO-PEI와 복합체를 이루는 RNA가 RNase와 같은 효소에 어느 정도 안정한지 검증한 실험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 RNA 기반 역분화 만능 줄기세포의 생성 유무를 확인한 결과이다.
도 7은 면역염색법(immunocytochemistry)을 이용하여 줄기세포 특이 마커인 Oct4 와 SSEA-1를 검출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라 제작된 역분화 만능 줄기세포의 삼배엽 분화 특성을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 사람의 역분화 만능 줄기세포(human iPSc)의 생성을 관찰한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

실험 재료 및 방법

본 발명의 실시예들에 사용된 실험 재료 및 방법은 다음과 같다.

<1-1> 유도 다능성 줄기세포(iPSc) 및 마우스 배아 줄기세포 배양

유도 다능성 줄기세포는 mitomycin C를 처리한 MEF 세포를 feeder 세포로 사용하여 유지하였다. iPS 배양액은 하이-글루코스(high-glucose 4.5g/L), Na-파이루베이트(pyruvate 0.11g/L) 및 L-글루타민(glutamine)이 들어있는 DMEM 배양액(No. 12800-017, GIBCO사 제조)에 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, GIBCO사 제조), 1% 비필수 아미노산(non-essential amino acid, Sigma사 제조), 50 U/ml 페니실린(penicillin), 50 ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 20% 소혈청 (fetal bovine serum, FBS, Hyclone사 제조)과 leukemia inhibitory factor (LIF, 1000 units/ml, CHEMICON사 제조)를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

<1-2> Embryoid body (EB) 형성 및 신경분화

삼배엽으로의 분화 가능성을 조사하기 위하여, 분화 배양액으로 10% 소혈청을 첨가한 DMEM/F12 (GIBCO사 제조)를 사용하였다. Embryoid body (EB)를 형성하기 위하여 4일간은 부유상태로 배양하였고, 4일간은 1 uM RA를 첨가하여 0.1% 젤라틴 코팅된 배양접시에서 배양하였다.

<1-3> 세포독성 및 생존율 측정

사람 진피 섬유아세포(Human dermal fibroblasts, HDFs) (Lonza, Walkersvile, MD, USA)를 10% (v/v) 소혈청(fetal bovine serum, Gibco BRL), 100 유닛/ml 페니실린 및 100 g/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM 배양액(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA)으로 구성된 생장배지에서, 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터로 배양하였다. GO-PEI 처리된 HDFs의 세포독성 및 생존율을 CCK-8 키트(Sigma) 및 live and dead 어세이를 이용하여 측정하였다.

세포독성 측정을 위하여, HDFs를 24-웰 플레이트에 접종하였다(2 x 10⁴ cells/well). 하루 뒤, 배양액을 무혈청 배지(serum free medium)로 바꾸고, 다양한 투여량의 GO-PEI (0, 0.6, 3, 6, 12, 및 30 ug)를 HDFs에 처리하였다. 24시간의 배양 후에, 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)로 3회 세척하고, 혈청을 함유한 1 ml의 배양배지를 첨가하였다. 100 uL의 CCK-8 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 각 웰의 흡광도는 450 nm에서 측정하였다. 그 결과는 0 ug 처리된 HDFs의 백분율로 표시하였다.

Live and dead 어세이를 위하여, HDFs를 24-웰 플레이트에 접종하였다(1.2 x 10⁴ cells/well). 하루 뒤 배양액을 무혈청 배지(serum free medium)로 바꾸고, 다양한 투여량의 GO-PEI (0, 6 및 12 mg)를 HDFs에 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 혈청을 함유한 배양배지를 첨가하였다. 살아 있거나 죽은 세포를 FDA (fluorescein diacetate, Sigma) 및 EB (ethidium bromide, Sigma)로 측정하였다. 세포들을 FDA/EB (5 g/ml 또는 10 g/ml) 용액에서 37℃로 5분간 배양한 후, PBS로 두 번 세척하였다. EB의 핵 투과성으로 인해 죽은 세포들은 오렌지색으로 염색되었으며, 비-형광성 FDA를 플루오레신(fluorescein)으로 전환할 수 있는 살아있는 세포들은 녹색으로 염색되었다. 염색 후에 형광 현미경(Model IX71 Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 시료들을 관찰하였다. 세포 생존율은 녹색-양성 세포들을 녹색- 또는 붉은색-양성 세포들로 나눈 값을 백분율로 표시하여 정량화하였다.

