CN105219724A

CN105219724A - 一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒

Info

Publication number: CN105219724A
Application number: CN201510685069.7A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 叶圣勤; 汪鑫; 瞿苏
Original assignee: Shanghai Longyao Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Longyao Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明提供了一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及黑色素瘤特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述黑色素瘤特异性抗原多肽组合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、GP100-A3、MART-1-A2以及TRP-2-A2抗原多肽；应用本发明的试剂盒可以高效地以主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。

Description

一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种增强抗癌免疫的试剂盒，尤其涉及一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒。

背景技术

黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分，多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜，其发病率随人种、地域、种族的不同而存有所差异，但近年来发病率却呈不断上升趋势，每年美国有25000个恶性黑素瘤新增病例，死亡约6000人，发病率在急速上升。

自进入二十一世纪以来，分子生物学与免疫学的长足进步为临床肿瘤治疗提供了新的策略。通过分子生物学的手段已鉴定出大量的肿瘤细胞特异性的抗原，并通过生物信息学的手段分析出其被免疫细胞识别的位点，这为重建患者的肿瘤特异性免疫反应带来的可能。但是最近十年以来的一系列临床试验结果显示，以肿瘤特异性抗原肽为基础的肿瘤疫苗的临床效果令人失望，其中一个重要的原因是抗原提呈过程的缺陷。

XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12，发现DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肽回输至小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。感染空载病毒的DC细胞并不能有效的激发相应的免疫反应，回输后对小鼠的肿瘤大小无显著性的影响。该研究提示了高表达IL12的DC细胞对于肿瘤疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。

DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性CD8阳性细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ类限制性的CD4阳性的一型T辅助细胞(type1Thelper,Th1)。一型极化树突状细胞(Type1PolarizedDendriticcell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DC1细胞的重要的特征是高表达IL12p70以及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞相关的免疫反应。RobbieB.Mailliard等证实了DC1体外诱导黑色素瘤抗原特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍以上。AdrianaTLarregina等人还发现DC1细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅助性T细胞对肿瘤组织的浸润。因此，高表达IL12的DC1细胞负载肿瘤特异性抗原肽可以为增强抗原肽为基础的肿瘤治疗疗效提供了一种策略，但现有技术中还没有能够相应的、成熟的并适用于激活肿瘤特异性免疫反应的试剂盒。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出一种试剂盒用于黑色素瘤的临床治疗。体外诱导肿瘤患者自体的DC细胞，获得富集DC1细胞的产物；DC1细胞负载肿瘤特异性肽段组合，可以用于体外或体内的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞的诱导。

为了解决上述技术问题，本发明所提供的技术措施为：

本发明提供了一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及黑色素瘤特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述黑色素瘤特异性抗原多肽组合为MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、GP100-A3、MART-1-A2以及TRP-2-A2，其多肽序列分别如SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6及SEQIDNo.7所示。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，NK细胞与K562细胞共培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNα，24小时后收集培养基上清而获得。

优选地，所述T细胞培养上清的制备过程中，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清。

优选地，利用试剂盒激活黑色素瘤病人肿瘤特异性免疫反应包括以下步骤：

步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入黑色素瘤特异性抗原多肽组合，获得负载有黑色素瘤特异性抗原多肽组合的成熟DC细胞；

步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INFγ以及所述的NK细胞与K562细胞共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DC1细胞；

步骤三，利用步骤二所获得的DC1细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。

优选地，所述NK细胞来源于人类脐带血。

优选地，所述T细胞培养上清为利用自体或异体T细胞获得。

优选地，所述步骤三中的体内主动诱导过程为将所述步骤二所获得的DC1细胞回输到病人体内。

优选地，所述步骤三中的体外被动诱导过程为将所述步骤二所获得的DC1细胞与T细胞混合培养，并再次负载黑色素瘤特异性抗原多肽，然后收集细胞，回输到病人体内。

优选地，试剂盒还可以包括GGT551培养基、DMEM/F12培养基或DMEM培养基。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明的技术效果体现在以下几个方面：

首先，本发明提供了一组用于黑色素瘤免疫治疗的特异性抗原多肽组合，该组合包含了多种黑色素肿瘤细胞的特异性表达抗原的肽段。这些肽段包括了HLA-A2与A3呈递的序列区域，覆盖了80％以上的已报道的黑色素瘤细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种新的黑色素瘤特异性抗原多肽组合，有利于激活罹患黑色素肿瘤病人的针对肿瘤细胞的获得性免疫反应。

