ES2963461T3 - Sistema de cultivo ex vivo y métodos de utilización del mismo - Google Patents

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Ravid Straussman
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Abstract

Se proporcionan sistemas de cultivo ex vivo. Por consiguiente, se proporciona un sistema de cultivo que comprende un medio de cultivo y una porción de tejido cortada con precisión colocada sobre un inserto de cultivo de tejido, en donde la porción de tejido cortada con precisión se mantiene en una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos 50 % de oxígeno y en donde dicho cultivo se agitado rotacionalmente facilitando la inmersión intermitente del corte de tejido en el medio de cultivo. También se proporcionan métodos para cultivar un tejido y métodos para usar el sistema de cultivo para seleccionar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de cultivoex vivoy métodos de utilización del mismo
La presente divulgación, en algunos aspectos de la misma, se refiere a un sistema de cultivoex vivoy a métodos de utilización del mismo.
Una selección convencional de regímenes terapéuticos contra el cáncer se basa principalmente en el tejido canceroso de origen, el estadio y el grado del tumor y la salud general del paciente. Esos regímenes de tratamiento son eficaces en algunos de los pacientes, sin embargo, son tóxicos y provocan muchos efectos adversos que pueden suponer un riesgo para la vida.
La disponibilidad de terapias farmacológicas dirigidas y la posibilidad de identificar marcadores tumorales específicos de un paciente han brindado opciones de tratamiento personalizadas, pero al mismo tiempo se requiere un uso extensivo de perfiles genéticos [véase, p. ej., Dancey et al. (2012)Cell148, 409-420; y Garraway et al. (2013)J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol.31, 1806-1814]. Sin embargo, la extrapolación de datos genéticos a regímenes de tratamiento específicos es compleja y predecir una respuesta del paciente no es fiable. Por ejemplo, en el caso de que el tumor de un paciente se caracterice por más de una mutación dirigible, será muy difícil predecir cuál de los posibles fármacos será más eficaz. Lo mismo ocurre cuando hay más de un fármaco disponible para una mutación específica. Por tanto, la elección de la terapia depende en gran medida de ensayo y error.
Existen varias tecnologías disponibles para someter a ensayo directamente la respuesta de las células cancerosas de un paciente frente a un tratamiento específico, como líneas celulares obtenidas a partir de un tumor, generadas a partir de tumores de pacientes y modelos de xenoinjertos obtenidos a partir de pacientes (PDX) [véase, p. ej., Crystal et al. (2014)Science346, 1480-1486; Clevers et al. (2016)Cell165, 1586-1597; e Hidalgo et al. (2014)Cáncer Discov.4, 998-1013]. Sin embargo, esos modelos son caros, requieren mucho tiempo y lo más importante es que no conservan el microambiente tumoral original, lo que puede tener un marcado efecto sobre la sensibilidad de los fármacos [Straussman et al. (2012)Nature487, 500-504].
Los sistemas de cultivoex vivode órganos (EVOC) utilizados en la biología del cáncer son cultivos de cortes cortados con precisión del tumor de un paciente. El EVOC se ha utilizado para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la toxicidad de fármacos, la captación viral, la susceptibilidad de los tumores frente a la radiación o fármacos anticancerígenos específicos [véase, p. ej., Vaira et al. (2010)Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A.107, 8352-8356; Vickers et al. (2004)Chem. Biol. Interact.150, 87-96; de Kanter et al. (2002)Curr. Drug Metab.3, 39-59; Stoff-Khalili et al. (2005)Breast Cancer Res. BCR7, R1141-1152; Merz et al. (2013)Neuro-Oncol.15, 670-681; Gerlach et al. (2014)Br. J. Cancer110, 479-488; Meijer et al. (2013)Br. J. Cancer109, 2685-2695; Grosso et al. (2013)Cell Tissue Res.
352, 671-684; Vaira et al. (2010)PNAS107, 8352-8356; Roife et al. (2016)Clin. Cancer Res.Junio 3, 1-10; Maund et al. (2014)Lab. Invest.94, 208-221; Vickers et al. (2004)Toxicol Sci.82(2):534-44; Zimmermann et al. (2009)Cytotechnology61(3): 145-152); Parajuli et al. (2009)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal45:442-450; Koch et al. (2014)Cell Communication and Signaling12:73; Graaf et al.Nature Protocols(2010) 5: 1540-1551; Majumder et al.Nat. Commun.
6, 6169 (2015); Naipal et al.BMC Cancer(2016) 16:78; Meijer et al.Future Sci. OA(2017) FSO190; documentos de publicaciones de solicitudes de Patente de EE. UU. n2: US2014/0228246, US2010/0203575 y US2014/0302491; y documento de publicación de solicitud de Patente Internacional n2: WO2002/044344.
El documento US 2005130254 describe un sistema para el ensayo de fármacos que utiliza un aparato para el cultivo de cortes de hígado. El aparato tiene una cámara con plasma y válvulas de gas, en donde se colocan de forma segura los cortes del hígado de un animal para maximizar el área de la superficie de los cortes de hígado expuestos al medio de cultivo. Se suministra plasma a la cámara para que suba y entre en contacto con los cortes de hígado, y alternativamente se retira del contacto con los cortes de hígado. El gas se suministra a la parte superior de la cámara. El sistema también incluye un depósito para contener los medios que entran y salen de la cámara. Se proporcionan métodos para evaluar la toxicidad de un fármaco o de un candidato a fármaco.
El documento WO2009034108 se refiere a un método para preparar un cultivo de cortes organotípicos de corazón, que comprende; a) proporcionar un corte de corazón, b) colocar el corte de la etapa a) sobre la superficie superior de un soporte semiporoso que es permeable a un medio de cultivo, c) colocar el soporte de la etapa b) sobre un medio de cultivo, en donde el corte es alimentado a través del soporte semiporoso por capilaridad.
KISHAN A. T. NAIPAL ET AL, divulga "Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer", BMC CANCER, (20160209), vol. 15, n2 5, doi:10.1186/s12885-016-2119-2, página 1989, véase el documento completo y en particular el resumen y las páginas 2-4.
MEIJER TITIA GET AL, divulga "Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction", FUTURE SCIENCE OA, (20170327), vol. 3, n22, doi:10.4155/fsoa-2017-0003, ISSN 2056-5623, páginas 1 - 13, véase en particular el párrafo "Organotypic tumor tissue slices", páginas 5-9 y la Tabla 1.
M M GERLACH ET AL, divulga "Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance", BRITISH JOURNAL OF CANCER, GB, (20131121), vol. 110, n22, do¡:10.1038/bje.2013.700, páginas 479 - 488, véase el documento completo y en particular las páginas 480-483. MERZ FELICITAS ET AL, divulga "ürganotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments", NEURO-On Co LOGY, (201306), vol. 15, n26, ISSN 1523-5866, páginas 670 - 681, véanse en particular las páginas 671-673.
GRINSHPUN ALBERT ET AL, divulga "Ev vivo organ culture as potential prioritization tool for breast cáncer targeted therapy", CANCER BIOLOGY & THERAPY, (20180322), ISSN 1555-8576, páginas 1 - 4, véase en particular la página 2, último párrafo completo de la columna de la izquierda.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un sistema de cultivo que comprende un medio de cultivo y un corte de tejido cortado con precisión colocado sobre un inserto de cultivo de tejidos, en donde dicho corte de tejido cortado con precisión se mantiene en una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos un 60% y menos de un 95% de oxígeno y en donde dicho cultivo se agita rotacionalmente facilitando la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo.
Preferiblemente, dicho cultivo está en una placa de cultivo de tejidos.
Preferiblemente, el sistema de cultivo comprende un fármaco.
La presente invención se refiere también a un método para cultivar un tejido, comprendiendo el método cultivar un corte de tejido cortado con precisión sobre un inserto para cultivo de tejido en un medio de cultivo, bajo una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos un 60% y menos de un 95% de oxígeno; y agitar el cultivo en rotación facilitando la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo.
Preferiblemente, comprende añadir un fármaco a dicho medio de cultivo.
La presente invención se refiere también a un método para determinar la eficacia de un fármaco o un lote de un fármaco, comprendiendo el método:
(i) cultivar un tejido según el método de la reivindicación 4;
(i) añadir el fármaco o el lote de un fármaco a dicho medio de cultivo; y
(iii) determinar el efecto de dicho fármaco o dicho lote de un fármaco sobre dicho tejido, en donde la sensibilidad de dicho tejido frente a dicho fármaco indica la eficacia de dicho fármaco.
Preferiblemente, dicho tejido es un tejido patológico.
La presente invención se refiere también a un método para seleccionar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método:
(i) cultivar un tejido patológico obtenido del sujeto según el método de la reivindicación 4;
(ii) añadir el fármaco a dicho medio de cultivo; y
(iii) determinar el efecto de dicho fármaco sobre dicho tejido, en donde la sensibilidad de dicho tejido frente a dicho fármaco indica la eficacia de dicho fármaco para el tratamiento de dicha enfermedad en dicho sujeto.
Preferiblemente, dicho tejido patológico es un tejido canceroso.
Preferiblemente, dicho tejido se selecciona a partir del grupo que consiste en tejido ovárico, colorrectal, pulmonar, pancreático, gástrico, gastroesofágico, mamario, hepático, cartilaginoso y óseo.
Preferiblemente, dicho fármaco se selecciona a partir del grupo que consiste en 5-flurouracilo (5FU), oxaliplatino, irinotecán, cisplatino, 4-hidroperoxi ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, navalbina, gemcitabina, gefitinib, tamoxifeno, olaparib, trametinib, everolimus y palbociclib.
Preferiblemente, dicho cultivo se realiza durante al menos 4 días.
Preferiblemente, dicho corte está en contacto directo con dicho inserto de cultivo de tejidos.
Preferiblemente, dicho inserto de cultivo de tejidos es un inserto de rejilla de titanio.
Preferiblemente, dicha atmósfera altamente oxigenada contiene al menos un 70% de oxígeno.
Breve descripción de las diversas perspectivas de los dibujos
Algunos aspectos de la divulgación se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de explicación ilustrativa de aspectos de la divulgación. A este respecto, la descripción junto con los dibujos muestra a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica aspectos de la divulgación.
En los dibujos:
La Fig. 1 muestra microfotografías histológicas representativas que exponen la morfología de cortes de xenoinjertos obtenidos a partir de cáncer de ovario humano después de 5 días de cultivoex vivo.Se incubaron cortes cortados con precisión de tejido recogido sobre un inserto de titanio (columna izquierda) en una placa de 6 pocilios, o directamente en la placa de 6 pocilios (columna derecha); con 21% de O2 (fila inferior) o con 80% de O2 (fila superior) durante 5 días; y teñidos con H&E. La barra de escala representa 50 pm. Para cada condición, los tejidos se sometieron a ensayo por triplicado.
La Fig. 2 muestra microfotografías histológicas representativas que exponen la morfología de cortes de xenoinjertos obtenidos a partir de cáncer de mama humano después de 5 días de cultivoex vivoen diferentes medios. Se incubaron cortes cortados con precisión del tejido recogido sobre un inserto de titanio con 80% de O2 en medio DMEM/F12 (panel izquierdo) o M199 (panel derecho) durante 5 días; y teñidos con H&E. La barra de escala representa 50 pm. Para cada condición, los tejidos se analizaron por duplicado.
La Fig. 3 demuestra la capacidad del método de cultivoex vivodesarrollado para predecir las respuestas de xenoinjertos obtenidos a partir de carcinoma de mama humano frente a un tratamiento farmacológico contra el cáncer. Se muestran gráficos generados por Jackson Laboratories que exponen la respuestain vivode dos xenoinjertos obtenidos a partir de carcinoma de mama humano frente al tratamiento con 4-hidroperoxi ciclofosfamida, lo que indica que el carcinoma de mama TM00096 es resistente al tratamiento mientras que el carcinoma de mama TM00098 es sensible al tratamiento. El eje y indica el tamaño del tumor en mm3.
Las microfotografías histológicas representativas muestran la morfología de cortes de los carcinomas de mama TM00096 (columna izquierda) y TM00098 (columna derecha) después de 5 días de cultivoex vivosobre un inserto de titanio con 80% de O2 tratados durante 4 días con las concentraciones indicadas de 4-hidroperoxi ciclofosfamida. La barra de escala representa 50 pm. Para cada condición, los tejidos se analizaron por duplicado.
La Fig. 4 muestra la capacidad método de cultivoex vivodesarrollado para predecir una respuesta de xenoinjertos obtenidos a partir de carcinoma colorrectal humano (CCR) frente a un tratamiento farmacológico contra el cáncer. Se muestran gráficos generados por Jackson Laboratories que exponen la respuestain vivode tres xenoinjertos obtenidos a partir de CCR frente al tratamiento con oxaliplatino, lo que indica que el CCR TM00134 es resistente al tratamiento, mientras que el tumor TM00170 es parcialmente sensible y el CCR TM00164 es muy sensible al tratamiento. El eje y indica el tamaño del tumor en mm3.