<1-4> GO-PEI의 세포흡수율 측정

GO-PEI의 세포흡수(cellular uptake)를 DiI (Sigma) 염색된 GO-PEI로 분석하였다. GO-PEI를 DiI로 2시간 동안 염색한 후, GO-PEI 용액을 13000 rpm으로 원심분리하고, 흡수되지 않은 DiI을 포함하는 상층액을 제거하였다. 수집된 GO-PEI를 엔도시토시스(endocytosis)에 사용하기 전에 증류수로 천천히 두 번 세척하였다. 세포흡수 측정을 위해, HDFs를 24-웰 플레이트에 접종하였다(1.2 x 10⁴ cells/well). 하루 뒤 배지를 무혈청 배지로 바꾸었다. 그 후, 다양한 투여량의 GO-PEI (0, 3, 12, 및 30 g)를 HDFs에 24시간 동안 처리하였다. GO-PEI 처리된 HDFs는 PBS에서 4% (w/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 실온으로 10분간 고정하였다. 세포들을 DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 염색하고 형광현미경(Model IX71, Olympus)으로 관찰하였다.

<1-5> Total RNA 준비

Oct3/4, -Sox2, -c-myc, -Klf4 유전자가 각각 발현되는 세포에 트리졸 시약 (Trizol reagent, Sigma사 제조) 1㎖ 을 넣고 상온에서 10분간 반응 후, 세포를 파괴하여 세포의 내용물을 용출시켰다. 200 ㎕의 클로로포름(chloroform)을 넣고 15초 동안 인버트(invert) 상태로 섞어준 다음 상온에서 15분간 반응하여 13,000 rpm, 15분, 4℃의 조건으로 원심 분리하여 DNA와 단백질 부분을 제외한 상층액만을 회수하였다. 그 후 500㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 13,000 rpm, 10분, 4℃의 조건 하에서 원심 분리하여 펠렛 (pellet)을 세척 (washing)하였다. 그리고 75% EtOH 1㎖ 로 세척하고 8,000 rpm, 5분, 4℃의 조건 하에서 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고 펠렛 (pellet)을 건조시켰다. 그 후 RNA 저해용액 (DEPC water) 40 ul에 펠렛을 녹여 total RNA를 준비하였다.

<1-6> 그래핀 옥사이드-폴리에틸렌이민와 total RNA 복합체 형성

준비된 그래핀 옥사이드-폴리에틸렌이민(Graphene oxide-Polyethylenimine) 복합체와 2ug의 total RNA (Oct3/4, Sox2, c-myc, Klf4의 4가지 total RNA 를 각각 0.5 ug씩)를 500ul 의 DMEM 배양액에 넣어 섞은 후 얼음 위에서 20분간 반응시킨다. 20분 후 3 x 10⁴ 으로 60mm 배양디쉬(Falcon제작)에 준비한 rat-ADSC/ human-ADSC 세포에 처리한다.

<1-7> 부유 배양 및 iPSc 생성관찰

Graphene oxide-Polyethylenimine와 total RNA 복합체가 처리된 rat-ADSC/ human-ADSC 세포는 48 시간 후, 트립신을 사용하여 세포를 떼어낸 후 하이-글루코스 (high-glucose 4.5g/L), Na-파이루베이트(pyruvate 0.11g/L) 및 L-글루타민 (glutamine)이 들어있는 DMEM 배양액 (GIBCO사 제조)에 50 U/ml 페니실린 (penicillin), 50 ug/ml 스트렙토마이신 (streptomycin), 10% 소 혈청이 들어있는 배양액을 넣고 60rpm mild rotary shaker(대한과학제조)에서 4일간 배양한다. 4일 후 mitomycin C를 처리한 MEF 세포에 부유배양한 세포 넣고, iPSCs 생성되는 것을 관찰한다.

