CZ2018309A3 - Autologní vakcína a způsob přípravy vakcíny a monitorování pacienta - Google Patents

Abstract

Autologní personalizovaná imunoterapeutická protinádorová vakcína využívající imunizační vlastnosti sporadických buněk a jejich částí, způsoby její výroby, a na základě monitorování pacienta načasování její výroby a podávání. Vakcínu je možno používat k vyvolání personalizované protinádorové imunitní odpovědi při autologní vakcinaci, která v organizmu vyvolává imunogenní reakci proti v aktuálním čase přítomným nádorovým buňkám.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká personalizované imunoterapeutické protinádorové vakcíny využívající imunizační vlastnosti sporadických buněk a jejich částí, způsobů její výroby, a na základě monitorování pacienta načasování její výroby a podávání. Vakcínu je možno používat k vyvolání personalizované protinádorové imunitní odpovědi při autologní vakcinaci, která v organizmu vyvolává imunogenní reakci proti v aktuálním čase přítomným nádorovým buňkám.

Dosavadní stav techniky

Nádorová buňka vychází z vlastních buněk organismu, ke kterým je ustanovena tolerance. Nádorové buňky ovšem tvoří specifické nádorové antigeny, které se v jiných typech vlastních buněk organizmu nevyskytují.

V boji proti nádorovým buňkám používá imunitní systém obě hlavní složky imunity: systém přirozené (nespecifické) imunity (makrofágy, NK buňky, granulocyty, komplement) i systém imunity adaptivní (specifické T a B lymfocyty). Spojkou mezi oběma systémy jsou dendritické buňky (DC).

Původně byly DC popsány Ralph Steinmanem a Zanvil Cohnem v roce 1973 (5,6). DC mají důležitou úlohu ve zprostředkování přirozené imunitní odpovědi a vyvolání adaptivní imunitní odpovědi. DC, často označované jako „nature adjuvans“ byly uznány jako buňky nejúčinněji prezentující antigen (APC), které jsou schopny aktivovat buňky naivní a tzv. paměťové imunitní odpovědi. DC mají vynikající kapacitu pro získávání a zpracování antigenu a jeho prezentaci Tbuňkám. Následně exprimují vysoké hladiny kostimulačních nebo koinhibujících molekul, které určují stupeň imunitní aktivace nebo anergii (7).

Při procesu akvizice a prezentace antigenu nejprve DC pohlcují antigeny prostřednictvím fagocytózy, pinocytózy a endocytózy použitím Fc receptorů, integrinů (avp3 nebo ανβ5), lektinových receptorů typu C (CLR, včetně manózového receptorů a DEC205), apoptotických buněčných receptorů a vychytávacích receptorů.

Antigeny jsou zpracovány do formy peptidů pomocí endogenní dráhy pro prezentaci na MHC molekulách I. třídy CD8+ T buňkám, nebo zpracované exogenní cestou pro prezentaci na HLA molekulách II. třídy CD4+ T buňkám.

Alternativně DC mohou také zpracovat antigeny křížovou prezentací (tzv. cross- presentation) spojením tzv. cytosolové dráhy (8) a vakuolámí dráhy (9). V cytosolové dráze jsou antigeny převedeny do cytoplazmy, kde jsou zpracovány na proteazomu před navázáním na nově vytvořené molekuly MHC třídy; tento proces může zahrnovat účast endoplazmatického retikula. Vakuolámí dráha je méně zřetelná, ale předpokládá se, že se vyskytuje v endocytických oddílech, protože dráha je odolná vůči inhibitorům proteazomů, ale citlivá na inhibitory lysozomální proteolýzy, a závisí na katepsinu S. Nově bylo zjištěno, že signalizace prostřednictvím TLR (toll like receptor) ovlivňuje zrání na fagozomech a indukuje akumulaci molekul i ve fagozomech pro optimální cross-prezentaci na HLA (10).

V průběhu procesu zrání DC migrují do sekundární lymfatické tkáně, jako jsou lymfatické uzliny (zachycení antigenů z kůže a orgánů), slezina (zachycení antigenů z krve), nebo Peyerovy plaky (zachycení antigenů z lumen střeva).

- 1 CZ 2018 - 309 A3

Oba aktivované typy DC konvenční (eDC) a plazmacytoidní (pDC) mohou migrovat v odezvě na homing chemokiny (CCL19 a CCL21) prostřednictvím exprese CCR7. (11)

DC infiltrace koreluje s intratumorální T-buněčnou infiltrací a současně lepší prognózou u pacientů s melanomem (12). U myšího modelu bylo prokázáno, že strategicky lokalizované DC pobývají v lymfatických uzlinách a mohou vyvolat T-buněčnou odpověď mnohem dříve, a nezávisle na migračních DC populacích (13). Tyto DC jsou umístěny v lymfatickém endotelovém sinu, kde se zachytávají antigeny rozpustné v lymfě a iniciují imunitní odpověď bez prodlení. Nově bylo ukázáno, že subpopulací nejvíce aktivující imunitní odpověď jsou DC buňky exprimující geny AXL, SIGLEC1 - tzv. AS DCs (14)

Pro indukci účinné imunitní reakce je nutné tyto specifické nádorové antigeny prezentovat zejména naivním T-lymfócytům. Tuto úlohu plní tzv. buňky prezentující antigen. Jejich nejúčinnějším představitelem jsou zralé dendritické buňky (mature DC - mDC). T-lymfocyty vyžadují, aby byl antigen buňkou prezentující antigen zpracován: pohlcen, rozštěpen, navázán na molekuly hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) a vystaven na jejím povrchu.

Jak už bylo uvedeno, DC jsou mezi buňkami prezentujícími antigen nej důležitější. Exprimují 50x více molekul MHC než makrofágy a na svém povrchu mají velké množství kostimulačních molekul. Jde o různorodou skupinu buněk, které se liší nejen svou anatomickou lokalizací, ale i svými povrchovými vlastnostmi a fúnkcí. Jsou rozptýlené ve většině tkání. DC mohou pohlcovat i vetší fragmenty buněk nesoucích nejrůznější proteiny, včetně těch, které nesou nádorové specifické antigeny, a dokonce i celé mrtvé či hynoucí buňky. Geny pro nádorové antigeny se dají vnést do DC pomocí rekombinantních virů či plazmidu. Výhodami takto aktivovaných DC je vysoká koncentrace antigenu, jeho přirozená konformace a trvalá produkce až do zániku těchto buněk.

DC proto zaslouženě zaujímají jedno z předních míst ve vývoji protinádorových vakcín. Po proběhlých pokusech na zvířatech probíhají v současné době klinické studie s aktivovanými DC u pacientů se solidními nádory (melanomem, karcinomem prostaty, karcinomem děložního čípku aj.) (1).

V současnosti užívané nádorové vakcíny využívají k aktivizaci imunitního systému nej častěji specifické nádorové antigeny, které pocházejí z humánních nebo zvířecích primárních tumorů. Jedná se například o vakcíny z DC na léčbu maligního melanomu (jako antigen je např. použit survivin, telomeráza, MART-1, MAGE-3), nádory ledvin (opět survivin, TERT), antigen karcinomu prostaty (PSA), antigen kolorektálního karcinomu (CEA) apod. (2). Vesměs jsou používány antigeny společné pro konkrétní histologický typ nádoru, který je dobře specifikován a popsán.

V některých případech jsou pro přípravu DC vakcín používány celé nádorové buňky pocházející z primárních tumorů nebo z uniformních nádorových linií (např. pro ovariální karcinom nádorové linie OV-90 nebo SK-OV-3, pro karcinom prostaty linie LNCaP nebo DU 145) (3,3a).

Imunoterapie s použitím DC na principech vakcinace je schválený postup k využití potenciálu pacientova vlastního imunitního systému k odstranění nádorových buněk u metastazujících karcinomů, např. u hormonálně refraktemího karcinomu prostaty. Ačkoli bylo testováno mnoho typů DC vakcín a v některých případech bylo jejich podání spojeno s klinickým výsledkem, možných komponent, zejména antigenů pro generování DC - vakcín a relativně fingujících vakcinačních schémat je hned několik.

Jeví se však, že v budoucnu budou mít význam zejména vakcíny, kterých podání bude integrováno s lokální aktivací imunitní odpovědi.

-2 CZ 2018 - 309 A3

Problémem stavu techniky je, že neexistuje jednoznačná shoda ohledně standardizovaného a úspěšného postupu - receptu na přípravu“ DC vakcíny, která by zaručovala lepší účinnost, zejména reálnou kontrolu nad nádorovým onemocněním. Aktuálně existuje enormní tlak na nové parametry imunomonitoringu, jelikož hodnocení relevantních imunitních odpovědí po očkování na bázi DC zůstává skutečným úskalím.

Dalším problémem je, že tradiční sledování imunitní odpovědi pomocí analýzy některých aktivovaných buněčných podskupin (např. -CD8+IFNy+| neodpovídá klinickému výsledku terapeutických vakcín. Během uplynulého desetiletí poskytly zvýšené znalosti biologie DC a klíčových mechanismů, které se podílejí na generování imunitní odpovědi, cenné nástroje pro zlepšení očkovacích látek na bázi DC, a stanovily je jako potenciálně léčebnou strategii pro pacienty s rakovinou.

Stále chybí integrace všech znalostí a pokroků při navrhování racionálních a účinných vakcín založených na DC, aby se dosáhlo dlouhodobé klinické odpovědi.

Jednou z oblasti, kde je snaha o integraci poznatků zřejmá, je oblast monitorování diseminace nádorového onemocnění a to jak na úrovni minimální reziduální nemoci, tak na úrovni biologie metastatické tkáně, zejména tzv. tumor-environmentu.

Přímým propojením primárního tumoru a metastáz jsou cirkulující nádorové buňky (CTC, circulating tumor cells) uvolňující se z primárního tumoru do krevního řečiště, kde následně cirkulují a „osídlují“ primárnímu tumoru vzdálené tkáně, případně osídlují zpětně tumor, z kterého se původně vzdálily. Teorie tzv. seedingu (osídlení vzdálených tkání) a self-seedingu (zpětné osídlení primárního tumoru) poskytly doposud dostatečné množství důkazů o tom, že se jedná o proces naprogramovaný na úrovni nádorových buněk a tumorů, ale zároveň úzce spjatý s funkčností imunitního systému. Zjednodušeně by se dalo říct, když imunitní systém nepracuje, nádorové buňky se množí. CTC jsou nezbytné pro vznik vzdálených metastáz a jejich detekce je považována za projev agresivity nádorů a jeho schopnosti metastázovat do vzdálených orgánů. Současné poznatky naznačují, že metastatický rozsev může být časným projevem nádorové progrese a nikoli pouze projevem pokročilého nádorového onemocnění. Vlastnosti CTC jsou přímo spojeny s dynamickými modifikacemi stavu onemocnění. U jednoho pacienta mutační profily CTC před a během léčby sdílejí jen málo sekvenčních variant (5).

Z výsledků dosavadních molekulárních analýz, se dá předpokládat, že antigeny CTC jsou jedinečné a liší se od primárního tumoru jak na úrovni genové exprese, tak na úrovni mutačního profilu DNA (4,5).

CTC jsou nádorovou tkání, která je jako jediná dostupná relativně neinvazivně a opakovaně. Vyšetření zahrnující test CTC se také nazývá tekutou biopsií, a to právě z důvodu možnosti použít CTC jako markéry nádorového onemocnění. To, že CTC můžeme použít jako marker prognostický, prediktivní, případně diagnostický bylo již ověřeno v několika stovkách klinických studií. Jednoduše řešeno, CTC můžeme využít pro monitorování průběhu nádorového onemocnění, zejména v situacích, kdy nás zajímá odpověď na typ podávané léčby.

K odstranění primárního tumoru bylo vyvinuto několik standardizovaných postupů, které se aplikují dle typu nádorového onemocnění (např. chirurgické odstranění primárního tumoru, zmenšení nádorové hmoty radioterapeuticky, chemoterapeuticky apod.). Po odstranění primárního tumoru a podle charakteru primárního tumoru pak následuje většinou léčba zajišťovací, tzv. adjuvantní, která má za cíl likvidovat zbylé nádorové buňky. Délka adjuvantní terapie je také standardizována a opírá se o dlouhodobá empirická data klinických studií. V praxi to ale znamená, že každý pacient s nádorem je léčen stejným způsobem a stejně dlouho jako jiný pacient se stejným nádorem. To je zásadní nevýhodou při léčení nádorových onemocnění dosud známými způsoby.

-3 CZ 2018 - 309 A3

DC imunoterapie

V klinických studiích zaměřených na DC vakcinaci se používají ex vivo generované DC odvozené od monocytů. Je však důležité poukázat na to, že od monocytů odvozené DC nejsou srovnatelné s DC podskupinami v těle; ale podobají se DC, které se objevují v průběhu zánětlivé odpovědi in vivo. Je nutno porovnávat rovněž účinnost aktivace DC ve vztahu k množství antigenu. Vakcinační protokoly se liší jak v počtu injikovaných DC (0,3 až 200 x 10⁶ buněk na injekci), v očkovacích schématech (jednou za 2 týdny ve 3-4 dávkách, nebo dokonce až do 10 injekcí podávaných každé 3-4 týdny), a v způsobu injikování (podkožní, intradermální, intranodální, intravenózní nebo intratumorální).

Optimální strategie k vyvolání nej silnější a dlouhotrvající imunitní odpovědi nebyla zatím stanovena (15-17).

Ex vivo přístupy k DC vakcinaci

Generování DC pro klinické studie zahrnuje kultivaci DC z monocytů nebo CD34 + hematopoetických prekurzorů a případně obohacení cirkulujících krevních DC podskupin. Vygenerované DC podskupiny se liší, nicméně, ve všech případech byla potvrzena preklinicky i klinicky aktivace imunitní odpovědi.

Dalším možným faktorem, který může mít vliv na kvalitu vakcíny DC je načasování procesu zrání. DC vakcíny používané v klinických studiích, maturují obvykle 24-48 hodin a hodnocení produkce cytokinů probíhá právě v tomto časovém úseku (18). Nicméně, většina z cytokinů produkovaných v průběhu DC zrání je exprimována během 24 hodin. Poté je jejich produkce opětovně nastartována až po setkání s T-buňkami a CD40L receptorem. Protokoly, ve kterých jsou DC buňky maturovány do 24 h, mohou být ideální pro zachování schopnosti produkovat cytokiny po injekci in vivo.

Imunizace antigenem

DC jsou obvykle aktivovány inkubací s peptidy, proteiny, RNA, nebo autologními/alogenními nádorovými buňkami (19). Peptidy jsou přímo prezentovány molekulami MHC na povrchu DC, zatímco proteiny a nádorové buňky vyžadují před navázáním se na molekuly MHC zpracování na peptidy.

Rada studií potvrdila schopnost DC buněk indukovat silnou specifickou T buněčnou odpověď po aktivaci mRNA (20-23). Transfekce DC s mRNA může být dosaženo s použitím např. kationtového lipidu, tj. DOTAP N-(2,3-dioleoyloxy-l-propyl) trimethylamonium metyl sulfát), nebo elektroporací (24-28).