Las microfotografías histológicas representativas muestran la morfología de los cortes de CCR TM00134 (panel izquierdo), TM00170 (panel central) y TM00164 (panel derecho) después de 5 días de cultivoex vivosobre un inserto de titanio con 80% de O2 tratados durante 4 días con oxaliplatino 0,2 pM. El tratamiento con DMSO servía como control. La barra de escala representa 50 pm. Para cada condición, los tejidos se sometieron a ensayo por triplicado.
La Fig. 5 muestra que los cortes de tejido tumoral cultivados bajo el método de cultivoex vivodesarrollado presentan una sensibilidad diferencial frente a diferentes fármacos anticancerígenos. El tejido tumoral de cáncer colorrectal humano (CCR) se tomó de una lesión metastásica en el peritoneo, extirpada durante una operación para reducir el volumen y quimioterapia intraperitoneal. Se muestran microfotografías histológicas representativas que exponen la morfología de los cortes tumorales después de 5 días de cultivoex vivoen un inserto de titanio con 80% de O2 tratados durante 4 días con los fármacos anticancerígenos indicados 5-fluouracilo (5-FU), irinotecán u oxaliplatino. El tratamiento con DMSO servía como control. Debe tenerse en cuenta que el tejido era sensible al tratamiento con oxaliplatino e irinotecán de manera dependiente de la dosis, pero resistente a 5-fluouracilo. La barra de escala representa 50 pm. Para cada condición, los tejidos se analizaron por triplicado.
La Fig. 6 muestra que los cortes de tejido tumoral obtenidos a partir de diferentes individuos y cultivados bajo el método de cultivoex vivodesarrollado, presentan una sensibilidad diferencial frente al mismo fármaco anticancerígeno. El tejido tumoral de cáncer colorrectal humano (CCR) se tomó de una lesión metastásica en el peritoneo, extirpada durante una operación para reducir volumen y quimioterapia intraperitoneal. Se muestran microfotografías histológicas representativas que exponen la morfología de los cortes del tumor después de 5 días de cultivoex vivosobre un inserto de titanio con 80% de O2 tratados durante 4 días con los fármacos anticancerígenos indicados: 5-fluouracilo (5-FU) u oxaliplatino. El tratamiento con DMSO sirvió como control, PR indica respuesta parcial; y NR indica que no hay respuesta. Se debe tener en cuenta que si bien el tumor obtenido del paciente n28 tenía una fuerte respuesta parcial frente al oxaliplatino y ninguna respuesta frente al 5-fluorouracilo, el otro paciente, el paciente n2 6, respondía parcialmente a ambos fármacos, La barra de escala representa 50 gm, Para cada condición, los tejidos se analizaron por duplicado,
La Fig, 7 muestra la capacidad del método de cultivoex vivodesarrollado para predecir la sensibilidad frente a una terapia dirigida según lo previsto por el perfil molecular, Se muestran microfotografías histológicas representativas que exponen la morfología de cortes de tumores de cáncer de mama triples negativos de dos pacientes, después de 5 días de cultivoex vivosobre un inserto de titanio con 80% de O2, tratados durante 4 días con AZD4547 (un inhibidor de FGFR). El tratamiento con DMSO sirvió como control, Se debe tener en cuenta que el Paciente n21 cuyo tumor albergaba una amplificación de FGFR1, era sensible a AZD4547 (un inhibidor de FGFR) mientras que el paciente n2 2 que no albergaba esa mutación, era resistente al tratamiento, La barra de escala representa 50 gm, Para cada condición, los tejidos se analizaron por duplicado,
La Fig, 8 muestra que la tinción con Ki67 para estudiar la proliferación se puede utilizar para evaluar la sensibilidad del tejido frente a diferentes tratamientos, Se muestran microfotografías histológicas representativas que exponen la morfología (mediante tinción con H&E) y la proliferación (mediante tinción con Ki67) de un paciente después de 5 días de cultivoex vivosobre un inserto de titanio con 80% de O2, tratado durante 4 días con los fármacos indicados, El gráfico de la derecha, generado por Jackson Laboratories, muestra la respuestain vivode ese xenoinjerto obtenido a partir de CCR frente al tratamiento con oxaliplatino y 5-fluouracilo, El eje y indica el tamaño del tumor en mm3, Ese paciente era parcialmente sensible al 5-fluouracilo pero muy sensible al oxaliplatino tantoin vivocomoex vivo.El tratamiento con DMSO sirvió como control, La barra de escala representa 50 gm, Para cada condición, los tejidos se analizaron por duplicado,
La Fig, 9 muestra el procesamiento de biopsias por punción con aguja gruesa para EVOC, En este ejemplo se colocan tres biopsias por punción con aguja gruesa, una al lado de la otra, en agarosa líquida en una bandeja de metal, Se añade más agarosa y se enfría la bandeja, Las biopsias se extraen cortando de la agarosa y el bloque se fija en el émbolo con pegamento de contacto, se incluye en más agarosa (usando el mismo método que con los trozos de tejido) y luego se corta con el microtomo, Los cortes de la biopsia se tratan y procesan de manera similar a los cortes de tejido, La barra de escala representa 100 gm,
La Fig, 10 muestra microfotografías histológicas que indican que el tejido se puede cortar y almacenar en un medio hasta 48 horas antes de comenzar la experimentación, sin ningún efecto adverso para el tejido ni ningún cambio en el resultado, Se muestra un tejido de cáncer de colon que se había tratado con DMSO como control o 5-fluorouracilo (5-FU) durante 4 días, inmediatamente después del corte o 48 horas después de la refrigeración, Se añadió BrdU 18 horas antes del final del experimento; y el tejido se tiñó con anticuerpo anti-BrdU para identificar las células en división, Se debe tener en cuenta que el tejido tratado con 5-FU todavía era algo viable pero comenzaba a responder al tratamiento con una mayor muerte celular y menos BrdU en ambas condiciones, La barra de escala representa 50 gM,
La Fig, 11 muestra imágenes histológicas representativas que exponen los tejidos indicados después de 5 días de cultivoex vivo; y una tabla que resume los tejidos examinados que conservaban la estructura y la viabilidad del tejido durante al menos 5 días de cultivo, Se incubaron cortes cortados con precisión del tejido recogido en un inserto de titanio en DMEM/F12 con 80% de O2 durante 5 días; y teñido con H&E. Todos los experimentos se realizaron por duplicado en dos casos diferentes del cáncer indicado,
Descripción de aspectos específicos de la divulgación
La presente divulgación, en algunos aspectos de la misma, se refiere a un sistema de cultivoex vivoy a métodos de utilización del mismo,
Antes de explicar en detalle al menos un aspecto de la divulgación, debe entenderse que la divulgación no está limitada necesariamente en su aplicación a los detalles establecidos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos, La divulgación es susceptible de otros aspectos o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de diversas maneras,
Las opciones de tratamiento personalizado para enfermedades como el cáncer generalmente emplean perfiles genéticos y pruebas de la respuesta de las células del paciente frente a un tratamiento específico, utilizando modelos costosos y que requieren mucho tiempo, como las líneas celulares obtenidas a partir de tumores, generadas a partir de tumores de pacientes y modelos de xenoinjertos obtenidos a partir de un paciente (PDX), En años recientes se ha sugerido el uso de sistemas de cultivoex vivode órganos (EVOC) en diversas aplicaciones, incluido el estudio de la toxicidad de fármacos, la captación viral, la susceptibilidad de los tumores frente a una radiación o fármacos anticancerígenos específicos,
Pese a reducir la presente divulgación a la puesta en práctica, los presentes inventores han desarrollado ahora un sistema EVOC que puede preservar la estructura y la viabilidad de un corte de tejido cortado con precisión hasta 7 días en cultivo y, como tal, puede predecir la respuesta de tejidos patológicos frente a diversos fármacos.
Como se ilustra a continuación y en la sección de ejemplos a continuación, el sistema EVOC recientemente desarrollado se basa en el cultivo de un corte de tejido colocado directamente sobre un inserto de cultivo (en este caso, en medio de una rejilla de titanio reutilizable) que permite una inmersión intermitente del corte en el medio, facilitando así la difusión de nutrientes y gases por todo el corte, en una atmósfera altamente oxigenada que contiene oxígeno (80%) usando un medio estándar, solo con la adición de suero de ternera fetal (FCS) y agentes antimicrobianos (Ejemplo 1, Tabla 1, Figuras 1-2 y 9), Los sistemas EVOC de diversos tejidos cancerosos, incluidos tejido ovárico, colorrectal, pulmonar, pancreático y mamario cultivados según este método, presentaban una alta viabilidad después de 4 a 6 días en cultivo (Ejemplo 1, Tabla 1, Figura 11),
A continuación, los presentes inventores muestran que el sistema EVOC desarrollado puede usarse para predecir la respuesta de los tumores frente a fármacos anticancerígenos (Ejemplo 2), Específicamente, los presentes inventores demuestran que la sensibilidad de los cortes de tejido cancerosoex vivode varios modelos de xenoinjertos obtenidos a partir de pacientes (PDX) para el tratamiento contra el cáncer, es consistente con la respuestain vivode los modelos de PDX frente al tratamiento (Ejemplo 2, Tabla 2, Figuras 3-4); y esa sensibilidad de los cortes de tejido de cáncer de mama triple negativoex vivoobtenidos a partir de pacientes para una terapia dirigida, es consistente con los datos del perfil molecular (Ejemplo 2, Figura 7), Además, los presentes inventores muestran que los sistemas EVOC de tumores humanos procedentes de diversos pacientes, presentan una sensibilidad diferencial frente a diferentes tratamientos anticancerígenos (Ejemplo 2, Tablas 3-4, Figuras 5-6 y 8), Es importante destacar que el tejido se puede almacenar en un medio durante al menos 48 horas antes del comienzo del experimento sin ningún efecto adverso sobre el tejido o la sensibilidad frente al fármaco (Ejemplo 2, Figura 10),
En conjunto, el sistema EVOC recientemente desarrollado preserva el microambiente, la estructura, la viabilidad y la heterogeneidad genética del tejido, Este sistema permite estudiar la respuesta de un tejido humano (por ejemplo, tejido canceroso) de una manera rápida, fiable y rentable, En consecuencia, las presentes enseñanzas sugieren además el uso de este sistema EVOC desarrollado para la investigación preclínica y básica, así como para calificar la eficacia de un fármaco para el tratamiento de enfermedades en general y para una terapia personalizada en particular,
Por tanto, según un primer aspecto de la presente divulgación, se proporciona un sistema de cultivo que comprende un medio de cultivo y un corte de tejido cortado con precisión colocado sobre un inserto de cultivo de tejidos, en donde dicho corte de tejido cortado con precisión se mantiene en una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos 50% de oxígeno y en donde dicho cultivo se agita rotacionalmente facilitando la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo,
Según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para cultivar un tejido, comprendiendo el método cultivar un corte de tejido cortado con precisión sobre un inserto de cultivo de tejidos en un medio de cultivo, bajo una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos 50% de oxígeno; y agitar el cultivo en un movimiento rotatorio que facilita la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo,
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "sistema de cultivo" se refiere al menos a un corte de tejido cortado con precisión, a un inserto y a un medio en un entornoex vivo,
Según aspectos específicos, el sistema de cultivo conserva la estructura y la viabilidad del corte de tejido cortado con precisión durante al menos 2-10, 2-7, 2-5, 4-7, 5-7 o 4-5 días en cultivo, Según un aspecto específico, el corte de tejido cortado con precisión conserva la viabilidad durante al menos 5 días, 6 días, 7 días o incluso 10 días, Según un aspecto específico, el corte de tejido cortado con precisión conserva la viabilidad durante al menos 5 días,
Según aspectos específicos, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% de las células en el tejido cortado con precisión conservan la viabilidad después de 4-5 días en cultivo, según se determina, p, ej,, mediante un análisis de la morfología de una área óptima de viabilidad,
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "área óptima de viabilidad" se refiere a un campo microscópico del tejido (por ejemplo, con un aumento de 20X) en el que está presente el mayor número de células vivas por unidad de área, según lo evaluado por un patólogo, en comparación con la muestra inmediata pre-EVOC de la misma especie,
Por tanto, según aspectos específicos, el cultivo se efectúa durante 2-10, 2-7, 2-5, 4-7, 5-7 o 4-5 días,
Según un aspecto particular, el cultivo se efectúa durante al menos 4 días,
Según un aspecto particular, el cultivo se efectúa durante al menos 5 días,
Según un aspecto particular, el cultivo se efectúa hasta durante 7 días,
Tal y como se usa en el presente documento, el término "tejido" se refiere a parte de un órgano sólido (es decir, no es sangre) de un organismo que tiene cierta vascularización que incluye más de un tipo de célula y conserva al menos alguna macroestructura del tejidoin vivodel que se ha extirpado.
