BR112019020953A2 - sistema de cultura ex-vivo e métodos de uso do mesmo - Google Patents

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Abstract

são fornecidos sistemas de cultura ex vivo. por conseguinte, é fornecido um sistema de cultura que compreende um meio de cultura e uma fatia de tecido cortada com precisão colocada em um inserto de cultura de tecido, em que a fatia de tecido cortada com precisão é mantida em uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio, e em que a dita cultura é agitada rotacionalmente facilitando a submersão intermitente da fatia de tecido no meio de cultura. também são fornecidos métodos para cultivar um tecido e métodos para usar o sistema de cultura para selecionar um fármaco para o tratamento de uma doença.

Description

“SISTEMA DE CULTURA EX-VIVO E MÉTODOS DE USO DO MESMO” CAMPO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção, em algumas modalidades, refere-se a um sistema de cultura ex-vivo e métodos de utilização do mesmo.
[0002] A seleção convencional de regimes terapêuticos anticâncer baseia-se principalmente no tecido cancerígeno de origem, no estágio e no grau do tumor e na saúde geral do paciente. Tais regimes de tratamento são eficazes em alguns pacientes, porém são tóxicos, induzindo muitos efeitos adversos que podem ter riscos à vida.
[0003] A disponibilidade de terapias com fármacos alvejadas e a possibilidade de identificar marcadores tumorais específicos do paciente instruiu opções de tratamento personalizadas, mas simultaneamente requerem uso extensivo de perfil genético [consultar, por exemplo, Dancey et al. (2012) Cell 148, 409 a 420; e Garraway et al. (2013) J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 31, 1806 a 1814], No entanto, a extrapolação de dados genéticos para regimes de tratamento específicos é complexa e a previsão da resposta do paciente não é confiável. Por exemplo, no caso em que o tumor de um paciente é caracterizado por mais de uma mutação segmentável, é muito difícil prever qual dos fármacos em potencial será mais eficaz. O mesmo acontece quando há mais de um fármaco disponível para uma mutação específica. A escolha da terapia é, portanto, fortemente dependente de tentativa e erro.
[0004] Várias tecnologias estão disponíveis para testar diretamente a resposta das células cancerígenas de um paciente a um tratamento específico, como linhagens celulares derivadas de tumores geradas a partir de tumores de pacientes e modelos de xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) [consultar, por exemplo, Crystal et al. (2014) Science 346, 1480 a 1486; Clevers et al. (2016) Cell 165, 1586 a 1597; e Hidalgo et al. (2014) Cancer Discov. 4. 998 a 1013], No entanto, esses modelos são caros e demandam tempo e, o mais importante, não retêm o microambiente tumoral original, o que pode ter um efeito marcante na sensibilidade ao fármaco [Straussman et al. (2012) Nature 487, 500 a 504],
Petição 870190099695, de 04/10/2019, pág. 14/97
2/64 [0005] Os sistemas de cultura de órgãos ex-vivo (EVOC) usados na biologia do câncer são culturas de fatias cortadas com precisão do tumor do paciente. O EVOC tem sido usado para diversas aplicações, incluindo o estudo da toxicidade de fármacos, captação viral, suscetibilidade de tumores à radiação ou fármacos anticâncer específicos [consultar, por exemplo, Vaira et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 107, 8352 a 8356; Vickers et al. (2004) Chem. Biol. Interact. 150, 87 a 96; de Kanter et al. (2002) Curr. Drug Metab. 3, 39-59; Stoff-Khalili et al. (2005) Breast Cancer Res. BCR 7, R1141 a 1152; Merz et al. (2013) Neuro-Oncol. 15, 670-681; Gerlach et al. (2014) fr. J. Câncer 110, 479 a 488; Meijer et al. (2013) fr. J. Cancer 109, 2685 a 2695; Grosso et al. (2013) Cell Tissue Res. 352, 671-684; Vaira et al. (2010) PNAS 107, 8352-8356; Roife et al. (2016) Clin. Cancer Res. 3 de junho; 1 a 10; Maund et al. (2014) Lab. Invest. 94, 208 a 221; Vickers et al. (2004) Toxicol Sci. 82 (2):534 a 44; Zimmermann et al. (2009) Cytotechnology 61(3): 145 a 152); Parajuli et al. (2009) In Vitro Cell.Dev.Biol.—Animal 45:442 a 450; Koch et al. (2014) Cell Communication and Signaling 12:73; Graaf et al. Nature Protocols (2010) Volume: 5: Páginas: 1540 a 1551; Majumder et al. Nat. Commum. 6.6169 (2015); Publicações de Pedido de Patente n° US2014/0228246, US2010/0203575 e US2014/0302491; e Publicação de Pedido de Patente Internacional n°: W02002/044344.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um sistema de cultura que compreende um meio de cultura e uma fatia de tecido cortada com precisão colocada em um inserto de cultura de tecido, em que a fatia de tecido cortada com precisão é mantida em uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio, e em que a cultura é agitada rotacionalmente facilitando a submersão intermitente da fatia de tecido no meio de cultura.
[0007] De acordo com algumas modalidades da invenção, a cultura está em uma placa de cultura de tecido.
[0008] De acordo com algumas modalidades da invenção, o sistema de cultura compreende um fármaco.
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3/64 [0009] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um método de cultivo de um tecido, sendo que o método compreende cultivar uma fatia de tecido cortada com precisão em um inserto de cultura de tecido em meio de cultura sob uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio; e agitar a cultura em uma rotação facilitando a submersão intermitente da fatia de tecido no meio de cultura.
[0010] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método compreende adicionalmente adicionar um fármaco ao meio de cultura.
[0011] De acordo com algumas modalidades da invenção, é fornecido um método para determinar a eficácia de um fármaco ou um lote de um fármaco, sendo que o método compreende:
(i) cultivar um tecido de acordo com o método da presente invenção;
(ii) adicionar o fármaco ou o lote de um fármaco ao dito meio de cultura; e (iii) determinar o efeito do fármaco ou do lote de um fármaco no tecido, em que a sensibilidade do tecido ao fármaco indica a eficácia do fármaco.
[0012] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido é um tecido patológico.
[0013] De acordo com algumas modalidades da invenção, é fornecido um método para selecionar um fármaco para o tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, sendo que o método compreende:
(i) cultivar um tecido patológico obtido do indivíduo de acordo com o método da presente invenção;
(ii) adição do fármaco ao meio de cultura; e (iii) determinar o efeito do fármaco no tecido, em que a sensibilidade do tecido ao fármaco indica a eficácia do fármaco no tratamento da doença no indivíduo.
[0014] De acordo com algumas modalidades da invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, sendo que o método compreende:
(i) selecionar um fármaco de acordo com o método da presente invenção;
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4/64 e
(ii) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco que demonstre eficácia para o tratamento da doença no indivíduo, tratando assim a doença no indivíduo.
[0015] De acordo com algumas modalidades da invenção, é fornecido um método de tratar uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo:
a) Selecionar um fármaco de acordo com o método do presente pedido; e
b) Administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco demonstrando eficácia para o tratamento de uma doença em um indivíduo, assim tratando a doença no indivíduo.
[0016] De acordo com algumas modalidades da invenção, o fármaco é uma combinação de fármacos.
[0017] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido ou a fatia de tecido cortada com precisão é isolada recentemente.
[0018] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido ou a fatia de tecido cortada com precisão são preservados a 4 °C.
[0019] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido ou a fatia de tecido cortada com precisão é criopreservada.
[0020] De acordo com algumas modalidades da invenção, a determinação é realizada por avaliação de morfologia, avaliação de viabilidade, avaliação de proliferação e/ou avaliação de morte celular.
[0021] De acordo com algumas modalidades da invenção, a determinação é realizada por avaliação de morfologia.
[0022] De acordo com algumas modalidades da invenção, a determinação é realizada dentro de 3 a 5 dias de cultivo.
[0023] De acordo com algumas modalidades da invenção, a doença é câncer.
[0024] De acordo com algumas modalidades da invenção, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em ovário, colorretal, pulmão, pâncreas, gástrico, gastroesofágico e mama.
[0025] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido patológico é
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5/64 um tecido canceroso.
[0026] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em ovariano, colorretal, pulmonar, pâncreas gástrico, gastroesofágico e mama.
[0027] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em ovariano, colorretal, pulmonar, pâncreas gástrico, gastroesofágico, mama, fígado, cartilagem e osso.
[0028] De acordo com algumas modalidades da invenção, a adição é realizada 12 a 24 horas após o início do cultivo.
[0029] De acordo com algumas modalidades da invenção, o fármaco é um fármaco anti-inflamatório ou um fármaco anticâncer.
[0030] De acordo com algumas modalidades da invenção, o fármaco é selecionado dentre o grupo que consiste em 5-Flurouricil (5FU), Oxaliplatina, Irinotecano, Cisplatina, 4-Hidroperoxi-Ciclofosfamida, Docetaxel, Doxorrubicina, Navalbina, Gemcitabina, Gefitinib, Tamoxifeno, Olaparib, Trametib.
[0031] De acordo com algumas modalidades da invenção, a concentração de fármaco é superior à dose de fármaco IC50 em uma linhagem celular.
[0032] De acordo com algumas modalidades da invenção, a concentração de fármaco é derivada de um experimento de dosagem em que é observada uma resposta dependente de dose.
[0033] De acordo com algumas modalidades da invenção, o cultivo é realizado por pelo menos 4 dias.
[0034] De acordo com algumas modalidades da invenção, o cultivo é realizado por pelo menos 5 dias.
[0035] De acordo com algumas modalidades da invenção, o cultivo é realizado por até 7 dias.
[0036] De acordo com algumas modalidades da invenção, o cultivo é realizado em uma placa de cultura de tecido.
[0037] De acordo com algumas modalidades da invenção, a fatia cortada com precisão é de 200 a 300 pm.
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6/64 [0038] De acordo com algumas modalidades da invenção, a fatia é colocada no meio da inserção da cultura de células.
[0039] De acordo com algumas modalidades da invenção, a fatia é uma fatia.
[0040] De acordo com algumas modalidades da invenção, a fatia está em contato direto com o inserto de cultura de tecido.
[0041] De acordo com algumas modalidades da invenção, o inserto de cultura de tecido é um inserto de grade de titânio.
[0042] De acordo com algumas modalidades da invenção, o tecido é um tecido humano.
[0043] De acordo com algumas modalidades da invenção, a atmosfera altamente oxigenada contém pelo menos 70% de oxigênio.
[0044] De acordo com algumas modalidades da invenção, a atmosfera altamente oxigenada contém menos de 95% de oxigênio.
[0045] De acordo com algumas modalidades da invenção, o método é realizado em combinação com o perfil genético.
[0046] Salvo se definido de outro modo, todos os termos científicos e/ou técnicos usados na presente invenção têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelo indivíduo versado na técnica à qual a invenção diz respeito. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou no teste de modalidades da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório descritivo de patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser necessariamente limitadores.
BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS [0047] Algumas modalidades da invenção são descritas no presente documento, apenas a título de exemplo, em referência aos desenhos anexos. Em referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os dados mostrados são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das modalidades da invenção. Em relação a isso, a descrição feita com os desenhos se toma evidente aos
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7/64 elementos versados na técnica sobre como as modalidades da invenção podem ser praticadas.
[0048] Nos desenhos:
[0049] As Figuras 1 mostra fotomicrografias histológicas representativas que demonstram a morfologia de fatias de xenoenxertos derivados de câncer ovariano humano após 5 dias de cultivo ex-vivo. As fatias cortadas com precisão do tecido colhido foram incubadas em inserto de titânio (coluna esquerda) em uma placa de 6 poços, ou diretamente na placa de 6 poços (coluna direita); em 21% de O2 (linha inferior) ou em 80% de O2 (linha superior) por 5 dias; e colorado com H&E. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em triplicata. [0050] A Figura 2 mostra fotomicrografias histológicas representativas que demonstram a morfologia de fatias de xenoenxertos derivados de câncer de mama humano após 5 dias de cultivo ex-vivo em diferentes meios. As fatias cortadas com precisão do tecido colhido foram incubadas em inserto de titânio em 80% de O2 em meios de DMEM/F12 (painel da esquerda) ou M199 (painel da direita) por 5 dias; e colorado com H&E. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em duplicata.
[0051] A Figura 3 demonstra a capacidade do método de cultivo ex-vivo desenvolvido para prever respostas de xenoenxertos derivados de carcinoma de mama humano a um tratamento com fármaco anticâncer. São mostrados gráficos gerados pelos Laboratórios Jackson que demonstram a resposta in vivo de dois xenoenxertos derivados de carcinoma de mama humano ao tratamento com 4Hidroperoxi ciclofosfamida, indicando que o carcinoma de mama TM00096 é resistente ao tratamento, enquanto o anticâncer TM00098 é sensível ao tratamento. O eixo geométrico y indica o tamanho do tumor em mm3.
[0052] As fotomicrografias histológicos representativos demonstram a morfologia das fatias dos TM00096 (coluna da esquerda) e TM00098 (coluna da direita) carcinomas da mama seguintes 5 dias de cultivo ex-vivo no inserto de titânio em 80% de O2 tratadas por 4 dias com as concentrações indicadas de 4
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Hidroperoxiciclofosfamida. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em duplicata;
[0053] A Figura 4 demonstra a capacidade do método de cultivo ex-vivo desenvolvido para prever a resposta de xenoenxertos derivados de carcinoma colorretal humano (CRC) a um tratamento com fármaco anticâncer. São mostrados gráficos gerados pelos Laboratórios Jackson demonstrando a resposta in vivo de três xenoenxertos derivados de CRC ao tratamento com Oxaliplatina, indicando que o TM00134 CRC é resistente ao tratamento, enquanto o tumor TM00170 é parcialmente sensível e ο TM00164 CRC é muito sensível ao tratamento. O eixo geométrico y indica o tamanho do tumor em mm3.
[0054] As fotomicrografias histológicos representativos demonstram a morfologia das fatias do TM00134 (painel da esquerda), TM00170 (painel do meio) e TM00164 (painel da direita) CRC seguinte 5 dias de cultivo ex-vivo no inserto de titânio em 80% de O2 tratados por 4 dias com Oxaliplatina 0,2 μΜ. O tratamento com DMSO serviu como controle. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em triplicata.
[0055] A Figura 5 demonstra que as fatias de tecido tumoral cultivadas sob o método de cultivo ex-vivo desenvolvido apresentam sensibilidade diferencial a diferentes fármacos anticâncer. O tecido tumoral do câncer colorretal humano (CCR) foi retirado de uma lesão metastática no peritônio removido durante uma operação para quimioterapia de descolamento e intraperitoneal. São mostradas fotomicrografias histológicas representativas que demonstram a morfologia de fatias de tumor após 5 dias de cultivo ex-vivo no inserto de titânio em 80% de O2 tratados por 4 dias com os indicados fármacos anticâncer 5-Fluouricil (5-FU) Irinotecano ou Oxaliplatina. O tratamento com DMSO serviu como controle. Observe que o tecido era sensível ao tratamento com Oxaliplatina e Irinotecano de maneira dependente da dose, mas resistente ao 5-Fluouricil. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em triplicata;
[0056] A Figura 6 demonstra que as fatias de tecido tumoral obtidas de diferentes indivíduos e cultivadas pelo método de cultivo ex-vivo desenvolvido apresentam a
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9/64 sensibilidade diferencial ao mesmo fármaco anticâncer. O tecido tumoral do câncer colorretal humano (CCR) foi retirado de uma lesão metastática no peritônio removido durante uma operação para quimioterapia de descolamento e intraperitoneal. São mostradas fotomicrografias histológicas representativas que demonstram a morfologia das fatias de tumor após 5 dias de cultivo ex-vivo no inserto de titânio em 80% de O2 tratados por 4 dias com os fármacos anticâncer indicados: 5-Fluouricil (5-FU) ou Oxaliplatina. O tratamento com DMSO serviu como controle. PR indica resposta parcial; e NR indica nenhuma resposta. Observe que, enquanto o tumor obtido do paciente no. 8 apresentaram forte resposta parcial à Oxaliplatina e nenhuma resposta ao 5-fluorouricil no outro paciente, o paciente n° 6, respondeu parcialmente a ambos os fármacos. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em duplicata.
