JP2015516371A - キエシンスルフヒドリルオキシダーゼ（ｑｓｏｘ１）を阻害するための組成物および該組成物の使用 - Google Patents

キエシンスルフヒドリルオキシダーゼ（ｑｓｏｘ１）を阻害するための組成物および該組成物の使用 Download PDF

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Abstract

基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げる方法が開示される。この方法は、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げることを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＱＳＯＸ１阻害剤に関連し、より具体的には、限定されないが、ラミニン関連疾患を処置するためのＱＳＯＸ１阻害剤の使用に関連する。
キエシンスルフヒドリルオキシダーゼ１（ＱＳＯＸ１）は、基質タンパク質におけるチオール基の対から分子状酸素への電子の移動を媒介するために結合型フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を使用する酵素であり、過酸化水素が副生成物として生成される。ＱＳＯＸ１は、ジスルフィド形成のこの基本的な触媒活性を、小胞体（ＥＲ）における初期段階のタンパク質折り畳みにおいて機能するいくつかの他の酵素と、また、ミトコンドリアの膜間腔におけるタンパク質の折り畳みおよび保持を媒介する酵素と共用する。しかしながら、ＱＳＯＸ１は、分泌経路においてＥＲの下流側のオルガネラに主に局在化すること、および、細胞からの調節された分泌を受けることが知られている唯一のジスルフィド触媒である。ＱＳＯＸ１は、電子を基質チオールからそのＦＡＤ補因子に渡すために一連のジチオール／ジスルフィド交換工程を受ける多ドメイン酵素である。この酵素の２つの主要なレドックス活性ドメイン（その第１のドメインがタンパク質チオール含有基質と相互作用し、その第２のドメインが分子状酸素の還元を触媒する）は、それらの相対的な配向を反応サイクルの期間中に変化させなければならない。特に、アミノ末端のチオレドキン折り畳み（Ｔｒｘ）ドメインにおけるレドックス活性なジシステインモチーフ（図１Ａ〜図１Ｂ）は、基質タンパク質からの電子を受け入れるために十分に溶媒にさらされなければならない。Ｔｒｘドメインはその後、電子をさらに移動させるためにジスルフィド生成のＥＲＶ折り畳み（Ｅｒｖ）ドメインのレドックス活性なジシステインモチーフに対して自身を埋没させなければならない（図１Ａ〜図１Ｂ）。哺乳動物およびトリパノソーマ寄生虫から得られるＱＳＯＸの一組の結晶構造により、ＱＳＯＸ酵素によって示される立体配座変化の本質が例示され、また、そのような再配置を可能にする柔軟なリンカーが特定された。
ＱＳＯＸ１は、乳汁分泌および哺乳動物の精嚢分泌におけるジスルフィド結合形成の触媒として最初に発見された［Ｊａｎｏｌｉｎｏ Ｖ．Ｇ．およびＳｗａｉｓｇｏｏｄ Ｈ．Ｅ．（１９７５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５０、２５３２〜２５３８］。ＱＳＯＸ１の転写物が後で、コンフルエンスに達し、休止状態に入ったときの培養された肺線維芽細胞におけるその誘導により特定された［Ｃｏｐｐｏｃｋ Ｄ．Ｌ．他（１９９３）、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．、４、４８３〜４９３］。ＱＳＯＸ１の発現が生体において胚発達の期間中に認められており［Ｐｏｒｔｅｓ Ｋ．Ｆ．他（２００８）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．、３９、２１７〜２２５］、同様にまた、成体の多くの器官および細胞タイプにおいて認められている。ＱＳＯＸ１のレベルが、大きい分泌能力を有する器官（例えば、肺、卵巣および子宮内膜など）において特に高く［Ｍｕｓａｒｄ Ｊ．Ｆ．他（２００１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２８７、８３〜９１］、また、胃、気管支、唾液腺、食道、ランゲルハンス島、膀胱、ならびに、男性生殖器系および女性生殖器系の両方の表面近い上皮層において特に高い［Ｔｕｒｙ Ａ．他（２００６）、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．、３２３、９１〜１０３］。ＱＳＯＸ１はまた、発達途中の脳において、空間的および時間的に複雑な発現パターンを示す［Ａｍｉｏｔ Ｃ．他（２００４）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１２５、１３〜２１］。休止している線維芽細胞によって産生されるＱＳＯＸ１が分泌されることが示された［Ｃｏｐｐｏｃｋ Ｄ．他（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６９、６０４〜６１０］。また、様々な体液におけるスルフヒドリルオキシダーゼ活性により、他の細胞タイプからのＱＳＯＸ１分泌が同様に示唆される［Ｊａｎｏｌｉｎｏ Ｖ．Ｇ．およびＳｗａｉｓｇｏｏｄ、上掲］。
細胞外または後期分泌のジスルフィド触媒の目的は依然として、大きな未解決の疑問のままであり、また、ＱＳＯＸ１の生来的な基質が今後、特定されなければならない。