Migrace DC do lymfatických uzlin

Migrace do lymfatických uzlin (LN) je pro indukci imunitní odpovědi kritická. DC vakcíny byly podávány intradermálně, subkutánně, intravenózně, intranodálně nebo intratumorálně, nej optimálnější způsob podání zatím nebyl stanoven.

Značné množství intradermálně podávaných DC aktivovaných antigenem melanomu, značených 111-indiem, zůstalo v místě vpichu, ztratilo životaschopnost, a bylo odstraněno do 48 hodin, pouze méně než 5% DC došlo do lymfatických uzlin.

Intratumorové podávání DC vakcín ukázalo retenci v místě vpichu s malým množstvím DC v lymfatických uzlinách (29,30).

-4CZ 2018 - 309 A3

Novější strategie zahrnují podávání DC vakcín více než jednou cestou, tzn. intradermálně, intravenózně aintranodálně.

Nežádoucí účinky DC vakcín jsou relativně mírné a přechodné; obvykle horečka, reakce v místě vpichu a únava. Imunogenicita DC vakcín byla rovněž zjištěna ve většině klinických studií s prokázanou indukci nádorově specifických T buněk u mnoha pacientů. Komplexní metaanalýza DC vakcinace pro karcinom prostaty a ledvin ukázala, že DC vakcínami indukované imunitní reakce jsou nádorově specifické v 77% a 61% vakcinovaných pacientů (31).

Stále chybí shoda o optimálním způsobu přípravy DC pro většinu vakcín. DC vakcíny mohou obsahovat zralé DC (fenotypově zralé, jak o tom svědčí upregulace kostimulačních molekul), (32). Mohou také produkovat IL-12, který je klíčovým faktorem pro vyvolání účinnosti vakcíny. Není ale známo, kolik IL-12 je ve skutečnosti dostačující a zda DC budou stále produkovat IL-12 po injekci nebo v případě střetu s T buňkami. Vzhledem k tomu, že existuje kauzální vztah mezi IL-12 produkcí a účinnosti vakcíny, je důležité vědět, jestli je IL-12 po injekci DC skutečně produkován (32).

V současnosti je jedním z hlavních problémů při praktickém provádění očkování použitím DC celkově nedostatečný poměr nákladů a přínosů terapie. Pro specifické DC vakcíny je jejich produkce nákladná a čas potřebný pro kultivaci a primární buňky může být značný (33,34). Protože např. růst nádorů u pacientů s recidivujícím glioblastomem (GBM) může být rychlý a spojený s progresivním neurologickým poklesem, čas potřebný k výrobě DC vakcíny může tuto léčbu v klinickém prostředí značně limitovat. Navíc bylo navrženo, že optimální čas pro očkování je ve fázi minimální nádorové zátěže, protože nádorově indukovaná imunosuprese může působit proti požadované imunitní odpovědi. Indukovaná nádorová imunosuprese je v korelaci s množstvím přítomného nádoru (32,35). To činí otázku času potřebného pro přípravu vakcíny kritickou záležitostí.

Přestože několik studií DC vakcinace prokázalo specifické imunitní odpovědi (38,39), jen málo skutečně prokázalo objektivní klinickou reakci - definovanou jako úplnou nebo částečnou odpověď dle kritérií Světové zdravotnické organizace nebo kritéria pro hodnocení reakce v solidních nádorech (RECIST) (40). Systematický přehled všech klinických studií s očkovacími látkami DC ukázal, že z hlediska objektivní odpovědi je klinický přínos této léčby velmi skromný. Konkrétně byla míra objektivní odpovědi 8,5%, 7,1% a 15,6% u melanomu, karcinomu prostaty, popř. gliomu (41). Navzdory skutečnosti, že několik nerandomizovaných studií prokázalo přínos pro přežití (42,43), chybějící objektivní klinická odpověď zůstává důležitou oblastí kritiky DC vakcín. Stále tedy existuje prostor pro zvyšování specificity a účinnosti DC vakcín.

Problém dostatečně rychlého a šetrného způsobu izolace nově vytvořených cirkulujících buněk v životaschopném stavu, aby je bylo možné použít pro analýzu a aktivaci dendritických buněk, byl již vyřešen způsobem filtrace na membráně využitím kapilárních sil, popsaným v dokumentu WO2014198242 autorů předkládané přihlášky.

Tyto a další problémy řeší různá provedení předkládaného vynálezu, ve kterých mohou být cirkulující nádorové buňky jak prognostickým, prediktivním, diagnostickým, tak i terapeutickým markérem.

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití cirkulujících nádorových buněk (circulating tumor cells -CTC) samostatně nebo v kombinaci s jinými nádorovými buňkami při výrobě vakcín z dendritických buněk. Oproti výše uvedeným vakcínám je možno překvapivě imunitní reakci proti nádorovému procesu vyvolat použitím tzv. cirkulujících nádorových buněk izolovaných přímo z pacienta v

-5 CZ 2018 - 309 A3 čase, kdy je jeho zdravotní stav uspokojivý (tj. není přítomný žádný znak tumorové progrese: tumor neroste, metastázy nejsou detekovány, proteinové biomarkery jsou v normě). Jediné, co v tomto čase odráží probíhající aktivaci nádorových procesů je rostoucí počet CTC v odebraném vzorku periferní krve pacienta. Přítomnost CTC v krvi pacienta v období remise už byla popsána, ale v překvapivě je možné podle vynálezu použít tyto buňky k imunizaci v čase, kdy je pacient dle klinické terminologie v remisi. Nově vzniklé nádorové buňky v krevním řečišti se podle vynálezu de facto využívají k boji proti „příbuzným“ nádorovým buňkám v řečišti a jinde, a to navíc ještě před tím, než lze jakoukoli progresi podle dosavadního stavu techniky zjistit. V rámci vynálezu se používá výhradně biologického materiálu izolovaného z pacienta, v případě nádorových buněk ve formě neschopné proliferace, takže pro pacienta nepředstavuje žádné další riziko.

Ačkoli podstata protinádorových vakcín na bázi dendritických buněk byla již dlouho známa, dosavadní práce se věnovala vždy přípravě protinádorových vakcín odvozených z buněčných nádorových kultur nebo autologních diseminovaných nádorových buněk, které jsou k dispozici v dostatečném množství, avšak zejména až v pokročilejších fázích nádorového onemocnění. Autoři vynálezu překvapivě zjistili, že robustní terapeutický protinádorový zásah vhodný i pro rutinní a opakované použití v onkologii může být proti předpokladům založen na pouze několika, nebo i na jediné nádorové buňce za podmínky, že je udělán v aktuálním čase, kdy narůstá počet CTC v periferní krvi. Vše je podmíněno osobitým přístupem k jednotlivým pacientům v rámci procesu personalizace onkologické a také onkoimunologické léčby.

Pomocí CTC je možné detekovat přicházející relaps onemocnění a začít imunitní systém směrovat proti tomu, co de facto ještě ve větší míře neexistuje - dalo by se tedy mluvit i o personalizovaných terapeuticko-preventivních vakcínách. Dle dosavadních výsledků výzkumu lze předpokládat, že objevivší se CTC v krvi pacienta v tzv. období remise byly přítomné v těle pacienta už v čase probíhající předchozí léčby, a tedy jsou jedinečně a individuálně specificky modifikovány terapeutickými zásahy, což také přispívá k specificitě jejich antigenního portfolia, jak bude dále ukázáno.

Jednotlivá provedení vynálezu reagují na skutečnost, že nádorové buňky jsou heterogenní populací buněk, nejsou geneticky stabilní, a v průběhu onkologického onemocnění vznikají stále další nové antigenně odlišné nádorové buňky. V těle pacienta tedy dochází v průběhu onemocnění k vzniku a šíření různých variant nádorových buněk, které se liší jak od původních buněk primárního nádoru, tak i mezi sebou. Nově vznikající nádorové buňky se liší i v případě, kdy je pokusné zvíře zaočkováno identickými buňkami stejné buněčné linie za cílem indukce homogenních modelů nádorového růstu. Vznik nových změněných nádorových buněk je dále indukován probíhající léčbou, jak na úrovni chemoterapie, tak na úrovni biologické léčby.

Vynález také dává k dispozici dostatečně rychlý způsob přípravy autologní protinádorové vakcíny na bázi aktivovaných dendritických buněk, aby umožnil dokončit přípravu a aplikaci vakcíny v čase, kdy ještě nedojde u nově vzniklých nádorových buněk k další genetické změně. Jak již bylo uvedeno, podle předkládaného vynálezu lze s výhodou připravovat DC-vakcíny díky dostupnému zdroji antigenů opakovaně v krátkých intervalech.

Vynález úspěšně řeší zásadní problém současných vakcín na bázi dendritických buněk, vytvořených nejčastěji z buněk buněčné kultury, např. komerčních buněčných linií, případně z buněk primárního tumoru, kdy tato vakcíny nedokážou aktivovat imunitní odpověď vůči nově vzniklým, antigenně odlišným nádorovým buňkám, které cirkulují v krevním oběhu, a které tak navzdory probíhající léčbě mohou vytvořit, nebo již vytvořily, vzdálené metastázy. Jak již bylo uvedeno výše, v důsledku toho dostávají dnes všichni pacienti se stejným typem primárního nádoru po jeho odstranění stejnou standardní zajišťovací (adjuvantní) léčbu. Vzhledem k relativně nízkému počtu CTC v periferní krvi (cca 1 CTC na 10⁶-10⁹ krevních buněk) je vysoce nepravděpodobné, že antigen prezentující buňka a CTC se v krvi potkají, a dojde k vyvolání imunitní odpovědi organismu. CTC jsou navíc značně dediferencovány, takže často ani antigen

-6CZ 2018 - 309 A3 prezentující buňka imunitního systému buňku CTC nerozpozná a neidentifikuje ji jako potenciální hrozbu.

Autoři vynálezu použili buňky CTC právě v této fázi jako vhodný terapeutický cíl, na který se potom zaměřuje léčba.

Z výše uvedeného plyne, že cílem je dosáhnout pomocí aktuálně vyrobené vakcíny ideálně dlouhodobou a individuálně specifickou odpověď na imunizaci. Účinek vakcíny neboli efektivitu imunizačního procesu, je pak možné kontrolovat (opakovaně) v čase navazujícím na podání vakcíny. Přímý efekt je ve standardizovaných protokolech klinických studií DC-vakcinace měřitelný vzestupem CD8+IFNy+ buněk, opakované testy však nepotvrdily korelaci mezi těmito buňkami a reálným klinickým dopadem. Podle vynálezu pak můžeme efektivitu vakcíny sledovat nepřímo pomocí hladiny CTC v periferní krvi. Samozřejmě, jsou v daném období standardem i vyšetření pomocí zobrazovacích metod, jejich nevýhodou však je, že změnu ve velikosti tumoru, případně metastázy, nejsme schopni odhalit v průběhu 2-4 týdnů, na straně druhé změnu v počtu CTC můžeme detekovat způsobem podle vynálezu v libovolně krátkém intervalu. V případě signifikantního nárůstu počtu CTC pak můžeme proces výroby opakovat s aktuálně přítomnými CTC v krvi.

I když dlouhodobá odpověď nebude znamenat úplné vymizení CTC a nádorových buněk např. v metastatických ložiskách, cílem je jejich počet minimalizovat a vytvořit tak tzv. udržitelný model růstu nádorové tkáně znázorněný na obr. 3., v anglické literatuře nazývaný také „stable disease“.

Z molekulárního testování vlastností primárních tumorů a CTC vyplývá že CTC exprimují kromě antigenů primárního tumoru také antigeny, které lze považovat za nové znaky agresivity nádorového onemocnění. CTC se tak využívají jako zdroj nových targetovatelných antigenů, tedy antigenů, vůči kterým je možné namířit léčbu.

První provedení vynálezu je tedy individuální autologní vakcína na bázi viabilních autologních dendritických buněk pro indukci imunitní odpovědi proti cirkulujícím nádorovým buňkám k vyvolání personalizované protinádorové imunitní odpovědi při autologní vakcinaci. Vakcína v organizmu vyvolává imunogenní reakci proti v aktuálním čase přítomným cirkulujícím a jiným nádorovým buňkám. Vakcína obsahuje jako účinnou složku vlastní antigeny z pacienta, přičemž těmito vlastními antigeny jsou antigeny pocházející z autologních cirkulujících nádorových buněk (CTC), aktuálně izolovaných z periferní krve pacienta.

Antigenem ve smyslu biologického materiálu použitelného pro aktivaci dendritických buněk se zde bude dále rozumět materiál odvozený z nádorových buněk ve formě zvolené ze skupiny: apoptické nádorové buňky, lyžované nebo usmrcené nádorové buňky; izolované části nádorových buněk vybrané z RNA, zejména mRNA, DNA a proteinů; a z buněk uvolňovaných váčků, kterými mohou být makrovezikuly a mikrovezikuly, např. exozomy vznikající samovolně z CTC ve vyšším počtu, než je běžné u jiných buněk, jakékoliv lyofilizované části CTC. Zpravidla se používá jedna forma, například lyzát, ale není vyloučeno současné použití dvou i více forem antigenů z nádorových buněk. Viabilní intaktní nádorové buňky z důvodu rizika pro pacienta jako antigen vhodné nejsou. Výše popsaný antigen je dendritickými buňkami přirozenou cestou zpracován a prezentován ve formě vhodné pro imunitní systém pacienta.

Aby byly protinádorové vakcíny účinné, musí být připravovány individuálně pro každého pacienta s použitím pacientových vlastních imunizačních antigenů. Termínem „autologní“ (vlastní) se zde rozumí, že odběr se provádí individuálně u každého jednotlivého pacienta.

Termínem izolovaný se rozumí, že materiál je zbaven alespoň některých jiných materiálů, se kterými se obvykle vyskytuje ve svém přirozeném prostředí. Termínem „aktuálně izolovaný“ se rozumí, že odběr se provádí u jednotlivého pacienta v takovém časovém bodě, aby připravená vakcína odpovídala aktuálnímu časovému vývoji nádorového onemocnění u pacienta, například

-7 CZ 2018 - 309 A3 podle individuálního časového plánu přizpůsobeného dle aktuálního stavu, s cílem personalizace přípravy vakcíny.

Takový vhodný časový bod může být určen monitorováním za použití standardizovaných diagnostických metod, jako je ultrazvuk, magnetická rezonance (MRI), pozitronová emisní tomografie-počítačová tomografie (PET-CT), a/nebo za pomoci standardních nádorových markérů (PSA, CA125, CAE) a/nebo ve výhodném provedení ještě podstatně dříve než známými diagnostickými metodami, použitím markéru podle předkládaného vynálezu, kterým je přítomnost a/nebo počet a/nebo vlastnosti cirkulujících nádorových buněk (CTC) v periferní krvi pacienta.

Cirkulujícími nádorovými buňkami (CTC) jsou zde označovány buňky uvolňující se z primárního tumoru do krevního oběhu. Stanovení CTC se může provádět v rámci tekuté biopsie, kterou se zde rozumí odběr periferní krve a analýza na cirkulující nádorové buňky, fragmenty cirkulující volné DNA (cfDNA) z nádorových buněk, exozomy apod, kde výsledkem vyšetření může být specifikace probíhajícího onkologického onemocnění, zejména jeho dynamiky rozvoje.