[0057] A Figura 7 demonstra a capacidade do método de cultivo ex-vivo desenvolvido para prever a sensibilidade à terapia direcionada, conforme previsto pelo perfil molecular. São mostradas fotomicrografias histológicas representativas que demonstram a morfologia das fatias de tumores de câncer da mama negativas triplos de dois doentes após 5 dias de cultivo ex-vivo no inserto de titânio em 80% de O2 tratados por 4 dias com AZD4547 (um inibidor de FGFR). O tratamento com DMSO serviu como controle. Observe que o paciente n° 1 cujo tumor abriga uma amplificação de FGFR1 foi sensível a AZD4547 (um inibidor de FGFR) enquanto o paciente n° 2 que não abriga essa mutação foi resistente ao tratamento. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em duplicata.
[0058] A Figura 8 demonstra que a coloração com Ki67 para proliferação pode ser usada para avaliar a sensibilidade do tecido a diferentes tratamentos. São mostradas fotomicrografias histológicas representativas que demonstram a morfologia (por coloração Η & E) e a proliferação (por coloração de Ki67) de um paciente após 5 dias de cultivo ex-vivo no inserto de titânio em 80% de O2 tratados por 4 dias com os fármacos indicados. O gráfico à direita, gerado pela Jackson Laboratories, demonstra a resposta in vivo desse xenoenxerto derivado de CRC ao tratamento com Oxaliplatina e 5-Fluouricil. O eixo geométrico y indica o tamanho do tumor em mm3. Este paciente
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10/64 era parcialmente sensível ao 5-Fluouricil, mas muito sensível à Oxaliplatina in vivo e ex vivo. O tratamento com DMSO serviu como controle. A barra de escala representa 50 pm. Para cada condição, os tecidos foram testados em duplicata. A Figura 9 demonstra o processamento das biópsias principais para EVOC. Neste exemplo, três biópsias principais são colocadas uma ao lado da outra em agarose líquida em uma bandeja de metal. Mais agarose é adicionada e a bandeja é resfriada. As biópsias são cortadas da agarose e o bloco é fixado no êmbolo com cola de contato, incorporado em mais agarose (com o uso do mesmo método que com pedaços de tecido) e depois cortado com o micrótomo. As fatias de biópsia são tratadas e processadas de maneira semelhante às fatias de tecido. A barra de escala representa 100 pm.
[0059] A Figura 10 mostra fotomicrografias histológicas que demonstram que o tecido pode ser fatiado e armazenado em meio por até 48 horas antes do início da experimentação sem nenhum efeito adverso ao tecido ou qualquer mudança no resultado. É mostrado um tecido de câncer de cólon que foi tratado com DMSO de controle ou 5-fluorouricil (5-FU) por 4 dias imediatamente após o fatiamento ou 48 horas após a refrigeração. Brdll foi adicionado 18 horas antes do final do experimento; e o tecido foi colorado com anticorpo antiBrdll para identificar células em divisão. Observe que o tecido tratado com 5-FU ainda é um pouco viável, mas começa a responder ao tratamento com aumento da morte celular e menos BrdU em ambas as condições. A barra de escala representa 50 pM.
[0060] A Figura 11 mostra imagens histológicas representativas que demonstram os tecidos indicados após 5 dias de cultivo ex-vivo; e uma tabela que resume os tecidos examinados que mantiveram, todos, a estrutura e a viabilidade do tecido por pelo menos 5 dias de cultura. As fatias de precisão de corte de tecido colhidas foram incubadas em inserto de titânio em DMEM/F12 com 80% de O2 por 5 dias; e coloradas com H&E. Todas os experimentos foram realizados em duplicata em dois casos diferentes do câncer indicado
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO [0061] A presente invenção, em algumas modalidades, refere-se a um sistema de cultura ex vivo e métodos de utilização do mesmo.
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11/64 [0062] Antes de explicar pelo menos uma modalidade da invenção em detalhes, deve-se entender que a invenção não é necessariamente limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção tem capacidade de outras modalidades ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.
[0063] As opções de tratamento personalizadas para doenças como o câncer geralmente empregam perfis genéticos e testam a resposta das células do paciente a um tratamento específico, com o uso de modelos caros e que demandam tempo, tais como linhagens celulares derivadas de tumores geradas a partir de tumores de pacientes e modelos de xenoenxerto derivado de pacientes (PDX). Nos últimos anos, foram sugeridos sistemas de cultura de órgãos ex vivo (EVOC) para uso em diversas aplicações, incluindo o estudo da toxicidade de fármacos, captação viral, suscetibilidade de tumores à radiação ou fármacos anticâncer específicos.
[0064] Embora reduzindo a presente invenção à prática, os presentes inventores desenvolveram agora um sistema EVOC que pode preservar a estrutura e a viabilidade de uma fatia de tecido cortada com precisão por até 7 dias em cultura e, sendo assim, podem prever a resposta de tecidos patológicos a vários fármacos.
[0065] Conforme é ilustrado abaixo e na seção de exemplos a seguir, o sistema EVOC recém-desenvolvido é baseado na cultura de uma fatia de tecido colocada diretamente em um inserto de cultura (neste caso, no meio de uma grade reutilizável de titânio) que permite submersão intermitente da fatia no meio, facilitando assim a difusão de nutrientes e gases em toda a fatia, em atmosfera altamente oxigenada que contém oxigênio (80%) com o uso de meio padrão com apenas a adição de soro fetal de bezerro (FCS) e antimicrobianos (exemplo 1, tabela 1, Figuras 1, 2 e 9). Os sistemas EVOC de vários tecidos cancerígenos, incluindo tecido ovariano, colorretal, pulmão, pâncreas e mama cultivados de acordo com este método, apresentaram alta viabilidade após 4 a 6 dias em cultura (Exemplo 1, Tabela 1, Figura 11).
[0066] A seguir, os presentes inventores mostram que o sistema EVOC desenvolvido pode ser usado para prever a resposta de tumores a fármacos anticâncer (Exemplo 2). Especificamente, os presentes inventores demonstram que a
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12/64 sensibilidade de fatias de tecido cancerígeno ex vivo obtidas de vários modelos de xenoenxertos derivados do paciente (PDX) ao tratamento anticâncer é coerente com a resposta in vivo dos modelos PDX ao tratamento (Exemplo 2, Tabela 2, Figuras 3 e 4); e que a sensibilidade de fatias de tecido de câncer de mama triplo negativo ex vivo obtidas de pacientes à terapia direcionada é coerente com os dados de perfil molecular (Exemplo 2, Figura 7). Além disso, os presentes inventores mostram que os sistemas EVOC de tumores humanos de vários pacientes apresentam sensibilidade diferencial a diferentes tratamentos anticâncer (Exemplo 2, Tabelas 3 e 4, Figuras 5 e 6 e 8). É importante ressaltar que o tecido pode ser armazenado em meio por pelo menos 48 horas antes do início da experimentação, sem nenhum efeito adverso sobre a sensibilidade do tecido ou do fármaco (Exemplo 2, Figura 10).
[0067] Tomados em conjunto, o sistema EVOC recentemente desenvolvido preserva o microambiente, a arquitetura, a viabilidade e a heterogeneidade genética dos tecidos. Esse sistema permite estudar uma resposta de tecido humano (por exemplo, tecido cancerígeno) de maneira rápida, confiável e rentável. Consequentemente, os presentes ensinamentos sugerem ainda o uso desse sistema EVOC desenvolvido para pesquisas pré-clínicas e básicas, assim como para qualificar a eficácia de um fármaco para tratamento de doenças em geral e para terapia personalizada em particular.
[0068] Desse modo, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um sistema de cultura que compreende um meio de cultura e uma fatia de tecido cortada com precisão colocada em um inserto de cultura de tecido, em que a dita fatia de tecido cortada com precisão é mantida em uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio e em que a dita cultura é agitada rotacionalmente facilitando a submersão intermitente da dita fatia de tecido no dito meio de cultura.
[0069] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de cultivo de um tecido, sendo que o método compreende cultivar uma fatia de tecido cortada com precisão em um inserto de cultura de tecido em meio de cultura sob uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio; e agitar a
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13/64 cultura em uma rotação facilitando a submersão intermitente da dita fatia de tecido no dito meio de cultura.
[0070] Conforme usado no presente documento, o termo sistema de cultura se refere a pelo menos uma fatia de tecido de corte de precisão, inserto e meio em um ambiente ex vivo.
[0071] De acordo com modalidades específicas, o sistema de cultura mantém a estrutura e a viabilidade da fatia de tecido cortada com precisão por pelo menos 2 a 10, 2 a 7, 2 a 5, 4 a 7, 5 a 7 ou 4 a 5 dias em cultura. De acordo com uma modalidade específica, a fatia de tecido cortada com precisão mantém a viabilidade por pelo menos 5 dias, 6 dias, 7 dias ou até 10 dias. De acordo com uma modalidade específica, a fatia de tecido cortada com precisão mantém a viabilidade por pelo menos 5 dias.
[0072] De acordo com modalidades específicas, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% das células no tecido cortado com precisão mantêm a viabilidade após 4 a 5 dias em cultura, conforme determinado por, por exemplo, análise morfológica de uma área de viabilidade ideal.
[0073] Conforme usado no presente documento, a frase área ideal de viabilidade se refere a um campo microscópico do tecido (por exemplo, em ampliação de 20X) no qual o maior número de células vivas por unidade de área está presente, conforme avaliado por um patologista, em comparação à amostra pré-EVOC imediata da mesma espécie.
[0074] Desse modo, de acordo com modalidades específicas, o cultivo é realizado por 2a10, 2a 7, 2a 5, 4a 7, 5 a 7 ou 4 a 5 dias.
[0075] De acordo com uma modalidade específica, o cultivo é realizado por pelo menos 4 dias.
[0076] De acordo com uma modalidade específica, o cultivo é realizado por pelo menos 5 dias.
[0077] De acordo com uma modalidade específica, o cultivo é realizado por até 7 dias.
[0078] Conforme usado no presente documento, o termo tecido se refere à parte
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14/64 de um órgão sólido (ou seja, não sanguíneo) de um organismo com alguma vascularização que inclui mais de um tipo de célula e mantém pelo menos uma estrutura macro do tecido in vivo a partir do qual foi excisado.
[0079] Os exemplos incluem, porém, sem limitação, tecido ovariano, tecido colorretal, tecido pulmonar, tecido pancreático, tecido mamário, tecido cerebral, retina, tecido cutâneo, osso, tecido cardíaco e tecido renal. De acordo com modalidades específicas, o tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em ovariano, colorretal, pulmonar, pâncreas gástrico, gastroesofágico e de mama. De acordo com modalidades específicas da invenção, o tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em ovariano, colorretal, pulmonar, pâncreas gástrico, gastroesofágico, mama, fígado, cartilagem e osso. De acordo com modalidades específicas, o tecido é um tecido cancerígeno metastático obtido a partir de locais tais como, porém, sem limitação, fígado, osso, pulmão e peritônio.
[0080] De acordo com modalidades específicas, o tecido não é um tecido hepático. [0081] De acordo com modalidades específicas, o tecido não é um tecido da próstata.
[0082] De acordo com modalidades específicas, o tecido é um tecido de mamífero. [0083] De acordo com uma modalidade específica, o tecido é um tecido humano. [0084] De acordo com outra modalidade específica, o tecido é um tecido de camundongo ou rato.
[0085] De acordo com modalidades específicas, o tecido é um tecido saudável.
[0086] De acordo com outras modalidades específicas, o tecido é um tecido patológico. O método pode empregar uma pluralidade de fatias de tecido cortadas com precisão (por exemplo, cada uma em um inserto separado), todas as quais podem ser de tecido (ou tecidos) patológico, tecido (ou tecidos) saudável ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, quando o tecido saudável serve como controle quando retirado da mesma origem tecidual que o tecido patológico).
[0087] De acordo com modalidades específicas, o tecido é um tecido patológico. [0088] Conforme usado no presente documento, o termo tecido patológico se refere a um tecido que causa uma doença. Portanto, espera-se que a eliminação de
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15/64 um tecido desse tipo leve ao tratamento, conforme definido adicionalmente abaixo no presente documento. Exemplos específicos de doenças passíveis de tratamento de acordo com algumas modalidades da presente invenção são descritos em detalhes abaixo. De acordo com modalidades específicas, o tecido patológico é um tecido inflamado, um tecido fibrótico ou um tecido canceroso. De acordo com uma modalidade específica, o tecido patológico é um tecido canceroso.
[0089] De acordo com modalidades específicas, o tecido é obtido cirurgicamente ou por biópsia, laparoscopia, endoscopia ou como xenoenxerto ou qualquer combinação dos mesmos.
[0090] O tecido pode ser cortado e cultivado diretamente após a extração do tecido (isto é, tecido primário) ou após a implantação em um modelo animal [isto é, um xenoenxerto derivado do paciente (PDX)], cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0091] O tecido ou a fatia de tecido para algumas modalidades da presente invenção pode ser isolado ou armazenado recentemente, por exemplo, a 4 °C ou criopreservado (isto é, congelado), por exemplo, nitrogênio líquido.
[0092] De acordo com modalidades específicas, o tecido ou a fatia de tecido é recém-isolado (ou seja, não mais de 24 horas após a recuperação do indivíduo e não submetido a processos de preservação), conforme revelado abaixo no presente documento.
[0093] De acordo com modalidades específicas, o tecido é criopreservado após a recuperação do tecido e antes do corte.
[0094] De acordo com modalidades específicas, o tecido é descongelado antes do corte.
[0095] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido é criopreservada após o corte.
[0096] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido é descongelada antes do cultivo.
[0097] De acordo com modalidades específicas, o tecido é preservado a 4 °C, por exemplo, no meio após a recuperação do tecido e antes do corte.
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16/64 [0098] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido é preservada a 4 °C, por exemplo, no meio após o corte e antes do cultivo.
[0099] De acordo com modalidades específicas, a preservação a 4 °C é efetuada por até 120 horas, até 96 horas, até 72 horas ou até 48 horas.
[0100] De acordo com modalidades específicas, a preservação a 4 °C é efetuada por 24 a 48 horas.
[0101] Desse modo, de acordo com modalidades específicas, o método compreende adicionalmente obter o tecido do indivíduo ou do modelo animal que compreende o tecido.
[0102] Conforme usado no presente documento, a frase xenoenxerto derivado do paciente (PDX) se refere ao tecido gerado pela implantação de um tecido primário em um animal de uma espécie diferente em relação ao doador do tecido primário. De acordo com modalidades específicas, o PDX é um tecido gerado pela implantação de um tecido primário humano (por exemplo, tecido canceroso) em um camundongo imunodeficiente.
[0103] Após a extração do tecido, o tecido é fatiado em fatias cortadas com precisão.
[0104] Conforme usado no presente documento, a frase fatia de tecido cortada com precisão se refere a uma fatia viável obtida a partir de um tecido sólido isolado com espessura reproduzível e bem definida (por exemplo, variação de ± 5% na espessura entre as fatias).
[0105] Tipicamente, a fatia de tecido é um minimodelo do tecido que contém as células do tecido em seu ambiente natural e mantém a conectividade tridimensional, tais como interações intercelulares e de matriz celular do tecido intacto sem a seleção de um tipo de célula específica dentre os diferentes tipos de células que constituem o tecido ou o órgão. O corte com precisão reduz as fontes de erro devido a variações na espessura da fatia e danos às superfícies de corte, que contribuem para uma troca desigual de gases e nutrientes ao longo das fatias de tecido; melhora a reprodutibilidade; e permite que fatias adjacentes sejam avaliadas quanto à histologia e comparadas em pares sob diferentes condições experimentais.
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17/64 [0106] A seção da fatia pode ser cortada em diferentes orientações (por exemplo, ântero-posterior, dorsal-ventral ou nasal-temporal) e espessura. O tamanho/espessura da seção de tecido é baseado na fonte de tecido e no método usado para corte em seção. De acordo com uma modalidade específica, a espessura da fatia cortada com precisão permite manter a estrutura do tecido em cultura.
[0107] De acordo com modalidades específicas, a espessura da fatia de corte com precisão permite acesso total das camadas celulares internas a oxigênio e nutrientes, de modo que as camadas celulares internas sejam expostas a concentrações suficientes de oxigênio e nutrientes.
[0108] De acordo com modalidades específicas, a espessura da fatia de corte com precisão permite acesso total das camadas celulares internas a oxigênio e nutrientes, de modo que as camadas celulares internas sejam expostas a mesmas concentrações de oxigênio e nutrientes que as camadas celulares externas.
[0109] De acordo com modalidades específicas, a fatia de corte com precisão está entre 50 a 1200 pm, entre 100 a 1000 pm, entre 100 a 500 pm, entre 100 a 300 pm ou entre 200 a 300 pm.
[0110] De acordo com uma modalidade específica, a fatia de corte com precisão é de 200 a 300 pm.
[0111] Os métodos para obter fatias de tecido são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na seção Exemplos a seguir e em Roife et al. (2016) Clin. Cancer Res. 3 de junho; 1 a 10; Vickers et al. (2004) Toxicol Sci. 82 (2):534 a 44; Zimmermann et al. (2009) Cytotechnology 61(3): 145 a 152); Koch et al. (2014) Cell Communication and Signaling 12:73; and Graaf et al. Nature Protocols (2010) Volume 5: Páginas: 1540 a 1551, cujo teor de cada um é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade. Tais métodos incluem, porém, sem limitação, fatiamento com o uso de um vibratome, incorporação de agarose seguida por corte em seção por um micrótomo ou fatiamento com uso de uma matriz.
[0112] Como um exemplo não limitador, o tecido é isolado e imediatamente colocado em um meio de dissecção fisiológico (por exemplo, PBS gelado) que pode ser suplementado com antibióticos.
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18/64 [0113] De acordo com modalidades específicas, o tempo isquêmico quente é menos do que 2 horas, menos do que 1,5 horas ou menos do que 1 hora.
[0114] De acordo com modalidades específicas, o tempo isquêmico frio é menos do que 96 horas, menos do que 72 horas, menos do que 48 horas, menos do que 24 horas, menos do que 12 horas, menos do que 5 horas ou menos do que 2 horas.
[0115] Antes do fatiamento, o tecido é fixado ao fatiador de tecidos com o uso de, por exemplo, cola de contato seguida de incorporação, por exemplo, em gel de agarose com baixo ponto de fusão. Posteriormente, o tecido é seccionado em fatias cortadas com precisão. Inúmeros dispositivos de corte em seção de tecidos adequados estão disponíveis comercialmente, tais como, porém, sem limitação, Compresstome™ VF-300 (Precisionary Instruments Inc. NC, EUA), fatiador de tecidos Brendel-Vitron (Tucson, AZ), fatiador de precisão Krumdieck (modelo n° MD4000-01; Alabama R&D) e micrótomo de lâmina vibratória Leica VT1200S (Leica, Wetzlar, Alemanha). De acordo com modalidades específicas, o dispositivo de corte em seção é preenchido com meio gelado tal como Williams Medium E ou tampão KrebsHenseleit (KHB). O elemento versado na técnica sabería qual meio e condições para dissecção e para preservar o tecido e a fatia de tecido antes do cultivo para cada tipo de tecido.
[0116] A seguir, a fatia de tecido é colocada em um inserto de cultura de tecido em um recipiente de cultura de tecido preenchido com meio de cultura. Uma fatia ou várias fatias podem ser colocadas em um único inserto de cultura de tecido. De acordo com modalidades específicas, uma fatia é colocada em um único inserto de cultura de tecido.
[0117] De acordo com modalidades específicas, o recipiente de cultura é preenchido com meio de cultura até o fundo da fatia de tecido (por exemplo, 4 ml de meio em uma placa de 6 poços que contém um inserto).
[0118] A cultura pode estar em um recipiente de vidro, plástico ou metal que pode fornecer um ambiente asséptico para o cultivo de tecido. De acordo com modalidades específicas, o recipiente de cultura inclui pratos, placas, frascos, garrafas e ampolas.
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Recipientes de cultura tais como COSTAR®, NUNC® e FALCON® estão disponíveis comercialmente de vários fabricantes.
[0119] De acordo com modalidades específicas, o recipiente de cultura é uma placa de cultura de tecido, como uma placa de 6 poços, uma placa de 24 poços, uma placa de 48 poços e uma placa de 96 poços.
[0120] De acordo com uma modalidade específica, o recipiente de cultura é uma placa de 6 poços de cultura de tecido.
[0121] De acordo com modalidades específicas, o recipiente de cultura não é prérevestido com proteínas extraídas de um tecido correspondente (por exemplo, quando o tecido é um tecido canceroso, então o recipiente de cultura não é pré-revestido com proteínas extraídas de tumor com estágio e grau). Exemplos não limitadores para tais proteínas incluem proteínas de ECM, como colágeno, fibronectina, laminina, vibronectina, caderina, filamina A, vimentina, osteopontina, Decorin, tenascina X, proteínas da membrana basal, proteínas citoesqueléticas e proteínas da matriz; e fatores de crescimento.
[0122] O meio de cultura usado pela presente invenção pode ser um meio à base de água que inclui uma combinação de substâncias como sais, nutrientes, minerais, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucléicos e/ou proteínas como citocinas, fatores de crescimento e hormônios, sendo que todos os quais são necessários para a proliferação celular e têm capacidade de manter a estrutura e a viabilidade do tecido. Por exemplo, um meio de cultura pode ser um meio de cultura de tecido sintético, tais como DMEM/F12 (pode ser obtido, por exemplo, nas Indústrias Biológicas), M199 (pode ser obtido, por exemplo, nas Indústrias Biológicas), RPMI (pode ser obtido, por exemplo, na Gibco-lnvitrogen Corporation produtos), M199 (pode ser obtido, por exemplo, da Sigma-Aldrich), Ko-DMEM (pode ser obtido, por exemplo, dos produtos da Gibco-lnvitrogen Corporation), suplementado com os aditivos necessários, conforme descrito abaixo no presente documento. Preferencialmente, todos os ingredientes incluídos no meio de cultura da presente invenção são substancialmente puros, com um grau de cultura de tecido.
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20/64 [0123] O elemento versado na técnica sabería selecionar o meio de cultura para cada tipo de tecido contemplado.
[0124] De acordo com modalidades específicas da invenção, o meio de cultura compreende soro, por exemplo, soro fetal de bezerro (FCS, pode ser obtido, por exemplo, a partir de produtos da Gibco-lnvitrogen Corporation).
[0125] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura compreende menos de 10% de soro.
[0126] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura compreende menos de 2% de soro obtido da mesma espécie que o tecido cultivado.
[0127] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura é desprovido de soro obtido da mesma espécie que o tecido cultivado.
[0128] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura compreende menos de 2% de soro autólogo ao tecido cultivado (isto é, do mesmo indivíduo).
[0129] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura é desprovido de soro autólogo ao tecido cultivado (isto é, do mesmo indivíduo).
[0130] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura compreende menos de 2% de soro humano.
[0131] De acordo com algumas modalidades da invenção, o meio de cultura é desprovido de soro humano.
[0132] De acordo com algumas modalidades da invenção, o meio de cultura é desprovido de qualquer contaminante animal, isto é, células animais, fluido ou patógenos (por exemplo, vírus que infectam células animais), ou seja, que são livres de xeno.
[0133] De acordo com algumas modalidades da invenção, o meio de cultura pode ainda incluir antibióticos (por exemplo, penicilina, estreptomicina, gentamicina), agentes antifúngicos (por exemplo, anfotericina B), L-glutamina ou NEAA (aminoácidos não essenciais).
[0134] De acordo com uma modalidade específica, o meio compreende soro e antibióticos.
[0135] De acordo com uma modalidade específica, o meio compreende
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DMEM/F12, FCS a 5%, glutamina, penicilina, estreptomicina, gentamicina e anfotericina B [0136] Deve-se observar que o meio de cultura pode ser atualizado periodicamente para manter níveis suficientes de suplementos e remover resíduos metabólicos que podem danificar o tecido. De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura é atualizado a cada 12 a 72 horas, a cada 24 a 72 horas, a cada 24 a 48 horas ou a cada 12 a 48 horas.
[0137] De acordo com modalidades específicas, o meio de cultura é atualizado a cada 12 a 48 horas.
[0138] De acordo com uma modalidade específica, o meio de cultura é atualizado uma vez após 12 a 24 horas e depois a cada 48 horas.
[0139] Conforme usado no presente documento, a frase inserção de cultura de tecido se refere a uma membrana porosa suspensa em um recipiente para cultura de tecido e é compatível com o cultivo ex vivo subsequente de uma fatia de tecido. O tamanho do poro tem capacidade de sustentar a fatia de tecido enquanto é permeável ao meio de cultura, permitindo a passagem de nutrientes e resíduos metabólicos à fatia e a partir da mesma, respectivamente. De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido é colocada no inserto de cultura de tecido, permitindo assim o acesso do meio de cultura às superfícies apical e basal da fatia de tecido.
[0140] De acordo com modalidades específicas, o tamanho do poro é de 0,1 pm a 20 pm, 0,1 pm a 15 pm, 0,1 pm a 10 pm, 0,1 pm a 5 pm, 0,4 pm a 20 pm, 0,4 pm a 10 pm ou 0,4 pm a 5 pm.
[0141] De acordo com modalidades específicas, o tamanho do poro é de 0,4 mm a 4 mm, 0,4 mm a 1 mm, 1 mm a 4 mm, 1 mm a 3 mm ou 1 mm a 2 mm.
[0142] De acordo com modalidades específicas, o inserto da cultura de tecido é estéril.
[0143] De acordo com modalidades específicas, o inserto da cultura de tecido é descartável.
[0144] De acordo com modalidades específicas, o inserto da cultura de células é reutilizável e autoclavável.
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22/64 [0145] O inserto de cultura celular pode ser sintético ou natural, pode ser inorgânico ou polimérico, por exemplo, titânio, alumina, politetrafluoretileno (PTFE), Teflon, aço inoxidável, policarbonato, nitrocelulose e ésteres de celulose. De acordo com modalidades específicas, o inserto de cultura de células é um inserto de titânio. Os insertos de cultura de células que podem ser usados com modalidades específicas da invenção estão disponíveis comercialmente em, por exemplo, Alabama R&D, Millipore Corporation, Costar, Coming Incorporated, Nunc, Vitron Inc.e SEFARe incluem, porém, sem limitação, Pastilhas MA0036 para placas de poços, BIOCOAT™, Transwell®, Millicell®, Falcon®-Cyclopore, Nunc® Anapore, tela de titânio e tela de Teflon.
[0146] De acordo com modalidades específicas, o inserto de cultura de tecido é um inserto de grade de titânio, tal como, mas não limitado a, Insertos de placas de poço de titânio MA0036 (Alabama P&D).
[0147] De acordo com modalidades específicas, o inserto para cultura de tecido não é revestido com um material orgânico, como colágeno, fibronectina ou polietilenoglicol (PEG).
[0148] De acordo com modalidades específicas, o inserto de cultura de tecido não é revestido com proteínas extraídas de um tecido correspondente (por exemplo, quando o tecido é um tecido canceroso, então o inserto de cultura de tecido não é prérevestido com proteínas extraídas de tumor de estágio e grau correspondente).
[0149] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido está em contato direto com o inserto de cultura de tecido.
[0150] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido não é separada do meio de cultura por um material orgânico heterólogo, tal como colágeno, fibronectina ou polímero sintético (que não faz parte do recipiente de cultura), por exemplo, polietilenoglicol (PEG).
[0151] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido está em contato direto com o meio de cultura.
[0152] De acordo com modalidades específicas, a fatia de tecido é colocada no meio da inserção da cultura de células. Desse modo, por exemplo, quando uma grade
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23/64 de titânio tal como a Titanium MA0036 Well plate Inserts é aplicada, a fatia de tecido é colocada na concavidade localizada no meio da inserção.
[0153] Em seguida, a fatia de tecido é cultivada (ou mantida) a uma temperatura fisiológica, por exemplo, 37° C., em uma atmosfera umidificada altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio e, por exemplo 5% de CO2.
[0154] De acordo com modalidades específicas, a atmosfera altamente oxigenada contém pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% de oxigênio.
[0155] De acordo com modalidades específicas, a atmosfera altamente oxigenada contém pelo menos 70% de oxigênio.
[0156] De acordo com outras modalidades específicas, a atmosfera altamente oxigenada contém menos de 95% de oxigênio.
[0157] De acordo com uma modalidade específica, a atmosfera altamente oxigenada contém cerca de 80% de oxigênio.
[0158] De acordo com uma modalidade específica, durante 0 processo de cultivo, a cultura é agitada em uma rotação facilitando a submersão intermitente da fatia de tecido no meio de cultura.
[0159] Conforme usado no presente documento, as frases agitação rotacional facilitando a submersão intermitente da fatia de tecido no meio de cultura ou agitar em uma rotação facilitando a submersão intermitente da fatia de tecido no meio de cultura se referem à agitação que permite submersão periódica da fatia de tecido no meio de modo que facilite a difusão de nutrientes e gases através do meio e através da fatia de tecido.
[0160] De acordo com modalidades específicas, a agitação é agitação orbital.
[0161] De acordo com modalidades específicas, a agitação é uma agitação angular, por exemplo, um ângulo de 30° a 45°.
[0162] De acordo com modalidades específicas, a agitação é efetuada por um rotador inclinado (tal como a unidade de incubação MD2500 disponível comercialmente da Alabama Research and Development) [0163] De acordo com modalidades específicas, a frequência de agitação é de 50 a 200 rpm, 50 a 150 rpm ou 50 a 100 rpm.
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24/64 [0164] De acordo com uma modalidade específica, a frequência de agitação é de cerca de 70 rpm.
[0165] A cultura de tecido e os métodos da presente invenção podem ser adaptados a muitas aplicações, incluindo, porém sem limitação:
1. Pesquisa pré-clínica e básica, que inclui:
- Estudar mecanismos envolvidos em saúde e doença;
- Triagem de um tecido patológico (por exemplo, um tecido tumoral) quanto à presença de marcadores específicos;
- Triagem e/ou desenvolvimento de fármacos inovadores, tais como fármacos anticâncer ou combinações de fármacos inovadores;
- Determinação da potência de um lote de um fármaco;
- Estudar mecanismos de sensibilidade e resistência dos tecidos humanos.
Desse modo, por exemplo, o tratamento do mesmo tumor com vários fármacos e combinações de fármacos pode ser explorado para um estudo mecanístico detalhado que não pode ser prontamente realizado em pacientes humanos;
- Estudo do microbioma do tumor: bactérias, vírus ou fungos que podem estar presentes em tumores de câncer.
[0166] 2. Testar o efeito de novos fármacos ou combinações de fármacos em fatias de tumores, a fim de priorizar fármacos ou combinações de fármacos para desenvolvimento posterior de fármacos, assim como estudos mecanísticos, testes pré-clínicos in vivo e testes clínicos.
[0167] 3. Prever a resposta do paciente a fármacos (por exemplo, fármacos anticâncer) e combinações de fármacos e, consequentemente, usar essa previsão para adaptar o regime de tratamento específico para o paciente (por exemplo, medicamento personalizado).
[0168] 4. Visto que a fatia de tecido mantém a estrutura e apresenta alta viabilidade após 5 dias de cultura, esse sistema permite modelagem de estudos de toxicidade crônica e aguda, incluindo a atividade metabólica do tecido.
