CZ20160U1 - Individuální imunoterapeutická protinádorová vakcína - Google Patents

Description

Individuální imunoterapeutická protinádorová vakcína

Oblast techniky

Technické řešení se týká autologní individuální protinádorové vakcíny vyráběné z krevních buněk pacienta jednotlivě pro každého pacienta. Buňky jsou in vitro modifikovány s použitím anti5 genů nádorových buněk a podány zpět pacientovi jako vakcína.

Dosavadní stav techniky

Přípravky založené na dendritických buňkách, které se upraví kultivací s nádorovými antigeny, jsou slibnými prostředky pro imunoterapii některých typů nádorů. Tak se například připravují maturované autologní antigen prezentující buňky kokultivací s rekombinantním fuzním protei10 nem obsahujícím prostatickou kyselou fosfatázu (prostatic acid phosphatase; PAP) a používají se pro imunoterapii rakoviny prostaty. Podobné přípravky byly navrženy pro terapii melanomu, nemalobuněčného plicního nádoru nebo kolorektálního karcinomu.

Oproti výše uvedeným přípravkům obsahujícím rekombinantní proteiny lze polyklonální imunitní reakci proti nádoru vyvolat použitím nádorových buněk izolovaných přímo z pacienta. Vakcí15 na pro léčbu ovariálního karcinomu na bázi dendritických buněk upravených pomocí nádorových buněk získaných z ascítické tekutiny příslušných pacientek je popsána v Zuzana Tobiášova et al., In vitro assessment of dendritic cells pulsed with apoptotic tumor cells as a vaccine for ovarian cancer patiens, Clinical Immunology (2006).

Podstata technického řešení

Protože odebírání nádorových buněk pacientovi může být obtížné a pro pacienta nepohodlné, bylo by výhodné mít k dispozici vakcínu umožňující jednodušší přípravu. Nyní se podařilo vyvinout autologní individuální protinádorovou vakcínu, která jako účinnou složku obsahuje maturované živé dendritické buňky, pocházející od jednotlivého pacienta a upravené pomocí usmrcených buněk z nádorových buněčných linií.

Podstatou technického řešení je autologní individuální protinádorová vakcína, která jako účinnou složku obsahuje živé dendritické buňky pocházející od jednotlivého pacienta, které obsahují pohlcené apoptotické buňky nádorové linie ajsou posléze maturovány saturačním činidlem stimulujícím Toll-Iike receptor 3.

V provedení pro imunoterapii ovariálního karcinomu obsahuje vakcína apoptotické buňky nádo30 rové linie OV-90 (ATCC # CRL-11732) nebo SK-OV-3 (ATCC # HTB-77). V provedení pro imunoterapii karcinomu prostaty obsahuje vakcína apoptotické buňky nádorové linie LNCaP (ATCC # CRL-1740) nebo DU 145 (ATCC # HTB-81).

Vakcína je vyrobena z živých in vitro připravených dendritických buněk, které in vitro pohlcují apoptotické nádorové buňky z buněčných linií a poté jsou pomocí maturačního agens aktivová35 ny. Takto připravené dendritické buňky mají schopnost v těle pacienta prezentovat nádorové antigeny v lymfatických uzlinách a aktivují antigen specifické T lymfocyty; výsledkem je klonální expanze nádorově specifických T lymfocytů. Nádorově specifické lymfocyty mohou přímo zabíjet nádorové buňky, a tak projevovat cytotoxickou aktivitu, nebo produkují cytokiny (např. INF gamma), které zprostředkují další protinádorové mechanismy. Rovněž jsou aktivovány B lymfocyty a dochází k produkci specifických protilátek.

Použití standardní buněčné nádorové linie, například komerčně dostupné, umožňuje jednodušší přípravu vakcíny a je výhodnější z hlediska dodržování standardního operačního postupu včetně kontroly kvality.

-1 CZ 20160 Ul

Příklady provedení

Nádorové buňky buněčné linie OV-90 a SK-OV-3 (ovariální karcinom) a LNCaP a DU 145 (karcinom prostaty) jsou rozmraženy z alikvotu buněčných bank a namnoženy do potřebného množství (minimálně 50 milionů buněk). Příprava nádorových buněk je započata 1 den před plánova5 ným zpracováním leukafretického produktu (den 0). V den 6 jsou buňky připraveny na indukci apoptózy.

Z leukaferetického produktu jsou izolovány mononukleámí buňky pomocí gradientové centrifugace na densitním médiu Ficoll Paque. Získané populace jsou pomocí sledu promývacích kroků očištěny od krevních destiček. Finální suspenze buněk obsahuje cca 30 % monocytů a 70 % lym10 focytů.

Ze směsné populace mononukleámích buněk jsou izolovány monocyty, které selektivně adherují na plastový povrch kultivační lahvičky. Tento separační krok trvá 2 hodiny. Poté je povrch lahvičky promyt proudem PBS a k adherujícím monocytům je přidáno kultivační médium s cytokiny potřebnými pro diferenciaci do dendritických buněk (IL-4, GM-CSF). Po třech dnech kultivace is jsou přidány Čerstvé cytokiny. Po dalších třech dnech kultivace se z monocytů stanou nezralé dendritické buňky, které plavou v médiu, a je proveden jejich sběr.

Den před sběrem nezralých dendritických buněk je u nádorových buněk UVB ozářením navozena apoptóza. Nezralé dendritické buňky jsou pulsovány, tj. 4 až 8 h kultivovány v přítomnosti apoptotických nádorových buněk. Ty jsou dendritickými buňkami pohlcovány. Poté jsou dendri20 tické buňky maturovány přidáním maturačního agens Poly(I:C) po dobu 12 až 2 h je proveden sběr pulsovaných maturovaných dendritických buněk. V této fázi je šarže vakcíny hotová, buňky jsou převedeny do zamražovacího média a rozděleny do alikvotu. Tyto jsou zamraženy a na několika alikvotech jsou provedeny testy kontroly kvality - testy sterility a fenotypu DC.

Průběh výroby vakcíny se monitoruje na základě kontroly kvality meziproduktů. Pro propuštění šarže je relevantní procento apoptotických a mrtvých nádorových buněk po indukci apoptózy a dále kontrola kvality konečného produktu.

Šarže je propuštěna, pokud je výtěžek vyšší než minimální požadovaný počet buněk: Minimální počet maturovaných pulsovaných buněk postačující pro aplikaci min. 5 vakcín a provedení kontroly kvality je 70 milionů.

Claims (3)

1. 30 NÁROKY NA OCHRANU

   1. Autologní individuální protinádorová vakcína, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje živé dendritické buňky pocházející od jednotlivého pacienta, které obsahují pohlcené apoptotické buňky nádorové linie a jsou maturovány.
2. 2. Vakcína podle nároku 1 pro imunoterapii ovariálního karcinomu, vyznačující se 35 t í m, že obsahuje apoptotické buňky buněčné linie OV-90 (ATCC # CRL-11732) a/nebo SKOV-3 (ATCC # HTB-77).
3. 3. Vakcína podle nároku 1 pro imunoterapii karcinomu prostaty, vyznačující se tím, že obsahuje apoptotické buňky buněčné linie LNCaP (ATCC # CRL-1740) a/nebo DU 145 (ATCC # HTB-81).