Zvýšený počet přítomných CTC v krvi by měl být v těchto situacích markérem, který dokáže odlišit pacienty, kteří potřebují po absolvování určité linie (fáze) léčby (např. adjuvantní) další přídavnou léčbu. Proto v souvislosti s CTC a tekutou biopsií mluvíme o personalizaci onkologické péče, a to právě na základě vlastností CTC-buněk.

Aktuální odběr CTC pro získání antigenů je vhodně prováděn v čase relapsu detekovatelného na úrovni výše uvedených standardních diagnostických metod a/nebo na úrovni zvýšeného počtu CTC a/nebo klastrů CTC (tj. shluků zejména buněk CTC, které je možné detekovat v krvi seskupené s buňkami imunitního systému a/nebo erytrocyty a/nebo trombocyty). Strategie využití CTC při výrobě personalizovaných vakcín se opírá o možnost monitorovat průběh standardní léčby pacienta pomocí CTC. Pří opakovaném vzrůstajícím počtu CTC lze CTC vyizolovat a použít je pro výrobu vakcíny, která bude aktuální pro tento časový úsek (tzn. aktuálně v reálném čase) a vyvolá imunitní odpověď zejména vůči antigenům přítomným v CTC.

Protože množství krve, které je možné získat od jednoho pacienta je omezené, zvláště u pokročilých stádií nádorových onemocnění, je možné s výhodou další CTC získat navíc z neadherentní frakce (supematantu) monocytámí frakce buněk, která vzniká v průběhu přípravy dendritických buněk, jak bude popsáno dále. Supernatant je tedy možné použít jako doplňkový/altemativní zdroj CTC, a/nebo jako zdroj lymfocytů, které mohou být pro pozdější použití uskladněny při -20 °C za standardizovaných podmínek podle protokolů zahrnujících mrazení buněk.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou tedy aktuálně izolovanými cirkulujícími nádorovými buňkami CTC izolované ze supematantu z neadherentní monocytámí frakce buněk periferní krve v kultivační láhvi po 1,5 - 3h inkubaci v kultivačním médiu. CTC z uvedeného supematantu se výhodně získají filtrací, jak je popsáno níže.

CTC se mohou výhodně získat filtrací krve na separační membráně s velikostí pórů 5-12 pm, ještě výhodněji s použitím kapilárních sil, a nejvýhodněji jako viabilní CTC, které dovolí jak kultivaci pro získání většího množství cirkulujících nádorových buněk, jak bude blíže popsáno níže, tak získání nepoškozené RNA z CTC.

Cílem lýzy nádorových buněk je získaní antigenů ve formě například proteinů a RNA, a zároveň možnost použít lyzační pufiry, které jsou vhodné pro vzorky s malým počtem buněk (1 až 1000 buněk) a nevyžadují další kroky čistění. Typická jednotlivá nádorová buňka obsahuje poměrně málo transkriptů většiny genů. Sekvenační data naznačují, že v myších embryonálních kmenových buňkách je přibližně 505 000 mRNA molekul, v myších embryonálních fibroblastech existuje asi 22 000 mRNA (51,52). Je zřejmé, že při analýze jednotlivých buněk může každá

-8CZ 2018 - 309 A3 ztráta během extrakce způsobená promýváním přinést signifikantní a dokonce i úplnou ztrátu některých transkriptů (53,54). Protokol založený na lyzačním médiu, který narušuje buněčnou membránu, činí RNA přístupnou a udržuje její integritu bez inhibice downstream enzymatických reakcí a to také v průběhu aplikace mražení a rozmrazování. V rámci vynálezu byly použity níže popsané metody 3a- 3c.

Lze tedy shrnout, že autoři předkládaného vynálezu nalezli v tomto provedení vynálezu prakticky využitelný způsob, jak používat CTC nejen diagnosticky, ale i terapeuticky, jako unikátní zdroj nádorových antigenů již v počátečních fázích onkologického onemocnění, tudíž z funkce markéru, který stav popisuje, se CTC dostávají do polohy efektoru, na kterém závisí, vůči jakým antigenům bude namířena imunitní odpověď. CTC jsou agresivní skupinou buněk, které může být připsána iniciace růstu metastatických nádorových ložisek. Na základě hypotézy, že bez CTC by metastázy nevznikly, by podle autorů vynálezu neměl být předmětem boje s nádorovým onemocněním pouze primární tumor, ale také CTC.

Výhodou CTC oproti jiným nádorovým buňkám používaným v procesu přípravy vakcín, kromě již vzpomínané nenáročnosti odběru je taky časový profil jejich výskytu. Víme, že prvé CTC se v krvi vyskytují minimálně v situaci, kdy primární tumor dosahuje velikosti 1 mm³ a jejich opětovný výskyt CTC je spojován s horší prognózou a neodpovídáním na podávanou léčbu (viz obr. 1) (6). Terapeutické využití CTC podle vynálezu tak přináší podstatnou výhodu oproti jiným typům nádorových buněk, zejména diseminovaným nádorovým buňkám doposud používaným k vakcinaci.

Diseminované nádorové buňky (DTC) se na rozdíl od CTC nevyskytují v krvi, ale v tělních tekutinách pacientů. Tělní tekutinou se zde rozumí jakákoli tekutina vyplňující libovolnou tělní dutinu přirozeně (jako např. kostní dřeň, mozkomíšní mok) a/nebo v důsledku pokročilého nádorového onemocnění (jako pleurální, perikardiální a synoviální výpotek, ascites, cefalická tekutina), nebo tekutina vnesená do tělní dutiny (peritoneální výplach, výplach dělohy). DTC je možné izolovat až ve finální fázi onkologického onemocnění, např. po několika měsících (jejich přítomnost je pro pacienta nepříznivým prognostickým ukazatelem), a proto nejsou vhodné pro monitorování průběhu terapie. DTC tedy v pozdních stadiích onemocnění poskytují dostatek antigenů k imunizaci, ale na straně druhé to podstatně ztíží boj aktivovaných buněk imunitního systému s již vytvořeným nadbytkem buněk nádorových, je však problémem proti enormnímu množství nádorových buněk vyvolat imunitní odpověď tak, aby v pokročilém stavu onemocnění bylo možné stav pacienta prognosticky zlepšit.

Naproti tomu se podle předkládaného vynálezu výhodně mohou CTC průběžně izolovat v situaci, kdy slouží pro monitorování postupu onemocnění, případně léčebného procesu. V případě zjištění narůstajícího počtu CTC jsou pak s výhodou použity stejné buňky jako zdroj imunizačních antigenů, dokud nádorové onemocnění ještě nepokročilo do fáze, kdy je přítomnost nádorových buněk v nadbytku přímo život ohrožující. Předkládaný vynález tedy také umožní stanovení nej vhodnějšího okamžiku přechodu od monitorování k léčbě.

DTC jsou nicméně využitelné v dalších výhodných provedeních vynálezu jako pomocný zdroj antigenů pro aktivaci dendritických buněk jako adjuvantní (přídavná) terapie doplňující terapii CTC. DTC se mohou získat filtrací odebrané tělní tekutiny obdobně jako CTC na separační membráně s velikostí pórů 5 - 12 pm, ještě výhodněji s použitím kapilárních sil, a nejvýhodněji jako viabilní buňky, a používat pro aktivaci buněk DC ve stejných formách jako CTC.

Ve vakcíně podle vynálezu lze adjuvantně použít též antigeny z primárních nádorových buněk izolovaných z primárního nádoru pacienta. Primární nádorové buňky jsou využitelné zejména v případech, kdy díky velikosti primárního tumoru a pokročilého stavu onemocnění, je možné získat přímo při indikovaném chirurgickém odstranění primárního tumoru nejenom dostatek biologického materiálu pro diagnostiku, ale také dostatek nádorové tkáně pro izolaci nádorových

-9CZ 2018 - 309 A3 buněk primárního tumoru. Antigeny zde mohou být opět ve formě uvedené výše pro antigeny z CTC.

Nádorovými buňkami použitými ve vakcíně podle vynálezu jsou výhodně buňky, pro zvýšení jejich množství/koncentrace obohacené, výhodně filtrací založenou na velikosti buněk, a/nebo pomnožené krátkodobou 3- až 5denní a/nebo dlouhodobou 5- až 21denní kultivací in vitro, výhodně v kultivačním médiu bez přídavku séra a/nebo s přídavkem autologního séra pacienta a/nebo jednoho nebo více jiných obvyklých růstových faktorů. Bylo zjištěno, že dlouhodobá kultivace je výhodná zejména pro uchování CTC např. v zamrazeném stavu a získání většího množství antigenů. Krátkodobá kultivace je výhodná pro bezprostředně následující vakcinaci pro rychlé získání minimálně geneticky změněných buněk. Je možné pro aktivaci DC použít buňky z obou typů kultivace, což může částečně simulovat proměnlivost buněk v průběhu času.

Koncentrováním buněk se rozumí separace CTC z periferní krve (popř. DTC z tělní tekutiny) výhodně filtrací založenou na velikosti buněk, opět výhodně na separační membráně s velikostí pórů 5-12 pm, a ještě výhodněji s použitím kapilárních sil, kdy je koncentrace CTC/DTC s výhodou zvýšena v získaném preparátu minimálně s faktorem ΙΟ⁶. V obohaceném filtrátu lze takto získat jednotky až stovky buněk CTC/DTC.

Výhodně je možné provést kultivaci nádorových buněk in vitro vedoucí k proliferaci, která je v některých případech (např. množství CTC na 8 ml krve je méně než 100) nezbytná pro dosažení dostatečného množství nádorových buněk k imunizaci. K tomu jsou potřebné viabilní buňky. Dostatečným množstvím CTC se zde rozumí empiricky stanovené množství buněk, které dokážou vyvolat imunitní odpověď. Stanovení může provést odborník rutinními postupy. S výhodou je dostatečné množství řádově stovky buněk CTC, popř. DTC. Kultivace není nutná v případě, kdy se použije in vitro amplifikace RNA, jak je popsáno dále. Kultivace může být výhodná i z důvodu např. pročištění CTC od bílých krvinek, jako kontrolní bod pro počítání, dokumentaci apod.

Kultivace se pro CTC/DTC provádí výhodně za standardizovaných kultivačních podmínek (37 °C, 5 % CO2). v kultivačním růstovém médiu jako je např. CellGRO, Xvivo, RPMI, DMEM, MEM. Bezsérové médium je vhodné v situaci, kdy chceme omezit vliv externích a neautologních faktorů jako např. cytokinů z fetálního bovinního séra vedoucích k aktivaci imunitní odpovědi na maximum. Kultivace v médiu s přídavkem autologního séra vede k minimalizaci externích vlivů na imunizaci dendritických buněk pacienta. Podmínky kultivace může určit odborník bez potřeby experimentování nebo jednoduchými testy.

Výrobu vakcíny lze však zahájit i s jednou zachycenou CTC, pokud se provede zmnožení molekul RNA (např. mRNA izolovaná z CTC může být nespecificky amplifikována, výhodně in vitro propagací nádorových buněk nebo in vitro amplifikací RNA) a následné imunizace dendritických buněk pomocí těchto transkriptů.

Samotné antigeny jsou jako antigeny indukující imunitní odpověď málo účinné, proto se ve vakcíně prezentují imunitním buňkám výhodně použitím při kultivaci připravených a/nebo od pacienta získaných dendritických buněk (DC). Takto připravené DC mají schopnost v těle pacienta prezentovat nádorové antigeny v lymfatických uzlinách a aktivovat antigen-specifické T lymfocyty.

Dalším provedením vynálezu je proto autologní vakcína, ve které jsou antigeny prezentované autologními in vitro maturovanými dendritickými buňkami po aktivaci shora uvedenými formami antigenů odvozených z CTC, přičemž RNA může být nespecificky amplifikována, výhodně in vitro propagací nádorových buněk nebo in vitro amplifikací RNA.

Dendritické buňky lze získat z monocytů. Monocyt je druh bílé krvinky, agranulocyt, který tvoří 3-8 % leukocytů periferní krve. Vzniká v kostní dřeni ze separátní vývojové linie primitivních

- 10CZ 2018 - 309 A3 bílých krvinek (retikulámích buněk). Prekurzorová buňka se nazývá monoblast, ze které se přes stadium promonocytu diferencuje monocyt. Ten v krvi koluje asi 8 hodin, poté přestupuje do tkání, ještě se zvětší a stává se z něj makrofág. Monocyt je v periferní krvi v podstatě nefunkční, a jedná se tedy o prekurzor makrofágu nebo také nezralý makrofág. Hlavní funkcí cirkulace monocytů v krvi je tvořit zásobu makrofágů pro potřeby všech tkání v těle. Krev jako zdroj monocytů může být odebrána jako periferní krev, neboje pacient podroben leukafaréze, při které dochází k oddělení monocytámí frakce na základě velikosti buněk.

Monocyty se mohou izolovat z krve také protokolem izolace na hustotním gradientu např Histopaque 1077, kdy se separuje celá frakce polymorfonukleáních buněk periferní krve PBMC (peripheral blood monocytes cells), a následně jsou monocyty izolovány díky jejich adhezivitě k plastovým povrchům. Získaná frakce PBMC se k tomuto účelu po případných krocích promývání např. fosfátováni pufirem (PBS) inkubuje v kultivačním médiu, jako je např. CellGRO, Xvivo, RPMI, DMEM, MEM, vhodně v kultivační láhvi po dobu přibližně 1,5 - 3 h. Tato doba, během které dojde k sedimentaci a adhezi monocytů na dno kultivační lahve, je u jednotlivých pacientů různá. Zbytek neadherovaných buněk je odstraněn v supematantu, který však může být ještě využit pro izolaci CTC, jak bylo popsáno výše. Přisedlé adherované monocyty lze kultivací diferencovat směrem ke kultuře buněk, která má vlastnosti zejména dendritických buněk (DC).

Ve výhodnějším provedení jsou dendritické buňky produkované kultivací in vitro monocytů, získaných separací z monocytámí frakce buněk periferní krve na separační membráně s velikostí pórů 7 - 10 pm, výhodněji s použitím kapilárních sil. To je výhodné proto, že separace na separační membráně, zejména při použití kapilární síly, je šetrná k monocytům, a dále z důvodu vysoké rychlosti separace i nízké ceny.

Další možnost, jak získat čistou kulturu monocytů, je elutrizace, tedy automatická separace PBMC, nebo jejich imunomagnetická separace na základě pozitivní selekce buněk s expresí antigenu CD 14 (CD 14+)· Jinou výhodnou možností získání maturovaných dendritických buněk pro účely vynálezu, zejména CD1+ CD19- buněk, je uzavřený automatický systém pro maturaci a aktivaci DC na principu imunomagnetické separace (Clinimacs™, Miltenyi Biotec, http://www.miltenyibiotec.com/en/clinical-applications/clinimacs-system/clinimacsinstruments/clinimacs -prodigy. aspx).

Zdrojem DC mohou být dále separované monocyty, CD34+ pozitivní buňky kostní dřeně a volné diferencované DC buňky myeloidního (mDC) nebo plazmacytoidního (pDC) DC-charakteru. Zvýšená produkce DC může být indukována podáním injekce růstového faktoru Flt3.