<1-8> Quantitative-PCR

cDNA를 합성하기 위하여 total RNA 3 ㎕ (1 ㎍/㎕)와 올리고 dT(oligo dT) 2 (10 pmols/㎕)를 혼합하여 70℃에서 5분간 반응시킨 후 4℃에서 5분간 방치하였다. 역전사 혼합물(reverse transcription mixture) (물 5.6㎕, ImProm-II 5X buffer 4㎕, 25 mM MgCl₂ 2.4㎕, 10 mM dNTP 1㎕, RNase inhibitor 1㎕ (40unit), Improm-II reverse transcriptase 1㎕, Promega사 제조)를 15 ul 넣고 25℃에서 5분간 어닐링 (annealing), 42℃에서 60분 동안 신장 (extending), 70℃에서 15분간 Improm-II 리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptase)를 불활성화 (inactivation) 하였다. 합성된 cDNA는 핫 스타트택폴리머라제 (제품명: AccuPrime DNA Taq polymerase, Invitrogen사 제조)를 이용하여 95℃ 15분, 95℃ 1분, 51~59℃ 1분, 72℃ 1분간 30 사이클, 72℃ 5분 동안 익스텐션(extension)하여 Semiquantitative PCR 분석으로 사용하였다. 유전자 복제에 사용된 프라이머는 표 1에 표시하였다. PCR후 DNA 밴드는 전기 영동하여 에디티움 브로마이드(ethidum bromide) 염색 후 UV하에서 관찰하였다. 또한 정량(Quantitative) PCR 분석을 위하여 합성된 cDNA를 쏘페스트 에바그린 수퍼믹스 (SsoFast EvaGreenSupermix, Bio-Rad)를 이용하여 95℃ 30초, 95℃ 5초, 51~59℃ 10초, 72℃ 10초간 40 사이클을 증폭시킨 후, 65℃부터 95℃까지 30초에 0.5℃씩 증가시키면서 melt curve값을 얻고 gene expression analysis for chromo4 real-time PCR detection system(Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다.

정량 및 세미정량 PCR 분석에 사용된 프라이머들

Genes	Forward primer	Reverse primer
Rat-GAPDH	CTTCATTGACCTCAACTAC	GGAAGGCCATGCCAGTGAGC
rOct4	AGAACCGTGTGAGGTGGAAC	TGTCTACCTCCCTTCCTTGC
rSox2	AAGGCCGTGCACGCCGACGA	ACCACACCATGAAGGCATTCAT
rNanog	TAGCCCTGATTCTTCTAGCA	TTTGCTGCAACGGCACATAA
rKlf4	CAGACCTGGAAAGTGGTGG	ACCTGTGTTGCCCGCAGCC
rRex-1	AAATCATGACGAGGCAAGGC	TGAGTTCGCTCCAACAGTCT
r FGF4	TGTGGTGAGCATCTTCGGAGTGG	CCTTCTTGGTCCGCCCGTTCTTA
r Nkx2.5	CGGTGGAGCTGGACAAAGCC	TAGCGGCGGTTCTGGAACCA
r Flk-1	ATACACCTGCACAGCGTACAG	TCCCGCATCTCTTTCACTCAC
rSM22a	GCTGAAGAATGGCGTGATTCTGAG	CCTTCAAAGAGGTCAACAGTCTGG
rSox17	AGGAGAGGTGGTGGCGAGTAG	GTTGGGATGGTCCTGCATGTG
rGata4	CGCTTACACCCCACCGCCTG	AGGCTTGATGAGGGGCCGGT
rGata6	TCATCACGACGGCTTGGACTG	GCCAGAGCACACCAAGAATCC
rNestin	AGAGAAGCGCTGGAACAGAG	AGGTGTCTGCAACCGAGAGT
r NCAM	CTTCTCGGGCTCTGTCAGTGGTGTGG	CACCCAGAAGACTGTGGATG

<1-9> Flow cytometry analysis

트립신을 사용하여 세포를 때어낸 후 PBS로 세척하였다. 세척한 세포는 1 ml의 PBS를 넣고, 세포의 GFP 형광을 FACS를 사용하여 측정하였으며 CellQuest analysis program (BectonDickinson)을 사용하여 그 수치를 분석하였다.

<1-10> 면역 염색법 (Immunocytochemistry)

미분화 및 분화된 iPS 세포를 면역염색법으로 확인하기 위하여 준비된 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 0.2% Triton X-100 용액에 10분간 반응시켰다. 그 후 세포를 PBS로 세척하고 10% 정상 염소 혈청에 1시간 동안 반응시킨 후 1 차 항체를 넣고 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 2차 항체를 붙이기 위하여 PBS로 세척한 후 2차 항체를 넣고 1시간 동안 반응시켰으며 핵은 10 ug/ml의 TOPRO3 (Sigma)을 사용하여 염색하였다. 사용한 1차 항체로는 SSEA1에 대한 모노클로날 항체 (1:100 chemicon) 및 Oct3/4에 대한 폴리클로날 항체 (1:250; Santa Cruz Biotechnology)이며, 2차 항체는 goat anti-rabbit Alexa Fluor 546 (1:200, Invitrogen, goat anti-mouse Alexa Fluor 546 (1:200, Invitrogen)을 사용하였다.