[0169] 5. Uma cultura que apresenta resposta ex vivo positiva pode ser usada
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25/64 como critério para inclusão de um paciente em um ensaio clínico. Essa etapa pode pré-selecionar pacientes com alta chance de resposta e, consequentemente, melhorar a chance de sucesso de testes clínicos. Nesses casos, a cultura de tecido ex-vivo pode se tornar posteriormente parte dos critérios de elegibilidade ao fármaco.
[0170] Desse modo, de acordo com modalidades específicas, o sistema de cultura compreende um fármaco.
[0171] De acordo com outras modalidades específicas, o método da presente invenção descrito acima compreende a adição de um fármaco ou uma combinação de fármacos, conforme descrito no presente documento abaixo.
[0172] Conforme usado no presente documento, a frase fármaco se refere a um agente que possui um efeito antipatológico, que inclui moléculas pequenas e fármacos biológicos (por exemplo, agentes de ácido nucleico, polipeptídeos, anticorpos, aptâmeros etc.). Tipicamente, o fármaco é exógeno à fatia de tecido cortada com precisão ou no corpo humano ou tecido a partir do qual a fatia de tecido cortada com precisão é derivada. O fármaco pode ser um fármaco aprovado pelas agências reguladoras para o tratamento da patologia ou um fármaco subdesenvolvido. De acordo com modalidades específicas, o fármaco é um lote de um fármaco.
[0173] De acordo com modalidades específicas, o fármaco é um fármaco antiinflamatório.
[0174] Exemplos não limitadores de fármacos anti-inflamatórios que podem ser usados com modalidades específicas da invenção incluem: Alclofenaco; Dipropionato de alclometasona; Acetonido de Algestona; Alfa Amilase; Amcinafal; Amcinafida; Amfenac sódico; Cloridrato de amiprilose; Anakinra; Anirolac; Anitrazafen; Apazona; Balsalazida dissódica; Bendazac; Benoxaprofeno; Cloridrato de benzidamina; Bromelinas; Broperamol; Budesonida; Carprofeno; Cicloprofeno; Cintazona; Cliprofeno; Propionato de clobetasol; Butirato de clobetasona; Clopirac; Propionato de cloticasona; Acetato de cormetasona; Cortodoxona; Deflazacort; Desonida; Desoximetasona; Dipropionato de dexametasona; Diclofenaco de potássio; Diclofenaco sódico; Diacetato de diflorasona; Diflumidona sódica; Diflunisal; Difluprednato; Diftalona; Sulfóxido de dimetila; Drocinonida; Endrisona; Enlimomab;
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Enolicam sódico; Epirizol; Etodolaco; Etofenamato; Felbinac; Fenamol; Fenbufen; Fenclofenaco; Fenclorac; Fendosal; Fenpipalona; Fentiazac; Flazalona; Fluazacort; Ácido flufenâmico; Flumizol; Acetato de flunisolida; Flunixina; Meglumina de Flunixin; Fluocortina Butilo; Acetato defluorometolona; Fluquazona; Flurbiprofeno; Fluretofeno; Propionato de fluticasona; Furaprofeno; Furobufen; Halcinonida; Propionato de halobetasol; Acetato de halopredona; Ibufenac; Ibuprofeno; Ibuprofeno alumínio; Ibuprofeno Piconol; llonidap; Indometacina; Indometacina sódica; Indoprofeno; Indoxol; Intrazol; Acetato de isoflupredona; Isoxepaco; Isoxicam; Cetoprofeno; Clohdrato de lofemizol; Lomoxicam; Etabonato de Loteprednol; Meclofenamato de Sódio; Ácido Meclofenâmico; Dibutirato de meclorisona; Ácido mefenâmico; Mesalamina; Meseclazona; Suleptanato de Metilprednisolona; Momiflumato; Nabumetona; Naproxeno; Naproxeno de Sódio; Naproxol; Nimazona; Olsalazina de sódio; Orgoteina; Orpanoxina; Oxaprozina; Oxifenbutazona; Cloridrato de paranilina; Polissulfato de sódio pentosano; Glicerato de Sódio Fenbutazona; Pirfenidona; Piroxicam; Cinamato de Piroxicam; Olamina piroxicam; Pirprofeno; Prednazato; Prifelona; Ácido prodólico; Proquazona; Proxazol; Citrato de Proxazol; Rimexolona; Romazarit; Salcolex; Salnacedina; Salsalato; Cloreto de Sanguinarium; Seclazona; Sermetacina; Sudoxicam; Sulindac; Suprofeno; Talmetacina; Talniflumato; Talosalato; Tebufelona; Tenidap; Tenidap sódico; Tenoxicam; Tesicam; Tesimida; Tetridamina; Tiopinac; Pivalato de tixocortol; Tolmetina; Tolmetina de sódio; Triclonida; Triflumidato; Zidometacina; Zomepirac Sódico.
[0175] De acordo com outras modalidades específicas, o fármaco é um fármaco anticâncer.
[0176] Conforme usado no presente documento, a frase fármaco anticâncer se refere a um agente que tem um efeito antitumoral, incluindo quimioterapia, moléculas pequenas, fármacos biológicos, terapia hormonal, anticorpos e terapia alvejada.
[0177] Fármacos anticâncer que podem ser usados com modalidades específicas da invenção incluem, porém sem limitação: Acivicina; Aclarubicina; Cloridrato de acodazol; Acronina; Adriamicina; Adozelesina; Aldesleucina; Altretamina; Ambomicina; Acetato de ametantrona; Aminoglutotimida; Amsacrina; Anastrozol;
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Anthramicina; Asparaginase; Asperlina; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Cloridrato de bisantreno; Dimesilato de bisnafida; Bizelesina; Sulfato de bleomicina; Sódio de Brequinar; Bropirimina; Bussulfano; Cactinomicina; Calusterona; Caracemida; Carbetimer; Carboplatina; Carmustina; Cloridrato de Carubicina; Carzelesina; Cedefingol; Clorambucil; Cirolemicina; Cisplatina; Cladribina; Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; Dactinomicina; Cloridrato de daunorrubicina; Decitabina; Dexormaplatina; Dezaguanina; Mesilato de dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel; Doxorrubicina; Cloridrato de doxorrubicina; Droloxifeno; Citrato de Droloxifeno; Propionato de dromostanolona; Duazomicina; Edatrexato; Cloridrato de eflornitina; Elsamitrucina; Enloplatina; Enpromate; Epipropidina; Cloridrato de epirrubicina; Erbulozol; Cloridrato de esorubicina; Estramustina; Estramustina Fosfato de Sódio; Etanidazol; Etoposido; Fosfato de etoposido; Ectrina; Cloridrato de fadrozol; Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; Fosfato de fludarabina; Fluorouracil; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecina Sódica; Gencitabina; Cloridrato de gencitabina; Hidroxiureia; Cloridrato de idarrubicina; Ifosfamida; llmofosina; Interferão Alfa-2a; Interferão Alfa-2b; Interferão Alfa-n1; Interferão Alfa-n3; Interferão beta-la; Interferão gama-l b; Iproplatina; Cloridrato de Irinotecano; Acetato de lanreotida; Letrozol; Acetato de leuprolida; Cloridrato de liarozol; Lometrexol de sódio; Lomustina; Cloridrato de losoxantrona; Masoprocol; Maitansina; Cloridrato de mecloretamina; Acetato de megestrol; Acetato de melengestrol; Melfalano; Menogaril; Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato de sódio; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcina; Mitocromina; Mitogilina; Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Cloridrato de mitoxantrona; Ácido micofenólico; Nocodazol; Noogalamicina; Ormaplatina; Oxisurano; Paclitaxel; Pegaspargase; Peliomicina; Pentamustina; Sulfato de peplomicina; Perfosfamida; Pipobroman; Lipossulfan; Cloridrato de piroxantrona; Plicamicina; Plomestane; Porfimero de sódio; Porfiromicina; Prednimustina; Cloridrato de procarbazina; Puromicina; Cloridrato de puromicina; Pirazofurina; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Cloridrato de Safingol; Semustine; Simtrazeno; Sparfosate Sódica; Esparsomicina; Cloridrato de espirogermanio; Espiromustina; Espiroplatina; Estreptonigrina;
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Estreptozocina; Sulofenur; Talisomicina; Taxol; Sódio de Tecogalan; Tegafur; Cloridrato de teloxantrona; Temoporfina; Teniposido; Teroxirona; Testolactona; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofuirina; Tirapazamina; Cloridrato de topotecano; Citrato de Toremifeno; Acetato de trestolona; Fosfato de Triciribina; Trimetrexato; Glucuronato de trimetrexato; Triptorelina; Cloridrato de tubulozol; Uracil Mostard; Uredepa; Vapreotida; Verteporfina; Sulfato de vinblastina; Sulfato de vincristina; Vindesina; Sulfato de vindesina; Sulfato de vidpidina; Sulfato de Vinglicinato; Sulfato de vinleurosina; Tartarato de Vinorelbina; Sulfato de vinrosidina; Sulfato de vinzolidina; Vorozol; Zeniplatina; Zinostatina; Cloridrato de Zorubicina. Agentes antineoplásicos adicionais incluem aqueles revelados no Capítulo 52, Agentes Antineoplásticos (Paul Calabresi e Bruce A. Chabner) e sua introdução, 1202 a 1263, de “The Pharmacological Basis of Therapeutics” de Goodman e Gilman, Oitava Edição, 1990, McGraw- Hill, Inc. (Health Professions Division).
[0178] Exemplos não limitadores de fármacos aprovados contra o câncer incluem: abarelix, aldesleucina, aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido de arsênico, asparaginase, azacitidina, AZD9291, AZD4547, AZD2247, AZD4547, AZD4547, bussulfano, calusterona, capecitabina, carboplatina, carmustina, celecoxib, cetuximab, cisplatina, cladribina, clofarabina, ciclofosfamida, citarabina, dabrafenib, dacarbazina, dactinomicina, actinomicina D, darbepoetina alfa, darbepoetubina, lipofosfato de sódio, diclorobenzeno dexrazoxano, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, propionato de dromostanolona, Solução B de Elliott, epirubicina, Epoetina alfa, erlotinibe, estramustina, etoposídeo, exemestano, Filgrastim, floxuridina, fludarabina, fluorouracina, 5-FU, fluorouracil 5-FU, acetato de histrelina, hidroxiureia, Ibritumomab Tiuxetan, idarubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferão alfa 2a, interferão alfa-2b, Irinotecano, lenalidomida, letrozol, leucovorina, acetato de leuprolida, levamisol, lomustina, CCNU, mecloretamina, mostarda nitrogenada, acetato de megestrol, melfalano, L-PAM, mercaptopurina 6-MP, mesna, mercaptopurina 6-MP Metotrexato, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, fenpropionato de nandrolona, nelarabina, Nofetumomab, Oprelvekin, Oprelvekin, Oxaliplatina, paclitaxel, palifermina
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29/64 de palbociclib, pamidronato, pegademase, pegasparobase, piramparamida, pipfilgrastim, Pegfilgrastim, quinacrina de pegfilgrastim, Rasburicase, rituximabe, sargramostim, sorafenibe, estreptozocina, maleato de sunitinibe, tamoxifeno, temozolomida, teniposídeo VM-26, testolactona, tioguanina 6-TG, tiotepa, tiotepa, topotecano, toremifazina, trositumibastina, Tositumibastina, valrubicina, vinblastina, vinorelbina, zoledronate e ácido zoledrônico.
[0179] De acordo com modalidades específicas, o fármaco anticâncer é selecionado dentre o grupo que consiste em Gefitinib, Lapatinib, Afatinib, BGJ398, CH5183284, Linsitinib, PHA665752, Crizotinib, Sunitinib, Pazopanib, Imatinib, Ruxolitinib, Dasatinib, BEZ235, Pictilis, BEZ235, Pictilis -2206, Trametinib/AZD6244, Vemurafinib/Dabrafenib, CCT196969/CCT241161, Barasertib, VX-680, NutlinS, Palbociclib, BI 2536, Bardoxolona, Vorinostat, Navitoclax (ABT263), Bortezomib, Vismodegib, 5-18, Visoregib, 5-20 Fluorouricil, Irinotecano, Epirrubicina, Cisplatina e Oxaliplatina.
[0180] De acordo com modalidades específicas, o fármaco anticâncer é selecionado dentre o grupo que consiste em 4-Hidroperoxi-Ciclofosfamida, 5Flurouricil (5FU), Oxaliplatina, Irinotecano, Docetaxel, Cisplatina, Trametinib, Palbociclib e AZD4547.
[0181] De acordo com algumas modalidades, o fármaco anticâncer é selecionado dentre o grupo que consiste em 5-Flurouricil (5FU), Oxaliplatina, Irinotecano, Cisplatina, 4-Hidroperoxi-Ciclofosfamida, Docetaxel, Doxorrubicina, Navalbina, Gencitanima, Gefitinib, Tamoxifeno, Olaparib, Trametib.
[0182] Será verificado que o sistema de cultura e métodos descritos no presente documento podem ser usados para testar o efeito diferencial de combinações de fármacos.
[0183] Desse modo, de acordo com modalidades específicas, o fármaco é uma combinação de fármacos.
[0184] Concentrações específicas do fármaco no sistema de cultura e métodos da presente invenção podem ser derivadas através da cultura de diferentes concentrações de fármacos em vários tecidos de câncer (do mesmo ou de outro tipo)
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30/64 e avaliando a faixa em que é alcançada uma resposta dependente da dose. Tipicamente, essa faixa dependente da dose reflete o espectro pelo qual se espera que o tecido de câncer cultivado responda ou não mostre resposta, produzindo um resultado preditivo.
[0185] De acordo com modalidades específicas, a concentração do fármaco no sistema de cultura e métodos da presente invenção é pelo menos a mesma que a dose de fármaco IC50 em uma linhagem celular (por exemplo, uma linhagem celular do mesmo tipo de tecido e/ou espécie).
[0186] De acordo com modalidades específicas, a concentração do fármaco no sistema de cultura e métodos da presente invenção é maior que a dose de fármaco IC50 em uma linhagem celular (por exemplo, uma linhagem celular do mesmo tipo de tecido e/ou espécie).
[0187] De acordo com modalidades específicas, a concentração de fármaco no sistema de cultura e métodos da presente invenção é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, em pelo menos 100 vezes a dose de fármaco IC50 em uma linhagem celular (por exemplo, uma linhagem celular do mesmo tipo de tecido e/ou espécie).
[0188] De acordo com modalidades específicas, a concentração do fármaco no sistema de cultura e métodos da presente invenção é pelo menos 10 vezes a dose de fármaco IC50 em uma linhagem celular (por exemplo, uma linhagem celular do mesmo tipo de tecido e/ou espécie).
[0189] Concentrações específicas de fármacos anticâncer que podem ser usadas com algumas modalidades da presente invenção são mostradas nas Tabelas 5 a 6 abaixo.
Tabela 5: Faixas específicas de concentração de fármacos anticâncer
Fármaco Faixa de concentração
5-FU 40 a 80 uM
Oxaliplatina 16 a 32uM
Irinotecano 20 a 96 uM
Cisplatina 10 a 30 uM
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31/64
4-hidroxiciclofosfamida 2 a 20 uM
Docetaxel 20 a 40 uM
Doxorrubicina 5 a 40 uM
Navalbine 5 a 10 uM
Gencitabina 5 a 50 uM
Gefitinib 1 a 10 uM
Tamoxifeno 10 a 20 uM
Olaparib 10 a 40 uM
Trametinib 1 a 10 uM
Everolimus 2 a 10 uM
Palbociclib 2,5 a 10 uM
Tabela 6: Concentrações específicas de fármacos anticâncer
Fármaco Concentração
5-FU 80 uM
Oxaliplatina 10 uM
Irinotecano 30 uM
Cisplatina 20 uM
4-hidroxiciclofosfamida 10 uM
Docetaxel 20 uM
Doxorrubicina 5 uM
Tamoxifeno 10 uM
Olaparib 20 uM
Trametinib 1 uM
Gencitabina 5 uM
[0190] De acordo com modalidades específicas, várias fatias de tecido de um tecido são preparadas e cultivadas em vários vasos de cultura (por exemplo, poços de uma placa), permitindo o teste de vários fármacos e combinações de fármacos.