近年、幾人かの研究者がＱＳＯＸ１とガンとを関連づけている。Ａｎｔｗｉ他［Ａｎｔｗｉ Ｋ．他（２００９）、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．、８、４７２２〜４７３１］の教示によれば、増大したＱＳＯＸ１タンパク質レベルがヒト患者における膵臓管腺ガン（ＤＡＰ）および関連した微小転移において認められた。さらに、ＤＡＰ患者の血清ペプチドームの質量分析研究では、見かけ上はタンパク質分解的な、ＱＳＯＸ１に由来するペプチドの高いレベルが明らかにされた［Ａｎｔｗｉ他（２００９）、上掲］。Ｋａｔｃｈｍａｎ他は、ＱＳＯＸ１が、マトリックスメタロプロテイナーゼによって媒介される膵臓腫瘍細胞の浸入を促進させることを教示する［Ｋａｔｃｈｍａｎ他（２０１１）、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、９（１２）、１６２１〜３１］。そのうえ、前立腺ガンについてのマウスモデルでは、Ｎｋｘ３．１腫瘍抑制因子の機能の喪失がＱＳＯＸ１の増大した産生をもたらした［Ｏｕｙａｎｇ Ｘ．他（２００５）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６５、６７７３〜６７７９］。ＱＳＯＸ１が、前立腺肥大および上皮間新形成において、すなわち、前立腺腫瘍形成における初期事象において特に高く発現した［Ｓｏｎｇ Ｈ．他（２００９）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２８、３３０７〜３３１９］。
さらなる背景技術には、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１０／０７７９２１および同ＷＯ２０１０／０７１７８７が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げる方法であって、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げることを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ラミニン含有基底膜を介する細胞遊走を阻害する方法であって、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記ラミニン含有基底膜を介する前記細胞遊走を阻害することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置の必要のある対象において処置する方法であって、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因の治療有効量を前記対象に投与し、それにより、前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を前記対象において処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置の必要のある対象において処置するために特定される医薬を製造するための、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因の治療有効量の使用が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＱＳＯＸ１と特異的に結合し、かつ、細胞遊走を支援する基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１活性を阻害する、抗原認識ドメインを含む単離された抗体が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、有効成分として本発明の単離された抗体を含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号２９〜３４に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するポリペプチドを含有するＣＤＲをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を対象において診断する方法であって、（ａ）前記対象の生物学的サンプルを、本発明の単離されたポリペプチドとＱＳＯＸ１タンパク質との間における免疫複合体形成のために好適な条件のもとで本発明の単離されたポリペプチドと接触させること；および（ｂ）前記免疫複合体の形成を検出し、ただし、所定の閾値を超える前記免疫複合体の存在により、前記ラミニン関連疾患が示され、それにより、前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を前記対象において診断することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の抗体を含む生物学的サンプルにおいてＱＳＯＸ１のレベルを検出するためのキットが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＱＳＯＸ１阻害剤を特定する方法であって、組織を試験作用因の存在下または非存在下で培養することを含み、前記試験作用因との前記培養の後での機能的基底膜における減少により、前記試験作用因が前記ＱＳＯＸ１阻害剤であることが示される方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＱＳＯＸ１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、長さが５００アミノ酸未満である単離されたポリペプチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号６に示されるＱＳＯＸ１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、長さが５００アミノ酸未満である単離されたポリペプチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置の必要のある対象において妨げるか処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を妨げるか処置する必要のある対象において上記疾患または状態を妨げるか、または処置するために特定される医薬を製造するための、上記単離された抗体の使用が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、上記単離された抗体を包装材に詰めた状態で含み、かつ、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態の処置において使用するために前記包装材の内部または表面において印刷で特定される製品が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＱＳＯＸ１と特異的に結合し、かつ、細胞遊走を支援する基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１活性を阻害する、抗原認識ドメインを含む抗体を製造する方法であって、（ａ）マウスを組換えＱＳＯＸ１ポリペプチドにより免疫化する工程；（ｂ）ハイブリドーマを工程（ａ）のマウスの脾臓細胞から作製する工程であって、前記脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合することを含む工程；および（ｃ）陽性のハイブリドーマを選択し、それにより、前記ＱＳＯＸ１と特異的に結合する前記抗原認識ドメインを含む前記抗体を製造する工程を含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は腫瘍細胞である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組織は腫瘍組織である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組織は線維芽細胞を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はインビボで行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は腫瘍である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記腫瘍は転移性固形腫瘍である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記腫瘍は腺ガンである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記腫瘍は、前立腺ガン、肺ガン、乳ガン、子宮頸ガン、尿膜管ガン、膣ガン、結腸ガン、食道ガン、膵臓ガン、咽頭ガン、胃ガンおよび骨髄性白血病からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は線維症に関連する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ラミニンはアルファ４鎖を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ラミニンはラミニン−４１１またはラミニン−４２１である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記作用因はポリペプチド作用因である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチド作用因は、抗体、抗体フラグメントまたはペプチドからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチド作用因は上記ＱＳＯＸ１のアミノ酸座標３４〜２６６に対して向けられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体はＭＡｂ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体フラグメントはｓｃＦＶ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記作用因はポリヌクレオチド作用因である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチド作用因は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイムおよびＤＮＡザイムからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記活性が、細胞外マトリックスの免疫蛍光（ＩＦ）染色アッセイ、または、可溶性ラミニンについて検出するウエスタンブロットアッセイのうちの少なくとも１つによってアッセイされる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は抗体フラグメントである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体はモノクローナル抗体