Ejemplos incluyen, entre otros, tejido ovárico, tejido colorrectal, tejido pulmonar, tejido pancreático, tejido mamario, tejido cerebral, retina, tejido cutáneo, óseo, tejido cardíaco y tejido renal. Según aspectos específicos, el tejido se selecciona a partir del grupo formado por tejido ovárico, colorrectal, pulmonar, pancreático, gástrico, gastroesofágico y mamario. Según aspectos específicos, el tejido se selecciona a partir del grupo formado por tejido ovárico, colorrectal, pulmonar, pancreático, gástrico, gastroesofágico, mamario, hepático, cartilaginoso y óseo. Según aspectos específicos, el tejido es un tejido canceroso metastásico obtenido de órganos tales como, entre otros, el hígado, el hueso, el pulmón y el peritoneo.
Según aspectos específicos, el tejido no es un tejido hepático.
Según aspectos específicos, el tejido no es un tejido prostático.
Según aspectos específicos, el tejido es un tejido de mamífero.
Según un aspecto específico, el tejido es un tejido humano.
Según otro aspecto específico, el tejido es un tejido de ratón o de rata.
Según aspectos específicos, el tejido es un tejido sano.
Según otros aspectos específicos, el tejido es un tejido patológico. El método puede emplear una pluralidad de cortes de tejido cortados con precisión seleccionados (por ejemplo, cada uno sobre un inserto distinto), en donde todos ellos pueden proceder de un(os) tejido(s) patológico(s), tejido(s) sano(s) o una combinación de los mismos (por ejemplo, si el tejido sano sirve como control cuando se adquiere teniendo el mismo origen tisular que el tejido patológico). Según aspectos específicos, el tejido es un tejido patológico.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "tejido patológico" se refiere a un tejido que causa una enfermedad. Por lo tanto, se espera que la eliminación de ese tejido conduzca al tratamiento tal y como se define más adelante en el presente documento. A continuación, se describen detalladamente ejemplos específicos de enfermedades susceptibles de tratamiento según algunos aspectos de la presente divulgación. Según aspectos específicos, el tejido patológico es un tejido inflamado, un tejido fibrótico o un tejido canceroso. Según un aspecto específico, el tejido patológico es un tejido canceroso.
Según aspectos específicos, el tejido se obtiene quirúrgicamente o mediante biopsia, laparoscopia, endoscopia o como xenoinjerto o cualquier combinación de los mismos.
El tejido se puede cortar y cultivar directamente después de la extracción del tejido (es decir, tejido primario) o después de la implantación en un modelo animal [es decir, un xenoinjerto obtenido a partir de un paciente (PDX)], cada posibilidad representa un aspecto distinto de la presente divulgación.
El tejido o el corte de tejido según algunos aspectos de la presente divulgación, se puede aislar o almacenar recién cortado, p. ej., a 4°C o crioconservar (es decir, congelar), p. ej., en nitrógeno líquido.
Según aspectos específicos, el tejido o el corte de tejido se aísla recién cortado (es decir, no más de 24 horas después de haberlo extraído del sujeto y no se somete a procesos de conservación), como se describe adicionalmente más adelante.
Según aspectos específicos, el tejido se crioconserva después de obtener el tejido y antes de cortarlo.
Según aspectos específicos, el tejido se descongela antes de cortarlo.
Según aspectos específicos, el corte de tejido se crioconserva después de cortarlo.
Según aspectos específicos, el corte de tejido se descongela antes del cultivo.
Según aspectos específicos, el tejido se conserva a 4°C, p. ej., en medio después de obtener el tejido y antes de cortarlo.
Según aspectos específicos, el corte de tejido se conserva a 4°C, p. ej., en medio después de cortarlo y antes del cultivo.
Según aspectos específicos, la conservación a 4°C se efectúa hasta durante 120 horas, 96 horas, 72 horas o 48 horas. Según aspectos específicos, la conservación a 42C se realiza durante 24-48 horas.
Por tanto, según aspectos específicos, el método comprende además obtener el tejido a partir del sujeto o del modelo animal que comprende el tejido.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "xenoinjerto obtenido a partir de un paciente (PüX)" se refiere al tejido generado mediante la implantación de un tejido primario en un animal de una especie diferente con respecto al donante del tejido primario. Según aspectos específicos, el PDX es un tejido generado mediante la implantación de un tejido primario humano (por ejemplo, tejido canceroso) en un ratón inmunodeficiente.
Después de la extracción del tejido, el tejido se secciona en cortes cortados con precisión.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "corte de tejido cortado con precisión" se refiere a un corte viable obtenido a partir de un tejido sólido aislado con un espesor reproducible y bien definido (por ejemplo, ± 5% de variación del espesor entre los cortes).
Normalmente, el corte de un tejido es un minimodelo del tejido que contiene las células del tejido en su entorno natural y conserva la conectividad tridimensional, como las interacciones intercelulares y de la matriz celular del tejido intacto, sin seleccionar un tipo de célula en particular entre los diferentes tipos de células que constituyen el tejido o el órgano. El corte de precisión reduce las fuentes de error debido a variaciones en el espesor de los cortes y a dañar las superficies cortadas, contribuyendo ambas a un intercambio desigual de gases y nutrientes a lo largo de los cortes de tejido; mejora la capacidad de reproducción; y permite evaluar la histología de cortes adyacentes y compararlos de dos en dos bajo diferentes condiciones experimentales.
La sección del corte se puede cortar con diferentes orientaciones (por ejemplo, anteroposterior, dorsal-ventral o nasaltemporal) y espesores. El tamaño/espesor de la sección de tejido se basa en la fuente del tejido y en el método utilizado para seccionar. Según un aspecto específico, el espesor del corte cortado con precisión permite conservar la estructura del tejido en cultivo.
Según aspectos específicos, el espesor del corte cortado con precisión permite que el oxígeno y los nutrientes tengan un acceso total a las capas celulares internas, de modo que las capas celulares internas están expuestas a concentraciones suficientes de oxígeno y nutrientes.
Según aspectos específicos, el espesor del corte cortado con precisión permite que el oxígeno y los nutrientes tengan un acceso total a las capas celulares internas, de modo que las capas celulares internas están expuestas a las mismas concentraciones de oxígeno y nutrientes que las capas celulares externas.
Según aspectos específicos, el corte cortado con precisión tiene un espesor entre 50 y 1200 gm, entre 100 y 1000 gm, entre 100 y 500 gm, entre 100 y 300 gm o entre 200 y 300 gm.
Según un aspecto específico, el corte de precisión tiene un espesor de 200-300 gm.
Los métodos para obtener cortes de tejido son conocidos en la técnica y se describen a modo de ejemplo en la sección de Ejemplos que sigue a continuación y en Roife et al. (2016)Clin. Cáncer Res.Junio 3, 1-10; Vickers et al. (2004)Toxicol Sci.82(2):534-44; Zimmermann et al. (2009)Cytotechnology61(3): 145-152); Koch et al. (2014)Cell Communication and Signaling12:73; y Graaf et al.Nature Protocols(2010) 5: 1540-1551. Esos métodos incluyen, pero no se limitan a, cortar usando un vibratomo, inclusión en agarosa seguida de corte con un micrótomo o cortar usando una matriz.
A modo de ejemplo no limitante, el tejido se aísla y se coloca inmediatamente en un medio de disección fisiológico (por ejemplo, PBS helado) que puede complementarse con antibióticos.
Según aspectos específicos, el tiempo de isquemia caliente es inferior a 2 horas, inferior a 1,5 horas o inferior a 1 hora.
Según aspectos específicos, el tiempo de isquemia fría es inferior a 96 horas, inferior a 72 horas, inferior a 48 horas, inferior a 24 horas, inferior a 12 horas, inferior a 5 horas o inferior a 2 horas.
Antes del corte, el tejido se fija al dispositivo para el corte de tejido usando, p. ej., pegamento de contacto seguido de inclusión, p. ej., en gel de agarosa de bajo punto de fusión. Posteriormente, el tejido se secciona en cortes cortados con precisión. Numerosos dispositivos para el corte de tejidos adecuados están disponibles comercialmente, tales como, entre otros, Compresstome™ VF-300 (Precisionary Instruments Inc. NC, EE. UU.), cortadora de tejidos Brendel-Vitron (Tucson, AZ), cortadora de tejidos de precisión Krumdieck (n2 de modelo MD4000-01; Alabama R&D) y microtomo de cuchilla vibratoria Leica Vt 1200S (Leica, Wetzlar, Alemania). Según aspectos específicos, el dispositivo para seccionar se llena con un medio enfriado con hielo, como medio Williams E o tampón Krebs-Henseleit (KHB). El experto en la técnica conocerá los medios y condiciones para la disección y conservación del tejido y el corte de tejido antes del cultivo para cada tipo de tejido.
A continuación, el corte de tejido se coloca sobre un inserto de cultivo de tejidos en un recipiente de cultivo de tejidos lleno de medio de cultivo. Se pueden colocar uno o varios cortes en un solo inserto de cultivo de tejidos. Según aspectos específicos, se coloca solo un corte en un inserto de cultivo de tejidos individual.
Según aspectos específicos, el recipiente de cultivo se llena con medio de cultivo hasta el fondo del corte de tejido (por ejemplo, 4 ml de medio en una placa de 6 pocilios que contiene un inserto).
El cultivo puede realizarse en un recipiente de vidrio, plástico o metal que pueda proporcionar un entorno aséptico para el cultivo de tejidos. Según aspectos específicos, el recipiente de cultivo incluye placas, bandejas, matraces, frascos y viales. Recipientes de cultivo como COSTAR®, NUNC® y HALCÓN® están disponibles comercialmente desde varios fabricantes.
Según aspectos específicos, el recipiente de cultivo es una placa de cultivo de tejidos tal como una placa de 6 pocillos, una placa de 24 pocilios, una placa de 48 pocilios y una placa de 96 pocilios.
Según un aspecto específico, el recipiente de cultivo es una placa de 6 pocilios para cultivo de tejidos.
Según aspectos específicos, el recipiente de cultivo no está recubierto previamente con proteínas extraídas de un tejido compatible (por ejemplo, cuando el tejido es un tejido canceroso, entonces el recipiente de cultivo no está recubierto previamente con proteínas extraídas de tumores de grado y estadio coincidentes). Ejemplos no limitantes de esas proteínas incluyen proteínas de la ECM tales como colágeno, fibronectina, laminina, vibronectina, cadherina, filamina A, vimentina, osteopontina, decorina, tenascina X, proteínas de la membrana basal, proteínas del citoesqueleto y proteínas de la matriz; y factores de crecimiento.
El medio de cultivo utilizado en la presente divulgación puede ser un medio a base de agua que incluye una combinación de sustancias tales como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos y/o proteínas tales como citocinas, factores de crecimiento y hormonas, todos ellos necesarios para la proliferación celular y capaces de mantener la estructura y viabilidad del tejido. Por ejemplo, un medio de cultivo puede ser un medio de cultivo de tejido sintético tal como DMEM/F12 (puede obtenerse, p. ej., en Biological Industries), M199 (puede obtenerse, p. ej., en Biological Industries), RPMI (puede obtenerse, p. ej., en productos de Gibco-Invitrogen Corporation), M199 (puede obtenerse, p. ej., en Sigma-Aldrich), Ko-DMEM (puede obtenerse, p. ej., en productos de Gibco-Invitrogen Corporation), complementado con los aditivos necesarios tal y como se describe con más detalle a continuación. Preferiblemente, todos los ingredientes incluidos en el medio de cultivo de la presente divulgación son sustancialmente puros, con calidad de cultivo de tejidos.
El experto en la técnica sabrá seleccionar el medio de cultivo para cada tipo de tejido contemplado.
Según aspectos específicos de la divulgación, el medio de cultivo comprende suero, p. ej., suero de ternera fetal (FCS, se puede obtener, p. ej., a partir de productos de Gibco-Invitrogen Corporation).
Según aspectos específicos, el medio de cultivo comprende menos del 10% de suero.
Según aspectos específicos, el medio de cultivo comprende menos del 2% de suero obtenido a partir de la misma especie que el tejido cultivado.
Según aspectos específicos, el medio de cultivo está desprovisto de suero obtenido de la misma especie que el tejido cultivado.
Según aspectos específicos, el medio de cultivo comprende menos del 2% de suero autólogo del tejido cultivado (es decir, del mismo sujeto).
Según aspectos específicos, el medio de cultivo está desprovisto de suero autólogo del tejido cultivado (es decir, del mismo sujeto).
Según aspectos específicos, el medio de cultivo comprende menos del 2% de suero humano.
Según algunos aspectos de la divulgación, el medio de cultivo está desprovisto de suero humano.
Según algunos aspectos de la divulgación, el medio de cultivo está desprovisto de cualquier contaminante animal, es decir, células animales, fluido o agentes patógenos (por ejemplo, virus que infectan células animales), es decir, que está exento de xeno.
Según algunos aspectos de la divulgación, el medio de cultivo puede incluir adicionalmente antibióticos (por ejemplo, penicilina, estreptomicina, gentamicina), agentes antifúngicos (por ejemplo, anfotericina B), L-glutamina o NEAA (aminoácidos no esenciales).
Según un aspecto específico, el medio comprende suero y antibióticos.
Según un aspecto específico, el medio comprende DMEM/F12, 5% de FCS, glutamina, penicilina, estreptomicina, gentamicina y anfotericina B.