Kultivace monocytů se zpravidla provádí, aby v průběhu kultivace diferencovaly z monocytů buňky s vlastnostmi dendritických buněk (tj. populace nezralých DC). V průběhu kultivace monocytů na DC se používá přídavků různých růstových faktorů (zejména IL-6, GM-CSF) do standardních kultivačních médií (jako je např. CellGRO,

Xvivo, RPMI, DMEM, MEM). V závislosti na zdroji DC buněk lze použít různé protokoly pro kultivaci DC. Doba kultivace je vhodně 2-6 dnů.

Ihned poté, co byly in vitro následně vystaveny setkání s antigenním podnětem, nezralé DC maturují. Maturace DC buněk je stěžejní pro prezentaci antigenů imunitním buňkám.

Aktivací DC se rozumí jejich přechod do stavu, kdy jsou schopné antigen dál prezentovat. Aktivní DC buňky prezentují komplex HLA-antigen T-buňkám CD4 a/nebo CD8 pro indukci klonální amplifikace T-buněčné odpovědi. Výhodně jsou dendritické buňky aktivované in vitro pomocí jedné nebo více shora uvedených forem antigenů odvozených z cirkulujících nádorových buněk. Autologní vakcína však může navíc obsahovat i dendritické buňky aktivované in vitro analogickými materiály odvozenými z DTC a/nebo primárních nádorových buněk. Aktivace dendritických buněk se tedy může provádět materiály (včetně celých atenuovaných buněk)

- 11 CZ 2018 - 309 A3 odvozenými z CTC, DTC, nebo primárních nádorových buněk samostatně, nebo se mohou pro aktivaci DC použít uvedené materiály v libovolné směsi.

Atenuované CTC jsou zde CTC, které byly zbaveny schopnosti se množit, ale jsou stále buňkami viabilními, aby DC mohly prezentovat imunitnímu systému nové antigeny získané z CTC. Atenuace se provádí například pomocí UV-C nebo elektromagnetického ozáření.

Apoptotickými CTC jsou buňky získané např. inkubací mimo CO2 inkubátor, se znaky apoptózy jako je např. přítomnost fragmentovaného buněčného jádra nebo přítomnost kaspázy 3.

Výše uvedené platí i pro adjuvantní použití antigenů DTC či primárních nádorových buněk předkládaných imunitnímu systému pomocí dendritických buněk.

Výhodně jsou dendritické buňky vyprodukované kultivací in vitro z monocytámí frakce buněk periferní krve odebrané již před terapií nebo v době stanovení diagnózy pacienta, zejména před zahájením chemoterapie, radioterapie, biologické nebo operační léčby, pro získání těmito zásahy neovlivněných buněk.

Další provedení vynálezu se týká použití autologních cirkulujících nádorových buněk aktuálně izolovaných z periferní krve pacienta jako zdroje antigenů pro výrobu autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti aktuálně přítomným nádorovým buňkám pacienta. Použití může navíc k CTC zahrnovat analogicky antigeny autologních diseminovaných nádorových buněk aktuálně izolovaných z tělních tekutin pacienta a/nebo primárních nádorových buněk aktuálně izolovaných z primárního nádoru pacienta Uvedené buňky i odvozené materiály mohou být používány jednotlivě nebo i v libovolných kombinacích.

Jak již bylo výše naznačeno, pomocí výskytu CTC v krvi je možné s výhodou detekovat efekt imunitní odpovědi. Způsobem podle vynálezu je tedy možné průběžně u pacienta sledovat, zdaje počet určitých nádorových buněk v odebraném vzorku krve v průběhu času konstantní, zda stoupá, klesá, nebo se nově objeví odlišné nádorové buňky. Je také možné s výhodou hodnotit charakter aktuálně přítomných CTC v krvi pacienta a tak zjistit, zdaje podaná vakcína funkční ve smyslu výskytu specifických CTC v krvi. Při provádění vynálezu se zpravidla vhodnou metodou porovnává:

- počet cirkulujících nádorových buněk v určitém objemu krve odebraném v dřívějším časovém bodě A, proti kterým již výhodně byla vyrobena vakcína odpovídající časovému bodu A, a

- počet cirkulujících nádorových buněk ve stejném objemu krve odebraném v pozdějším časovém bodě B, přičemž se má rozhodnout, o postupu onemocnění a dále o tom, zda podávat stejnou vakcínu jako v bodě A nebo zahájit výrobu nové vakcíny odpovídající bodu B. Může být například empiricky určený počet buněk, se kterým se porovná počet buněk stanovený v určitém časovém bodě, a je-li stanovený počet buněk vyšší než určený mezní počet buněk, například vyšší než 10 nebo vyšší než 100 buněk, zahájí se příprava vakcíny. Dále může být určen poměr v procentech, a je-li stanovený počet buněk například o 5 % vyšší než určený počet buněk nebo o 5 % vyšší než počet buněk stanovený v dřívějším časovém bodě, zahájí se příprava vakcíny atd. Takto je možné definovat významný rozdíl, tedy takovou míru překročení určené prahové hodnoty, kdy již je vhodné zahájit výrobu vakcíny. Signifikantní mírou překroční hodnoty počtu CTC je například zvýšení množství CTC o 25%. Tato a jiná kritéria lze používat jednotlivě nebo v libovolné kombinaci. Jak již bylo uvedeno, přípravu vakcíny lze zahájit, i pokud se nalezne jediná CTC (počet CTC buněk není limitujícím faktorem při zahájení procesu výroby vakcíny), transkripcí RNA in vitro a následnou imunizací dendritických buněk pomocí těchto transkriptů.

Určené časové intervaly mezi odběry mohou být stejné nebo různé a mohou být například od jednoho týdne do jednoho roku.

- 12CZ 2018 - 309 A3

Předmětem vynálezu je tedy také použití, kde navíc se pacientovi v určených časových intervalech odebírají vzorky periferní krve, ve kterých se ex vivo testuje přítomnost CTC a/nebo jejich citlivost na autologní vakcínu vyrobenou aktuálně pro dřívější časový bod, a příprava autologní vakcíny vyrobené aktuálně pro pozdější časový bod se zahájí, je-li počet izolovaných CTC pro pozdější časový bod o významný rozdíl vyšší než jejich určený mezní počet a/nebo počet izolovaných CTC pro dřívější časový bod, vždy vztaženo na stejný objem krve.

Pro doplnění se navíc pacientovi v pravidelných časových intervalech mohou odebírat vzorky tělních tekutin, ve kterých se ex vivo testuje přítomnost DTC a/nebo jejich citlivost na autologní vakcínu vyrobenou aktuálně pro dřívější časový bod.

Vakcínu podle vynálezu lze podávat vhodně před zahájením chemoterapie, po ukončení nebo přerušení chemoterapie, alternativně také spolu s jinou biologickou léčbou, s výhodou v situacích, kdy je použita léčba imunoterapeutická.

Další předmět vynálezu je způsob přípravy autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám, kde vakcína obsahuje jako účinnou složku vlastní antigeny z pacienta, kde způsob zahrnuje následující kroky

a) poskytne se aktuální vzorek periferní krve pacienta v daném čase

b) provede se izolace z aktuálního vzorku periferní krve viabilních autologních cirkulujících nádorových buněk, CTC;

c) s CTC z kroku b) se provede krok zvolený ze skupiny: atenuace, příprava lyzátu, příprava izolovaných částí, příprava z nich odvozených exozomů, a/nebo příprava z nich izolované RNA;

d) aktuálně v kroku c) připraveným materiálem, nebo materiálem připraveným v kroku c) dříve, je-li k dispozici, se aktivují dendritické buňky.

Výhodně jsou dendritické buňky v kroku d) vyprodukované kultivací in vitro z monocytámí frakce buněk periferní krve odebrané již před nebo v době stanovení diagnózy pacienta, zejména před zahájením chemoterapie, radioterapie, biologické nebo operační léčby, pro možnost získání dostatečného množství léčbou neovlivněných buněk.

Kroky b) až d) výše mohou navíc ve výhodných provedeních zahrnovat jeden nebo více kroků, avšak vždy v dále uvedeném pořadí, zvolených ze skupiny:

- jako součást kroku b) se dále provede krok b^a), při kterém se alespoň část získaných CTC pomnoží a/nebo vyčistí krátkodobou 3- až 5denní a/nebo dlouhodobou 5- až 21denní kultivací in vitro v živném médiu, která se může provádět přímo na separační membráně;

-jako součást kroku c) se dále provede krok c^a), při kterém se provede amplifikace RNA;

- jako součást kroku d) se dále provede krok d^a), při kterém se provede testování dostatečné maturace dendritických buněk pomocí testu na schopnost fagocytózy a/nebo analýzou genové exprese vybrané skupiny genů typických pro fúnkční DC;

- jako součást kroku d) se dále provede krok d^b), při kterém se vakcína ve formě aktivovaných DC prezentujících antigeny CTC uloží v alikvotech pro pozdější použití.

Výše získaný materiál z kroku d), je určený zpravidla pro bezprostřední použití, takže může být přímo použit pro vakcinaci, popř. postačuje jeho doplnění např. pufrem a/nebo nastavit osmotický tlak např. pomocí NaCl, popř. ještě s přídavkem konzervační látky. Vakcínu, případně antigen je možné před použitím uchovávat při -20 až -80 °C.

- 13CZ 2018 - 309 A3

Pomocí testu na schopnost fagocytózy se výhodně provádí testování dostatečné maturace (stupně zralosti) DC buněk, neboť pouze funkční, zralá DC-buňka je schopná fagocytovat antigeny z okolí. Použitý test, který urychlí celý proces testování stupně maturace DC buněk, je komerčně dostupný (pHrodo™ Green Zymosan Bioparticles™ Conjugate for Phagocytosis, ThermoFisherScientific) a funguje na principu aktivace fluorescence za určitého stupně kyselosti (pH), takže výsledkem je, že v případě, že buňka fagocytuje proteiny z okolí, její fagozomy se zbarví na zeleno (fluorescenční mikroskopie). Nové konjugáty pHrodo® Green, které jsou citlivé na pH, poskytují rychlejší a přesnější výsledky než jiné testy fagocytózy. Konjugáty pHrodo® Green jsou nefluorescenční vně buňky při neutrálním pH, ale fluoreskují při kyselém pH zářivě zeleně, například ve fagozomech. Použití tohoto testu fagocytózy je s výhodou oproti jiným komplikovanějším a dražším metodám jako průtoková cytometric a efektivně šetří čas. Obdobně e možné použít testy zaměřeny na aktivitu procesu endocytózy/pinocytózy.

Další možností testování maturace je analýza genové exprese vybrané skupiny genů, které jsou pro maturované DC typické. Příkladem je exprese např. CD80, CD83, CD86 a HLA-DR, jak ukázáno v tabulce 2. To přinese principiální zrychlení celého procesu testování kvality vakcíny oproti stavu techniky založené např. na analýze proteinů pomocí průtokové cytometric. Test genové exprese je možné udělat z podstatně menšího množství maturovaných DC.

Zralé DC je možné uchovávat při -20 až -80 °C po dobu několika týdnů (58).

Antigeny jsou výhodně prezentované autologními in vitro maturovanými dendritickými buňkami po aktivaci antigeny z CTC ve shora uvedených formách, přičemž RNA může být nespecificky amplifikována, výhodně in vitro propagací nádorových buněk nebo in vitro amplifikací RNA.

Způsob přípravy vakcíny na bázi CTC popsaný výše může navíc obsahovat kroky, při kterých se odděleně analogickým způsobem zpracují DTC získané z tělních tekutin pacienta. Vakcinační materiál na bázi DTC potom společně působí jako adjuvantní vakcína s vakcínou na bázi CTC. Společným působením se zde rozumí smíchání imunizujících antigenů (výše uvedené formy antigenů pocházející z buněk CTC a DTC) při aktivaci nezralých DC. Výsledkem kombinování CTC a DTC imunizace je tedy jenom jedna vakcína. Lze také uvažovat o aplikaci oddělených CTC a DTC vakcín tak, aby se jejich účinky v určitém období překrývaly.

Způsob přípravy autologní vakcíny může tedy zahrnovat kroky, při kterých se, odděleně od přípravy vakcíny CTC, navíc

m) poskytne se aktuální vzorek tělních tekutin pacienta v daném čase

n) provede se izolace z aktuálního vzorku tekutin pacienta viabilních autologních diseminovaných nádorových buněk, DTC;

o) s DTC z kroku n) se provede krok zvolený ze skupiny: atenuace, příprava lyzátu, příprava izolovaných částí, příprava z nich odvozených exozomů, a/nebo příprava z nich izolované RNA;

p) aktuálně v kroku o) připraveným materiálem, nebo materiálem připraveným v kroku o) dříve, je-li k dispozici, se aktivují dendritické buňky.

Jako dendritické buňky v bodě p) se výhodně použijí dendritické buňky vyprodukované kultivací in vitro z monocytámí frakce buněk odebrané již před nebo v době stanovení diagnózy pacienta, zejména před zahájením chemoterapie, radioterapie, biologické nebo operační léčby.

Dále se může provést jeden nebo více doplňujících kroků, avšak vždy v dále uvedeném pořadí, zvolených ze skupiny:

- 14CZ 2018 - 309 A3

- jako součást kroku n) se dále provede krok n^a), při kterém se alespoň část získaných DTC pomnoží a/nebo vyčistí krátkodobou 3- až 5denní a/nebo dlouhodobou 5- až 21denní kultivací in vitro v živném médiu, výhodně se kultivace provádí přímo na separační membráně;

-jako součást kroku o) se dále provede krok o^a), při kterém se provede amplifikace RNA;

- jako součást kroku p) se dále provede krok p^a), při kterém se provede testování dostatečné maturace dendritických buněk pomocí testu na schopnost fagocytózy a/nebo analýzou genové exprese vybrané skupiny genů typických pro funkční DC;

- jako součást kroku p) se dále provede krok p^b), při kterém se vakcína ve formě aktivovaných DC prezentujících antigeny DTC uloží v alikvotech pro pozdější použití.

Ostatní parametry způsobu jsou analogické těm uvedeným výše pro CTC.

Vakcína, použití i způsoby podle vynálezu dále dovolí snížit náklady na protirakovinnou vakcinaci, neboť při použití CTC podle vynálezu pro aktivaci DC nejen odpadají náklady na získání primárního tumoru při operaci, čištění buněk primárního tumoru apod., ale k vyvolání stejné systémové imunitní odpovědi jako u vakcín podle stavu techniky bude potřeba i nižšího množství DC-buněk, které ale budou specifičtěji imunizované, a poskytovat specifičtější a účinnější imunitní odpověď. Vakcínu podle vynálezu je obecně možné aplikovat např. subkutánně, intranodálně, intravenózně. Všechny uvedené typy podání budou testovány na úrovni klinické studie.