<1-11> 알카라인 포스파타제 (Alkaline phosphatase, AP) 활성도 측정

AP 활성도는 세포를 citrate buffered acetone (sigma 제작)이 들어있는 고정액으로 30초간 고정시킨 후, 증류수로 45초 동안 세척하고 미리 준비해 둔 alkaline-dye mixture (Sigma 제작)를 각 웰에 적용하고, 상온에서 빛을 차단한 채 30분 동안 반응시키고 관찰하였다.

<1-12> 통계처리

정량적인 데이터는 평균 ±표준편차로 표시하였다. 통계분석은 Bonferroni test를 사용한 ANOVA로 수행하였다. p value < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

<실시예 2>

본 발명의 유전자 전달체의 제작

<2-1> GO-PEI 복합체의 제작

GO-PEI 복합체를 제작하기 위하여, 25kDa PEI 용액(1 mg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 GO 용액(0.1 mg/ml) (Graphene Supermarket, Calverton, NY, USA)에 10분간 천천히 첨가하였다. 약 10분간의 초음파 처리 후에, 상기 혼합물을 오버나잇으로 교반하고, 원심분리를 이용하여 탈이온수로 5회 세척한 후 탈이온수에서 재분산시켰다.

<2-2> GO-PEI와 RNA 복합체의 제작

GO-PEI와 RNA의 복합체 형성을 위한 조건을 확립하기 위하여 gel retardation 어세이를 수행하였다. GO-PEI와 RNA의 복합체 형성을 식별하기 위하여 GO-PEI의 다른 N/P 비율(0, 7.5, 15, 30, 및 45)과 2ug 의 total RNA 복합체를 아가로즈 겔 전기영동 분석법을 통하여 분석하였다. GO-PEI 및 RNA 혼합물을 실온에서 20분간 배양한 후, 시료들을 65℃에서 10분간 가열하였다. GO-PEI RNA 복합체는 EtBr 염색된 1% (w/v) 아가로즈 겔에서 전기영동으로 확인할 수 있었다. 겔은 gel documentation system (GL 2200 PRO Imaging system, CARESTREAM, Rochester, NY, USA)을 사용하여 판독하였다.

그 결과 GO-PEI 30 N/P 비율과 복합체를 이룬 것에서 상당한 지연을 보인 것을 확인할 수 있었으므로(도 2), 본 실시예에서는 N/P 30 비율의 GO-PEI와 2 ug RNA 복합체를 사용하였다.

<실시예 3>

GO-PEI 복합체의 세포독성 검증

GO-PEI의 세포 독성을 확인하기 위해, 사람 진피 섬유아세포를 이용하여 0.6, 3, 6, 12, 30 ㎍의 GO-PEI를 처리한 후 MTT (4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디 페닐 테트라졸륨 브로마이드) 분석하였고, 또한 FDA/EtBr 염색을 사용하여 분석하였다. 그 결과 사용된 모든 GO-PEI 농도에서 세포독성을 보이지 않았다(도 3A). 또한 GO-PEI의 세포 내로의 도입 정도를 식별하기 위하여 GO-PEI는 빨간색 형광 염료로 표지하여 분석한 결과 적은 양의 GO-PEI를 사용하여도 모두 세포 내로 들어가서 형광을 보이는 것을 확인하였다(도 3B).

<실시예 4>

본 발명의 유전자 전달체의 세포 내 도입

<4-1> GO-PEI와 RNA 복합체의 세포 내 도입 및 발현

Rat-ADSC 세포에 GO-PEI와 RNA 복합체를 처리한 후 어느 정도 발현이 유지되는지 확인하기 위하여 GFP 형광을 확인하였다. 본 연구에 사용된 RNA는 Lenti-Oct3/4, -Sox2, -c-myc, -Klf4가 발현되는 293T 세포의 total RNA 를 추출하여 사용한 것으로 각 Lenti-viral genes 은 GFP 형광을 발현한다. 따라서 GO-PEI와 RNA 복합체가 도입된 세포는 GFP 형광을 보이게 된다. GO-PEI와 RNA 복합체가 도입된 세포에서 시간별로 발현되는 GFP를 Flow cytometry 로 분석한 결과 24시간 후부터 GFP의 발현이 감소되는 것으로 보이며(도 4A), 이는 24시간 이후부터 세포내로 도입된 RNA가 제거되는 것으로 생각할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 GO-PEI와 RNA 복합체가 도입된 세포 분석 시 도입 후 24시간과 48시간 후의 세포를 사용하였다.