[0191] De acordo com modalidades específicas, os métodos da invenção compreendem:
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32/64 (i) determinar o efeito de uma pluralidade (por exemplo, pelo menos 2) de fármacos de acordo com o método da presente invenção; e (ii) determinar o efeito de combinações de fármacos que demonstram ser eficazes de acordo com a etapa (i), em que a sensibilidade aumentada do tecido a uma combinação de fármacos indica a eficácia da combinação de fármacos.
[0192] Conforme usado no presente documento, o termo sensibilidade aumentada se refere a um aumento no efeito induzido pela combinação de fármacos em comparação ao efeito induzido por cada um dos fármacos na combinação, que pode ser por um efeito aditivo ou um efeito sinérgico. De acordo com modalidades específicas, o efeito é um efeito sinérgico.
[0193] De acordo com modalidades específicas, o aumento é de pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes, em comparação com o efeito induzido por cada um dos fármacos na combinação.
[0194] De acordo com outras modalidades específicas, o aumento é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mais de 100% em comparação com o efeito induzido por cada um dos fármacos na combinação.
[0195] Conforme mencionado, de acordo com modalidades específicas, o tecido ou as fatias de tecido podem ser armazenados a 4 °C ou criopreservados e descongelados conforme desejado, permitindo testes seriais de vários fármacos e combinações de fármacos sequencialmente.
[0196] Desse modo, por exemplo, de acordo com modalidades específicas, os métodos da invenção compreendem:
(i) determinar o efeito de pelo menos dois fármacos de acordo com o método da invenção;
(ii) cultivar uma fatia de tecido adicional obtida do tecido patológico obtido do indivíduo (por exemplo, após criopreservação e descongelamento)
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33/64 de acordo com o método da presente invenção;
(iii) adicionar combinações de fármacos consideradas eficazes para o tratamento da doença no indivíduo de acordo com a etapa (i); e (iv) determinar o efeito da combinação de fármacos na fatia de tecido, em que a sensibilidade aumentada da fatia de tecido à combinação de fármacos indica a eficácia da combinação de fármacos para o tratamento da doença no indivíduo.
[0197] O fármaco ou a combinação de fármacos pode ser adicionado à cultura em vários pontos de tempo. De acordo com modalidades específicas, o fármaco é adicionado à cultura 2 a 48 horas, 2 a 36, 2 a 24, 12 a 48, 12 a 36 ou 12 a 24 horas após o início da cultura.
[0198] De acordo com uma modalidade específica, o fármaco ou a combinação de fármacos é adicionado à cultura 12 a 24 horas após o início do cultivo.
[0199] De acordo com uma modalidade específica, o fármaco ou a combinação de fármacos é adicionada à cultura 12 a 36 horas após o início do cultivo.
[0200] De acordo com uma modalidade específica, o fármaco ou a combinação de fármacos é adicionada à cultura 12 a 48 horas após o início do cultivo.
[0201] O cultivo na presença do fármaco ou a combinação de fármacos pode ser efetuado durante todo o período de cultivo desde a primeira adição do fármaco ou pode ser limitado em tempo. Alternativa ou adicionalmente, o fármaco ou a combinação de fármacos pode ser adicionado à cultura múltiplas vezes, por exemplo, quando o meio de cultura é atualizado.
[0202] A seleção da concentração de fármaco e do tempo de incubação com o fármaco ou a combinação do fármaco estão dentro da capacidade dos elementos versados na técnica.
[0203] De acordo com modalidades específicas, a concentração do fármaco e o tempo de incubação com o fármaco ou a combinação do fármaco resultam em efeito detectável no tecido, conforme descrito abaixo no presente documento.
[0204] A seleção da concentração de fármaco usada para o teste ex vivo que resultará em efeito detectável no tecido está dentro das capacidades dos elementos
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34/64 versados na técnica. Preferencialmente, a concentração usada deve estar dentro da faixa linear do parâmetro selecionado.
[0205] O número de concentrações de fármacos testados pode ser pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 6, 1 a 10, 2 a 10, 3 a 10, 5 a 10, 1 a 5, 2 a 5 e 3 a 5 concentrações diferentes no mesmo ensaio.
[0206] O número de repetições de amostras para cada uma das concentrações testadas de fármacos pode ser 2, 3, 4, 5 ou 6 repetições.
[0207] Após o cultivo, o efeito do fármaco ou a combinação de fármacos no tecido pode ser determinado para determinar a eficácia de um fármaco.
[0208] Desse modo, de acordo com outro aspecto da presente invenção, há um método para determinar a eficácia de um fármaco ou um lote de um fármaco, sendo que o método compreende:
(i) cultivar uma fatia de tecido cortada com precisão em um inserto de cultura de tecido em um meio de cultura sob uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio; e agitar a cultura em uma rotação facilitando a submersão intermitente da dita fatia de tecido no dito meio de cultura;
(ii) adicionar o fármaco ou o lote de um fármaco ao dito meio de cultura; e (iii) determinar o efeito do dito fármaco ou do dito lote de um fármaco no dito tecido, em que a sensibilidade do dito tecido ao dito fármaco indica a eficácia do dito fármaco.
[0209] De acordo com modalidades específicas, a etapa de determinação é efetuada após o tempo de cultivo predeterminado. O tempo de cultivo pode variar e a determinação do tempo de cultivo que resultará em efeito detectável está dentro das capacidades dos elementos versados na técnica.
[0210] De acordo com modalidades específicas, a determinação é realizada dentro de 2 a 10, 2 a 7, 2 a 5, 3 a 10, 3 a 7, 3 a 5 ou 4 a 5 dias de cultivo.
[0211] De acordo com uma modalidade específica, a determinação é realizada dentro de 3 a 5 dias de cultivo.
[0212] De acordo com outra modalidade específica, a determinação é realizada
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35/64 dentro de 4 a 5 dias de cultivo.
[0213] Os métodos para determinar os efeitos induzidos pelo fármaco ou a combinação de fármacos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo:
- Avaliação da viabilidade utilizando, por exemplo, o teste MTT, que se baseia na capacidade seletiva das células vivas para reduzir o sal amarelo MTT (brometo de 3-(4, 5-dimetiltiazolil-2) -2, 5-difeniltetrazólio) (Sigma, Aldrich St Louis, MO, EUA) a um precipitado de formazana insolúvel em azul púrpura; o ensaio WST ou o ensaio de captação de ATP;
- Avaliação da proliferação utilizando, por exemplo, o ensaio BrDu [kit colorimétrico Cell Proliferation ELISA BrdU (Roche, Mannheim, Alemanha] ou coloração Ki67;
- avaliação da morte celular utilizando, por exemplo, o ensaio TUNEL [Roche, Mannheim, Alemanha], o ensaio de anexina V [Kit de Apoptose de ApoAlert® Anexina V (Clontech Laboratories, Inc., CA, EUA)], o ensaio de LDH, o ensaio de Caspase Ativado 3, o ensaio Caspase Ativado 8 e o ensaio de óxido nítrico sintase;
- Avaliação da senescência com o uso, por exemplo, do ensaio de galactosidase associado a3(Dimri GP, Lee X, et al. 1995. Um biomarcador que identifica células humanas senescentes em cultura e no envelhecimento da pele in vivo. Proc Natl Acad Sei USA 92:93639367) e ensaio de encurtamento com telomerase;
- avaliação do metabolismo celular utilizando, por exemplo, o ensaio de captação de glicose;
- Vários métodos de detecção de RNA e proteínas (que detectam nível de expressão e/ou atividade); e
- Avaliação da morfologia com o uso, por exemplo, da coloração com
Hemaotxilina e Eosina (H&E);
[0214] De acordo com modalidades específicas, a determinação é realizada por avaliação de morfologia, avaliação de viabilidade, avaliação de proliferação e/ou
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36/64 avaliação de morte celular.
[0215] De acordo com modalidades específicas, a determinação é efetuada por avaliação de morfologia.
[0216] A avaliação de morfologia com o uso de coloração de H&E pode fornecer detalhes sobre, por exemplo, conteúdo, tamanho e densidade das células, razão de células viáveis/células mortas, proporção de células doentes (por exemplo, tumor)/células saudáveis, infiltração de células imunes, fibrose, tamanho e densidade nuclear e integridade, corpos apoptóticos e figuras mitóticas. De acordo com modalidades específicas, o efeito do fármaco no tecido é determinado pela avaliação da morfologia, por exemplo, por um patologista.
[0217] Tipicamente, os resultados de cada um dos ensaios são expressos em uma forma numérica em que uma classificação alta se correlaciona com a sensibilidade a fármaco e uma pontuação baixa correlacionada com a resistência a fármaco.
[0218] Conforme usado no presente documento, a frase sensibilidade a um fármaco ou sensibilidade à combinação de fármacos se refere à capacidade de um fármaco ou combinação de fármacos de induzir alterações celulares, como alterações na viabilidade celular, taxa de proliferação, diferenciação, morte celular, necrose, apoptose, senescência, transcrição e/ou taxa de tradução de genes específicos e/ou alterações nos estados proteicos, por exemplo, fosforilação, desfosforilação, translocação e quaisquer combinações dos mesmos. De acordo com modalidades específicas, as alterações celulares são refletidas pela viabilidade celular diminuída, taxa de proliferação diminuída, morte celular aumentada e/ou morfologia aberrante, em comparação com o mesmo na ausência do fármaco.
[0219] De acordo com uma modalidade específica, as alterações celulares são refletidas pela viabilidade celular diminuída.
[0220] De acordo com uma modalidade específica, as alterações celulares são refletidas por morfologia aberrante.
[0221] De acordo com modalidades específicas, a alteração é pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10
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37/64 vezes ou pelo menos 20 vezes, em comparação com o mesmo na ausência do fármaco.
[0222] De acordo com outras modalidades específicas, a mudança é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% em comparação com o mesmo na ausência do fármaco.
[0223] De acordo com modalidades específicas, a eficácia determinada do fármaco indica a potência de um lote de um fármaco, ou seja, a sensibilidade do fármaco é indicativa de que o lote é potente.
[0224] Conforme usado no presente documento, o termo potência se refere à medida da atividade biológica do fármaco, com base no atributo do fármaco que está vinculado às propriedades biológicas relevantes (isto é, sensibilidade ao fármaco).
[0225] De acordo com modalidades específicas da invenção, o método compreende comparar a sensibilidade do tecido ao fármaco com a sensibilidade do tecido a um lote padrão de referência do fármaco, de modo a determinar a potência relativa do lote.
[0226] Conforme usado no presente documento, o termo potência relativa se refere a uma medida qualitativa da potência de um lote do fármaco, relativamente a uma referência padrão (RS) do fármaco, com uma potência conhecida.
[0227] De acordo com modalidades específicas, a potência de um lote do fármaco é determinada relativamente à potência conhecida de um padrão de referência (RS).
[0228] Conforme usado no presente documento, a frase padrão de referência ou RS se refere a um fármaco padronizado, que é usado como base de medição para o fármaco. O RS fornece um nível calibrado de efeito biológico contra o qual as novas preparações do fármaco podem ser comparadas.
[0229] De acordo com uma modalidade específica, o RS é caracterizado pela potência e qualidade ideais de um componente ativo que é eficaz no tratamento da doença (por exemplo, doença inflamatória, câncer).
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38/64 [0230] A potência de cálculo e a potência relativa são conhecidas na técnica. De acordo com modalidades específicas, a potência relativa é calculada com o uso de um software adequado para ensaios biológicos, tal como software de análise de linha paralela, por exemplo, PLA (Stegmann Systems GmbH) e software de análise de dados Gen5 (BioTek).
[0231] A implantação do método e/ou sistema de modalidades da invenção pode envolver a realização ou conclusão de tarefas selecionadas manualmente, automaticamente ou uma combinação das mesmas. Além disso, de acordo com a instrumentação e o equipamento reais das modalidades do método e/ou sistema da invenção, várias tarefas selecionadas podem ser implantadas por hardware, software ou firmware ou uma combinação dos mesmos com o uso de um sistema operacional. [0232] De acordo com modalidades específicas, a eficácia determinada do fármaco ou a combinação de fármacos indica adequação do fármaco para o tratamento de uma doença.
[0233] Conforme os presentes inventores mostram que o sistema EVOC desenvolvido pode prever respostas de tumores a fármacos anticâncer e tratamento combinacional (Exemplo 2, na seção Exemplos a seguir), a presente invenção também contempla o uso dos sistemas e métodos de cultura descritos no presente documento para prever a resposta de um indivíduo específico a um regime de tratamento, selecionando assim, o regime de tratamento adequado para esse indivíduo específico e tratando o indivíduo de acordo com esta seleção.
[0234] Desse modo, de acordo com u m aspecto da presente invenção, é fornecido um método para selecionar um fármaco para o tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, sendo que o método compreende:
(i) cultivar uma fatia de tecido cortada com precisão de tecido patológico obtida do indivíduo em um inserto de cultura de tecido em meio de cultura sob uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio; e agitar a cultura em uma rotação facilitando a submersão intermitente da dita fatia de tecido no dito meio de cultura;
(ii) adição do fármaco ao dito meio de cultura; e
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39/64 (iii) determinar o efeito do dito fármaco no dito tecido, em que a sensibilidade do dito tecido ao dito fármaco indica a eficácia do dito fármaco para o tratamento da dita doença no dito indivíduo.
[0235] De acordo com outros aspectos da invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, sendo que o método compreende:
(a) selecionar um fármaco ou uma combinação de fármacos de acordo com o método descrito no presente documento; e (b) administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco ou uma combinação de fármacos que demonstra eficácia para o tratamento da dita doença no dito indivíduo, tratando assim a doença no indivíduo.
[0236] Conforme usado no presente documento, a frase indivíduo se refere a um indivíduo mamífero (por exemplo, ser humano) que é diagnosticado com a doença ou corre o risco de desenvolver uma doença. Usos veterinários também são contemplados. O indivíduo pode ser de qualquer gênero e idade, inclusive neonatal, infantil, juvenil, adolescente, adulto e idoso.
[0237] O termo tratar se refere a inibir ou interromper o desenvolvimento de uma patologia (doença, distúrbio ou afecção) e/ou causar a redução, remissão ou regressão de uma patologia. Os elementos versados na técnica entenderão que várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia e, de modo similar, várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia.
[0238] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco ou de uma combinação de fármacos está dentro da capacidade dos elementos versados na técnica. A dosagem pode variar dependendo do fármaco escolhido, da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, a rota de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual em vista da afecção do paciente. (Consultar, por exemplo, Fingí et al., 1975, em “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, cap. 1 p. 1).
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40/64 [0239] De acordo com modalidades específicas, a doença é uma doença inflamatória que pode ser uma doença inflamatória crônica da doença inflamatória aguda.