其次，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒，体外制备成熟DC1细胞，用于负载黑色素瘤细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本发明试剂盒所制备的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高(如CD80，CD86，CD40L等表面抗原高表达)；经过sCD40L刺激之后，DC1细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达量。由此可见，本发明提供了一个更有效成熟DC1细胞制备方案，所得细胞产物可以用于黑色素瘤细胞特异性抗原负载。

最后，本发明提供了一种用于肿瘤治疗的DC1负载抗原肽的临床应用方案。DC1细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞(CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。

附图说明

图1为利用本发明的试剂盒(细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清)制备的DC1细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7，CD70，HLA-DR，CD83，CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；

图2为本发明的试剂盒(细胞培养上清为T细胞培养上清)制备的DC1细胞(10％和40％比例的T细胞培养上清)与常规方案制备的对照DC细胞相比，CD11C，CD70，HLA-DR，CD83，CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；

图3为经过sCD40L激活之后，本发明试剂盒(细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清)制备的DC1细胞所分泌的IL-12与常规方案制备的成熟DC细胞分泌量之对比；

图4为经过sCD40L激活之后，本发明试剂盒(细胞培养上清为T细胞培养上清)制备的DC1细胞(10％和40％比例的T细胞培养上清)所分泌的IL-12与常规方案制备的成熟DC细胞分泌量之对比；

图5为本发明试剂盒(细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清)制备的DC1细胞诱导T细胞之后，ELIspot试验中IFNγ分泌水平与常见方案制备的DC细胞诱导之对比；

图6为本发明试剂盒(细胞培养上清为T细胞培养上清)制备的DC1细胞(10％和40％比例的T细胞上清)诱导T细胞之后，ELIspot试验中IFNγ分泌水平与常见方案制备的DC细胞诱导之对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一(细胞培养上清为T细胞培养上清)

在利用本发明的试剂盒激活黑色素瘤病人特异性免疫反应时，首先进行成人外周血来源的一型极化树突状细胞的制备(type1polarizeddendriticcell，DC1)。外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(GeneTher.200310(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。按密度3.0×10⁶/ml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在GGT551培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境中培养。培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-41000IU/ml以及10％血浆的DMEM/F12培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一半量的培养基。培养第五天，更换含5％血浆培养基并加入T细胞上清10％，并按照终浓度加入加入IFNα，培养二十小时之后再加入20ug/ml的poly-I:C。如图2所示，经过6天的诱导，制备产物显示出了明显的DC细胞的表型，流式细胞术检测结果显示CD83，CD86等与免疫激活相关的标志物达到了95％以上，说明制备产物中DC细胞纯度极高。通过图4也可以看出，DC1细胞经过sCD40L刺激之后，高表达IL12，由本发明试剂盒制备的DC细胞表达的IL12量大约是常规方案的10倍(10％T-DC)。检测试验中，第五天加入10％或40％T细胞上清诱导，获得的DC1细胞经过sCD40L激活的之后与T细胞共培养。ELIspot试验(图6)显示IFNγ表达阳性的T细胞的数量高于普通DC细胞诱导的数量。

DC1细胞培养至第六天，将试剂盒中的肿瘤抗原肽段粉剂离心后(300g，10min)，每支分别溶于200ulDMEM/F12培养基中(每个肽2ug/ml)，充分混匀后加入到DC1中，孵育2h。收集的DC1细胞分为两份，每份至少10⁶个细胞，可以用于直接与肽混合回输病人体内，或用于体外诱导CTL细胞。DC1细胞体外诱导肿瘤抗原特异性CTL细胞时，如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度3.0×10⁶/ml接种培养。每隔两天倍比添加RPMI1640培养基。至培养第五天和第六天，分别加入添加激活试剂IFN-γ、CD3和IL1-α混合液各1ml。将获得的抗原肽负载DC1与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加RPMI1640培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽。将试剂盒中的肿瘤抗原肽粉剂离心后(300g，10min)，每管分别加入1ml的GGT551培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过18天。