Cabe señalar que el medio de cultivo puede renovarse periódicamente para mantener niveles suficientes de complementos y eliminar los productos de desecho metabólicos que pueden dañar el tejido. Según aspectos específicos, el medio de cultivo se renueva cada 12-72 horas, cada 24-72 horas, cada 24-48 horas o cada 12-48 horas. Según aspectos específicos, el medio de cultivo se renueva cada 12-48 horas.
Según un aspecto específico, el medio de cultivo se renueva una vez después de 12-24 horas y luego aproximadamente cada 48 horas.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "inserto de cultivo de tejidos" se refiere a una membrana porosa suspendida en un recipiente para cultivo de tejidos y que es compatible con un cultivoex vivoposterior de un corte de tejido. El tamaño de poro es capaz de sostener el corte de tejido a la vez que es permeable al medio de cultivo permitiendo el paso de nutrientes y desechos metabólicos hacia y desde el corte, respectivamente. Según aspectos específicos, el corte de tejido se coloca sobre el inserto de cultivo de tejidos, permitiendo así el acceso del medio de cultivo tanto a las superficies apicales como basales del corte de tejido.
Según aspectos específicos, el tamaño de poro es de 0,1 gm - 20 gm, 0,1 gm - 15 gm, 0,1 gm - 10 gm, 0,1 gm - 5 gm, 0,4 gm - 20 gm, 0,4 gm - 10 gm o 0,4 gm - 5 gm.
Según aspectos específicos, el tamaño de poro es de 0,4 mm - 4 mm, 0,4 mm - 1 mm, 1 mm - 4 mm, 1 mm - 3 mm o 1 mm - 2 mm.
Según aspectos específicos, el inserto de cultivo de tejidos es estéril.
Según aspectos específicos, el inserto de cultivo de tejidos es desechable.
Según aspectos específicos, el inserto de cultivo celular es reutilizable y esterilizable en autoclave.
El inserto de cultivo celular puede ser sintético o natural, puede ser inorgánico o polimérico, p. ej., titanio, alúmina, politetrafluoroetileno (PTFE), teflón, acero inoxidable, policarbonato, nitrocelulosa y ésteres de celulosa. Según aspectos específicos, el inserto de cultivo celular es un inserto de titanio. Los insertos de cultivo celular que se pueden usar con aspectos específicos de la divulgación están disponibles comercialmente, p. ej., en Alabama R&D, Millipore Corporation, Costar, Coming Incorporated, Nunc, Vitron Inc. y SEFAR, e incluyen, sin limitarse a, insertos de placa de pocilios MA0036, BIOCOAT™, Transwell®, Millicell®, Falcon®-Cyclopore, Nunc® Anapore, rejilla de titanio y rejilla de teflón.
Según aspectos específicos, el inserto de cultivo de tejidos es un inserto de rejilla de titanio, tal como, sin limitarse a, insertos de placa de pocilios de titanio MA0036 (Alabama R&D).
Según aspectos específicos, el inserto de cultivo de tejidos no está recubierto con un material orgánico tal como colágeno, fibronectina o polietilenglicol (PEG).
Según aspectos específicos, el inserto de cultivo de tejidos no está recubierto con proteínas extraídas de un tejido compatible (por ejemplo, cuando el tejido es un tejido canceroso, entonces el inserto de cultivo de tejidos no está recubierto previamente con proteínas extraídas de tumores de grado y estadio coincidentes).
Según aspectos específicos, el corte de tejido está en contacto directo con el inserto de cultivo de tejidos.
Según aspectos específicos, el corte de tejido no está separado del medio de cultivo por un material orgánico heterólogo tal como colágeno, fibronectina o polímero sintético (que no forma parte del recipiente de cultivo), p. ej., polietilenglicol (PEG).
Según aspectos específicos, el corte de tejido está en contacto directo con el medio de cultivo.
Según aspectos específicos, el corte de tejido se coloca en el centro del inserto de cultivo celular. Así, p. ej., cuando se aplica una rejilla de titanio como los insertos de placa de pocilios de titanio MA0036, el corte de tejido se coloca en la concavidad ubicada en medio del inserto.
A continuación, el corte de tejido se cultiva (o se mantiene) a una temperatura fisiológica, p. ej., 37°C, en una atmósfera humidificada altamente oxigenada que contiene al menos un 50% de oxígeno y, p. ej., un 5% de CO2.
Según aspectos específicos, la atmósfera altamente oxigenada contiene al menos un 60%, al menos un 70% o al menos un 80% de oxígeno.
Según aspectos específicos, la atmósfera altamente oxigenada contiene al menos un 70% de oxígeno.
Según otros aspectos específicos, la atmósfera altamente oxigenada contiene menos de un 95% de oxígeno.
Según un aspecto específico, la atmósfera altamente oxigenada contiene aproximadamente un 80% de oxígeno.
Según un aspecto específico, durante el proceso de cultivo, el cultivo se agita en un movimiento rotatorio facilitando la inmersión intermitente del corte de tejido en el medio de cultivo.
Tal y como se usan en el presente documento, las expresiones "agitado rotacionalmente facilitando la inmersión intermitente del corte de tejido en el medio de cultivo" o "agitando en un movimiento rotatorio facilitando la inmersión intermitente del corte de tejido en el medio de cultivo" se refiere a una agitación que permite la inmersión periódica del corte de tejido en el medio, de forma que se facilita la difusión de nutrientes y gases por todo el medio y a través del corte de tejido.
Según aspectos específicos, la agitación es una agitación orbital.
Según aspectos específicos, la agitación es una agitación en ángulo, p. ej., un ángulo de 30° - 45°.
Según aspectos específicos, la agitación se efectúa mediante un aparato rotador inclinado (tal como la unidad de incubación MD2500 disponible comercialmente en Alabama Research and Development).
Según aspectos específicos, la frecuencia de agitación es de 50 - 200 rpm, 50 - 150 rpm o 50 - 100 rpm.
Según un aspecto específico, la frecuencia de agitación es de aproximadamente 70 rpm.
El cultivo de tejidos y los métodos de la presente divulgación se pueden adaptar a muchas aplicaciones, incluidas, sin limitarse a:
1. Investigación preclínica y básica que incluye:
- Estudiar mecanismos implicados en la salud y la enfermedad;
- Examinar un tejido patológico (por ejemplo, un tejido tumoral) para detectar la presencia de marcadores específicos;
- Detectar y/o desarrollar nuevos fármacos, como fármacos anticancerígenos o nuevas combinaciones de fármacos;
- Determinar la potencia de un lote de fármaco;
- Estudiar los mecanismos de sensibilidad y resistencia de tejidos humanos. Así, p. ej., el tratamiento del mismo tumor con múltiples fármacos y combinaciones de fármacos puede aprovecharse para un estudio funcional detallado que no se puede realizar fácilmente en pacientes humanos;
- Estudiar el microbioma tumoral: bacterias, virus u hongos que pueden estar presentes en los tumores cancerosos.
2. Someter a ensayo el efecto de nuevos fármacos o combinaciones de fármacos sobre cortes de tumores con el fin de priorizar fármacos o combinaciones de fármacos para un mayor desarrollo de fármacos, así como estudios funcionales, pruebas preclínicasin vivoy ensayos clínicos.
3. Predecir la respuesta de un paciente a los fármacos (por ejemplo, fármacos contra el cáncer) y combinaciones de fármacos y, en consecuencia, utilizar esa predicción para adaptar el régimen de tratamiento específico para el paciente (es decir, medicina personalizada).
4. Como el corte de tejido conserva la estructura y presenta una alta viabilidad después de 5 días de cultivo, este sistema permite modelar estudios de toxicidad crónica y aguda, incluida la actividad metabólica del tejido.
5. Un cultivo que presenta una respuesta positivaex vivopuede utilizarse como criterio para la inclusión de un paciente en un ensayo clínico. Por tanto, esta etapa puede preseleccionar pacientes con altas posibilidades de respuesta y, en consecuencia, puede mejorar las posibilidades de éxito de los ensayos clínicos. En tales casos el cultivo de tejidosex vivopodría convertirse más adelante en parte de los criterios de elegibilidad para el fármaco. Así, según aspectos específicos el sistema de cultivo comprende un fármaco.
Según otros aspectos específicos, el método de la presente divulgación descrito anteriormente comprende añadir un fármaco o una combinación de fármacos, como se describe adicionalmente a continuación.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la palabra "fármaco" se refiere a un agente que tiene un efecto antipatológico que incluye moléculas pequeñas y fármacos biológicos (por ejemplo, agentes de ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, aptámeros, etc.). Normalmente, el fármaco es exógeno al corte de tejido cortado con precisión o en el cuerpo humano o el tejido a partir del cual se obtiene el corte de tejido cortado con precisión. El fármaco puede ser un fármaco aprobado por las agencias reguladoras para el tratamiento de la patología o un fármaco en desarrollo. Según aspectos específicos, el fármaco es un lote de un fármaco.
Según aspectos específicos, el fármaco es un fármaco antiinflamatorio.
Ejemplos no limitantes de fármacos antiinflamatorios que se pueden usar con aspectos específicos de la divulgación incluyen: alclofenaco; dipropionato de alclometasona; acetónido de algestona; alfa amilasa; amcinafal; amcinafida; amfenaco sódico; clorhidrato de amiprilosa; anakinra; anirolaco; anitrazafeno; apazona; balsalazida disódica; bendazac; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelina; broperamol; budesonida; carprofeno; oioloprofeno; cintazona; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopirac; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; deflazacort; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenaco potásico; diclofenaco sódico; diacetato de diflorasona; diflumidona sódica; diflunisal; difluprednato; diftalona; dimetilsulfóxido; drocinonida; endrisona; enlimomab; enolicam sódico; epirizol; etodolaco; etofenamato; felbinac; fenamol; fenbufeno; fenclofenaco; fencloraco; fendosal; fenpipalona; fentiazaco; flazalona; fluazacort; ácido flufenámico; flumizol; acetato de flunisolida; flunixino; flunixina meglumina; fluocortina de butilo; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; furaprofeno; furobufeno; halcinonida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenaco; ibuprofeno; ibuprofeno aluminio; ibuprofeno piconol; ilonidap; indometacina; indometacina sódica; indoprofeno; indoxol; intrazol; acetato de isoflupredona; isoxepaco; isoxicam; ketoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lomoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato sódico; ácido meclofenámico; dibutirato de meclorisona; ácido mefenámico; mesalamina; meseclazona; suleptanato de metilprednisolona; momiflumato; nabumetona; naproxeno; naproxeno sódico; naproxol; nimazona; olsalazina sódica; orgoteína; orpanoxina; oxaprozina; oxifenbutazona; clorhidrato de paranilina; pentosano polisulfato de sodio; glicerato de sodio de fenbutazona; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; olamina de piroxicam; pirprofeno; prednazato; prifelona; ácido prodólico; procuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarita; salcolex; salnacedina; salsalato; cloruro de sanguinario; seclazona; sermetacina; sudoxicam; sulindaco; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap sódico; tenoxicam; tesicam; tesimida; tetridamina; tiopinaco; pivalato de tixocortol; tolmetina; tolmetina sódica; triclonida; triflumidato; zidometacina; zomepiraco sódico.
Según otros aspectos específicos, el fármaco es un fármaco anticancerígeno.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "fármaco anticancerígeno" se refiere a un agente que tiene un efecto antitumoral que incluye quimioterapia, moléculas pequeñas, fármacos biológicos, terapia hormonal, anticuerpos y terapia dirigida.
Los fármacos contra el cáncer que se pueden usar con aspectos específicos de la divulgación incluyen, sin limitarse a: acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adriamicina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimero; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; estramustina fosfato sódico; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-n1; interferón alfa-n3; interferón beta-la; interferón gamma-lb; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromán; piposulfano; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato de sodio; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; taxol; tecogalán de sodio; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofuirina; tirapazamina; clorhidrato de topotecán; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorrubicina. Agentes antineoplásicos adicionales incluyen los descritos en el capítulo 52, Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner), y su introducción, 1202-1263, de Goodman and Gilman’s "The Pharmacological Basis of Therapeutics", octava edición, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division).
Ejemplos no limitantes de fármacos contra el cáncer aprobados incluyen: abarelix, aldesleucina, aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido de arsénico, asparaginasa, azacitidina, AZD9291, AZD4547, AZD2281, bevacuzimab, bexaroteno, bleomicina, bortezombib, busulfano, calusterona, capecitabina, carboplatino, carmustina, celecoxib, cetuximab, cisplatino, cladribina, clofarabina, ciclofosfamida, citarabina, dabrafenib, dacarbazina, dactinomicina, actinomicina D, darbepoetina alfa, darbepoetina alfa, daunorrubicina liposomal, daunorrubicina, deeifabina, denileucina diftifox, dexrazoxano, dexrazoxano, doeetaxel, doxorrubicina, propionato de dromostanolona, solución B de Elliott, epirrubicina, epoetina alfa, erlotinib, estramustina, etopósido, exemestano, filgrastim, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo 5-FU, fulvestrant, gefitinib, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, acetato de goserelina, acetato de histrelina, hidroxiurea, ibritumomab tiuxetán, idarrubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferón alfa 2a, interferón alfa-2b, irinotecán, lenalidomida, letrozol, leucovorina, acetato de leuprolida, levamisol, lomustina, CCNU, mecloretamina, mostaza nitrogenada, acetato de megestrol, melfalán, L-PAM, mercaptopurina 6-MP, mesna, metotrexato, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, fenpropionato de nandrolona, nelarabina, nofetumomab, oprelvequina, oprelvequina, oxaliplatino, paclitaxel, palbociclib palifermina, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pemetrexed disódico, pentostatina, pipobromán, plicamicina, mitramicina, porfímero sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicasa, rituximab, sargramostim, sorafenib, estreptozocina, maleato de sunitinib, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido VM-26, testolactona, tioguanina 6-TG, tiotepa, tiotepa, topotecán, toremifeno, tositumomab, trametinib, trastuzumab, tretinoína ATRA, mostaza de uracilo, valrubicina, vinblastina, vinorelbina, zoledronato y ácido zoledrónico.