[0240] Doenças inflamatórias associadas à hipersensibilidade [0241] Exemplos não limitadores de hipersensibilidade incluem:
[0242] Hipersensibilidade de tipo II, que inclui, entre outros, doenças reumatoides, doenças autoimunes reumatoides, artrite reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 jul; 15 (3):791), espondilite, espondilite anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189), doenças sistêmicas, doenças autoimunes sistêmicas, lúpus eritematoso sistêmico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (12):49), esclerose, esclerose sistêmica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol, março de 1999; 6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Revjun 1999; 169:107), doenças glandulares, doenças autoimunes glandulares, doenças autoimunes pancreáticas, diabetes, diabetes tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract, outubro de 1996; 34 Suppl:S125), doenças da tireoide, doenças da tireoide autoimunes, doença de Graves (Orgiazzi J Endocrinol Metab Clin North Am., Jun 2000; 29 (2):339), tireoidite, tireoidite autoimune espontânea (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 15 de dezembro de 2000; 165 (12):7262), tireoidite de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema, mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. Agosto de 1999; 57 (8): 1759); doenças reprodutivas autoimunes, doenças ovarianas, autoimunidade ovariana (Garza KM. et al., J. Reprod Immunol, fevereiro de 1998; 37 (2):87), infertilidade anti-esperma autoimune (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol, mar de 2000; 43 (3):134), perda fetal repetida (TincaniA. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9), doenças neurodegenerativas, doenças neurológicas, doenças neurológicas autoimunes, esclerose múltipla (Cross AH. et al., J Neuroimmunol. 1 de jan de 2001 ;112 (1-2):1), mal de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm. Suppl. 1997;49:77), miastenia gravis (Infante AJ. E Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (12):83), neuropatias motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. maio de 2000; 7 (3):191), síndrome de Guillain-Barre, neuropatias e neuropatias autoimunes (Kusunoki S. Am J Med. Sei. abril de 2000; 319 (4):234), doenças miastênicas, síndrome miastênica de
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Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med. Sci. abril de 2000; 319 (4):204), doenças neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplásica, síndrome de homem rígido não paraneoplásico, atrofias cerebelares, atrofias cerebelares progressivas, encefalite, encefalite progressiva do cerebelo, encefalite, encefalite de Rasmussen, esclerose lateral amiotrófica, coréia de Sydeham, coréia de Sydeham Ia, síndrome de Gilles de la Tourette, polendocrinopatias, polendocrinopatias autoimunes (Antoine JC. e Honnorat J. Rev Neurol (Paris), 2000 jan; 156 (1 ):23); neuropatias, neuropatias dismunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50:419); neuromiotonia, neuromiotonia adquirida, artrogripose múltipla congênita (Vincent A. et al., Ann NY Acad Sci. 13 de maio de 1998; 841:482), doenças cardiovasculares, doenças cardiovasculares autoimunes, aterosclerose (Matsuura E. et al., Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S135), infarto do miocárdio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S132), trombose (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9), granulomatose, granulomatose de Wegener, arterite, arterite de Takayasu e síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr, 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660); doença autoimune antifator VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2):157); vasculites, vasculites necrotizantes de pequenos vasos, poliangiite microscópica, síndrome de Churg e Strauss, glomerulonefhte, glomerulonefhte necrosante focal imune a pauci-imune, glomerulonefhte crescente. Ann Med. Interne (Pahs). Maio de 2000; 151 (3): 178); síndrome antifosfolípide (Flamholz R. et al., J. Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171); insuficiência cardíaca, anticorpos adrenoceptor dep do tipo agonista em insuficiência cardíaca (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de junho de 1999;83 (12A):75H), púrpura trombocitopênica (Moccia F. Ann Ital Med. Int. abr-jun de 1999; 14 (2): 114); anemia hemolitica, anemia hemolitica autoimune (DG Efremov, et al., Leuk Lymphoma jan de 1998; 28 (3-4):285), doenças gastrointestinais, doenças autoimunes do trato gastrointestinal, doenças intestinais, doença intestinal inflamatória crônica (Garcia Herola A.et al., Gastroenterol Hepatol, jan de 2000;23 (1):16), doença celíaca (Landau YE. E Shoenfeld Y. Harefuah 16 de jan de 2000; 138 (2):122), doenças autoimunes da musculatura, miosite, miosite autoimune, síndrome de Sjogren (Feist E.et al.,lnt Arch
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Allergy Immunol, set de 2000;123 (1):92); doença autoimune do músculo liso (Zauli D.et al., Biomed Pharmacother, jun de 1999; 53 (5-6):234), doenças hepáticas, doenças autoimunes hepáticas, hepatite autoimune (Manns MP. J Hepatol ago 2000; 33 (2):326) e cirrose biliar primária (Strassburg CP. et al., Eur J. Gastroenterol Hepatol, junho de 1999;11 (6):595);
[0243] Hipersensibilidade mediada por células tipo IV ou T, incluindo, porém, sem limitação, doenças reumatoide, artrite reumatoide (Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sei USA, 18 de janeiro de 1994;91 (2):437), doenças sistêmicas, doenças autoimunes sistêmicas, lúpus eritematoso sistêmico (Datta SK., Lupus 1998; 7 (9):591), doenças glandulares, doenças autoimunes glandulares, doenças pancreáticas, doenças autoimunes pancreáticas, diabetes tipo 1 (Castano L. e Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647); doenças da tireoide, doenças autoimunes da tireoide, doença de Graves (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol, março de 1993; 92 (1 ):77)-, doenças ovarianas (Garza KM. et al., J. Reprod Immunol, fevereiro de 1998; 37 (2):87), prostatite, prostatite autoimune (Alexander RB. et al., Urology, dez de 1997;50 (6):893), síndrome poliglandular, síndrome poliglandular autoimune, síndrome poliglandular autoimune tipo I (Hara T. et al., Blood. 1991 1 de março; 77 (5):1127), doenças neurológicas, doenças neurológicas autoimunes, esclerose múltipla, neurite, neurite óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurocirurgia Psiquiatria maio de 1994; 57 (5):544), miastenia gravis (Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 dez; 20 (12):2563), síndrome de homem rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sei USA 27 de março de 2001; 98 (7):3988), doenças cardiovasculares, autoimunidade cardíaca na doença de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest, 15 de outubro de 1996; 98 (8):1709), púrpura trombocitopênica autoimune (Semple JW. et al., Blood 15 de maio de 1996; 87 (10):4245), autoimunidade de linfócitos T antiauxiliares (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9), anemia hemolítica (Sallah S. et al., Ann Hematol, mar de 1997; 74 (3):139), doenças hepáticas, doenças autoimunes hepáticas, hepatite, hepatite crônica ativa (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol, mar de 1990; 54 (3):382), cirrose biliar, cirrose biliar primária (Jones DE. Clin Sei (Colch) nov de 1996 ;91 (5):551), doenças
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43/64 néfricas, doenças autoimunes néfricas, nefririte, nefririteintersticial (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol, Ago 1990; 1 (2):140), doenças do tecido conjuntivo, doenças do ouvido, doenças autoimunes do tecido conjuntivo, doença autoimune do ouvido (Yoo TJ. et al., Cell Immunol, ago de 1994; 157 (1):249), doença do ouvido interno (Gloddek B. et al., Ann NY Acad Sci 29 de dezembro de 1997; 830:266), doenças de pele, doenças cutâneas, doenças dérmicas, doenças de pele bolhosas, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e pênfigo foliáceo;
[0244] Hipersensibilidade tardia, incluindo, entre outros, dermatite de contato e erupção farmacosa.
[0245] Doenças autoimunes [0246] Incluem, entre outras, doenças cardiovasculares, doenças reumatoides, doenças glandulares, doenças gastrointestinais, doenças cutâneas, doenças hepáticas, doenças neurológicas, doenças musculares, doenças néfricas, doenças relacionadas à reprodução, doenças do tecido conjuntivo e doenças sistêmicas.
[0247] Exemplos de doenças cardiovasculares autoimunes incluem, porém, sem limitação aterosclerose (Matsuura E. et al., Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S135), infarto do miocárdio (VaaralaO. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S132), trombose (TincaniA. etal., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9), granulomatose de Wegener, arterite de Takayasu, síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660), doença autoimune antifator VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost. 2000; 26 (2):157), vasculite necrotizante de pequenos vasos, poliangiite microscópica, Síndrome de Churg e Strauss, necrotização focal pauciimune e glomerulonefrite crescente (Noel LH. Ann Med. Interne (Paris), maio de 2000; 151 (3):178), síndrome antifosfolípide (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171), insuficiência cardíaca induzida por anticorpos (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de junho de 1999; 83 (12A):75H), púrpura trombocitopênica (Moccia F. Ann Ital Med. Int. abr-jun de 1999; 14 (2): 114; Semple JW. et al., Blood, 15 de maio de 1996; 87 (10):4245), anemia hemolítica autoimune (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma, jan de 1998; 28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol mar de 1997; 74 (3):139), autoimunidade cardíaca na doença de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin
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Invest, 15 de outubro de 1996; 98 (8):1709) e autoimunidade de linfócitos T antiauxiliares (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9).
[0248] Exemplos de doenças reumatoides autoimunes incluem, porém, sem limitação, artrite reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol jul de 2000; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units SA 18 de janeiro de 1994; 91 (2):437) e espondilite anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).
[0249] Exemplos de doenças glandulares autoimunes incluem, porém, sem limitação, doença pancreática, diabetes tipo I, tireoide, doença de Graves, tireoidite, tireoidite autoimune espontânea, tireoidite de Hashimoto, mixedema idiopático, autoimunidade ovariana, infertilidade antiesperma autoimune, prostatite autoimune e síndrome poliglandular autoimune do tipo I. doenças incluem, entre outras, doenças autoimunes do pâncreas, diabetes tipo 1 (Castano L. e Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract out de 1996; 34 Suppl:S125), doenças da tireoide autoimunes, doença de Graves (Orgiazzi J Endocrinol Metab Clin North Am jun de 2000; 29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol, mar de 1993; 92 (1):77), tireoidite autoimune espontânea (Braley-Mullen H. e Yu S, J Immunol., 15 de dez de 2000; 165 (12):7262), tireoidite de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho ago de 1999; 57 (8):1.810), mixedema idiopática (MitsumaT. Nippon Rinsho. ago de 1999; 57 (8):1759), autoimunidade ovariana (Garza KM. et al., J. Reprod. Immunol., fevereiro de 1998; 37 (2):87), infertilidade anti-esperma autoimune (Diekman AB. et al., Am J Reprod. Immunol, mar de 2000; 43 (3):134), prostatite autoimune (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec; 50 (6):893) e síndrome poliglandular autoimune do tipo I (Hara T. et al., Blood. 1 de março de 1991; 77 (5):1127).
[0250] Exemplos de doenças gastrointestinais autoimunes incluem, porém, sem limitação, doenças intestinais inflamatórias crônicas (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol, jan de 2000; 23 (1):16), doença celíaca (Landau YE. E Shoenfeld Y. Harefuah 16 de jan de 2000; 138 (2): 122), colite, ileite e doença de Crohn.
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45/64 [0251] Exemplos de doenças cutâneas autoimunes incluem, porém sem limitação, doenças cutâneas bolhosas autoimunes, tais como, sem limitação, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e pênfigo foliáceo.
[0252] Exemplos de doenças hepáticas autoimunes incluem, porém sem limitação, hepatite, hepatite ativa crônica autoimune (Franco A. et al., Clin Immunol. Immunopathol, mar de 1990; 54 (3):382), cirrose biliar primária (Jones DE. Clin Sei (Colch), novembro de 1996; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J. Gastroenterol Hepatol, jun d 1999; 11 (6):595) e hepatite autoimune (Manns MP. J Hepatol, agosto de 2000; 33 (2):326).
[0253] Exemplos de doenças neurológicas autoimunes incluem, porém, sem limitação, esclerose múltipla (Cross AH. etal., J Neuroimmunol 1 dejan de 2001 ;112 (1-2):1), mal de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77), miastenia gravis (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol dez de 1990; 20 (12):2563), neuropatias, neuropatias motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. maio de 2000; 7 (3): 191); Síndrome de Guillain-Barre e neuropatias autoimunes (Kusunoki S. Am J Med. Sei. abril de 2000; 319 (4):234), miastenia, síndrome miastênica de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med. Sei. abril de 2000; 319 (4):204); doenças neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplásica e síndrome do homem rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A, 27 de março de 2001; 98 (7):3988); síndrome do homem rígido não paraneoplásico, atrofias cerebelares progressivas, encefalite, encefalite de Rasmussen, esclerose lateral amiotrófica, coréia de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette e polendocrinopatias autoimunes (Antoine JC. e Honnorat J. Rev Neurol (Paris) jan de 2000; 156 (1):23); neuropatias disimunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50:419); neuromiotonia adquirida, artrogripose múltipla congênita (Vincent A. et al., Ann NY Acad Sci. 13 de maio de 1998; 841:482), neurite, neurite óptica (Soderstrom M. et al., J. Neurol Neurosurg Psychiatry, maio de 1994; 57 (5):544) e doenças neurodegenerativas.
[0254] Exemplos de doenças musculares autoimunes incluem, entre outros, miosite, miosite autoimune e síndrome de Sjogren primária (Feist E. et al., Int Arch
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Allergy Immunol set de 2000; 123 (1):92) e doença autoimune do músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother, junho de 1999; 53 (5-6):234).
[0255] Exemplos de doenças néfricas autoimunes incluem, porém, sem limitação, nefrite e nefrite intersticial autoimune (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol, agosto de 1990; 1 (2):140).
[0256] Exemplos de doenças autoimunes relacionadas à reprodução incluem, porém, sem limitação, perda fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9).
[0257] Exemplos de doenças autoimunes do tecido conjuntivo incluem, porém sem limitação, doenças do ouvido, doenças do ouvido autoimunes (Yoo TJ. et al., Cell Immunol, agosto de 1994; 157 (1):249) e doenças autoimunes do ouvido interno (Gloddek B. et al., Ann NY Acad Sci 1997, 29 de dezembro de 1997; 830:266).
[0258] Exemplos de doenças sistêmicas autoimunes incluem, entre outros, lúpus eritematoso sistêmico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2):49) e esclerose sistêmica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol, março de 1999; 6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev, jun de 1999; 169:107).
[0259] Doenças infecciosas [0260] Exemplos de doenças infecciosas incluem, porém, sem limitação, doenças infecciosas crônicas, doenças infecciosas subagudas, doenças infecciosas agudas, doenças virais, doenças bacterianas, doenças protozoárias, doenças parasitárias, doenças fúngicas, doenças por micoplasma e doenças por príons.
[0261] De acordo com modalidades específicas, a doença é câncer.
[0262] Os termos câncer e cancerígeno descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Conforme usado no presente documento, os termos câncer e cancerígeno se referem a qualquer tumor sólido, metástase de câncer e/ou um pré-câncer sólido.
[0263] Exemplos de câncer incluem, porém, sem limitação, carcinoma, blastoma, sarcoma e linfoma. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão (incluindo câncer de células pequenas, câncer de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do
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47/64 pulmão), glioma, câncer de melanoma, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico, gastroesofágico ou estomacal (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, sarcoma de tecidos moles, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireóide, carcinoma hepático, carcinoma carcinoide de sarcoma de Kaposi e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço.
[0264] Pré-cânceres são caracterizados e conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Berman JJ. and Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med. Inform Decis Mak. 3, 8). Exemplos de pré-cânceres incluem, entre outros, pequenos pré-cânceres adquiridos, lesões grandes adquiridas com atipia nuclear, lesões precursoras que ocorrem com síndromes hiperplásicas herdadas que progridem para o câncer e hiperplasias difusas adquiridas e metaplasias difusas. Exemplos não limitadores de pequenos pré-cânceres incluem HGSIL (lesão intraepitelial escamosa de alto grau do colo uterino), AIN (neoplasia intraepitelial anal), displasia das cordas vocais, criptas aberrantes (do cólon), PIN (neoplasia intraepitelial prostática).
[0265] Exemplos não limitadores de lesões grandes adquiridas com atipia nuclear incluem adenoma tubular, AILD (linfadenopatia angioimunoblástica com disproteinemia), meningioma atípico, pólipo gástrico, parapsoríase em placas grandes, mielodisplasia, carcinoma de células transitórias papilares in situ, anemia refratária com blastos excessivos e anemia refratária Papiloma schneideriano. Exemplos não limitadores de lesões precursoras que ocorrem com síndromes hiperplásicas herdadas que evoluem para câncer incluem síndrome atípica da toupeira, adenomatose de células C e MEA. Exemplos não limitadores de hiperplasias difusas adquiridas e metaplasias difusas incluem a doença de Paget no osso e colite ulcerativa.