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記モノクローナル抗体はＭＡｂ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は一本鎖抗体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記一本鎖抗体はｓｃＦＶ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体または抗体フラグメントはヒト化される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体はキメラ抗体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は固体支持体に固定化される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は検出可能成分に結合される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された抗体は、配列番号７および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された抗体は、配列番号２７および配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、機能的基底膜における上記減少は、上記基底膜でのラミニン集合における低下を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ラミニン集合における上記低下は、上記組織での可溶性ラミニンにおける増大を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組織は組織培養物を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はインビボで行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、ＱＳＯＸ１の活性レベルまたは発現レベルにおける低下を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＱＳＯＸ１はヒトＱＳＯＸ１である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＱＳＯＸ１はマウスＱＳＯＸ１である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は腫瘍である。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１Ａ〜図１Ｂは、ＨｓＱＳＯＸ１のドメイン構成および反応サイクルを示す概略的例示である。図１Ａは、ＨｓＱＳＯＸ１の４つのドメインを例示する概略図である。アミノ末端フラグメント、すなわち、ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘが、２つのＴｒｘ折り畳みドメインから構成される。カルボキシ末端フラグメント、すなわち、ＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖが、２つのＥｒｖ折り畳みドメインから構成される。その活性部位システインおよび補因子結合能を失っている変性Ｅｒｖ様スルフヒドリルオキシダーゼモジュールが“ΨＥｒｖ”として示される。黄色の玉はＣＸＸＣモチーフ（レドックス活性ジスルフィド）を表す。３つの融合した六角形は、Ｅｒｖドメインが結合するフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を示す。図１Ｂは、ＨｓＱＳＯＸ１による基質酸化および酸素還元の反応サイクルにおける工程を例示する。ドメインが、Ａの場合と同じ名称および色により表され、ただし、灰色の線はＴｒｘ２ドメインとΨＥｒｖドメインとの間のリンカーを表す。融合した黄色の玉はジスルフィド結合を表す。分離した黄色の玉は、還元されたシステインを示す。
図１Ｃ〜図１Ｍは、ＱＳＯＸ１が、サブコンフルエントな線維芽細胞においてゴルジに局在化し、コンフルエントな線維芽細胞によって分泌されることを示す。図１Ｃ〜図１Ｊは、ゴルジ特異的抗体（ｐ１１５）またはＥＲ特異的抗体（ＧＲＡＳＰ６５）のどちらかにより免疫染色されるサブコンフルエントなＷＩ−３８線維芽細胞（赤色）と、ＱＳＯＸ１（緑色）とを例示する写真である。ＤＡＰＩ染色（青色）は核を示す。スケールバーは１０μｍである。図１Ｋは、コンフルエントＷＩ−３８細胞抽出物のウエスタンブロット（上段）と、ＲＴ−ＰＣＲ（下段）とを例示する写真であり、これらは、ＱＳＯＸ２ではなく、ＱＳＯＸ１の発現をこれらの細胞において明らかにする。図１Ｌは、ＷＩ−３８培養上清のウエスタンブロット（上段）および細胞のＲＴ−ＰＣＲ（下段）をコンフルエンスの関数として例示する写真である。図１Ｍは、５ｍＭのＤＴＴを添加したときの酸素消費によって測定される細胞培養上清のスルフヒドリルオキシダーゼ活性を例示する棒グラフである。