Vynález v dalším provedení poskytuje nový dostatečně citlivý, účinný, pro pacienta přijatelný a bezpečný, prakticky snadno proveditelný a z hlediska nákladů přijatelný způsob monitorování pacienta v průběhu nádorového onemocnění nebo i před jeho vznikem, pro identifikaci objevení se cirkulujících nádorových buněk, a tedy zvýšeného rizika vytvoření nádoru. CTC můžeme z tohoto hlediska považovat za validní prognostický marker nádorového onemocnění. Vynález umožňuje, aby se CTC staly také biomarkerem prediktivním, tedy určujícím pravděpodobnost efektivity plánované terapie. Vynález dále umožňuje, použít cirkulující nádorové buňky jako biomarker diagnostický, zejména v situacích, kdy není možné standardními metodami určit původ primárního tumoru. Nový způsob monitorování pomocí CTC může nahradit nebo doplnit tradiční sledování imunitní odpovědi na vakcíny pomocí analýzy některých aktivovaných buněčných podskupin (např. -CD8+IFNy+), který neodpovídá klinickému výsledku. Nový způsob monitorování je zejména výhodný pro zjištění okamžiku, kdy zahájit další léčbu, zvláště výhodně kdy zahájit léčbu některou z vakcín podle vynálezu popsaných výše, a/nebo kdy zahájit přípravu vakcíny pro indukci imunitní odpovědi některým ze způsobů podle vynálezu popsaných výše.

Dva cykly, každý obsahující monitorování, zahájení výroby aktuální vakcíny na základě přítomnosti CTC, kdy se v jednotlivých časových bodech hodnotí nejenom počet CTC jejich vlastnosti, a aplikace vakcíny, jsou ukázány na obr. 2.

Součástí vynálezu je tedy také způsob monitorování pacienta pro určení, zda zahájit přípravu aktuální autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám a/nebo na vznik, postup nebo rekurenci jeho nádorového onemocnění, kde vakcína obsahuje jako účinnou složku antigeny pocházející z buněk individuálního pacienta, či zda zahájit jinou diagnostiku nebo léčení, kde způsob zahrnuje následující kroky:

a) poskytne se aktuální vzorek periferní krve pacienta;

b) provede se izolace z aktuálního vzorku periferní krve viabilních autologních cirkulujících nádorových buněk, CTC;

- 15CZ 2018 - 309 A3

c) stanoví se aktuální počet a/nebo charakter CTC;

d) stanovený aktuální počet CTC se porovná se srovnávací hodnotou zvolenou z

i) určeného mezního počtu CTC;

ii) počtu CTC stanoveného dříve u alespoň jednoho předchozího odběru a izolace CTC podle bodů a) až c), je-li k dispozici;

e) popřípadě se zahájí příprava aktuální autologní vakcíny, je-li aktuální počet izolovaných CTC o významný rozdíl vyšší než určený mezní počet podle bodu d) i), popřípadě než předchozí počet podle bodu d) ii), je-li charakter CTC významně odlišný oproti předchozímu odběru.

V jiném provedení způsobu monitorování výše se po bodu b) stanoví účinnost dříve připravené vakcíny na izolované CTC, a v případě zjištění citlivosti buněk se vynechá krok e) přípravy nově aktuální autologní vakcíny.

Vynález dále poskytuje způsob monitorování popsaný výše, při kterém se v bodech c) až e) namísto nebo navíc k počtu CTC použije k monitorování stanovení exprese alespoň jednoho markéru přítomného na CTC a/nebo alespoň jednoho s tumorem asociovaného markéru standardně používaného pro daný typ nádorové tkáně.

Při popsaném způsobu monitorování je z důvodu nízkého počtu CTC výhodně velikost aktuálního vzorku periferní krve pacienta alespoň 2 x 8 ml.

Charakterem CTC se zde rozumí genová exprese specifických s tumorem asociovaných genů, jak je zde např. ukázaná na obr. 5.

Počtem buněk se zde vždy rozumí počet buněk vztažený na stejný objem krve nebo tělní tekutiny. Předchozím odběrem může být buď odběr bezprostředně předcházející aktuálnímu odběru nebo některý z dřívějších odběrů. Testování se u CTC i DTC se výhodně provádí stanovením genové exprese vhodného markéru a/nebo testováním přítomnosti mutací, nejvýhodněji za pomoci sekvenování nové generace (NGS - next generation sequencing).

Při způsobu monitorování podle vynálezu je dále výhodné, jestliže způsob monitorování odpovědi na léčbu zahrnuje také testování mutačního a expresního profilu buněk primárního tumoru (viabilních a/nebo fixovaných) například tím, že se bude průběžně v krvi sledovat také přítomnost antigenů specifických pro primární tumor. Vhodně se může opět využít sledování genové exprese metodou qPCR, mutační analýzu např. použitím metody NGS).

Způsob monitorování odpovědi na léčbu může výhodně zahrnovat také testování koncentrace a mutačního profilu volné cirkulující DNA při kterém se použije aspoň jeden biomarker mutačního původu, který byl detekován původně v CTC a/nebo v primárním tumoru a/nebo v DTC. Testování mutačního profilu volné cirkulující DNA je sice v oboru známé, ale nikoli využití poměru množství volné DNA a mutované volné DNA pro rychlý monitoring buněčné odpovědi na vakcíny. Ve vztahu k počtu a/nebo charakteru CTC se volná cirkulující DNA a volná mutovaná DNA jeví jako jednoznačně nejlepší test na sledování imunizace.

Způsob monitorování odpovědi se výhodně u stejného pacienta provádí opakovaně, výhodně v pravidelných časových intervalech Časové intervaly jsou navrženy dle individuální potřeby pacienta. S výhodou je tedy inovativně vytvářen časový plán (personalizovaný plán), který se řídí zejména aktuálním stavem pacienta. Stavem pacienta se rozumějí aktuální počty a charakter CTC vyskytujících se v periferní v krvi v kombinaci se standardním diagnostickým postupem u jednotlivých typů nádorového onemocnění. Časové intervaly mezi odběry mohou být stejné nebo různé a mohou být například od jednoho týdne do jednoho roku.

- 16CZ 2018 - 309 A3

V dalším provedení se alespoň v některých časových intervalech může uskladnit pro pozdější použití při imunizaci materiál, kterým je alespoň jeden člen zvolený ze skupiny cirkulující nádorové buňky, diseminované nádorové buňky, buňky primárního tumoru; z těchto typů buněk odvozené formy antigenů jak uvedeno shora. Pro uchování na delší dobu se může výhodně použít lyofilizace.

Ve vakcíně, použití a způsobu podle vynálezu týkajících se DTC je tělní tekutina výhodně zvolená ze skupiny kostní dřeň; mozkomíšní mok; pleurální, perikardiální a synoviální výpotek; ascites; cefalická tekutina; a peritoneální výplach.

Objasnění výkresů

Obr. 1 ukazuje prognostický význam snížení počtu CTC v průběhu terapie

Obr. 2 ukazuje výrobu DC-vakcíny na základě zvýšeného počtu CTC

Obr. 3 ukazuje viabilní CTC zachycené na separační membráně

Obr. 4 ukazuje CTC proliferující za podmínek in vitro

Obr. 5 ukazuje viabilní DTC zachycené na separační membráně

Obr. 6 ukazuje monitorování změn v přítomnosti a charakteru CTC v průběhu probíhající neoadjuvantní terapie u pacientky s karcinomem prsu

Obr. 7 ukazuje výsledek testování schopnosti fagocytovat zobrazením aktivních fagozomů v DC pomocí vitálního fluorescenčního barvení

Příklady uskutečnění vynálezu

Postup získání vakcíny ze sporadických buněk

Postup získání vakcíny ze sporadických buněk lze schematicky rozdělit do následujících fází, které budou dále podrobně popsány.

i. Příprava a získání imunizačního antigenů.

CTC byly v tomto příkladu izolovány z vlastní krve pacienta (tj. autologně) pomocí separace založené na velikosti nádorových buněk. Tato fáze zahrnovala následující kroky:

i.a Izolace a kultivace cirkulujících nádorových buněk (CTC)

K selekci CTC z plné krve (EDTA, 2x8 ml) byla použita metoda filtrace pomocí vzlínavosti na membráně s velikostí pórů 7-10 pm. (Metacell s.r.o., ČR). Zachycené buňky byly následně in vitro kultivovány v bezsérovém médiu RPMI po dobu 3-5 dnů za standardních podmínek (37 °C, 5% CO₂), protokol je popsán v odkazech (45-47). Součástí hodnocení přítomnosti CTC ve vzorku byla cytomorfologická analýza CTC vitální fluorescenční mikroskopií. Tento test je založen na cytomorfblogické charakterizaci vlastností živých buněk barvených fluorescenčně (Nucblue® Live ReadyProbes® Reagent a Celltracker™ Green CMFDA, Thermo Fisher Scientific, USA). Pod fluorescenčním mikroskopem byla hodnocena cytopatologická kritéria jako velikost buňky (u nádorových buněk, tedy i CTC, je zpravidla >15 pm), velikost (>10 pm) a tvar jádra buněk, nepravidelnost jaderní membrány, poměr objemu jádra a cytoplazmy,

- 17CZ 2018 - 309 A3 přítomnost, vzhled a počet jadérek, přítomnost proliferace (detekce mitóz) nebo/a vytváření 2D a 3D-buněčných struktur (48). Obr. 3 ukazuje viabilní cirkulující nádorové buňky zachycené na separační membráně, v průběhu protokolu separace založené na velikosti buněk (MetaCell™)). Nej světlejší jsou jádra (zbarvená původně světle modře), šedá je cytoplazma (původně zelená) ukazující nepravidelný tvar buněk. Cytomorfblogická analýza kultivace in vitro frakce obohacené na CTC potvrdila v jednotlivých kontrolních bodech (7, 14, 21 a 28 dnů) proces zmnožení izolovaných CTC. Obr. 4 ukazuje cirkulující nádorové buňky proliferující za podmínek in vitro. Nejsvětlejší jsou jádra (zbarvená původně světle modře), šedáje cytoplazma (původně zelená).

Stejný postup byl použit pro izolaci DTC z ascitické tekutiny (viz obr. 5) (56), velikost vzorku byla v tomto případě 21 ml, ascitická tekutina byla odebírána přímo z peritonea do zkumavky (50ml, Coming) bez protisrážlivých činidel a filtrována přes membránu (MetaCellTM). Po zhodnocení hustoty ascitické tekutiny může být před samotnou filtrací ascitická tekutina ještě naředěna RPMI nebo PBS.

i.b Molekulární charakterizace CTC

Potvrzení nádorového původu buněk pomocí tumor asociovaných (TA) genů (analýza genové exprese (qPCR)).

Součástí zhodnocení přítomnosti CTC ve vzorku byla také molekulární analýza (testování genové exprese). Ke každému z dále uvedených typů separovaných CTC se přítomnost CTC v obohacené buněčné frakci na kultivační membráně prokazovala také pomocí analýzy genové exprese pro skupiny specifických tumor-asociovaných (TA) genů. K potvrzení nádorového původu izolovaných buněk byla izolována jejich RNA. Pro izolaci RNA byl použit RNasy Mini Kit (Qiagen, Germany) a pro syntézu cDNA High-Capacity RNA-to-cDNA™ Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). qPCR analýza byla provedena s použitím TaqMan™ Gene Expression Assays (Thermo Fisher Scientific, USA) a pomocí Cobas z 480 (Roche s.r.o., ČR). CTC byly detekovány na základě exprese tumor asociovaných genů KRT18, KRT19 (keratin 18/19), EpCAM (epithelilal cell adhesion molecule), MUC1 (mucin 1), MGB (mammaglobín), HER2, ESR (receptor estrogenu), PGR (receptor progesteronu), CD45 a CD68 (markéry bílých krvinek), CD24 a CD44 (markéry kmenových buněk) a ACTB (kontrolní gen).

Exprese TA-genů byla porovnávána ve frakcích RNA izolované z celkové krve tzv. leukocytámí frakce), RNA izolované z buněčné frakce obohacené na CTC bezprostředně po filtraci a RNA izolované z buněčné frakce obohacené na CTC po filtraci na separační (kultivační) membráně (MetaCell®), (49,50) a krátkodobé in vitro inkubaci (3-5 dnů).

Porovnání ukazuje na míru obohacení získané buněčné frakce o buňky s nádorovými vlastnostmi vůči frakci bílých krvinek (tzv. leukocytámí frakce izolována z periferní krve lýzou erytrocytů). CTC-vyšetření analýzou genové exprese v kombinaci s cytomorfblogickou analýzou obsahuje informaci o přítomnosti/nepřítomnosti CTC v periferní krvi a jejich vlastnostech (exprese tumorasociovaných genů). V souvislosti s podávanou léčbou se hodnotí také exprese genů asociovaných s chemorezistencí.

Přehled výsledků genové exprese pro jednotlivé typy CTC u jednotlivých tumorů je schematicky zobrazen v tabulce 1.

- 18CZ 2018 - 309 A3

Tabulka 1: Nejčastěji zvýšená genová exprese tumor-asociovaných genů stanovená ve vzorcích CTC u jednotlivých typů tumorů.

i

tf

i JÍ' ýsl· : ' «Ί ; : 3 „ : to : cj : S3 š t: r:Ýj · 'C i £$ i i» i r* ý Č : Š3 ; :'P : 3 § AIS : d : « : fJ to ; g*s.;; to i Atf . <r4 kJ *> : Q : pg : <j : S : § : U 'tj 0: « a, leH υ M i £ i SS i § : KS : O : ~

tri 8 g 2 g u to 4,1 iJ to <ri Q to & 1

*ČJ £J ”O a 2 j u to & to a> řj Š SS 'a to 15 to h 0 $3 4,í

VNV’IR

tf

tf

Mí)

tf

tf

tf

1X1,1

tf

tf

,ΟΤΛ

>1

tf

O : žsJto, : r**< : £;* g 4í » s : <1.1 : fíS : 1 & 1 < Ó UJuiU

Rs X

tf

tf

tf

. N ; U ; x* ; U i W : ftq : 1^ | : O | : Pl O >·············································

tf

ra : J : Xv»·’ · :·!»: yjčí : « ; ! 9 r ; ; 0 ; 9 úĚC : U : : ^ :

53 C ¢3 -t-to ÍÚ to '*1 &Í4 « to *s a s § $ +~^ Šá 1 *s a 1 *to

a tft 25 0 to *3) g J3 3 <S *Sj O

4j i S U to R R t? ÍU to' 1 U

VSd

tf

l.lAt

tf

tf

tf

«ĎiW

tf

Ý. M^í · Ca · #ώ : $ £3

iwxo

tf

tf

tf

tf

kí

tf

: >ÍJ : « I u Q : .s, S « ,S : t-j ,λ ui μ p Λ5 : : Jššá 3 i 5Í i 1 i μ § - A ? : a i a a <s> : ň : β ! 0 - í : U § : δ: «I8 W .i : ® : S : u υ μ ! S š£ 1 ÍX, ; ’á i S i S ij : S3 : irt : +>·. Γ· : ^ : rM : U ’- ; O : ý : :t.· ‘g MíigiS .$ 1 H ·->. : *h : .? \ : « L :JS:W: i Rl i 1 i třU ,... ii - II U <“ M X irt Z. iU

t MR

tf

tf

tf

kí

tf

tf

tf

tf

K

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

tf

mo

&

k!

k!

tf

tf

u ϋ

Q KQ

L1 ú <Ži tf

ϋ & U

§

CŮ ÍS

v H

u

ω KS l*i

u *4 y φ

u &

- 19CZ 2018 - 309 A3

Z tabulky vyplývá, že zvolením vhodné kombinace X - indikovaných genů je možné potvrdit/vyvrátit původ testovaných nádorových buněk, v našem případě cirkulujících nádorových buněk, a potvrdit tak jejich přítomnost v testovaném vzorku. S výhodou je, že v rámci jednoho vzorku bylo možné sledovat několik markérů najednou (až 30 genů z jedné frakce obohacené na CTC), což je výhodné oproti standardizovaným imunohistochemickým analýzám, kdy je možné použít maximálně do pěti protilátek.