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48/64 [0266] De acordo com modalidades específicas, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer gastroesofágico e câncer de mama.
[0267] De acordo com modalidades específicas, o câncer é um câncer metastático.
[0268] Visto que várias tecnologias adicionais estão disponíveis para prever a resposta de um paciente a um regime de tratamento, os métodos da presente invenção podem ser combinados com outros métodos conhecidos na técnica, tais como, porém sem limitação, perfis genéticos, linhas celulares derivadas de tumores geradas a partir de tumores de pacientes e modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX), conforme também descrito na seção Exemplos a seguir.
[0269] De acordo com modalidades específicas, o método é efetuado em combinação com o perfil genético.
[0270] Conforme usado no presente documento, o termo perfil genético se refere à assinatura molecular de um conjunto de genes em amostras biológicas com o uso de qualquer tecnologia de perfil adequada, tal como, porém, sem limitação, técnicas de sequenciamento de DNA, sequenciamento de RNAe microarranjos.
[0271 ] Conforme usado no presente documento, o termo sobre se refere a ± 10% [0272] Os termos compreende, compreender, inclui, incluir, ter e seus conjugados significam incluir, porém, porém, sem limitação,.
[0273] O termo consistir em significa incluir e limitado(a) a.
[0274] O termo consistir essencialmente em significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas das reivindicações reivindicadas, composição, método ou estrutura.
[0275] - Conforme usadas no presente documento, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite o contrário. Por exemplo, o termo um composto ou pelo menos um (1) composto pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.
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49/64 [0276] Ao longo deste pedido, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve-se entender que a descrição no formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo revelado especificamente todas as subfaixas possíveis, assim como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa como 1 a 6 deve ser considerada como tendo subfaixas especificamente reveladas, como 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 2 a 4, 2 a 6, 3 a 6 etc., assim como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[0277] Sempre que uma faixa numérica for indicada no presente documento, devese incluir qualquer número citado (fracionário ou integral) dentro da faixa indicada. As frases variando/varia entre um primeiro número indica e um segundo indica número e variando/varia de um primeiro número indica a um segundo número indica são usadas aqui de forma intercambiável e devem incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os números fracionários e integrais entre eles.
[0278] Conforme usado no presente documento, o termo método se refere a modos, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo, porém sem limitação, esses modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos, ou facilmente desenvolvidos a partir de modos conhecidos, meios, técnicas e procedimentos de praticantes das artes químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.
[0279] Quando é feita referência a listagens de sequências específicas, essa referência deve também compreender sequências que correspondem substancialmente à sua sequência complementar, incluindo variações menores de sequência, resultantes de, por exemplo, erros de sequência, erros de clonagem ou outras alterações que resultam na substituição da base, exclusão ou adição de bases, desde que a frequência de tais variações seja menos do que 1 em 50 nucleotídeos; alternativamente, menos do que 1 em 100 nucleotídeos; alternativamente, menos do que 1 em 200 nucleotídeos; em alternativa, menos do que 1 em 500 nucleotídeos;,
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50/64 menos de 1 em 1000 nucleotídeos, alternativamente, menos de 1 em 5.000 nucleotídeos, alternativamente, menos de 1 em 10.000 nucleotídeos.
[0280] É apreciado que certos recursos da invenção, os quais são, para maior clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidos em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, vários recursos da invenção, que são, para brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou conforme for adequado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certos recursos descritos no contexto de várias modalidades não devem ser considerados recursos essenciais dessas modalidades, a menos que a modalidade seja inoperativa sem esses elementos.
[0281] Várias modalidades e aspectos da presente invenção, conforme delineado acima e conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.
EXEMPLOS [0282] Agora é feita referência aos exemplos a seguir, os quais, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas modalidades da invenção de uma maneira não limitativa.
[0283] Em geral, a nomenclatura usada no presente documento e os procedimentos laboratoriais usados na presente invenção incluem técnicas de DNA molecular, bioquímico, microbiológico e de DNA recombinante. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Consultar, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual ’’Sambrook et al., (1989); Current Protocols in Molecular Biology Volumes l-lll Ausubel, RM, ed. (1994); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nova York (1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, Nova York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series ”, Vols. 1 a 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (1998); metodologias estabelecidas nas Pats. N° U.S. 4.666.828; U.S.4.683.202; U.S.4.801.531; U.S.5.192.659 e U.S.5.272.057; Cell
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Biology: A Laboratory Handbook ”, Volumes I a III Cellis, JE, ed. (1994); Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique por Freshney, Wiley-Liss, NY (1994), terceira edição; Current Protocols in Immunology Volumes I a III Coligan JE, ed. (1994); Stites et al. (eds), Immunology Basic and Clinical (8a Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman and Co., Nova York (1980); os imunoensaios disponíveis são descritos extensivamente na literatura científica e de patentes, consultar, por exemplo, as Pats n° U.S.3.791.932; U.S.3.839.153; U.S.3.850.752; U.S.3.850.578; U.S.3.853.987; U.S.3.867.517; U.S.3.879.262; U.S.3.901.654; U.S.3.935.074; U.S.3.984.533; U.S.3.996.345; U.S.4.034.074; U.S.4.098.876; U.S.4.879.219; U.S.5.011.771 e U.S.5.281.521; Oligonucleotide Synthesis Gait, MJ, ed. (1984); NucleicAcid Hybridization Hames, BD, e Higgins SJ, eds. (1985); Transcription and Translation Hames, BD e Higgins SJ, eds. (1984); Animal Cell Culture Freshney, Rl, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); A Practical Guide to Molecular Cloning Perbal, B., (1984) e Methods in Enzymology vol. 1 a 317, Academic Press; PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications ”, Academic Press, San Diego, CA(1990); Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados a título de referência como se totalmente apresentados no presente documento. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos nele contidos sejam conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações no presente documento contidas são incorporadas ao presente documento a título de referência. MATERIAIS E MÉTODOS [0284] Fatias de tecido - Tecidos saudáveis e cancerígenos (fígado, pulmão, cólon, mama, pâncreas ou tecidos metastáticos de câncer originários do pulmão, cólon, mama ou pâncreas) foram obtidos de modelos de ratos PDX (Nod Scid Gamma Mice Jackson Laboratories EUA e/ou Harlan Laboratórios); biópsias humanas e tecidos removidos cirurgicamente; e xenoenxertos derivados de humanos (câncer ovariano, PDX pancreático). Após a coleta, o tecido fresco foi imediatamente colocado em
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52/64 solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS, Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) ou meio de cultura gelada (RPMI Biological Industries). Um cortador de tecidos de precisão (Compresstome™VF-300: A Precisionary Instruments Inc. NC, EUA) foi limpa com etanol a 70%, lavada duas vezes com água estéril e uma nova lâmina (Double Edge Blades 32017759 Belgar, Jerusalém, Israel) foi fixada e posicionada no lugar.
[0285] O tecido permaneceu no gelo até ser transferido para o cortador de tecido pré-limpo; em seguida, o tecido foi removido do PBS e gentilmente fixado ao êmbolo com cola de contato e estabilizado em agarose com gel baixo a 3%, aquecido a 50 °c e depois resfriado para se solidificar antes do uso (agarose, A0701 Sigma-Aldrich, 3% em gel) 0,9 g de NaCI). O êmbolo com o tecido foi inserido em seu local designado no fatiador de tecidos e o banho foi preenchido com Williams Medium E gelado com adição de penicilina e estreptomicina. Para manter o meio no banho a baixas temperaturas, foi construída uma bobina de resfriamento oca assentada no banho. Água gelada foi então bombeada através da bobina com o uso de uma bomba de imersão padrão. O tecido foi fatiado em fatias de ~ 250 μΜ. Aproximadamente 30 a 40 fatias foram preparadas a partir de um pedaço de tecido de 1 cm3. Duas ou três fatias foram imediatamente colocadas em cassetes descartáveis de histologia plástica e fixadas em PFA a 4%.
[0286] Procedimento de cultivo - As fatias de tecido foram colocadas individualmente em placas de 6 poços (Coming CC-3516 Getter, Petach-Tikva, Israel) diretamente, sobre os insertos de titânio (MA0036 Well Inserts, P&D em Alabama, Alabama, EUA) ou em PEG ou PEG colocado em uma pastilha de titânio. Cada poço continha 4,5 ml de meio DMEM/F12 ou M199 suplementado com penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 pg/ml), gentamicina (G1397 50 pg/ml Sigma-Aldrich), soro fetal de bezerro a 5% (FCS) 10270106 Gibco Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel), anfotericina B (A-4888 2,5 pg/ml Sigma-Aldrich) e glutamina (L-glutamina 03-020-1B 100 pl/ml Indústrias Biológicas). As placas foram incubadas em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 e 21% ou 80% de O2 (com o uso da câmara de
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53/64 oxigênio: BioSpherix C274, NY, EUA; Controlador de oxigênio: Biospherix ProOx C21, NY, EUA; e oxigênio 98% Maxima Air Innovations, Ashdod, Israel).
[0287] A incubadora inteira foi colocada em um agitador orbital agitando (TOU120N MRC, Holon, Israel) a 70 rpm. Após a incubação de um dia para o outro, o meio foi substituído por meio fresco. Nos poços indicados, o meio fresco continha um fármaco anticâncer [4-Hidroperoxi ciclofosfamida (sc-206885 ENCO, Petach Tikva, Israel), 5-Flurouricil (5FU, A10042 Adooq Biotag, Kfar Yona, Israel), Oxaliplatina (09512 Sigma -Aldrich), Irinotecano (A10479-200 Adooq Biotag, Kfar Yona, Israel), Docetaxel (01885 Sigma-Aldrich), Cisplatina (Sigma-Aldrich), Trametinib (A11029 Adooq Biotag, Kfar Yona, Israel), inibidor do CDK4/6 Palbociclibe (PZ0199 SigmaAldrich) ou inibidor de FGFR AZD4547 (A11075-5 Adooq Biotag) nas concentrações indicadas. O meio foi substituído uma vez a cada 48 horas por fármaco fresco/DMSO por 4 a 6 dias.
[0288] Ensaios funcionais - Dezoito a vinte e quatro horas antes do final da cultura, BrdU foi adicionado ao meio (Concentração final: 10 pm/ml) para coloração subsequente com um anticorpo antiBrdU (BRDU + anti-BRDU B5002 Sigma-Aldrich e 94-MS-1058-P Eldan, Petach Tikva, Israel) e/ou anti Ki67 (94-RM-9106 -S Eldan, Petach Tikva, Israel). No final da cultura, os tecidos foram colocados entre duas lamelas de vidro, colocados em um cassete de histologia plástica descartável e fixados de um dia para o outro em 4% de Paraformalideído (PFA). A seguir, as fatias foram parafinizadas, bloqueadas e cortadas em fatias de 5 μΜ para coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) e outra coloração de IHC, tal como coloração de Ki67. EXEMPLO 1 [0289] CONDIÇÕES DE CULTURA ÓRGÃO EX-VIVO PARA MANUTENÇÃO DA ESTRUTURA E FUNÇÃO DE FATIAS DE TECIDOS SAUDÁVEIS E TUMORES [0290] Afim de obter a estrutura e a função do tecido por pelo menos 5 dias em uma cultura de órgãos ex vivo (EVOC), várias condições foram examinadas. As condições incluíam:
1. cultivar as fatias de tecido em diferentes superfícies, como insertos de titânio, em comparação com a imersão direta das fatias no meio de
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54/64 cultura;
2. incubando o tecido sob condições de cultura de tecido normalizadas de 21% de O2 e 5% de CO2 em comparação com a atmosfera altamente oxigenada que contém 80% de O2;
3. cultivar 1 fatia em cada poço em comparação com várias fatias em cada poço;
4. com 0 uso de diferentes mídias, tais como DMEM/F12 e M199;
5. cultivo em PEG com ou Sem insertos de titânio.
[0291] Os resultados são resumidos na Tabela 1 abaixo.
[0292] Para essa finalidade, incubar o tecido sob atmosfera altamente oxigenado que contém 80% de O 2 aumentou significativamente a viabilidade do tecido, em comparação com as condições de cultura de tecido padrão de 21% de O2 (cultura representativa de xenoenxertos derivados de câncer ovariano humano é mostrada na Figura 1). Além disso, o tecido sobrevive melhor quando suportado em insertos de titânio que permitem uma interface meio/ar em comparação com o inserto direta do tecido na cultura de tecido, de modo que a fatia seja completamente imersa no meio (cultura representativa de xenoenxertos derivados de câncer ovariano humano é mostrado na Figura 1). Além disso, o DMEM/F12 foi um meio melhor que ο M199 (a cultura representativa de xenoenxertos derivados de câncer ovariano humano é mostrada na Figura 2).
Tabela 1: Resumo da cultura de Órgãos de tecido humano ex-vivo (EVOC) sob diferentes condições de cultivo
Tecido Inserto de cultura de tecido O2 % Meio de cultura Dias em Cultura Viabilidad e*
Câncer de ovário (modelo PDX) titânio 21% DMEM/F12 5 5%
Sem inserto 21% DMEM/F12 5 0%
Titânio 80% DMEM/F12 5 80%
Sem inserto 80% DMEM/F12 5 50%
Titânio 80% M199 5 20%
Câncer de mama (modelo Titânio 80% DMEM/F12 5 60 a 90%
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PDX) Sem inserto 80% DMEM/F12 5 0 a 40%
Titânio 80% DMEM/F12 5 90%+
Titânio com PEG 80% DMEM/F12 5 0 a 5%
Câncer de cólon (modelo PDX) Titânio 80% DMEM/F12 5 100%
Titânio com PEG 80% DMEM/F12 5 5%
Câncer de pulmão (modelo PDX) Titânio 80% DMEM/F12 5 100%
Câncer de pâncreas (modelo PDX) Titânio 80% DMEM/F12 5 90%
CRC Primário ** Titânio 80% DMEM/F12 4 100%
Metástase hepática de CRC ** Titânio 80% DMEM/F12 4 100%
Metástase Peritoneal de CRC Titânio 80% DMEM/F12 5 80 a 100%
Pulmão Primário ** Titânio 80% DMEM/F12 5a7 dias 100%
As experiências são duplicadas ou triplicadas para melhorar a robustez do ensaio. % de Viabilidade é uma avaliação subjetiva por análise morfológica da área de viabilidade ótima tomada independentemente por pelo menos dois observadores independentes diferentes.
[0293] ** O tecido foi obtido da cirurgia e cultivado diretamente.
[0294] *** PDX - xenoenxerto derivado do paciente, carcinoma colorretal de CRC [0295] Os tecidos para os EVOCs apresentados na Tabela 1 acima foram todos obtidos da cirurgia. No entanto, o ensaio desenvolvido pode ser adaptado para pequenos tecidos de biópsia retirados por biópsia nuclear do tecido tumoral (Figura 9). Especificamente, o tecido é incorporado na agarose em duas etapas: a primeira agarose líquida é colocada em uma pequena bandeja de metal, as biópsias principais colocadas na agarose e a agarose adicionada no topo das biópsias. A bandeja é resfriada e a agarose com as biópsias é cortada em bloco. Na segunda etapa, o bloco de agarose é fixado ao êmbolo com cola de contato e cercado por agarose de maneira semelhante à usada para pedaços de tecido.
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56/64 [0296] No geral, EVOCs de diferentes fontes representando numerosos tecidos que mantiveram a estrutura e a viabilidade do tecido por pelo menos 5 dias de cultura foram estabelecidos (Figuras 1, 2 e 11). É importante ressaltar que todos os tecidos foram examinados por um patologista e foram considerados totalmente viáveis com a mesma morfologia do tecido patológico regular do paciente.
[0297] Tomados em conjunto, cultivar uma fatia de tecido diretamente no meio de um inserto de titânio em meio DMEM/F12 sob atmosfera altamente oxigenado que contém O2 a 80% e agitando a cultura em agitação orbital, 0 que facilita a submersão intermitente da fatia de tecido em meio de cultura mantido a estrutura e viabilidade do tecido por pelo menos 5 dias de cultivo. Esse sistema EVOC recém-desenvolvido foi usado nos seguintes exemplos abaixo.