Según aspectos específicos, el fármaco anticancerígeno se selecciona a partir del grupo formado por gefitinib, lapatinib, afatinib, BGJ398, CH5183284, linsitinib, PHA665752, crizotinib, sunitinib, pazopanib, imatinib, ruxolitinib, dasatinib, BEZ235, pictilisib, everolimus, MK-2206, trametinib/AZD6244, vemurafinib/dabrafenib, CCT196969/CCT241161, barasertib, VX-680, nutlina 3, palbociclib, Bl 2536, bardoxolona, vorinostat, navitoclax (ABT263), bortezomib, vismodegib, olaparib (AZD2281), simvastatina, 5-fluorouracilo, irinotecán, epirrubicina, cisplatino y oxaliplatino.
Según aspectos específicos, el fármaco anticancerígeno se selecciona a partir del grupo formado por 4-hidroperoxi ciclofosfamida, 5-fluorouracilo (5FU), oxaliplatino, irinotecán, docetaxel, cisplatino, trametinib, palbociclib y AZD4547.
Según aspectos específicos, el fármaco anticancerígeno se selecciona a partir del grupo formado por 5-fluorouracilo (5FU), oxaliplatino, irinotecán, cisplatino, 4-hidroperoxi ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, navalbina, gemcitabima, gefitinib, tamoxifeno, olaparib, trametinib, everolimus y palbociclib.
Se apreciará que el sistema de cultivo y los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para someter a ensayo el efecto diferencial de combinaciones de fármacos.
Por tanto, según aspectos específicos, el fármaco es una combinación de fármacos.
Se pueden obtener concentraciones específicas del fármaco en el sistema de cultivo y los métodos de la presente divulgación, cultivando diferentes concentraciones de fármaco en diversos tejidos cancerosos (del mismo tipo o de diferente tipo) y evaluando el intervalo con el que se logra una respuesta dependiente de la dosis. Normalmente, ese intervalo dependiente de la dosis refleja el espectro mediante el cual se espera que el tejido canceroso cultivado responda o no muestre una respuesta, lo que produce un resultado predictivo.
Según aspectos específicos, la concentración de fármaco en el sistema de cultivo y los métodos de la presente divulgación es al menos la misma que la dosis Cl50 de fármaco en una línea celular (por ejemplo, una línea celular del mismo tipo de tejido y/o especie).
Según aspectos específicos, la concentración de fármaco en el sistema de cultivo y los métodos de la presente divulgación es mayor que la dosis Cl50 de fármaco en una línea celular (por ejemplo, una línea celular del mismo tipo de tejido y/o especie).
Según aspectos específicos, la concentración de fármaco en el sistema de cultivo y los métodos de la presente divulgación es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces la dosis Cl50 de fármaco en una línea celular (por ejemplo, una línea celular del mismo tipo de tejido y/o especie).
Según aspectos específicos, la concentración de fármaco en el sistema de cultivo y los métodos de la presente divulgación es al menos 10 veces la dosis Cl50 de fármaco en una línea celular (por ejemplo, una línea celular del mismo tipo de tejido y/o especie).
Las concentraciones específicas de fármacos anticancerígenos que se pueden usar con algunos aspectos de la presente divulgación se muestran en las Tablas 5-6 del presente documento a continuación.
Tabla 5: Intervalos de concentración específicos de fármacos anticancerígenos
Tabla 6: Concentraciones específicas de fármacos contra el cáncer.
Según aspectos específicos, se preparan y se cultivan varios cortes de tejido procedentes de un tejido en varios recipientes de cultivo (por ejemplo, pocilios de una placa), lo que permite someter a ensayo una cantidad de fármacos y combinaciones de fármacos,
Según aspectos específicos, los métodos de la divulgación comprenden:
(i) determinar el efecto de una pluralidad (por ejemplo, al menos 2) de fármacos según el método de la presente divulgación; y
(ii) determinar el efecto de combinaciones de fármacos que han demostrado ser eficaces según la etapa (i), en donde una mayor sensibilidad del tejido frente a una combinación de fármacos indica una eficacia de la combinación de fármacos,
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "sensibilidad incrementada" se refiere a un aumento en el efecto inducido por la combinación de fármacos en comparación con el efecto inducido por cada uno de los fármacos en la combinación, lo que puede ser mediante un efecto aditivo o un efecto sinérgico, Según aspectos específicos, el efecto es un efecto sinérgico,
Según aspectos específicos, el aumento es de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces en comparación con el efecto inducido por cada uno de los fármacos en la combinación,
Según otros aspectos específicos, el aumento es de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%<o>más del 100% en comparación con el efecto Inducido por cada uno de los fármacos de la combinación.
Como se ha mencionado, según aspectos específicos, el tejido o los cortes de tejido se pueden almacenar, es decir, a 4°C o crioconservar y descongelar según se desee, lo que permite realizar pruebas en serie de varios fármacos y combinaciones de fármacos de forma secuencial,
Por tanto, p, ej,, según aspectos específicos, los métodos de la divulgación comprenden:
(i) determinar el efecto de al menos dos fármacos según el método de la divulgación;
(ii) cultivar un corte de tejido adicional obtenido a partir del tejido patológico obtenido del sujeto (por ejemplo, después de una crioconservación y descongelación) según el método de la presente divulgación;
(iii) añadir combinaciones de fármacos determinados que son eficaces para el tratamiento de la enfermedad en el sujeto según la etapa (i); y
(iv) determinar el efecto de la combinación de fármacos sobre el corte de tejido, en donde una mayor sensibilidad del corte de tejido frente a la combinación de fármacos indica una eficacia de la combinación de fármacos para el tratamiento de la enfermedad en el sujeto,
El fármaco o la combinación de fármacos se puede añadir al cultivo en varios momentos, Según aspectos específicos, el fármaco se añade al cultivo 2-48 horas, 2-36, 2-24, 12-48, 12-36 o 12-24 horas después del inicio del cultivo, Según un aspecto específico, el fármaco o la combinación de fármacos se añade al cultivo 12-24 horas después del inicio del cultivo,
Según un aspecto específico, el fármaco o la combinación de fármacos se añade al cultivo 12-36 horas después del inicio del cultivo,
Según un aspecto específico, el fármaco o la combinación de fármacos se añade al cultivo 12-48 horas después del inicio del cultivo,
El cultivo en presencia del fármaco o de la combinación de fármacos puede realizarse durante todo el período de cultivo desde la primera adición del fármaco o puede limitarse en el tiempo, De forma alternativa, o adicional, el fármaco o la combinación de fármacos se puede añadir al cultivo varias veces, p, ej,, cuando se renueva el medio de cultivo, La selección de la concentración de fármaco y el tiempo de incubación con el fármaco o la combinación de fármacos están dentro de las competencias de los expertos en la técnica,
Según aspectos específicos, la concentración de fármaco y el tiempo de incubación con el fármaco o la combinación de fármacos dan como resultado un efecto detectable sobre el tejido, tal y como se describe con más detalle a continuación,
La selección de la concentración del fármaco utilizado para las pruebasex vivoque darán como resultado un efecto detectable sobre el tejido, están dentro de las competencias de los expertos en la técnica, Preferiblemente, la concentración utilizada debería estar dentro del intervalo lineal del parámetro seleccionado,
La cantidad de concentración del fármaco sometido a ensayo puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 6, 1 -10, 2-10, 3-10, 5-10, 1 -5, 2-5 y 3-5 concentraciones diferentes en el mismo ensayo,
El número de repeticiones de las muestras para cada una de las concentraciones de fármaco analizadas, puede ser 2, 3, 4, 5 o 6 repeticiones,
Después del cultivo, se puede determinar el efecto del fármaco o la combinación de fármacos sobre el tejido, para determinar de ese modo la eficacia de un fármaco,
Así, según otro aspecto de la presente divulgación, existe un método para determinar la eficacia de un fármaco o un lote de un fármaco, comprendiendo el método:
(i) cultivar un corte de tejido cortado con precisión sobre un inserto de cultivo de tejidos en un medio de cultivo en una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos un 50% de oxígeno; y agitar el cultivo con una rotación que facilite la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo;
(ii) añadir el fármaco o el lote de un fármaco a dicho medio de cultivo; y
(iii) determinar el efecto de dicho fármaco o dicho lote de un fármaco sobre dicho tejido, en donde la sensibilidad de dicho tejido frente a dicho fármaco indica la eficacia de dicho fármaco,
Según aspectos específicos, la etapa determinante se efectúa después de un tiempo de cultivo predeterminado. El tiempo de cultivo puede variar y la determinación del tiempo de cultivo que dará como resultado un efecto detectable está dentro de las competencias de los expertos en la técnica.
Según aspectos específicos, la determinación se efectúa a los 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5 o 4-5 días de cultivo.
Según un aspecto específico, la determinación se efectúa a los 3-5 días de cultivo.
Según otro aspecto específico, la determinación se efectúa a los 4-5 días del cultivo.
Los métodos para determinar los efectos inducidos por el fármaco o la combinación de fármacos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo;
- Evaluación de la viabilidad utilizando, p. ej., la prueba MTT que se basa en la capacidad selectiva de las células vivas para reducir la sal amarilla MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma, Aldrich St Louis, MO, EE. UU.) a un precipitado de formazán insoluble de color azul púrpura; el ensayo WST o el ensayo de captación de ATP;
- Evaluación de la proliferación utilizando, p. ej., el ensayo BrDu [kit colorimétrico de BrdU de ELISA para proliferación celular (Roche, Mannheim, Alemania)] o tinción Ki67;
- Evaluación de la muerte celular utilizando, p. ej., el ensayo TUNEL [Roche, Mannheim, Alemania] el ensayo Anexina V [kit de apoptosis de anexina V de ApoAlert® (Clontech Laboratories, Inc., CA, EE. UU.)], el ensayo LDH, el ensayo de caspasa 3 activada, el ensayo de caspasa 8 activada y el ensayo de óxido nítrico sintasa;
- Evaluación de la senescencia usando, p. ej., ,el ensayo de p-galactosidasa asociada a la senescencia (Dimri GP, Lee X, et al. 1995. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 92:9363-9367) y el ensayo de acortamiento de la telomerasa;
- Evaluación del metabolismo celular utilizando, p. ej., el ensayo de captación de glucosa;
- Diversos métodos de detección de ARN y proteínas (que detectan el nivel de expresión y/o actividad); y
- Evaluación de la morfología utilizando, p. ej., la tinción con hematoxilina y eosina (H&E);
Según aspectos específicos, la determinación se realiza mediante evaluación de la morfología, evaluación de la viabilidad, evaluación de la proliferación y/o evaluación de la muerte celular.
Según aspectos específicos, la determinación se realiza mediante evaluación morfológica.
La evaluación morfológica mediante la tinción H&E puede proporcionar detalles sobre, p. ej., contenido, tamaño y densidad celulares, proporción de células viables/células muertas, proporción de células enfermas (por ejemplo, tumorales) / células sanas, infiltración de células inmunes, fibrosis, tamaño, densidad e integridad nucleares, cuerpos apoptóticos y figuras mitóticas. Según aspectos específicos, el efecto del fármaco sobre el tejido se determina mediante una evaluación de la morfología, p. ej., con un patólogo.
Normalmente, los resultados de cada uno de los ensayos se expresan en forma numérica en donde una puntuación alta se correlaciona con sensibilidad al fármaco y una puntuación baja se correlaciona con resistencia al fármaco.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "sensibilidad frente a un fármaco" o "sensibilidad frente a una combinación de fármacos" se refiere a la capacidad de un fármaco o una combinación de fármacos para inducir cambios celulares tales como cambios en la viabilidad celular, tasa de proliferación, diferenciación, muerte celular, necrosis, apoptosis, senescencia, tasa de transcripción y/o traducción de genes específicos y/o cambios en los estados de las proteínas, p. ej., fosforilación, desfosforilación, translocación y cualquier combinación de las mismas. Según aspectos específicos, los cambios celulares se reflejan en una disminución de la viabilidad celular, una disminución de la tasa de proliferación, un aumento de la muerte celular y/o una morfología aberrante en comparación con los mismos en ausencia del fármaco.