Výroba DC-vakcíny na základě přítomnosti CTC

Příklad časového průběhu počtu CTC (plná čára), resp. váženého průměru počtu CTC (tečkovaná čára) (oba údaje na svislé ose) je ukázán na obr. 2.

CTC zachycené na filtrační membráně ze vzorku periferní krve se dále specifikují. Odběr krve a izolace CTC se provádí v intervalech čtyř týdnů (ukázáno jako body na plné čáře). Intervaly jsou upraveny dle typu terapie, kterou aktuálně pacient podstupuje (personalizace intervalů odběrů). Při zvýšeném počtu CTC v krve je z izolovaných CTC (např. v týdnu 12 na obr. 2) ihned připravena a aplikována vakcína (znázorněno injekční stříkačkou). Následně po vakcinaci je předpoklad poklesu CTC, avšak při kontrolním odběru v týdnu 36 se opět objeví CTC indikující případný relaps. Postup izolace novodetekovaných CTC a přípravy nové vakcíny a její aplikace jsou provedeny následně (týden 36). Opakované testování vzorků periferní krve umožňuje sledování dynamiky CTC v čase ve smyslu nárůstu/poklesu počtu CTC a změny/stability jejich vlastností.

Monitorování změn CTC v průběhu probíhající neoadjuvantní terapie

Monitorování změn CTC v průběhu probíhající neoadjuvantní terapie u karcinomu prsu ukazuje obr. 6. (dosud nezveřejněný článek původců vynálezu (57)). Specifikace nádorového onemocnění u pacientky jsou uvedeny v tabulce na obrázku. Exprese genů v CTC, pokud CTC byly detekovány (CTC+) je znázorněna pod časovou osou, spolu se změnami ve velikosti primárního tumoru v čase. Na obr. 6:

FEC Fluorouracil, Epirubicin, Cyclofosfamid, RT - radioterapie, BCF - Prsní žlázu zachovávající chirurgie, SLNB - biopsie sentinelové uzliny, IDC - invazivní duktální karcinom, G - grade tumoru, Testované geny: markéry kmenových buněk CD24, CD44, ALDH1, VIM, markéry epiteliálních buněk: EPCAM, MUC1, markéry pro terapii: HER2, ESR, geny asociované s chemorezistencí: MRP1, MRP2 MRP4, MRP5, MRP7, MDR1, ERCC1.

Případová studie prezentovaná na obr. 6 dokumentuje průběh změn na úrovni přítomnosti a charakteru CTC, ve vztahu k aktuálním klinicko-patologickým charakteristikám a podávané léčbě. Z uvedených dat je důležité v souvislosti s charakterem CTC a připravovanou DCvakcínou zdůraznit několik zajímavých výsledků.

Vzhledem k typu a pokročilosti nádorového onemocnění v čase diagnózy (07/2015) byla u pacientky s karcinomem prsu (histotyp: triple-negativní, TNBC - triple negative breast cancer) indikována neoadjuvatní léčba typu FEC (FEC Fluorouracil, Epirubicin, Cyclofosfamid), V průběhu léčby byl monitorován úbytek nádorové hmoty pomocí sonografického vyšetření a také byla sledována přítomnost CTC a jejich vlastností. Navzdory probíhající léčbě byl tumor i po pěti měsících stále přítomný. Paralelně s probíhajícími sono-kontroloním vyšetřením byly ve vzorcích krve detekovány CTC. Analýzou genové exprese CTC se zjistilo, že jejich vlastnosti se v průběhu léčby mění. Jedná se o změny jak na úrovni tumor-asociovaných genů, tak i na úrovni genů asociovaných s chemorezistencí (změny v genech MRP1, MRP2, MRP4, MRP5, MRP7, MDR1, ERCC1). V období postoperačním a po radioterapii (RT) CTC nebyly detekovány (CTC). Následně došlo opět k jejich výskytu i navzdory podávané chemoterapii (capecitabin). Z uvedeného plyne, že CTC se mění v čase a je zásadní na tyto změny reagovat změnou léčby u konkrétního pacienta.

-20CZ 2018 - 309 A3

i. c Molekulární charakterizace cirkulujících nádorových buněk - mutační analýza pomocí NGS

Potvrzení nádorového původu buněk bylo dále provedeno mutační analýzou pomocí NGS (Next Generation Squencing, Sekvenování nové generace GeneReader™, Oiagen) pro panel 12 genů (QIaAct Clinical Insight Tumor Panel™, Qiagen) s cílem identifikace nových epitopů potenciálně prezentabilních přes DC. Testovací panel QiaAct nabízí sekvenační analýzu 1250 mutací ve dvanácti nej častěji mutovaných genech asociovaných s nádorovým procesem pomocí NGS, analýza mutací v genu KRAS, NRAS, ERBB2, ERBB3, KIT, ALK, PDGFR, EGFR, BRAF, PI3KCA, RAF2. Výsledky sekvenační analýzy jsou automaticky zhodnoceny pomocí software QIA-Analyse a interpretovány pomocí QIA- Interpreter (Qiagen - Ingenuity). Centrální databáze mutací pro porovnání sekvenačních dat mezi laboratořemi umožňuje minimalizovat chyby v datové analýze a standardizovat ji.

Na základě získaných výsledků byla v primárním tumoru u pacientky s kolorektálním karcinomem doložena přítomnost mutace v kodonu 13 genu KRAS. V CTC mutace v kodonu 13 zjištěna nebyla, byly však zjištěny mutace v kodonech 14 a 45. Protokol výsledků vzhledem k rozsáhlosti dat není přiložen. Obdobná zjištění jsou reportována také v publikacích (4,5).

ii. Kultivace DC s monitorováním buněčné viability ii.a. Izolace a maturace PC.

DC byly generovány ex vivo z mononukleámích buněk periferní krve (PBMC). PBMC byly separovány standardním způsobem na hustotním gradientu (Histopaque 1077, SigmaAldrich). Po promytí odseparovaného prstence buněk standardizovaným pufirem (zde použit PBS, phosphate buffer saline - fosfátový pufr, Lonza) byly monocyty (10⁶-10⁷) izolovány adherencí PBMC buněk k povrchu kultivačního plastu (Coming) (10⁶ buněk) v médiu RPMI 1640 (SigmaAldrich) po dobu přibližně 1,5 - 3 h. Neadherované buňky byly z kultivační láhve odstraněny spolu s médiem (objem 12 ml). Tento tzv. supernatant je možné využít dále jednak jako zdroj případných Tbuněk. Po centrifugaci a přemytí získaných buněk je možné uchovávat tuto buněčnou frakci zamraženou (-20°C). Dále, filtrací supematantu (12 ml, nebo alikvotní objemy) přes separační membránu je možné získat další CTC a to zejména u pacientů s pokročilým nádorovým onemocněním. Separované CTC jsou dále kultivovány in vitro jak již bylo popsáno v bodu i a.

Nezralé DC (immature DC, imDC) byly následně diferencovány po dobu 4 dnů (37 °C, 5% CO2) v růstovém médiu RPMI 1640 (SigmaAldrich). Podobně je možné použít média typu Cellgrow (Cellgenix), Mo-DC Differentiation Medium (Miltenyi Biotech)). Růstové médium bylo doplněné interleukinem IL-4 (2500 U/ml) a růstovým faktorem GM-CSF (20 ng/ml) a buňky byly kultivovány po dobu 4 dnů. Následně, v poměru 5:1 (lOxlO² DC:2xl0² nádorových buněk CTC ve formě lyzátu) byly buňky kultivovány v 96 jamkové destičce (37 °C, 5% CO2, 24-48 h). Ke kontrolní populaci DC byl přidán DC Poly(EC) (VacciGrade™ InvivoGen) v koncentraci 25 pg/ml.

Testováním přítomnosti markérů (zejména klastrů diferenciace - CD) pomocí qPCR (viz protokol testování kvality DC pomocí qPCR v tabulce 2) jsme prokázali proběhlý proces maturace DC a to zejména signifikantně zvýšenou hladinou HLA-DR na buňkách v DC-kultuře v porovnání s kontrolním leukocytámím základem (tzv. white blood cells - WBC) izolovaným z periferní krve při úvodním (odběr krve pro izolaci PBMC a/nebo CTC) zpracovávání periferní krve. Standardní provedení qPCR je podrobně popsáno v publikacích (50, 56, 57). Zkráceně, RNA byla izolována z buněk (monocytámí frakce) odebíraných v průběhu kultivace den 0, 2, 3, 4, 5. cDNA byla generována pomocí High capacity RNA to cDNA kitu® (Themofisher), testování genové exprese proběhlo dle protokolu použitím TaqmanFast Advanced Master Mixu® (reakční chemie Themofisher), na přístroji Cobas 4800 (Roche). Kontrolními geny pro testovanou frakci byly ACTB, CD45, CD68. Protokol pro testování kvality produkovaných a zejména o testování

-21 CZ 2018 - 309 A3 úrovně genové exprese aktivovaných DC byl vytvořen na základě publikovaných dat skupiny Castiello et al. (37).

V následující tabulce je ukázán specifický panel testovaných genů. Přítomnost minimálně 5 některých, maximálně všech těchto genů ukazuje dobrou kvalitu generovaných DC.

Tabulka. 2 Vybrané ukazatele kvality (markéry stability a potence) DC buněk testované pomocí genové exprese (qPCR)

	Nasev genu	Zhsčem Unicode	Zkmka	Táíjmss RtóW
1	: chemoíkm (C-C moíív) ligand 1 (CCLiXrtiRNA..		CCL1
•7	títemokm (CK mot i podobaý 1 (CCRL1), wraasta X siRNA,	Hs.724744	CCRL1	Netěstovátio
1	mofefah CD80 (CD89X mRNA,		aw	HsfWSTM ml
4..	mofeteb CB70 (W70), aRNA	Hg. 501497	€070
5.	molekula CD83KD83). mRNA.	Hs. 595133	€083
0,	molekuh CDSŮKDSbk mRNX	007Π82	CDM
7,	molekula HLA-DR (HLA-DRA), mRNA, řetžkec		HLÁ- DR |
S..		SkW447	KAMI	HWU4S3Ž m1
9.	protem 27 (IH27), tmmkxipt vadstóa 2, mRNA.	&.5W34	>127
H)..	mmoravý· aetootíeký fšifctoa Mfein&tkevasý-proiem 6 (TNTAIP6), mRNA.	Hs.,437322	TNT AI PO

ii.b. Test viability DC

Viabilita buněk byla stanovena barvením ReadyProbes® Cell Viability Imaging Kit 15 (Blue/Green), (Thermofisher). ReadyProbes® Cell Viability Image Imaging Kit (Modrá/Zelená) je test připravený k použití, který umožňuje rychle a snadno určit životaschopnost buněk. Použitím stabilního reakčního činidla NucBlue® Live (Hoechst 33342) a činidla NucGreen® Dead podle protokolu výrobce na 1 ml růstového média (např. RPMI 1640) poté byla určována

-22CZ 2018 - 309 A3 životaschopnost počítáním živých a mrtvých buněk. NucBlue® Live reaguje s jádry všech buněk a může být detekováno standardním filtrem DAPI (blue fluorescent protein, BFP - modrá). NucGreen® Dead reaguje pouze s jádry buněk s narušenou integritou plazmatické membrány a detekuje je pomocí standardní filtrační sady FITC / (green fluorescent protein, GFP - zelená). Tato kombinace je vhodná pro stanovení vitality fluorescenční mikroskopii, případně průtokovou cytometrií.

iii. Příprava buněčného lyzátu CTC a aktivace DC

Pro přípravu buněčného lyzátu cirkulujících nádorových buněk v našich experimentech byly použity níže popsané metody iii.a- iii.c.

iii.a. Lýza buněk pomocí lyzačních pufrů

Pro buněčnou lýzu a udržení RNA stability byl použit roztok BSA (1-4 mg/ml, Fermentas); k výrobě roztoku byla použita RNAse free voda. Na jednu buňku se počítá s roztokem 5 μΐ, tzn. úměrně k tomu, bylo upraveno lyžování většího počtu buněk (55). Cirkulující nádorové buňky byly přeneseny na separační (kultivační) membráně s velikostí pórů 7 - 10 pm (MetaCell™) do lyzačního roztoku (500 pl) ve zkumavce Eppendorf (1,5 ml). Přítomnost nelyžovaných buněk pro kontrolu správného procesu lýzy byla provedena po vyjmutí membrány z lyzačního roztoku. Membrána byla barvena zrychleným May - Gruenwaldovým protokolem barvení. Po 15 minutách nebyly na membráně přítomny žádné kompaktní buňky. Koncentrace RNA nebyla měřena, množství lyzačního roztoku bylo upraveno dle počtu přítomných CTC buněk dokumentovaných v průběhu cytomorfólogické analýzy.

iii.b. Lýza buněk pomocí zmrazení a rozmražení

Metoda zmrazení a rozmrazování se běžně používá k lýze bakteriálních a savčích buněk. Technika zahrnuje zmrazení buněčné suspenze v lázni nebo mrazicím zařízení na suchém ledu/ethanolu a poté rozmražení materiálu při pokojové teplotě nebo teplotě 37°C (min Ih). Tento způsob lýzy způsobuje, že se buňky nafouknou a nakonec se rozpadají v důsledku procesu tvorby ledových krystalů během zmrazení, a jejich smíchání během rozmrazování. Pro efektivní lýzu je zapotřebí více cyklů a proces může být poměrně dlouhý. Ukázalo se však, že zmrazení/rozmrazování účinně uvolňuje proteiny umístěné v cytoplazmě savčích buněk.

iii. c. Lyzační protokol GentleMACs©

Cirkulující nádorové buňky byly přeneseny na separační (kultivační membráně MetaCell™ do homogenizační zkumavky typu C (Miltenyi) a mechanicky rozrušeny pomocí GentleMACS ™ Dissociator (Miltenyi) pomocí nainstalovaného softwarového programu m_spleen04. Buněčná suspenze byla centrifiigována při 1000 x g po dobu 10 minut. Peleta byla resuspendována v PBS, přemístěna do zkumavky typu M (Miltenyi) a lyžována pomocí GentleMACS ™ Dissociator pomocí programu protein_01. Suspenze byla přefiltrována přes filtr 70 pm a 30 pm, poté sonikována po dobu 30 minut nebo/a lyžována pomocí lyzačního pufru BSA.