EXEMPLO 2
O EVOC DESENVOLVIDO PODE SER USADO PARA PREVER A RESPOSTA DE TUMORES A FÁRMACOS ANTICÂNCER [0298] O EVOC desenvolvido pode prever a resposta in vivo de xenoenxertos derivados do paciente ao tratamento: Vários modelos de xenoenxerto (PDX) derivados de pacientes com camundongos com respostas conhecidas in-vivo a fármacos anticâncer foram adquiridos da Jackson Laboratories. Os tumores foram excisados dos camundongos, cultivados conforme descrito nos Materiais e Métodos e no Exemplo 1 acima e foram testadas a sensibilidade das fatias de tecido aos agentes anticancerígenos. Ao todo, sete modelos de PDX originários de três tipos de tumores (câncer de mama, câncer de pulmão e câncer colorretal) foram testados e em todos os modelos testados o sistema EVOC desenvolvido foi capaz de prever corretamente a sensibilidade dos tumores ao tratamento com fármaco (Tabela 2 abaixo e Figuras 3 e 4). Além disso, foi observada uma resposta clara dependente da dose no sistema EVOC.
[0299] Desse modo, conforme pode ser observado nas Figuras 3 e 4 e Tabela 2 abaixo, os tumores que eram resistentes ao tratamento in vivo também eram resistentes ao tratamento ex vivo, mesmo quando doses muito altas foram aplicadas. Pelo contrário, aplicando-se um tratamento ao qual os tumores eram sensíveis in vivo,
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57/64 a morte celular foi detectada ex vivo em baixas concentrações do fármaco e a sensibilidade do fármaco aumentou com concentrações do fármaco aumentadas.
Tabela 2: A resposta in-vivo de modelos de camundongo de PDX ao tratamento de fármaco sistêmico conforme comparado à resposta dos mesmos tumores ex-vivo.
Modelo # Tipo de câncer Dose de fármaco e EVOC (mM) In-Vivo EVOC
TM00356 Pulmão Docetaxel (80 μΜ) PR PR
Cisplatina (30 pM) NR NR
Trametinib (1 pM) NR NR
TM00213 Pulmão Docetaxel (80 pM) Cr Cr
Cisplatina (30 pM) PR PR
Trametinib (1 pM) PR PR
TM00096 Mama Docetaxel (60 pM) Cr Cr
4-HA (60 pm) PR PR
TM00098 Mama Docetaxel (60 pM) Cr Cr
4-HA (60 pM) Cr Cr
TM00164 Cólon 5-FU (320 pM) PR PR
Oxaliplatina (16 pM) Cr PR
TM00134 Cólon 5-FU (320 pM) NR NR
Oxaliplatina (16 pM) NR NR
5-FU (20 pM) + Oxaliplatina (4 pM) NR
TM00170 Cólon 5-FU (320 pM) PR PR
Oxaliplatina (16 pM) PR PR
5-FU (20 pM) + Oxaliplatina (4 pM) PR
Dados in vivo foram gerados por Jackson Laboratories.
5-FU - 5-Fluorouricil; Hidroperoxi-ciclofosfamida 4-HA-4;
[0300] CR - resposta completa; PR - resposta parcial; e NR - sem resposta.
[0301] O EVOC desenvolvido demonstra que os tumores humanos apresentam sensibilidade diferencial a diferentes tratamentos anticâncer: Os tecidos tumorais do paciente excisados dos tumores do paciente durante a excisão cirúrgica foram cultivados diretamente conforme descrito nos Materiais e Métodos e no Exemplo 1
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58/64 acima e foi testada a sensibilidade das fatias de tecido aos agentes anticâncer. Os esquemas anticâncer mais comuns foram usados para cada tipo de tumor, ou seja, para o câncer colorretal humano, o tratamento padrão é o 5-fluoruricil, a Oxaliplatina e/ou o Irinotecano. A Figura 5 demonstra um exemplo para um tumor que se mostrou resistente a altas doses de 5-fluorouracil, mas relativamente sensível ao Irinotecano e Oxaliplatina. A determinação da proliferação celular por, por exemplo, coloração com Ki67 também pode ser usada para avaliar a viabilidade e a sensibilidade da fatia de tecido a agentes anticâncer. Desse modo, a Figura 8 demonstra um exemplo para um câncer colorretal que foi considerado parcialmente sensível ao 5-fluouracil, mas muito sensível ao tratamento com Oxaliplatina pela coloração com Ki67.
[0302] Em conjunto, o sistema EVOC desenvolvido indicava claramente que os tumores dos pacientes podem ser sensíveis a um fármaco anticâncer, mas resistentes a outro. Além disso, o EVOC gerado a partir de diferentes pacientes individuais respondeu diferentemente aos mesmos tratamentos anticâncer (Figura 6 e Tabelas 3 e 4 abaixo). Além disso, para cada tratamento anticâncer, foi observada uma resposta dependente da dose (por exemplo, Tabelas 3 e 4).
Tabela 3: A resposta ex vivo do câncer colorretal humano obtida de 8 pacientes.
Fármaco Dose EVOC 3 EVOC 5 EVOC 6 EVOC 1 EVOC 8 EVOC 9 EVOC 11 EVOC 7
Imediato 4 4 4 4 4 4 4 4
DMSO 4 4 3 3 4 3 4 4
Irinotecano 32 pM 3 2 3 4 1 3
64 pM 4 3 1 3 3
128 pM 2 1 2 1 0 0 3
5-FU 20 pM 3 4 2 3
80 pM 2 4 2 2 4 4 0 3
320 pM 0 3 2 1 4 0 1 3
Oxaliplatina 16 pM 4 4 2 4 4 0 4
32 pM 2 1 2 2
64 pM 2 0 1 2 1 0 0 2
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59/64 [0303] 0 a resposta completa; 1 - resposta parcial forte; 2 - resposta parcial média;
- resposta parcial fraca; e 4 - Sem resposta.
Tabela 4: A Resposta ex-vivo de Câncer colorretal humano para terapia de combinação.
DMSO 5-FU e Oxaliplatina 5-FU e Irinotecano 5-FU, Irinotecano e Oxaliplatina
2 pM e2 pM 20 pM e 4 pM 20 pM e 20 pM 80 pM e 20 pM 320 pM e 64 pM 20 pM e 30 pM 80 pM e 16 pM 20 pM e 4 pM e 4 pM 80 pM e 64 pM e 32 pM 320 pM e 128 pM e 64 pM
EVOC3 4 4 3 4
EVOC5 4 4 0 0
EVOC6 3 2 0
IchEVOC 1 3 2
EVOC9 3 0
EVOC11 4 2 0 0
EVOC7 4 4 2
EVOC20 4 2 2
EVOC23 4 4
EVOC24 4 1 3
EVOC26 4 3 3
EVOC28 4 3 2
EVOC29 4 2
EVOC33 3 3
EVOC34 4 4
EVOC35 4 4 4
EVOC36 4 4 4
EVOC37 4 4 4
EVOC38 4 3 3
EVOC39 1 1 2
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EVOC40 4 1 2
EVOC41 4 2
EVOC43 4 4 4
EVOC44 4 3 4
EVOC45 3 3 2
EVOC46 3 2 1
EVOC47 3 3
[0304] 0 a resposta com piei a; 1 - respos ta parcial forte; 2 - resposta parcial média;
- resposta parcial fraca; e 4 - Sem resposta.
[0305] O EVOC desenvolvido pode prever a sensibilidade à terapia alvejada, conforme previsto pelo perfil molecular: Conforme um meio para medicamento personalizado, o tecido tumoral do paciente pode ser testado para possíveis mutações genéticas acionáveis, por exemplo, sequenciamento de exoma. Um dos tumores obtidos foi de uma paciente com câncer de mama triplo negativo que foi encontrado para abrigar alterações genéticas somáticas potencialmente direcionáveis, incluindo uma amplificação de FGFR1 e uma amplificação de CDK6. Conforme pode ser visto na Figura 7, embora o tumor obtido desse paciente (Paciente 1) fosse resistente ex vivo ao inibidor de CDK4/6, palbociclib, demonstrou alta sensibilidade ao inibidor de FGFR AZD4547. Com máxima importância, um câncer de mama obtido de outro paciente que não teve amplificação do FGFR1 (Paciente 2) foi resistente à inibição de FGFR no sistema EVOC desenvolvido.
[0306] O tecido pode ser armazenado por 48 horas antes do cultivo: Os tecidos tumorais do paciente excisados dos tumores do paciente durante a excisão cirúrgica foram cultivados diretamente conforme descrito nos Materiais e Métodos e no Exemplo 1 acima ou cultivados após 48 horas de armazenamento em meio a 4 °C; e a sensibilidade das fatias de tecido aos agentes anticâncer foi testada. A Figura 10 demonstra um exemplo para um tecido de câncer de cólon que foi considerado parcialmente sensível ao 5-fluouracil de maneira semelhante em ambas as condições (isto é, cultivada diretamente ou após 48 horas a 4 °C).
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61/64 [0307] Tomados em conjunto, o tecido pode ser armazenado em meio por pelo menos 48 horas antes do início da experimentação, sem nenhum efeito adverso no tecido ou na sensibilidade ao fármaco.
[0308] Tomado em conjunto, o recém desenvolvido EVOC toma o processo de estudo da resposta do tecido humano do câncer rápido, rentável e universal para muitos tecidos cancerosos. Todos os tecidos cancerígenos testados, incluindo tecido ovariano, colorretal, pulmão, pâncreas e mama, apresentaram alta viabilidade após 4 a 7 dias em cultura.
[0309] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes àquele indivíduo versado na técnica. Consequentemente, a mesma se destina a abranger tais alternativas, modificações e variações que estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
[0310] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados ao presente documento na sua totalidade a título de referência no relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado para ser incorporado ao presente documento a título de referência. Adicionalmente, citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser construída como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior à presente invenção. Na extensão de que as seções são usadas, as mesmas não devem ser interpretadas como necessariamente limitadoras.
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Claims (39)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sistema de cultura que compreende um meio de cultura e uma fatia de tecido cortada com precisão colocada em um inserto de cultura de tecido caracterizado pelo fato de que a dita fatia de tecido cortada com precisão é mantida em uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio e em que a dita cultura é agitada rotativamente facilitando intermitentemente a submersão da dita fatia de tecido no dito meio de cultura.
  2. 2. Sistema de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que a dita cultura está em uma placa de cultura de tecido.
  3. 3. Sistema de cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e
    2, caracterizado pelo fato de que compreende um fármaco.
  4. 4. Método de cultura de um tecido, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma fatia de tecido cortada com precisão em um inserto de cultura de tecido em um meio de cultura sob uma atmosfera altamente oxigenada que contém pelo menos 50% de oxigênio; e agitar a cultura em uma rotação facilitando a submersão intermitente da dita fatia de tecido no dito meio de cultura.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente adicionar um fármaco ao dito meio de cultura.
  6. 6. Método de determinação de eficácia de um fármaco ou um lote de um fármaco, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) cultivar um tecido de acordo com o método tal como definido na reivindicação 4;
    (ii) adicionar o fármaco ou o lote de um fármaco ao dito meio de cultura; e (iii) determinar o efeito do dito fármaco ou do dito lote de um fármaco no dito tecido, em que a sensibilidade do dito tecido ao dito fármaco indica a eficácia do dito fármaco.
  7. 7. Sistema de cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
    3, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito tecido é um tecido patológico.
  8. 8. Método para selecionar um fármaco para o tratamento de uma doença
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    2/5 em um indivíduo com necessidade do mesmo, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) cultivar um tecido patológico obtido do indivíduo de acordo com o método tal como definido na reivindicação 4;
    (ii) adição do fármaco ao dito meio de cultura; e (iii) determinar o efeito do dito fármaco no dito tecido, em que a sensibilidade do dito tecido ao dito fármaco indica a eficácia do dito fármaco para o tratamento da dita doença no dito indivíduo.
  9. 9. Método para tratar uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) selecionar um fármaco de acordo com o método tal como definido na reivindicação 8; e (b) administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco que demonstre eficácia para o tratamento da dita doença no dito indivíduo, tratando assim a doença no indivíduo.
  10. 10. Sistema de cultura, de acordo com a reivindicação 3, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 8 e 9, caracterizado pelo fato de que o dito fármaco é uma combinação de fármacos.
  11. 11. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o tecido ou a dita fatia de tecido cortada com precisão são isolados recentemente.
  12. 12. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o tecido ou a dita fatia de tecido cortada com precisão são preservados a 4 °C.
  13. 13. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o tecido ou a dita fatia de tecido cortada com precisão são criopreservados.
  14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizado pelo fato de que a dita determinação é efetuada por avaliação de morfologia, avaliação de viabilidade, avaliação de proliferação e/ou avaliação de morte
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    3/5 celular.
  15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizado pelo fato de que a dita determinação é realizada por avaliação de morfologia.
  16. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 15, caracterizado pelo fato de que a dita determinação é realizada dentro de 3 a 5 dias de cultivo.
  17. 17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que a dita doença é câncer.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em ovário, colorretal, pulmão, pâncreas, gástrico, gastroesofágico e mama.
  19. 19. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito tecido patológico é um tecido cancerígeno.
  20. 20. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em ovário, colorretal, pulmão, pâncreas gástrico, gastroesofágico e mama.
  21. 21. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em ovário, colorretal, pulmão, pâncreas gástrico, gastroesofágico, mama, fígado, cartilagem e osso.
  22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 21, caracterizado pelo fato de que a dita adição é realizada 12 a 24 horas após o início da dita cultura.
  23. 23. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 5 a 22, caracterizado pelo fato de que o dito fármaco é um fármaco anti-inflamatório ou anticâncer.
  24. 24. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das
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    4/5 reivindicações 3 e 5 a 22, caracterizado pelo fato de que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em 5-Flurouricil (5FU), Oxaliplatina, Irinotecano, Cisplatina, 4-Hidroperóxi Ciclofosfamida, Docetaxel, Doxorrubicina, Navalbina, Gencitabina, Gefitinib, Tamoxifeno, Olaparib, Trametinib, Everolimus e Palbociclib.
  25. 25. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 5 a 24, caracterizado pelo fato de que a dita concentração de fármaco é maior que a dose de fármaco IC50 em uma linhagem celular.
  26. 26. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 5 a 24, caracterizado pelo fato de que a dita concentração de fármaco é derivada de uma experiência de dosagem em que é observada uma resposta dependente da dose.
  27. 27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 26, caracterizado pelo fato de que o dito cultivo é realizado por pelo menos 4 dias.
  28. 28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 26, caracterizado pelo fato de que o dito cultivo é realizado por pelo menos 5 dias.
  29. 29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 28, caracterizado pelo fato de que o dito cultivo é realizado por até 7 dias.
  30. 30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 29, caracterizado pelo fato de que o dito cultivo é realizado em uma placa de cultura de tecido.
  31. 31. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a dita fatia de corte com precisão é de 200 a 300 pm.
  32. 32. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a dita fatia é colocada no meio do dito inserto de cultura de células.
  33. 33. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a dita fatia é uma fatia.
  34. 34. Sistema de cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a dita fatia está em contato direto com o dito
    Petição 870190099695, de 04/10/2019, pág. 81/97
    5/5 inserto de cultura de tecido.
  35. 35. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o dito inserto de cultura de tecido é um inserto de grade de titânio.
  36. 36. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o dito tecido é um tecido humano.
  37. 37. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a dita atmosfera altamente oxigenada contém pelo menos 70% de oxigênio.
  38. 38. Sistema de cultura ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a dita atmosfera altamente oxigenada contém menos de 95% de oxigênio.
  39. 39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 38, caracterizado pelo fato de que o dito método é efetuado em combinação com o perfil genético.
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