Según un aspecto específico los cambios celulares se reflejan en una disminución de la viabilidad celular.
Según un aspecto específico los cambios celulares se reflejan en una morfología aberrante.
Según aspectos específicos, el cambio es de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces en comparación con el mismo en ausencia del fármaco.
Según otros aspectos específicos el cambio es de al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o al menos un 100% en comparación con el mismo en ausencia del fármaco.
Según aspectos específicos, la eficacia determinada del fármaco indica la potencia de un lote de fármaco, es decir, la sensibilidad frente al fármaco es indicativa de que el lote es potente.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "potencia" se refiere a la medición de la actividad biológica del fármaco, basándose en el atributo del fármaco que está ligado a las propiedades biológicas relevantes (es decir, sensibilidad frente al fármaco).
Según aspectos específicos de la divulgación, el método comprende comparar la sensibilidad del tejido frente al fármaco con la sensibilidad del tejido frente a un lote estándar de referencia del fármaco, para determinar la potencia relativa del lote.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "potencia relativa" se refiere a una medición cualitativa de la potencia de un lote del fármaco, en relación con un patrón de referencia (RS) del fármaco, que tiene una potencia conocida.
Según aspectos específicos, la potencia de un lote del fármaco se determina en relación con la potencia conocida de un patrón de referencia (RS).
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "patrón de referencia" o "RS" se refiere a un fármaco estandarizado, que se utiliza como base de medición para el fármaco. El RS proporciona un nivel calibrado del efecto biológico con el que se pueden comparar nuevas preparaciones del fármaco.
Según un aspecto específico, el RS se caracteriza por una potencia y calidad óptimas de un componente activo que es eficaz en el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, enfermedad inflamatoria, cáncer).
El cálculo de la potencia y la potencia relativa se conoce en la técnica. Según aspectos específicos, la potencia relativa se calcula utilizando un programa informático adecuado para ensayos biológicos, tal como un programa informático de análisis de líneas paralelas, p. ej., PLA (Stegmann Systems GmbH) y un programa informático de análisis de datos Gen5 (BioTek).
La implementación del método y/o el sistema de aspectos de la divulgación puede implicar realizar o completar tareas seleccionadas de forma manual, automática o una combinación de las mismas. Además, de acuerdo con la instrumentación y el equipamiento reales de los aspectos del método y/o el sistema de la divulgación, diversas tareas seleccionadas podrían implementarse mediante un soporte físico, programa informático o soporte lógico inalterable (hardware, software o firmware) o mediante una combinación de los mismos utilizando un sistema operativo.
Según aspectos específicos, la eficacia determinada del fármaco o de la combinación de fármacos indica la idoneidad del fármaco para el tratamiento de una enfermedad.
Como los presentes inventores muestran que el sistema EVOC desarrollado puede predecir las respuestas de tumores frente a fármacos anticancerígenos y al tratamiento combinado (Ejemplo 2 en la sección de Ejemplos a continuación), la presente divulgación también contempla el uso de los sistemas y métodos de cultivo descritos en el presente documento para predecir la respuesta de un sujeto específico frente a un régimen de tratamiento, seleccionando de ese modo el régimen de tratamiento adecuado para ese sujeto específico y tratando al sujeto de acuerdo con esa selección.
Por tanto, según un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para seleccionar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método:
(i) cultivar un corte de tejido patológico cortado con precisión obtenido del sujeto, sobre un inserto de cultivo de tejidos en un medio de cultivo bajo una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos un 50% de oxígeno; y agitar el cultivo con una rotación que facilite la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo;
(ii) añadir el fármaco a dicho medio de cultivo; y
(iii) determinar el efecto de dicho fármaco sobre dicho tejido, en donde una sensibilidad de dicho tejido frente a dicho fármaco indica la eficacia de dicho fármaco para el tratamiento de dicha enfermedad en dicho sujeto.
Según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método:
(a) seleccionar un fármaco o una combinación de fármacos según el método descrito en el presente documento; y
(b) administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco o una combinación de fármacos que muestren una eficacia para el tratamiento de dicha enfermedad en dicho sujeto, tratando de ese modo la enfermedad en el sujeto.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un sujeto mamífero (por ejemplo, un ser humano) al que se le diagnostica la enfermedad o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad. También se contemplan usos veterinarios. El sujeto puede ser de cualquier género y tener cualquier edad, incluidos neonatos, bebés, jóvenes, adolescentes, adultos y adultos mayores.
El término "tratar" se refiere a inhibir o detener el desarrollo de una patología (enfermedad, trastorno o afección) y/o provocar la reducción, remisión o regresión de una patología. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una patología y, de manera similar, se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una patología.
La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco o de una combinación de fármacos está dentro de las competencias de los expertos en la técnica. La dosificación puede variar dependiendo del fármaco elegido, la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico encargado de cara al estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1 pág.1).
Según aspectos específicos, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria que puede ser una enfermedad inflamatoria crónica o una enfermedad inflamatoria aguda.
Enfermedades inflamatorias asociadas con hipersensibilidad.
Ejemplos no limitantes de hipersensibilidad incluyen:
Hipersensibilidad de tipo II que incluye, sin estar limitada a, enfermedades reumatoides, enfermedades autoinmunes reumatoides, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol, julio de 2000; 15 (3):791), espondilitis, espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunes sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2):49), esclerosis, esclerosis sistémica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 marzo; 6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev, junio de 1999; 169:107), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunes glandulares, enfermedades autoinmunes pancreáticas, diabetes, diabetes tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 octubre; 34 Suplemento: S125), enfermedades de la tiroides, enfermedades autoinmunes de la tiroides, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 junio; 29 (2):339), tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 de diciembre de 2000; 165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema, mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 agosto; 57 (8):1759); enfermedades reproductivas autoinmunes, enfermedades ováricas, autoinmunidad ovárica (Garza KM. et al., J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37 (2):87), infertilidad autoinmune antiespermática (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. Marzo de 2000; 43 (3):134), pérdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2:S107-9), enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neurológicas, enfermedades neurológicas autoinmunes, esclerosis múltiple (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 1 de enero de 2001; 112 (1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997; 49:77), miastenia grave (Infante AJ. y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1 -2) :83), neuropatías motoras (Komberg AJ. J Clin Neurosci. Mayo de 2000; 7 (3):191), síndrome de Guillain-Barré, neuropatías y neuropatías autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 abril; 319 (4):234), enfermedades miasténicas, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 abril; 319 (4):204), enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica, síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatías, poliendocrinopatías autoinmunes (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París) enero de 2000; 156 (1):23); neuropatías, neuropatías disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Supl 1999; 50:419); neuromiotonía, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci.
13 de mayo de 1998; 841:482), enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes cardiovasculares, aterosclerosis (Matsuura E. et al., Lupus. 1998; 7 Suplemento 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Suplemento 2:S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2:S107-9), granulomatosis, granulomatosis de Wegener, arteritis, arteritis de Takayasu y síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660); enfermedad autoinmune antifactor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost. 2000; 26 (2): 157); vasculitis, vasculitis necrosantes de pequeños vasos, poliangeítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis, glomerulonefritis necrosante focal pauci-inmune, glomerulonefritis semilunar (Noel LH. Ann Med Interne (París). Mayo de 2000; 151 (3):178); síndrome antifosfolípido (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171); insuficiencia cardíaca, anticuerpos agonistas del receptor adrenérgico p en la insuficiencia cardíaca (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de junio de 1999; 83 (12A):75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 abril-junio; 14 (2):114); anemia hemolítica, anemia hemolítica autoinmune (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma, enero de 1998; 28 (3-4):285), enfermedades gastrointestinales, enfermedades autoinmunes del tracto gastrointestinal, enfermedades intestinales, enfermedad inflamatoria intestinal crónica (García Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 23 de enero de 2000 (1): 16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138 (2):122), enfermedades autoinmunes de la musculatura, miositis, miositis autoinmune, síndrome de Sjogren (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol, septiembre de 2000; 123 (1):92); enfermedad autoinmune del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother junio de 1999; 53 (5-6):234), enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunes hepáticas, hepatitis autoinmune (Manns MP. J Hepatol 2000 agosto; 33 (2) i326) y cirrosis biliar primaria (Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. Junio de 1999; 11 (6):595);
Hipersensibilidad mediada por linfocitos T o células de tipo IV, que incluyen, sin estar limitada a, enfermedades reumatoides, artritis reumatoide (Tisch R, McDevitt HO. Proc Nati Acad Sci U S A 1994 18 de enero; 91 (2):437), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunes sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Datta SK., Lupus 1998; 7 (9):591), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunes glandulares, enfermedades pancreáticas, enfermedades autoinmunes pancreáticas, diabetes tipo 1 (Castaño L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647); enfermedades de la tiroides, enfermedades autoinmunes de la tiroides, enfermedad de Graves (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol, marzo de 1993; 92 (1):77); enfermedades de los ovarios (Garza KM. et al., J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37 (2):87), prostatitis, prostatitis autoinmune (Alexander RB. et al., Urology, diciembre de 1997; 50 (6):893), síndrome poliglandular, síndrome poliglandular autoinmune, síndrome poliglandular autoinmune de tipo I (Hara T. et al., Blood. 1 de marzo de 1991; 77 (5): 1127), enfermedades neurológicas, enfermedades neurológicas autoinmunes, esclerosis múltiple, neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, mayo de 1994; 57 (5):544), miastenia grave (Oshima M. et al., Eur J Immunol, diciembre de 1990; 20 (12):2563), síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Nati Acad Sci U S A 27 de marzo de 2001; 98 (7):3988), enfermedades cardiovasculares, autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 15 de octubre; 98 (8):1709), púrpura trombocitopénica autoinmune (Semple JW. et al., Blood 1996 15 de mayo; 87 (10):4245), autoinmunidad de linfocitos T colaboradores (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9), anemia hemolítica (Sallah S. et al., Ann Hematol, marzo de 1997; 74 (3): 139), enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunes hepáticas, hepatitis, hepatitis crónica activa (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol, marzo de 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar, cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) noviembre de 1996; 91 (5) :551), enfermedades néfricas, enfermedades autoinmunes néfricas, nefritis, nefritis intersticial (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 agosto; 1 (2):140), enfermedades del tejido conectivo, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunes del tejido conectivo, enfermedades autoinmunes del oído (Yoo TJ. et al., Cell Immunol, agosto de 1994; 157 (1):249), enfermedad del oído interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 29 de diciembre de 1997; 830:266), enfermedades de la piel, enfermedades cutáneas, enfermedades dérmicas, enfermedades de la piel ampollosas, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo.
Hipersensibilidad de tipo retardado que incluye, sin estar limitada a, dermatitis de contacto y erupción farmacológica.
Enfermedades autoinmunes
Incluyen, sin estar limitadas a, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutáneas, enfermedades hepáticas, enfermedades neurológicas, enfermedades musculares, enfermedades néfricas, enfermedades relacionadas con la reproducción, enfermedades del tejido conectivo y enfermedades sistémicas.
Ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, aterosclerosis (Matsuura E. et al., Lupus. 1998; 7 suplemento 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 suplemento 2:S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2:S107-9), granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660), enfermedad autoinmune antifactor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2): 157), vasculitis necrotizante de pequeños vasos, poliangeítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrosante focal pauciinmune y glomerulonefritis semilunar (Noel LH. Ann Med Interne (París). Mayo de 2000; 151 (3):178), síndrome antifosfolípido (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171), insuficiencia cardíaca inducida por anticuerpos (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de junio de 1999; 83 (12A):75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 abril-junio; 14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 15 de mayo; 87 (10):4245), anemia hemolítica autoinmune (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma, enero de 1998; 28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol, marzo de 1997; 74 (3): 139), autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 15 de octubre; 98 (8):1709) y autoinmunidad de linfocitos T colaboradores (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9).
Ejemplos de enfermedades reumatoides autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol, julio de 2000; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Nati Acad Sci USA 1994 18 de enero; 91 (2):437) y espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).
Ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, enfermedad pancreática, diabetes de tipo I, enfermedad de la tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmune antiespermática, prostatitis autoinmune y síndrome poliglandular autoinmune de tipo I. Las enfermedades incluyen, sin estar limitadas a, enfermedades autoinmunes del páncreas, diabetes de tipo 1 (Castaño L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Octubre; 34 Suplemento: S125), enfermedades autoinmunes de la tiroides, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 junio; 29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol, marzo de 1993; 92 (1):77), tiroiditis autoinmune espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 de diciembre de 2000; 165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema idiopátioo (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 agosto; 57 (8):1759), autoinmunidad ovárioa (Garza Km. et al., J Reprod immunol, febrero de 1998; 37 (2):87), infertilidad autoinmune antiespermátioa (Diekman AB. et al., Am J Reprod immunol. Marzo de 2000; 43 (3):134), prostatitis autoinmune (Alexander RB. et al., ürology, diciembre de 1997; 50 (6):893) y síndrome poliglandular autoinmune de tipo i (Hara T. et al., Blood. 1 de marzo de 1991; 77 (5):1127).
Ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas (Garoía Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 23 de enero de 2000 (1):16), enfermedad oelíaoa (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138 (2):122), colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.
Ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunitarias incluyen, sin estar limitadas a, enfermedades cutáneas ampollosas autoinmunitarias, tales como, sin estar limitadas a, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo.
Ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmune (Franco A. et al., Clin immunol immunopathol, marzo de 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Soi (Coloh) noviembre de 1996; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. Junio de 1999; 11 (6):595) y hepatitis autoinmune (Manns MP. J Hepatol 2000 agosto; 33 (2):326).
Ejemplos de enfermedades neurológioas autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, esclerosis múltiple (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 1 de enero de 2001; 112 (1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997; 49:77), miastenia grave (infante AJ. y Kraig E, int Rev immunol 1999; 18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J immunol, diciembre de 1990; 20 (12):2563), neuropatías, neuropatías motoras (Komberg AJ. J Clin Neurosoi. Mayo de 2000; 7 (3): 191); síndrome de Guillain-Barré y neuropatías autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Soi. 2000 abril; 319 (4):234), miastenia, síndrome miasténioo de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Soi. 2000 abril; 319 (4):204); enfermedades neurológioas paraneoplásioas, atrofia oerebelosa, atrofia oerebelosa paraneoplásioa y síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proo Natl Aoad Soi üSA 2001 27 de marzo; 98 (7):3988); síndrome del hombre rígido no paraneoplásioo, atrofias oerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófioa, corea de Sydeham, síndrome de Gilíes de la Tourette y poliendoorinopatías autoinmunes (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París) enero de 2000; 156 (1):23); neuropatías disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Eleotroenoephalogr Clin Neurophysiol Supl 1999; 50:419); neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple oongénita (Vincent A. et al., Ann N Y Aoad Soi. 13 de mayo de 1998; 841:482), neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, mayo de 1994; 57 (5):544) y enfermedades neurodegenerativas.
Ejemplos de enfermedades musculares autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, miositis, miositis autoinmune y síndrome de Sjogren primario (Feist E. et al., int Aroh Allergy immunol, septiembre de 2000; 123 (1):92) y enfermedad autoinmune del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmaoother junio de 1999; 53 (5-6):234).
Ejemplos de enfermedades néfrioas autoinmunes inoluyen, sin estar limitadas a, nefritis y nefritis interstioial autoinmune (Kelly CJ. J Am Soo Nephrol 1990 agosto; 1 (2): 140).
Ejemplos de enfermedades autoinmunes relacionadas con la reproducción incluyen, sin estar limitadas a, pérdidas fetales repetidas (Tinoani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2:S107-9).
Ejemplos de enfermedades autoinmunes del tejido conectivo incluyen, sin estar limitadas a, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunes del oído (Yoo TJ. et al., Cell immunol, agosto de 1994; 157 (1):249) y enfermedades autoinmunes del oído interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Aoad Soi 29 de diciembre de 1997; 830:266).
Ejemplos de enfermedades sistémioas autoinmunes incluyen, sin estar limitadas a, lupus eritematoso sistémioo (Erikson J. et al., immunol Res 1998; 17 (1-2):49) y esclerosis sistémioa (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab immunol. 1999 marzo; 6 (2): 156); Chan OT. et al., immunol Rev, junio de 1999; 169:107).
Enfermedades infecciosas
Ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, sin estar limitadas a, enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades protozoarias, enfermedades parasitarias, enfermedades fúngioas, enfermedades por miooplasmas y enfermedades priónicas.
Según aspectos específicos, la enfermedad es cáncer.
Los términos "cáncer" y "canceroso" describen el estado fisiológico en los mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Tal y como se usan en el presente documento, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a cualquier tumor sólido, metástasis de cáncer y/o un preoánoer sólido.
Ejemplos de cáncer incluyen, sin estar limitados a, carcinoma, blastoma, sarcoma y linfoma. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluido cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenooaroinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), glioma, melanoma, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, gastroesofágioo<o>de estómago (incluido el cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma carcinoide de sarcoma de Kaposi y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.
Los precánceres están bien caracterizados y son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Berman JJ. y Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak. 3:8). Ejemplos de precánceres incluyen, sin estar limitados a, precánceres pequeños adquiridos, lesiones grandes adquiridas con atipia nuclear, lesiones precursoras que ocurren con síndromes hiperplásicos hereditarios que progresan a cáncer, e hiperplasias difusas y metaplasias difusas adquiridas. Ejemplos no limitantes de precánceres pequeños incluyen HGSIL (lesión intraepitelial escamosa de alto grado del cuello uterino), AIN (neoplasia intraepitelial anal), displasia de cuerdas vocales, criptas aberrantes (de colon), PIN (neoplasia intraepitelial prostática).
Ejemplos no limitantes de lesiones grandes adquiridas con atipia nuclear incluyen adenoma tubular, AILD (linfadenopatía angioinmunoblástica con disproteinemia), meningioma atípico, pólipo gástrico, parapsoriasis en placas grandes, mielodisplasia, carcinoma papilar de células de transiciónin situ,anemia refractaria con exceso de blastos y papiloma de Schneider. Ejemplos no limitantes de lesiones precursoras que ocurren con síndromes hiperplásicos hereditarios que progresan a cáncer incluyen síndrome de lunar atípico, adenomatosis de células C y MEA. Ejemplos no limitantes de hiperplasias difusas adquiridas y metaplasias difusas incluyen la enfermedad ósea de Paget y la colitis ulcerosa.
Según aspectos específicos, el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer gastroesofágico y cáncer de mama.
Según aspectos específicos, el cáncer es un cáncer metastásico.
Como están disponibles diversas tecnologías adicionales para predecir la respuesta de un paciente frente a un régimen de tratamiento, los métodos de la presente divulgación se pueden combinar con otros métodos conocidos en la técnica, tales como, pero sin estar limitados a, perfiles genéticos, líneas celulares obtenidas a partir de tumores generadas desde tumores de pacientes y modelos de xenoinjertos obtenidos a partir de pacientes (PDX), como también se describen en la sección de Ejemplos a continuación.
Según aspectos específicos, el método se lleva a cabo en combinación con un perfil genético.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "perfil genético" se refiere a la firma molecular de un conjunto de genes en muestras biológicas, utilizando cualquier tecnología de análisis adecuada, tal como, sin estar limitada a, secuenciación de ADN, secuenciación de ARN y técnicas de micromatrices.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.
Los términos y expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a".
La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas del producto, composición, método o estructura reivindicados.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la forma singular "un", "una" y "el, la" incluye referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar diversos aspectos de esta divulgación en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la divulgación. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo describe específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente descritos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 al 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, p. ej., 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que en el presente documento se indique un intervalo numérico, se entiende que incluye cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las expresiones "que van/varían entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que van/varían desde" un primer número indicado "hasta" un segundo número indicado, se utilizan en este documento indistintamente y se entiende que incluyen el primer y el segundo número indicado y todos los números fraccionarios e integrales entre los mismos.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluidos, sin estar limitados a, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos o fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las ciencias químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
Cuando se hace referencia a listados de secuencias particulares, se debe entender que esa referencia también incluye secuencias que corresponden sustancialmente a su secuencia complementaria e incluye variaciones menores de la secuencia, resultantes de, p. ej., errores de secuenciación, errores de clonación u otras alteraciones que dan como resultado una sustitución de bases, deleción de bases o adición de bases, siempre que la frecuencia de esas variaciones sea inferior a 1 entre 50 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 entre 100 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 entre 200 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 entre 500 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 entre 1.000 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 entre 5.000 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 entre 10.000 nucleótidos.
Se aprecia que ciertas características de la divulgación que, para mayor claridad, se describen en el contexto de aspectos separados, también se pueden proporcionar combinadas en un solo aspecto. Por el contrario, diversas características de la divulgación que, por brevedad, se describen en el contexto de un único aspecto, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otro aspecto descrito de la divulgación. Ciertas características descritas en el contexto de varios aspectos no deben considerarse características esenciales de esos aspectos, a menos que el aspecto no sea operativo sin esos elementos.
Diversos aspectos y aspectos de la presente divulgación tal y como se han descrito anteriormente en el presente documento y como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran un soporte experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunos aspectos de la divulgación de forma no limitativa.
Generalmente, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente divulgación incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Esas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, p. ej., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes l-lll Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías establecidas en los documentos de patente de EE. UU. n2 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes l-lll Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes l-lll Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular lmmunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles están ampliamente descritos en la bibliografía científica y de patentes, véanse, p. ej., los documentos de patente de EE. UU. n2.3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. l., ed. (1986); "lmmobilized Cells and Enzymes" lRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). A lo largo de ese documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos allí mencionados son ampliamente conocidos en el ámbito y se proporcionan para la comodidad del lector.
Materiales y métodos
Cortes de tejido- Se obtuvieron tejidos sanos y cancerosos (hígado, pulmón, colon, mama, páncreas o tejidos metastásicos de cáncer procedentes de pulmón, colon, mama o páncreas) a partir de modelos de ratón PDX (Nod Scid Gamma Mice Jackson Laboratories USA y/o Harían Laboratories); biopsias humanas y tejidos extirpados quirúrgicamente; y xenoinjertos de origen humano (cáncer de ovario, PDX pancreático). Después de la recogida, el tejido fresco se colocó inmediatamente en solución salina tamponada con fosfato helada (PBS, Biological lndustries, Kibbutz Beit Haemek, lsrael) o en medio de cultivo helado (RPMl Biological lndustries). Un cortador de tejido de precisión (Compresstome™ VF-300: Precisionary Instruments ine, NC, EE. UU.) se limpió con etanol al 70%, se lavó dos veces con agua esterilizada, y se fijó y se colocó una cuchilla nueva (Double Edge Blades 32017759 Belgar, Jerusalén, Israel).
El tejido permaneció sobre hielo hasta que se transfirió al cortador de tejido previamente limpiado; luego, el tejido se retiró del PBS y se fijó suavemente al émbolo con pegamento de contacto y se estabilizó en agarosa para gel de baja gelificación al 3% calentado a 50°C y luego se enfrió para que se solidificase antes del uso (agarosa, baja gelificación A0701 Sigma-Aldrich, 3% en 0,9 g de NaCI). El émbolo con el tejido se insertó en su lugar designado en el cortador de tejido y el baño se llenó con medio E de Williams helado con penicilina y estreptomicina añadidas. Para mantener el medio en el baño a bajas temperaturas, se construyó un serpentín de enfriamiento hueco situado en el baño. Luego se bombeó agua helada a través del serpentín utilizando una bomba de inmersión estándar. El tejido se seccionó en cortes de ~250 pm. Se prepararon aproximadamente 30-40 cortes a partir de un trozo de tejido de 1 cm3. Inmediatamente se colocaron dos o tres cortes en casetes de histología de plástico desechables y se fijaron en PFA al 4%.
Procedimiento de cultivo- Los cortes de tejido se colocaron individualmente en placas de 6 pocilios (Corning CC-3516 Getter, Petach-Tikva, Israel) directamente, encima de insertos de titanio (insertos para pocilios MA0036, Alabama R&D, Alabama, EE. UU.) o sobre PEG o PEG colocado sobre un inserto de titanio. Cada pocilio contenía 4,5 mi de medio DMEM/F12 o M199 complementado con penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 pg/ml), gentamicina (G1397 50 pg/ml Sigma-Aldrich), suero fetal de ternera al 5% (FCS, 10270106 Gibco Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel), anfotericina B (A-4888 2,5 pg/ml Sigma-Aldrich) y glutamina (L-Glutamina 03-020-1B 100 pl/ml Biological Industries). Las placas se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2 y 21% u 80% de O2 (usando la cámara de oxígeno: BioSpherix C274, NY, EE. UU.; controlador de oxígeno: Biospherix ProOx C21, NY, EE. UU.; y oxígeno al 98% Maxima Air Innovations, Ashdod, Israel).
Toda la incubadora se colocó en un agitador orbital agitando (TOU-120N MRC, Holon, Israel) a 70 rpm. Después de incubar durante la noche, el medio se reemplazó con medio de nuevo aporte. En los pocilios indicados, el medio fresco contenía un fármaco anticancerígeno [4-hidroperoxi ciclofosfamida (sc-206885 ENCO, Petach Tikva, Israel), 5-fluorouracilo (5FU, A10042 Adooq Biotag, Kfar Yona, Israel), oxaliplatino (09512 Sigma-Aldrich), irinotecán (A10479-200 Adooq Biotag, Kfar Yona, Israel), docetaxel (01885 Sigma-Aldrich), cisplatino (Sigma-Aldrich), trametinib (A11029 Adooq Biotag, Kfar Yona, Israel), inhibidor de CDK4/6 Palbociclib (PZ0199 Sigma-Aldrich) o inhibidor de FGFR AZD4547 (A11075-5 Adooq Biotag) con las concentraciones indicadas. El medio se reemplazó una vez cada 48 horas con fármaco de nuevo aporte/DMSO durante 4 a 6 días.