本发明试剂盒(细胞培养上清为T细胞培养上清)诱导的DC1细胞的临床应用：

应用上述描述的方法，本发明针对黑色素瘤病人采用了DC1介导免疫疗法进行治疗方法简述如下：符合入选标准的患者(III或IV级)在进行化疗之前，取外周血150ml，按上述的方法进行制备DC1以及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。

第六天在病人的淋巴结注射抗原负载的5-10×10⁶个DC1细胞(重悬于1ml生理盐水)，培养第十六，十七，十八天每天收集10⁹个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重悬之后，静脉回输。目前已完成6例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法安全可靠。

实施例二(细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清)

外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(GeneTher.200310(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。加入IL-2(2000U/ml)以及IL15(2ng/ml)。每两至三天倍比加入培养基，并等量补加因子。至第十二天收集。诱导完成之后，NK细胞按1-3×10⁶/ml接种至培养基RPMI1640中，加入IFNa(1000UI/ml)并以0.5-1.5×10⁵/ml密度接种K562细胞(可替换为K562-NK细胞)混合培养，收集激活24-48小时过程中的培养基上清，过滤之后-80度冻存或直接用于DC1细胞的制备。外周血单个核细胞按密度3.0×10⁶/ml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在含1000U/mlIL-2扩增培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境中培养。培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-41000U/ml以及10％血浆的培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一半量的培养基。培养第六天，更换含5％血浆培养基并加入NK细胞上清10％，并按照终浓度1000UI/ml加入IFNγ，培养二十小时之后再加入20ug/ml的poly-I:C。培养至第七天收集细胞即为DC1细胞。DC1s细胞培养至第六天，将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽段粉剂离心后(300g，10min)，每支分别溶于200ul培养基中(每个肽2ug/ml)，充分混匀后加入到DC1中，孵育2h。收集的DC1细胞分为两份，每份至少10⁶个细胞，可以用于直接与肽混合回输病人体内，或用于体外诱导CTL细胞。

如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度3.0×10⁶/ml接种培养。每隔两天倍比添加含1000U/mlIL-2的扩增培养基。至培养第五天添加IFN-γ，第六天加入IL-1α与CD3。

将上述获得的抗原肽负载DC1与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加含1000U/ml的扩增培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽。将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽粉剂离心后(300g，10min)，每管分别加入1ml的培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过20天。

如图1所示，经过诱导，本发明试剂盒制备的DC1细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7，CD70，HLA-DR，CD83，CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物的多个表面标志物成阳性。通过图3也可以看出，本发明制备而得的细胞产物IL12p70表达量大大高于目前常用的方案，本发明诱导的DC1细胞所分泌的IL-12几乎是常规方案制备的成熟DC细胞分泌量的10倍。检测试验中，体外诱导实验显示经本试剂盒制备的DC1诱导之后，活化的T细胞即IFNγ表达阳性的T细胞显著性升高(图5)。

第七天在病人的淋巴结注射抗原负载的5-10×10⁶个DC1细胞(重悬于1ml生理盐水)，培养第十六，十七，十八天每天收集10⁹个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重悬之后，静脉回输。目前已完成5例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法安全可靠。

本发明的一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，相对于现有技术具有如下优点：

其次，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒体外制备成熟DC1细胞，用于负载黑色素瘤细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本发明试剂盒所制备的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高(如CD80，CD86，CD40L等表面抗原高表达)；经过sCD40L刺激之后，DC1细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达量。由此可见，本发明提供了一个更有效成熟DC1细胞制备方案，所得细胞产物可以用于黑色素瘤细胞特异性抗原负载。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，其特征在于，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及黑色素瘤特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述黑色素瘤特异性抗原多肽组合为序列如SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6及SEQIDNo.7的多肽组合。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞与K562细胞共培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNα，24小时后收集培养基上清而获得。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清的制备过程中，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，利用试剂盒激活黑色素瘤病人肿瘤特异性免疫反应包括以下步骤：

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞来源于人类脐带血。

6.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清为利用自体或异体T细胞获得。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤三中的体内主动诱导过程为将所述步骤二所获得的DC1细胞回输到病人体内。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤三中的体外被动诱导过程为将所述步骤二所获得的DC1细胞与T细胞混合培养，并再次负载黑色素瘤特异性抗原多肽，然后收集细胞，回输到病人体内。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有GGT551培养基、DMEM/F12培养基。