Pro všechny metody byl zaveden test přítomnosti živých nádorových (trypan blue exlusion assay). V případě stále přítomných životaschopných buněk, byly provedeny další lyzační kroky a mrazení, rozmražení až do dosažení 0% životaschopnosti. Koncentraci proteinů v lyzátu je možné stanovit pomocí standardizovaného testu s kyselinou bicinchoninovou (BCA) (Pierce Biotechnology/Thermo Fisher Scientific, USA) podle pokynů výrobce.

iv. Testování funkce aktivovaných DC iv.a. Test fagocytózy

-23CZ 2018 - 309 A3

Funkčnost generovaných DC byla prokázána směrovou migrací a schopností fagocytózy. Fagocytámí schopnost byla testována pomocí pHrodo® Green Zymosan A BioParticles® konjugátů pro fagocytózu (Thermofisher, USA): Buňky byly opláchnuty lx roztokem pro živé buňky a ošetřeny suspenzí konjugátu pHrodo™ Green Zymosan A BioParticles® konjugát v živém buněčném zobrazovacím roztoku v koncentraci 1 mg/ml. Buňky byly inkubovány po dobu 90 minut při 37 °C. Jádra byla obarvena NucBlue® Live Cell Stain. Zobrazení aktivních fagozomů je možné díky fluorescenci pHrodo částic ve fagozomech DC-buněk kultivovaných z monocytů v in vitro kultuře jak je vidět obr. 7, kde fagozomy jsou zobrazeny světlé na tmavém pozadí. Měřítko reprezentuje 10 pm.

v. Aktivace DC lyzátem CTC-buněk nebo RNA

Ke kultuře kultivovaných DC-buněk byly přidány antigeny CTC v různých formách (A= lyzát CTC a B=RNA).

AI. celkový buněčný lyzát CTC vytvořen dle protokolu iii.a.

A2. celkový buněčný lyzát CTC vytvořen dle protokolu iii.b.

A3, celkový buněčný lyzát CTC vytvořen dle protokolu iii.c.

Kvantita buněčného lyzátu byla vztažena k počtu detekovaných CTC na separační membráně (počet izolovaných CTC se pohyboval v rozmezí 100 - 150 buněk). Vzorky s početnějším zastoupením CTC byly uskladněny (-20°C) pro další testování.

B. RNA izolována z obohacené frakce CTC-buněk byla v různých koncentracích (100, 250, 500, 750 a 1000 ng RNA) v H₂O přidána přímo ke kultuře DC- buněk. Koncentrace a čistota RNA byla měřena pomocí spektrofotometru (NanoDrop).

v.a. Test produkce IFNy u aktivovaných T- buněk

V rámci potvrzení indukce imunitní odpovědi aktivovanými DC (tedy DC, které byly vystavené antigenům CTC - přidání CTC lyzátů k DC buňkám) byl proveden test, kdy za standardizovaných podmínek (RPMI, 37°C, 5% CCL) byly autologní T-buňky pacienta vystaveny aktivovaným DC-buňkám.

T-buňky byly získány z frakce neadherovaných polymorfonukleámích buněk, nebo přímou izolací pomocí imunomagnetické separace (anti CD4, anti CD8, Dynabeads, Invitrogen)

Stručně, T-buňky (autologní nebo/a neautologní) byly vystaveny krátkodobé (24h) kultivaci s aktivovanými DC buňkami (DC buňky imunizovány antigeny CTC v různých formách jak je popsáno výše). Kultivační médium, ve kterém probíhá společná kultivace, bylo odebírané v čase a zamraženo pro pozdější testování exprese cytokinů, zejména INFy, standardizovaným testem ELISA. Kalibrační křivka hodnot IN Fy umožňuje pak určit optimální množství buněk a dobu potřebnou k imunizaci.

Očekávalo se frekventní dělení T-buněk, které by odpovídalo tzv. klonální expanzi na podnět DC-buněk. Klonální expanze v naší krátkodobé kultivaci (24h) nebyla potvrzena, avšak aktivace T-buněk byla potvrzena zvýšenou produkcí IFN-γ v T-buňkách, a to analýzou genové exprese odebíraných T-buněk odebíraných v čase 8-16-24 h (test genové exprese byl proveden za standardních podmínek qPCR s použitím qPCR chemie TaqMan Fast Advanced Master mixu a sond: ACTB (Hs01060665_gl ), CD45 (Hs04189704_ml ) a IFNy (Hs00989291_ml ) CD4 (Hs01058407_ml ), CD8 (Hs00233520_ml ) (www. thermofisher.com)

v.b. Test aktivace T-buněk pomocí DC- buněk - testování genové exprese na úrovni mRNA

Test probíhal obdobně jako test popsaný v bodě v.a, k určení stupně aktivace bylo však použito analýzy genové exprese T-buněk. Stručně, z aktivovaných T-buněk byla izolována mRNA a testována na přítomnost genů aktivační kaskády, zejména IFNy, TNFa, ΝΕκβ-komplexu,

-24CZ 2018 - 309 A3 případně dalších molekul, které vznikají v aktivační řadě signálních drah. Jako kontrolní geny byly použity ACTB a CD45. Ke zhodnocení relativního množství RNA byla použita metoda relativní kvantifikace podle Livaka el al (36). Výpočet se opírá o hodnoty naměřené pomocí qPCR (tzv. Quantification Cycles - Cq) a porovnává je jak vůči kontrolním genům ve vzorci, tak mezi kontrolními skupinami vzorků na základě rozdílných hodnot Cq pro kontrolní gen a sledovaný gen, tzv. target.

Průmyslová využitelnost

Vynález poskytuje personalizované imunoterapeutické protinádorové vakcíny použitelné v onkologii, jejichž výrobu a podávání lze na základě monitorování pacienta přesně načasovat a zajistit, aby protinádorová imunitní odpověď byla zaměřená právě proti nádorovým buňkám, které se v tomto čase v organismu začínají šířit, a případně by mohly vytvořit metastázy.

Literatura

1. Anguille S, Smits EL, Lion E, van Tendeloo VF, Berneman ZN. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 2014 Jun;15(7):e257-67. doi: 10,1016/S1470-2045(13)705850.

2. Tagliamonte M, Petrizzo A, Tornesello ML, Buonaguro FM, Buonaguro L. Antigen-specific vaccines for cancer treatment. Hum Vaccin Immunother. 2014;10(l 1):3332-46. doi: 10,4161/21645515,2014,973317.

3. Brtnicky T, Podrazil M, Bartunkova J, Spíšek R, Rob L. Aktivní buněčná imunoterapie karcinomu ovaria pomocí dendritických buněk Česka Gynekol. 2012 Jun;77(3):215-20.

3a. CZ20160U1

4. Yu Ml, Bardia A2, Aceto N3, Bersani F3, Madden MW3, Donaldson MC3, Desai R3, Zhu H3, Comaills V3, Zheng Z4, Wittner BS3, Stojanov P5, Brachtel E6, Sgroi D7, Kapur R8, Shioda T2, Ting DT2, Ramaswamy S2, Getz G9, lafrate AJ7, Benes C2, Toner M10, Maheswaran Sil, Haber DA12. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 2014 Jul 11 ;345(6193):216-20. doi: 10.1126/science. 1253533.

5. De Luca F, Rotunno G, Salvianti F, Galardi F, Pestrin M, Gabellini S, Simi L, Mancini I, Vannucchi AM, Pazzagli M, Di Leo A, Pinzani P. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. 2016 May 3;7(18):26107-19. doi: 10.18632/oncotarget.843L

6. Dawood S, Broglio K, Valero V, Reuben J, Handy B, Islam R, Jackson S, Hortobagyi GN, Fritsche H, Cristofanilli M. irculating tumor cells in metastatic breast cancer: from prognostic stratification to modification of the staging system? Cancer. 2008 Nov 1;113(9):2422-30. doi: 10.1002/cncr.23852.

7. Steinman RM. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu Rev Immunol 2012; 30:1-22.

8. Blum JS, Wearsch PA, Cresswell P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol 2013;31:443-473.

9. Segura E, Amigorena S. Cross-presentation in mouse and human dendritic cells. Adv Immunol 2015; 127:1-31.

-25CZ 2018 - 309 A3

10. Nair-Gupta P, Baccarini A, Tung N, et al. TLR signals induce phagosomal MHC-I delivery from the endosomal recycling compartment to allow cross-presentation. Cell 2014; 158:506-521.

11. Benvenuti F. The dendritic cell synapse: a life dedicated to T cell activation. Front Immunol 2016

12. Roberts EW, Broz ML, Binnewies M, et al. Critical role for CD103+/CD141+dendritic cells bearing CCR7 for tumor antigen trafficking and priming of T cell immunity in melanoma. Cancer Cell 2016; 30:324-336

13. Gerner MY, Torabi-Parizi P, Germain RN. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity 2015; 42:172-185.

14. Villani AC, Satija R, Reynolds G, Sarkizova S, Shekhar K, Fletcher J, Griesbeck M, Butler A, Zheng S, Lazo S, Jardine L, Dixon D, Stephenson E, Nilsson E, Grundberg I, McDonald D, Filby A, Li W, De Jager PL, Rozenblatt-Rosen O, Lane AA, Haniffa M, Regev A, Hacohen N. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 2017 Apr 21;356(6335).

15. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol 2004;22:329-360

16. Dhodapkar MV, Steinman RM, Sapp M, et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J Clin Invest 1999; 104:173-180.

17. Constantino J, Gomes C, Falcao A, Cruz MT, Neves BM. Antitumor dendritic cell-based vaccines: lessons from 20 years of clinical trials and future perspectives. Transl Res 2016; 168:74—95

18. Langenkamp A, Messi M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming of TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nat Immunol 2000; 1:311-316

19. O'Neill D, Bhardwaj N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol Med 2005; 109:97-112.

20. Nair SK, Morse M, Boczkowski D, et al. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells. Ann Surg 2002; 235:540-549.

21. Muller MR, Tsakou G, Grunebach F, Schmidt SM, Brossart P. Induction of chronic lymphocytic leukemia (CLL)-specific CD4- and CD8-mediated T-cell responses using RNAtransfected dendritic cells. Blood 2004; 103:1763-1769

22. Nencioni A, Muller MR, Grunebach F, et al. Dendritic cells transfected with tumor RNA for the induction of antitumor CTL in colorectal cancer. Cancer Gene Ther 2003; 10:209-214

23. Milazzo C, Reichardt VL, Muller MR, Grunebach F, Brossart P. Induction of myelomaspecific cytotoxic T cells using dendritic cells transfected with tumor-derived RNA. Blood 2003; 101:977-982

24. Gilboa E, Vieweg J. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev 2004; 199:251-263.

-26CZ 2018 - 309 A3

25. Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Coleman DM, Dahm P, Vieweg J. Human dendritic cells transfected with renal tumor RNA stimulate polyclonal T-cell responses against antigens expressed by primary and metastatic tumors. Cancer Res 2001; 61:3388-3393.

26. Strobel I, Berchtold S, Gotze A, Schulze U, Schuler G, Steinkasserer A. Human dendritic cells transfected with either RNA or DNA encoding influenza matrix protein Ml differ in their ability to stimulate cytotoxic T lymphocytes. Gene Ther 2000; 7:2028-2035.

27. Koido S, Kashiwaba M, Chen D, Gendler S, Kufe D, Gong J. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. J Immunol 2000; 165:5713-5719.

28. Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors. J Clin Invest 2002;109:409-417

29. Fujiwara S, Wada H, Miyata H, et al. Clinical trial of the intratumoral administration of labeled DC combined with systemic chemotherapy for esophageal cancer. J Immunother 2012; 35:513-521.

30. Lesterhuis WJ, de Vries IJ, Schreibelt G, et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients. Clin Cancer Res 2011; 17:5725-5735.

31. Draube A, Klein-Gonzalez N, Mattheus S, et al. Dendritic cell based tumor vaccination in prostate and renal cell cancer: a systematic review and meta-analysis. PLoS One 2011; 6:el8801.

32. Carreno BM, Becker-Hapak M, Huang A, et al. IL-12p70-producing patient DC vaccine elicits Tcl-polarized immunity. J Clin Invest 2013; 123:3383-3394

33. Scandella E, Men Y, Gillessen S, Forster R, Groettrup M. Prostaglandin E2 is a key factor for CCR7 surface expression and migration of monocyte-derived dendritic cells. Blood 2002; 100:1354-1361.

34. Krause P, Bruckner M, Uermosi C, Singer E, Groettrup M, Legler DF. Prostaglandin E(2) enhances T-cell proliferation by inducing the costimulatory molecules OX40L, CD70, and 41BBL on dendritic cells. Blood 2009; 113:2451-2460.

35. Ma DY, Clark EA. The role of CD40 and CD154/CD40L in dendritic cells. Semin Immunol 2009;21:265-272

36. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8.

37. Castiello L, Sabatino M, Zhao Y, Tumaini B, Ren J, Ping J, Wang E, Wood LV, Marincola FM, Puri RK, Stroncek DF. Quality controls in cellular immunotherapies: rapid assessment of clinical grade dendritic cells by gene expression profiling. Mol Ther. 2013 Feb;21(2):476-84. doi: 10.1038/mt.2012.89. Epub 2012 Nov 13. Erratum in: Mol Ther. 2013 Feb;21(2):495.

38. Breton G, Lee J, Zhou YJ, et al. Circulating precursors of human CDlc+ and CD141+ dendritic cells. J Exp Med 2015; 212:401-413.

39. Boullart AC, Aarntzen EH, Verdijk P, et al. Maturation of monocyte-derived dendritic cells with toll-like receptor 3 and 7/8 ligands combined with prostaglandin E2 results in high interleukin-12 production and cell migration. Cancer Immunol Immunother 2008; 57:1589-1597.

-27CZ 2018 - 309 A3

40. Mailliard RB, Wankowicz-Kalinska A, Cai Q, et al. α-type-l polarized dendritic cells: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res 2004; 64:59345937.

41. Lee JJ, Foon KA, Mailliard RB, Muthuswamy R, Kalinski P. Type 1-polarized dendritic cells loaded with autologous tumor are a potent immunogen against chronic lymphocytic leukemia. J Leukoc Biol 2008; 84:319-325.

42. Okada H, Kalinski P, Ueda R, et al. Induction of CD8+ T-cell responses against novel glioma-associated antigen peptides and clinical activity by vaccinations with α-type 1 polarized dendritic cells and polyinosinic-polycytidylic acid stabilized by lysine and carboxymethylcellulose in patients with recurrent malignant glioma. J Clin Oncol 2011; 29:330336.

43. Chiang CL, Kandalaft LE, Tanyi J, et al. A dendritic cell vaccine pulsed with autologous hypochlorous acid-oxidized ovarian cancer lysate primes effective broad antitumor immunity: from bench to bedside. Clin Cancer Res 2013; 19:4801-4815

44. Alix-Panabiěres C, Pantel K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin Chem. 2013 Jan;59(l): 110-8. doi: 10,1373/clinchem.2O12,194258. Epub 2012 Sep 26.