Ensayos funcionales- Dieciocho a veinticuatro horas antes del final del cultivo, se añadió BrdU al medio (concentración final: 10 pm/ml) para la tinción posterior con un anticuerpo anti-BrdU (BRDU anti-BRDU B5002 Sigma-Aldrich y 94-MS-1058-P Eldan, Petaj Tikva, Israel) y/o anti Ki67 (94-RM-9106-S Eldan, Petaj Tikva, Israel). Al final del cultivo, los tejidos se colocaron entre dos cubreobjetos de vidrio, se colocaron en un casete de histología de plástico desechable y se fijaron durante la noche en paraformaldehído (PFA) al 4%. A continuación, los cortes se parafinaron, se formaron bloques y se escindieron en cortes de 5 pM para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y otras tinciones IHC, como la tinción con Ki67.
Ejemplo 1
Condiciones de cultivoex vivode órganos para mantener la estructura y la función de cortes de tejido sano y tumoral
Para obtener una estructura y función del tejido durante al menos 5 días en un cultivoex vivode órganos (EVOC), se examinaron varias condiciones. Las condiciones incluían:
1. cultivar los cortes de tejido sobre diferentes superficies, tales como insertos de titanio, en comparación con sumergir directamente los cortes en el medio de cultivo; 2345
2. incubar el tejido en condiciones estándar de cultivo de tejidos con 21% de O2 y 5% de CO2 en comparación con una atmósfera altamente oxigenada que contenía 80% de O2;
3. cultivar 1 corte en cada pocillo en comparación con varias cortes en cada pocillo;
4. utilizar diferentes medios como DMEM/F12 y M199;
5. cultivar sobre PEG con o sin insertos de titanio.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 a continuación.
Con ese fin, al incubar el tejido en una atmósfera altamente oxigenada que contenía 80% de O2 aumentaba significativamente la viabilidad del tejido en comparación con las condiciones de cultivo de tejido estándar con 21% de O2 (en la Figura 1 se muestra un cultivo representativo de xenoinjertos obtenidos a partir de cáncer de ovario humano). Además, el tejido sobrevive mejor cuando se retiene sobre insertos de titanio que permiten una interfaz medio/aire, en comparación con insertar directamente el tejido en el pocilio de cultivo de tejidos, de modo que el corte queda completamente sumergido en el medio (en la Figura 1 se muestra un cultivo representativo de xenoinjertos obtenidos a partir de cáncer de ovario humano). Además, DMEM/F12 era un medio mejor que M199 (en la Figura 2 se muestra un cultivo representativo de xenoinjertos obtenidos a partir de cáncer de ovario humano).
Tabla 1: Resumen de cultivoex vivode órganos (EVOC) con tejido humano bajo diferentes condiciones de cultivo
Todos los tejidos para los EVOCs presentados en la Tabla 1 anterior se obtuvieron mediante cirugía. Sin embargo, el ensayo desarrollado se puede adaptar para pequeñas biopsias de tejido tomadas mediante biopsia por punción con aguja gruesa (del inglés, "core biopsy") del tejido tumoral (Figura 9). Específicamente, el tejido se incluye en agarosa en dos pasos: primero se coloca agarosa líquida en una pequeña bandeja de metal, las biopsias por punción con aguja gruesa se colocan sobre la agarosa y se añade agarosa encima de las biopsias. Se enfría la bandeja y la agarosa con las biopsias se corta en bloques. En el segundo paso, el bloque de agarosa se fija al émbolo con pegamento de contacto y se rodea con agarosa de manera similar a la utilizada para los trozos de tejido.
En general, se establecieron EVOCs a partir de diferentes fuentes que representaban numerosos tejidos que conservaban la estructura y la viabilidad del tejido durante al menos 5 días de cultivo (FIGs.1,2 y 11). Es importante destacar que todos los tejidos fueron examinados por un patólogo y se consideraron completamente viables con la misma morfología que un tejido patológico normal del paciente.
En conjunto, se cultiva un corte de tejido directamente en el medio de un inserto de titanio en medio DMEM/F12 en una atmósfera altamente oxigenada que contiene 80% de O2 y se agita el cultivo con agitación orbital lo que facilita la inmersión intermitente del corte de tejido en el medio de cultivo, conservándose la estructura y la viabilidad del tejido durante al menos 5 días de cultivo. Este sistema de EVOC recientemente desarrollado se<usó>en I<os>siguientes Ejemplos a continuación.
Ejemplo 2
El EVOC desarrollado puede utilizarse para predecir la respuesta de tumores frente a fármacos contra el cáncer
El EVOC desarrollado puede predecir la respuestain vivode xenoinjertos obtenidos a partir de pacientes frente a un tratamiento: se obtuvieron diversos modelos en ratón de xenoinjerto obtenido a partir de pacientes (PDX) con respuestasin vivoconocidas frente a fármacos contra el cáncer, en Jackson Laboratories. Los tumores se extirparon de los ratones, se cultivaron como se ha descrito en los Materiales y Métodos y en el Ejemplo 1 anterior y se sometió a ensayo la sensibilidad de los cortes de tejido frente a los agentes anticancerígenos. Resumiendo, se sometieron a ensayo siete modelos de PDX procedentes de 3 tipos de tumores (cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer colorrectal) y en todos los modelos analizados el sistema EVOC desarrollado era capaz de predecir correctamente la sensibilidad de los tumores frente al tratamiento farmacológico (Tabla 2 a continuación y Figuras 3-4). Además, se observó una clara respuesta dependiente de la dosis en el sistema EVOC.
Por lo tanto, como se puede observar en las Figuras 3-4 y la Tabla 2 a continuación, los tumores que eran resistentes al tratamientoin vivotambién eran resistentes al tratamientoex vivo,incluso cuando se aplicaban dosis muy altas. Por el contrario, al aplicar un tratamiento frente al cual los tumores eran sensiblesin vivo,se detectaba muerte celularex vivocon bajas concentraciones de fármaco y la sensibilidad frente a los fármacos se incrementaba con el aumento de las concentraciones de fármaco.
Tabla 2: La respuestain vivode modelos de ratones PDX frente al tratamiento farmacológico sistémico en comparación con la respuesta de los mismos tumoresex vivo
El EVOC desarrollado demuestra que los tumores humanos presentan sensibilidad diferencial frente a distintos tratamientos anticancerígenos: los tejidos tumorales de pacientes extirpados de tumores de pacientes durante la escisión quirúrgica, se cultivaron directamente como se describe en los Materiales y Métodos y en el Ejemplo 1 anterior y se analizó la sensibilidad de los cortes de tejido frente a los agentes anticancerígenos. Se utilizaron los regímenes anticancerígenos más comunes para cada tipo de tumor, es decir, p. ej,, para el cáncer colorrectal humano el tratamiento estándar es 5-fluorouracilo, oxaliplatino y/o irinotecán. La Figura 5 muestra un ejemplo de un tumor que era resistente a dosis altas de 5-fluorouracilo pero relativamente sensible al irinotecán y al oxaliplatino. La determinación de la proliferación celular mediante, p. ej., la tinción con Ki67 también se puede utilizar para evaluar la viabilidad del corte de tejido y la sensibilidad frente a los agentes anticancerígenos. Por lo tanto, la Figura 8 muestra un ejemplo de un cáncer colorrectal que se encontró que era parcialmente sensible al 5-fluorouracilo pero muy sensible al tratamiento con oxaliplatino mediante tinción con Ki67.
En resumen, el sistema EVOC desarrollado indicaba claramente que los tumores de los pacientes pueden ser sensibles frente a un fármaco contra el cáncer, pero resistentes frente a otro. Además, los EVOCs generados a partir de diferentes pacientes individuales respondían de manera diferente a los mismos tratamientos contra el cáncer (Figura 6 y Tablas 3-4 a continuación). Además, para cada tratamiento contra el cáncer se observaba una respuesta dependiente de la dosis (p. ej., Tablas 3-4).
Tabla 3: La respuestaex vivode cáncer colorrectal humano obtenida a partir de 8 pacientes.
Tabla 4: La respuestaex vivode cáncer colorrectal humano frente a una terapia combinada
El EVOC desarrollado puede predecir la sensibilidad frente a una terapia dirigida según lo previsto por el perfil molecular: como medio para la medicina personalizada, el tejido tumoral del paciente se puede analizar para detectar posibles mutaciones genéticas procesables, p. ej., secuenciación del exoma. Uno de los tumores obtenidos era de una paciente con un cáncer de mama triple negativo que albergaba cambios genéticos somáticos que son potencialmente identificables, incluida una amplificación de FGFR1 y una amplificación de CDK6. Como se puede observar en la Figura 7, si bien el tumor obtenido de esa paciente (Paciente 1) era resistenteex vivoal inhibidor de CDK4/6 palbociclib, mostraba una alta sensibilidad frente al inhibidor de FGFR, AZD4547. Lo más importante era que un cáncer de mama obtenido de otra paciente que no tenía amplificación de FGFR1 (Paciente 2) era resistente a la inhibición de FGFR en el sistema EVOC desarrollado.
El tejido se puede almacenar durante 48 horas antes del cultivo; I<os>tejidos tumorales de pacientes extirpados a partir de tumores de pacientes durante la escisión quirúrgica, se cultivaron directamente como se ha descrito en Materiales y Métodos y en el Ejemplo 1 anterior o se cultivaron después de 48 horas de almacenamiento en medio a 4 sC ; y se analizó la sensibilidad de los cortes de tejido frente a agentes anticancerígenos. La Figura 10 muestra un ejemplo de un tejido de cáncer de colon que se encontró que era parcialmente sensible al 5-fluorouracilo de manera similar en ambas condiciones (es decir, cultivado directamente o después de 48 horas a 40C).
Resumiendo, el tejido se puede almacenar en un medio durante al menos 48 horas antes del comienzo del experimento sin ningún efecto adverso sobre el tejido o la sensibilidad frente al fármaco.
Resumiendo, el EVOC recientemente desarrollado hace que el procedimiento de estudiar la respuesta de un tejido canceroso humano sea rápido, rentable y universal para muchos tejidos cancerosos. Todos los tejidos cancerosos analizados, incluidos el tejido de ovario, colorrectal, pulmón, páncreas y mama, presentaban una alta viabilidad después de 4 a 7 días en cultivo.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de cultivo que comprende un medio de cultivo y un corte de tejido cortado con precisión colocado sobre un inserto de cultivo de tejidos, en donde dicho corte de tejido cortado con precisión se mantiene en una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos 60% y menos de 95% de oxígeno y en donde dicho cultivo se agita rotacionalmente facilitando la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo.
2. El sistema de cultivo según la reivindicación 1, en el que dicho cultivo está en una placa de cultivo de tejidos.
3. El sistema de cultivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende un fármaco.
4. Un método para cultivar un tejido, comprendiendo el método cultivar un corte de tejido cortado con precisión sobre un inserto de cultivo de tejidos en un medio de cultivo bajo una atmósfera altamente oxigenada que contiene al menos 60% y menos de 95% de oxígeno; y agitar el cultivo en un movimiento rotatorio que facilita la inmersión intermitente de dicho corte de tejido en dicho medio de cultivo.
5. El método según la reivindicación 4, que comprende además añadir un fármaco a dicho medio de cultivo.
6. Un método para determinar la eficacia de un fármaco o un lote de un fármaco, comprendiendo el método:
(i) cultivar un tejido según el método de la reivindicación 4;
(i) añadir el fármaco o el lote de un fármaco a dicho medio de cultivo; y
(iii) determinar el efecto de dicho fármaco o dicho lote de un fármaco sobre dicho tejido, en donde una sensibilidad de dicho tejido hacia dicho fármaco indica la eficacia de dicho fármaco.
7. El sistema de cultivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde dicho tejido es un tejido patológico.
8. Un método para seleccionar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método:
(i) cultivar un tejido patológico obtenido del sujeto según el método de la reivindicación 4;
(ii) añadir el fármaco a dicho medio de cultivo; y
(iii) determinar el efecto de dicho fármaco sobre dicho tejido, en donde una sensibilidad de dicho tejido hacia dicho fármaco indica la eficacia de dicho fármaco para el tratamiento de dicha enfermedad en dicho sujeto.
9. El sistema de cultivo o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en donde dicho tejido patológico es un tejido canceroso.
10. El sistema de cultivo o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho tejido se selecciona a partir del grupo que consiste en tejido ovárico, colorrectal, pulmonar, pancreático, gástrico, gastroesofágico, mamario, hepático, cartilaginoso y óseo.
11. El sistema de cultivo o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5-10, en donde dicho fármaco se selecciona a partir del grupo que consiste en 5-fluorouracilo (5FU), oxaliplatino, irinotecán, cisplatino, 4-hidroperoxi ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, navalbina, gemcitabina, gefitinib, tamoxifeno, olaparib, trametinib, everolimus y palbociclib.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-11, en el que dicho cultivo se efectúa durante al menos 4 días.
13. El sistema de cultivo del método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho corte está en contacto directo con dicho inserto de cultivo de tejidos.
14. El sistema de cultivo o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho inserto de cultivo de tejidos es un inserto de rejilla de titanio.
15. El sistema de cultivo o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dicha atmósfera altamente oxigenada contiene al menos 70% de oxígeno.
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