<4-2> GO-PEI와 RNA 복합체의 RNA 안정성

앞선 결과에서 rat-ADSC 세포에 GO-PEI와 RNA 복합체를 도입 시 48 시간 이후부터 RNA 의 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 GO-PEI와 복합체를 이루는 RNA가 RNase와 같은 효소에 어느 정도 안정한지 검증하기 위하여 다음 실험을 하였다. GO-PEI와 RNA가 복합체를 만들 때, co-incubation 은 두 가지 물질과 동시에 RNase를 넣고, post-incubation 은 두 가지 물질로 복합체를 만든 후 RNase를 넣어서 복합체를 만든 후 rat-ADSC 세포에 처리 후 GFP 형광을 형광 현미경과 Flow cytometry 로 분석하였다.

그 결과 두 가지 물질이 복합체를 형성한 후에 RNase를 처리한 경우는 RNA가 제거되지 않고 세포 내로 RNA가 전달되는 것을 확인하였으나, 두 가지 물질과 동시에 처리된 경우에는 RNA가 모두 제거되어 세포 내로 RNA가 전달되지 않았음을 알 수 있었다(도 5). 따라서, GO-PEI와 RNA가 복합체를 형성하면 RNA가 안정적으로 세포 내로 도입되는 것을 알 수 있다.

<실시예 5>

역분화 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)의 확립

<5-1> 역분화 만능 줄기세포의 생성 확인

Rat-ADSC 세포에 GO-PEI와 RNA 복합체를 도입 후 48 시간 이후에 회전하는 교반기에서 4일 동안 부유 배양한다. 4일 후 mitomycin C 처리된 MEF 세포를 feeder 로 사용하여 부유 배양한 세포를 같이 배양하면서 역분화 만능 줄기세포 생성 유무를 관찰하였다. 약 3일 후부터 콜로니(colony) 모양의 세포가 커지는 현상을 확인할 수 있었고, 이 콜로니의 크기가 커지면 MEF feeder로 옮겨서 세포를 안정화하면서 유지하였다(도 6A). 줄기세포의 특성을 분석하기 위하여 줄기세포의 특징이라고 보고되고 있는 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, AP) 활성도를 실시한 결과 정상적인 줄기세포와 같이 염색되는 것을 확인하였다(도 6B). 확립된 역분화 만능 줄기세포의 줄기세포성(stemness)을 확인하기 위하여 다능성 마커 유전자(Oct3/4, Sox2, Nanog, c-myc, Rex1, FGF4)를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과 줄기세포와 같이 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6C).

또한, 면역 염색법(immunocytochemistry)을 이용한 방법에서도 줄기세포 특이 마커인 Oct3/4 와 SSEA-1이 모두 염색되는 것을 확인하였다(도 7 A,B).

<5-2> 역분화 만능 줄기세포의 분화능 검증

역분화 만능 줄기세포의 삼배엽 분화 특성을 확인하기 위하여 배상체 (embryonic body)를 형성하여 14일 동안 삼배엽(3 germ layers)으로 분화시켜 RT-PCR을 실시한 결과 중배엽 (Nkx2.5, Flk1, SM22a), 내배엽 (Sox17, Gata4, Gata6) 및 외배엽 (Nestin, NCAM)으로 분화가 일어났음을 확인할 수 있었다 (도 8). 이로써 본 발명에서 사용된 역분화 만능 줄기세포(rat-iPSc)는 줄기세포의 특성을 가지는 것으로 확인되었다.

<5-3> 사람의 역분화 만능 줄기세포(human iPSc)의 확립

Human-ADSC 세포에 GO-PEI와 RNA 복합체를 도입 후 48 시간 이후에 회전하는 교반기에서 4일 동안 부유 배양하였다. 4일 후 mitomycin C 처리된 STO 세포를 feeder 로 사용하여 부유 배양한 세포를 같이 배양하면서 역분화 만능 줄기세포 생성 유무를 관찰하였다. 약 3일 후부터 콜로니 모양의 세포가 생기는 현상을 확인할 수 있었다(도 9).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. (a) 25 kDa의 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 용액을 그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO) 용액에 첨가하고, 초음파를 처리한 후 교반하여 GO-PEI 복합체를 형성시키는 단계;
   (b) Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4 유전자가 각각 발현되는 세포들에서 total RNA를 분리하는 단계;
   (c) 상기 (a) 단계의 GO-PEI 복합체에 상기 (b) 단계의 total RNA를 넣어 GO-PEI-RNA 복합체를 형성시키는 단계; 및
   (d) 상기 (c) 단계의 GO-PEI-RNA 복합체를 인간세포를 제외한 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 역분화 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPSC)의 제조방법으로서,
   상기 (c) 단계에서 GO-PEI 복합체는 total RNA와 30의 N/P 비율로 결합된 것을 특징으로 하는 역분화 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPSC)의 제조방법.
   
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