45. Kolostova K, Zhang Y , Hoffman RM, Bobek V.: In vitro culture and characterization of human lung cancer circulating tumor cells isolated by size exclusion from an orthotopic nudemouse model expressing red fluorescent protein. J of Fluorescence, 2014 Sep;24(5):1531-6 , IF: 1,667

46. Bobek V, Matkowski R, Gtirlich R, Grabowski K, Szelachowska J, Lischke R, Schtitzner J, Harustiak T, Pazdro A3, Rzechonek A , Kolostova K Cultivation of circulating tumor cells in esophageal cancer. Folia Histochem Cytobiol. 2014;52(3):171-7., IF: 1,00

47. Kolostova K, Cegan M, Bobek V. Circulating tumor cells in patients with urothelial tumors: Enrichment and in vitro culture. CUAJ-Canadian Urological Association Journal, Can Urol Assoc J 2014;8(9-10):, IF: 1,92

48. Kolostova K, Spicka J, Matkowski R, Bobek V. Isolation, primary culture, morphological and molecular characterization of circulating tumor cells in gynecological cancers. Am J Transl Res. 2015,17:1203-13. , IF: 3,65

49. Kolostova K, Matkowski M, Jcdryka M, Soter K, Cegan M, Pinkas M, Pavlasek J, Spicka J, Bobek V: The Added value of circulating tumor cells examination in ovarian cancer staging of ovarian cancer. Amer J of Cancer Res, 2015, 15;5(11):3363-75. IF: 4,165

50. Kolostova K, Pinkas M, Jakabova A, Pospíšilova E, Svobodova P, Spicka J, Cegan M, Matkowski R, Bobek V. Molecular characterization of circulating tumor cells in ovarian cancer. Am J Cancer Res. 2016 May l;6(5):973-80.

51. Islam S, Kjallquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, Lonnerberg P, et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Res (2011) 21:1160—710,1101/gr.l 10882,110

52. Ramskold D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR, et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol (2012) 30:777-8210,1038/nbt.2282

-28CZ 2018 - 309 A3

53. Bengtsson M, Hemberg M, Rorsman P, Stahlberg A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Mol Biol (2008) 9:63,10,1186/1471-2199-9-63

54. Marshall LA, Wu LL, Babikian S, Bachman M, Santiago JG. Integrated printed circuit board device for cell lysis and nucleic acid extraction. Anal Chem (2012) 84:9640510,1021/ac302622v

55. Svec D, Andersson D, Pekny M, Sjóback R, Kubista M, Stahlberg A.Direct cell lysis for single-cell gene expression profiling. Front Oncol. 2013 Nov 7;3:274.

56. Kolostova K, Spicka J, Matkowski R, Bobek V. Isolation, primary culture, morphological and molecular characterization of circulating tumor cells in gynecological cancers. Am J Transl Res. 2015 Jul 15;7(7): 1203-13. eCollection 2015.

57. Bielčiková Z., Jakabová A, Pinkas M, Zemanová M, Kološtová K, Bobek V: Circulating tumor cells: what we know, what do we want to know about them and are they ready to be used in clinics? Am J Transl Res 2017;9(6): XXX-XXXwww.ajtr.org /ISSN:19438141/AJTR0055749

58. Nair S, Archer GE, Tedder TF. ISOLATION AND GENERATION OF HUMAN DENDRITIC CELLS. Current protocols in immunology / edited by John E Coligan . [et al]. 2012;0 7:Unit7.32. doi:10.1002/0471142735. im0732s99.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (33)

1. Autologní vakcína na bázi viabilních autologních dendritických buněk pro indukci imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám, kde vakcína obsahuje jako účinnou složku vlastní antigeny z pacienta, vyznačující se tím, že tyto antigeny pocházejí z autologních cirkulujících nádorových buněk, CTC, aktuálně izolovaných z periferní krve pacienta

2. Autologní vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktuálně izolovanými cirkulujícími nádorovými buňkami jsou navíc CTC izolované ze supernatantu z neadherentní monocytární frakce buněk periferní krve po 1,5 - 3h inkubaci v kultivačním médiu.

3. Autologní vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že aktuálně izolovanými cirkulujícími nádorovými buňkami jsou CTC izolované filtrací z krve na separační membráně s velikostí pórů 5-12 pm.

4. Autologní vakcína podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že aktuálně izolovanými cirkulujícími nádorovými buňkami jsou viabilní CTC.

5. Autologní vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že navíc k antigenům pocházejícím z autologních CTC obsahuje antigeny pocházející z autologních diseminovaných nádorových buněk, DTC, aktuálně izolovaných z tělních tekutin pacienta.

6. Autologní vakcína podle nároku 5, vyznačující se tím, že aktuálně izolovanými diseminovanými nádorovými buňkami jsou DTC izolované filtrací tělní tekutiny na separační membráně s velikostí pórů 5-12 pm.

7. Autologní vakcína podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že aktuálně izolovanými diseminovanými nádorovými buňkami jsou viabilní DTC

-29CZ 2018 - 309 A3

8. Autologní vakcína podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že nádorovými buňkami jsou buňky obohacené filtrací založenou na velikosti buněk a/nebo pomnožené krátkodobou 3- až 5denní a/nebo dlouhodobou 5- až 21 denní kultivací in vitro, výhodně v kultivačním médiu bez přídavku séra a/nebo s přídavkem autologního séra pacienta a/nebo jednoho nebo více jiných obvyklých růstových faktorů.

9. Autologní vakcína podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že antigeny pocházející z autologních CTC jsou imunitnímu systému prezentované jimi aktivovanými autologními viabilními in vitro maturovanými dendritickými buňkami.

10. Autologní vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že antigeny pocházející z autologních DTC jsou imunitnímu systému prezentované jimi aktivovanými autologními viabilními in vitro maturovanými dendritickými buňkami.

11. Autologní vakcína podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že dendritickými buňkami jsou dendritické buňky vyprodukované kultivací in vitro z monocytámí frakce buněk periferní krve odebrané již před nebo v době stanovení diagnózy pacienta, výhodně před zahájením chemoterapie, radioterapie, biologické nebo operační léčby.

12. Autologní vakcína podle kteréhokoli z nároků 9 až 11, vyznačující se tím, že dendritickými buňkami jsou dendritické buňky vyprodukované kultivací in vitro monocytů, získaných separací z monocytámí frakce buněk periferní krve na separační membráně s velikostí pórů 7-10 pm.

13. Autologní vakcína podle některého z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje dendritické buňky aktivované in vítr o pomocí antigenů z cirkulujících nádorových buněk a/nebo pomocí antigenů z diseminovaných nádorových buněk.

14. Použití autologních cirkulujících nádorových buněk aktuálně izolovaných z periferní krve pacienta jako zdroje antigenů, pro výrobu autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti aktuálně přítomným nádorovým buňkám pacienta.

15. Použití podle nároku 14, kde se pro další posílení imunitní odpovědi navíc použijí antigeny autologních diseminovaných nádorových buněk aktuálně izolovaných z tělních tekutin pacienta.

16. Použití podle nároku 14 nebo 15, kde navíc se pacientovi v určených časových intervalech odebírají vzorky periferní krve, ve kterých se ex vivo testuje přítomnost CTC a/nebo jejich citlivost na autologní vakcínu vyrobenou aktuálně pro dřívější časový bod, a příprava autologní vakcíny vyrobené aktuálně pro pozdější časový bod se zahájí, je-li počet izolovaných CTC pro pozdější časový bod o významný rozdíl vyšší než jejich určený mezní počet a/nebo počet izolovaných CTC pro dřívější časový bod, vždy vztaženo na stejný objem krve.

17. Použití podle kteréhokoli z nároků 14-16, kde navíc se pacientovi v pravidelných časových intervalech odebírají vzorky tělních tekutin, ve kterých se ex vivo testuje přítomnost DTC a/nebo jejich citlivost na autologní vakcínu vyrobenou aktuálně pro dřívější časový bod.

18. Způsob přípravy autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám, kde vakcína obsahuje jako účinnou složku vlastní antigeny z pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

a) poskytne se aktuální vzorek periferní krve pacienta v daném čase

b) provede se izolace z aktuálního vzorku periferní krve viabilních autologních cirkulujících nádorových buněk, CTC;

c) s CTC z kroku b) se provede krok zvolený ze skupiny: atenuace, příprava lyzátu, příprava izolovaných částí, příprava z nich odvozených exozomů, a/nebo příprava z nich izolované RNA;

-30CZ 2018 - 309 A3

d) aktuálně v kroku c) připraveným materiálem, nebo materiálem připraveným v kroku c) dříve, je-li k dispozici, se aktivují dendritické buňky.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že jako dendritické buňky v bodě d) se použijí dendritické buňky vyprodukované kultivací in vítr o z monocytámí frakce buněk odebrané již před nebo v době stanovení diagnózy pacienta, zejména před zahájením chemoterapie, radioterapie, biologické nebo operační léčby.

20. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že se navíc provede jeden nebo více kroků, avšak vždy v dále uvedeném pořadí, zvolených ze skupiny:

- jako součást kroku b) se dále provede krok b^a), při kterém se alespoň část získaných CTC pomnoží a/nebo vyčistí krátkodobou 3- až 5denní a/nebo dlouhodobou 5- až 21 denní kultivací in vitro v živném médiu;

- jako součást kroku c) se dále provede krok c^a), při kterém se provede amplifikace RNA;

- jako součást kroku d) se dále provede krok d^a), při kterém se provede testování dostatečné maturace dendritických buněk pomocí testu na schopnost fagocytózy a/nebo analýzou genové exprese vybrané skupiny genů typických pro funkční DC;

- jako součást kroku d) se dále provede krok d^b), při kterém se vakcína ve formě aktivovaných DC prezentujících antigeny CTC uloží v alikvotech pro pozdější použití.

21. Způsob přípravy autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám, kde vakcína obsahuje jako účinnou složku vlastní antigeny z pacienta, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje následující kroky:

m) poskytne se aktuální vzorek tělních tekutin pacienta v daném čase

n) provede se izolace z aktuálního vzorku tekutin pacienta viabilních autologních diseminovaných nádorových buněk, DTC;

o) s DTC z kroku n) se provede krok zvolený ze skupiny: atenuace, příprava lyzátu, příprava izolovaných částí, příprava z nich odvozených exozomů, a/nebo příprava z nich izolované RNA;

p) aktuálně v kroku o) připraveným materiálem, nebo materiálem připraveným v kroku o) dříve, je-li k dispozici, se aktivují dendritické buňky.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že jako dendritické buňky v bodě p) se použijí dendritické buňky vyprodukované kultivací in vítr o z monocytámí frakce buněk odebrané již před nebo v době stanovení diagnózy pacienta, zejména před zahájením chemoterapie, radioterapie, biologické nebo operační léčby.

23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se navíc provede jeden nebo více kroků, avšak vždy v dále uvedeném pořadí, zvolených ze skupiny:

- jako součást kroku n) se dále provede krok n^a), při kterém se alespoň část získaných DTC pomnoží a/nebo vyčistí krátkodobou 3- až 5denní a/nebo dlouhodobou 5- až 21 denní kultivací in vitro v živném médiu;

- jako součást kroku o) se dále provede krok o^a), při kterém se provede amplifikace RNA;

- jako součást kroku p) se dále provede krok p^a), při kterém se provede testování dostatečné maturace dendritických buněk pomocí testu na schopnost fagocytózy a/nebo analýzou genové exprese vybrané skupiny genů typických pro funkční DC;

- jako součást kroku p) se dále provede krok p^b), při kterém se vakcína ve formě aktivovaných DC prezentujících antigeny DTC uloží v alikvotech pro pozdější použití.

24. Způsob monitorování pacienta pro určení, zda zahájit přípravu aktuální autologní vakcíny pro indukci imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám a/nebo na vznik, postup nebo rekurenci jeho nádorového onemocnění, kde vakcína obsahuje jako účinnou složku antigeny pocházející z buněk individuálního pacienta, či zda zahájit jinou diagnostiku nebo léčení, vyznačující se tím, že se

-31 CZ 2018 - 309 A3

a) poskytne aktuální vzorek periferní krve pacienta;

b) provede izolace z aktuálního vzorku periferní krve viabilních autologních cirkulujících nádorových buněk, CTC;

c) stanoví aktuální počet a/nebo charakter CTC;

d) stanovený aktuální počet CTC porovná se srovnávací hodnotou zvolenou z

i) určeného mezního počtu CTC;

ii) počtu CTC stanoveného dříve u alespoň jednoho předchozího odběru a izolace CTC podle bodů a) až c), je-li k dispozici;

e) popřípadě zahájí příprava aktuální autologní vakcíny, je-li aktuální počet izolovaných CTC o významný rozdíl vyšší než určený mezní počet podle bodu d) i), popřípadě než předchozí počet podle bodu d) ii), je-li charakter CTC významně odlišný oproti předchozímu odběru.

25. Způsob monitorování podle nároku 24, vyznačující se tím, že se po bodu b) stanoví účinnost dříve připravené vakcíny na izolované CTC, a v případě zjištění citlivosti buněk se vynechá krok e) přípravy nově aktuální autologní vakcíny.

26. Způsob monitorování podle nároku 24 nebo 25, vyznačující se tím, že se v bodech c) až e) namísto nebo navíc k počtu CTC použije k monitorování stanovení exprese alespoň jednoho markéru přítomného na CTC a/nebo alespoň jednoho s tumorem asociovaného markéru standardně používaného pro daný typ nádorové tkáně.

27. Způsob monitorování podle kteréhokoli z nároků 24 až 26, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje sledování přítomnosti antigenů specifických pro primární tumor.

28. Způsob monitorování podle kteréhokoli z nároků 24 až 27, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje sledování poměru množství volné DNA a mutované volné DNA ve vzorku krve, ve vztahu k počtu a/nebo charakteru CTC.

29. Způsob monitorování podle některého z nároků nároku 24 až 28, vyznačující se tím, že se u stejného pacienta provádí opakovaně, výhodně v pravidelných časových intervalech.

30. Způsob monitorování podle nároku 29, vyznačující se tím, že se alespoň v některých časových intervalech uskladní pro pozdější použití při imunizaci materiál, kterým je alespoň jeden člen zvolený ze skupiny cirkulující nádorové buňky, diseminované nádorové buňky; z těchto typů buněk odvozené antigeny.

31. Vakcína podle nároku 5 nebo 6, použití podle nároku 15 nebo 17, nebo způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že tělní tekutina je zvolená ze skupiny kostní dřeň; mozkomíšní mok; pleurální, perikardiální a synoviální výpotek; ascites; cefalická tekutina; nebo peritoneální výplach.

32. Vakcína podle některého z nároků 1, 5, 9, 10 nebo 13, použití podle nároků 14 nebo 15, nebo způsob podle některého z nároků 18, 21, 24, 27 nebo 30, vyznačující se tím, že antigen je ve formě zvolené ze skupiny: apoptické, lyžované, lyofilizované nebo usmrcené nádorové buňky; izolované části buněk vybrané z RNA, DNA a proteinů; z buněk uvolněné makrovezikuly, mikrovezikuly nebo exozomy.

33. Vakcína podle některého z nároků 1, 5, 9, 10 nebo 13, použití podle nároků 14 nebo 15, nebo způsob podle některého z nároků 18, 21, 24, 27 nebo 30, vyznačující se tím, že RNA je nespecificky amplifikovaná, výhodně in vitro propagací nádorových buněk nebo in vitro amplifikací RNA.