図２Ａ〜図２Ｆは、活性なＱＳＯＸ１が、密な線維芽細胞単層を培養において形成するために要求されることを示す。図２Ａ〜図２Ｄは、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ）またはＱＳＯＸ１特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＱＳＯＸ１）によるトランスフェクションの４日後におけるＷＩ−３８培養単層のＤＡＰＩ染色を例示する写真である。図２Ｃ〜図２Ｄは、５０ｎＭの組換えＱＳＯＸ１（ｒＱＳＯＸ１）または不活性型変異体（ｒＱＳＯＸ１−ＡＡ）がｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４時間で補充された、ｓｉＱＳＯＸ１により処理される培養物を示す。スケールバーは１０μｍである。図２Ｅは、図２Ａ〜図２Ｄに示されるような領域からの細胞数の定量化を例示する棒グラフである。図２Ｆは、ＱＳＯＸ１のドメイン構成の略図および構造の概略的例示であり、レドックス活性なジスルフィドが、“ＣＸＸＣ”と表示される対になった黄色の玉として示される。フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子が、融合した六角形（上段）またはオレンジ色の棒（下段）によって示される。ギザギザの垂直線は、ＱＳＯＸ１の可溶性型または膜結合型のどちらかを生じさせる選択的スプラシング事象を表す。“ＴＭ”は膜貫通領域を表す。組換えＱＳＯＸ１はすべてのＱＳＯＸ１ドメインおよびレドックス活性部位にわたる。ｒＱＳＯＸ１−ＡＡ変異体はアミノ末端のレドックス活性なシステインを欠く。 図２Ｇ〜図２Ｈは、活性なＱＳＯＸ１が、密な線維芽細胞単層を培養において形成するために要求されることを示す。図２Ｇ〜図２Ｈは、ＱＳＯＸ１ノックダウンが組織培養プレートからの細胞剥離を引き起こすことを例示する棒グラフである。図２Ｇは、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後１日目、２日目および４日目について報告されるような、対照プレートおよびＱＳＯＸ１ノックダウンプレートでの細胞数を示す。図２Ｈは、培養上清におけるトリパンブルー染色によって示されるような、剥離して浮遊しており、しかし、生存していることが見出される細胞の数を示す。
図３Ａ〜図３Ｒは、ＱＳＯＸ１が基底膜へのラミニン取り込みのために要求されることを示す写真である。図３Ａ〜図３Ｌは、ＱＳＯＸ１ノックダウンＷＩ−３８培養物（ｓｉＱＳＯＸ１、図３Ｄ〜図３Ｆ）と比較して、対照（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ、図３Ａ〜図３Ｃ）においてより実質的なラミニンマトリックスを明らかにする、Ｐ１ポリクローナル抗体を使用するラミニン免疫染色を例示する。ｓｉＱＳＯＸ１培養物に、ｒＱＳＯＸ１−ＡＡ変異体（図３Ｊ〜図３Ｌ）ではなく、組換えＱＳＯＸ１（ｒＱＳＯＸ１、図３Ｇ〜図３Ｉ）がｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４時間で補充される場合、厚いラミニンマトリックスの回復がもたらされる。スケールバーは１０μｍである。図３Ｍ〜図３Ｒは、ラミニン鎖特異的抗体による対照ノックダウン細胞単層およびｓｉＱＳＯＸ１処理された細胞単層の免疫染色を例示する。ＬＡＭＡ２およびＬＡＭＡ４は、ラミニンのα２鎖およびα４鎖を認識する抗体による染色をそれぞれ示す。スケールバーは１０μｍである。
図４Ａ〜図４Ｃは、ＱＳＯＸ１が基底膜へのラミニン取り込みのために要求されることを示す。図４Ａは、図３Ａ〜図３Ｌに示される領域などの領域から得られるラミニン強度の定量化を示す棒グラフである。図４Ｂは、ＷＩ−３８細胞培養上清サンプルにおけるラミニンのウエスタンブロット（上段パネル）およびＱＳＯＸ１のウエスタンブロット（下段パネル）を例示する写真である。レーン１〜レーン２は、対照ｓｉＲＮＡにより処理される細胞から得られる上清に対応する。レーン３〜レーン５は、ＱＳＯＸ１特異的ｓｉＲＮＡにより処理された細胞から得られる上清に対応する。図４Ｃは、図３Ｍ〜図３Ｒに示される領域などの領域から得られるラミニン鎖強度の定量化を示す棒グラフである。
図５Ａ〜図５Ｆは、ＱＳＯＸ１が基底膜へのラミニン取り込みのために要求されることを示す写真である。ＷＩ−３８表面のＳＥＭ像により、より低倍率で撮影された像で矢印によって示されている、明確なクラスター化物が明らかにされる。この物質は、α４鎖を含有するラミニンであると推定されるが、対照ｓｉＲＮＡにより処理された細胞にだけ現れ、ｓｉＱＳＯＸ１により処理された細胞には現れなかった。
図５Ｇは、図６Ａ〜図６Ｒのために使用される遊走アッセイの概略図である。線維芽細胞を、蛍光標識された腫瘍細胞が加えられる前に上部チャンバーにおいてコンフルエンスにまで成長させた。線維芽細胞／ＥＣＭ層に突き抜け、多孔性膜を通って遊走し、上部チャンバーの底部表面に到達した腫瘍細胞が計数された。
図６Ａ〜図６Ｑは、線維芽細胞によって産生されるＱＳＯＸ１が腫瘍上皮細胞の接着および遊走を促進させることを示す。図６Ａ〜図６Ｏは、示された処理に供されるＷＩ−３８線維芽細胞の事前に形成された間質層を通って遊走した蛍光標識されているＨ４６０ヒト肺ガン細胞を示す写真である。組換え酵素（ｒＱＳＯＸ１、図６Ｇ〜図６Ｉ、および、ｒＱＳＯＸ１−ＡＡ、図６Ｊ〜図６Ｌ）を、（図２Ａ〜図２Ｈ、図３Ａ〜図３Ｒ、図４Ａ〜図４Ｃおよび図５Ａ〜図５Ｆの場合のように）線維芽細胞のｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に加えた。“抗α６”と表示される図６Ｍ〜図６Ｏについては、Ｈ４６０細胞が、対照トランスフェクションされた線維芽細胞への重層に先立ってインテリグン活性を阻止する、α６インテグリンサブユニットに対する抗体により処理された。３つの代表的な領域がそれぞれの処理について示される。図６Ｐは、図６Ａ〜図６Ｏに示されるパネルなどのパネルから得られる遊走細胞数の定量化を示す棒グラフである。図６Ｑは、サンプルのそれぞれにおいて、力に供された後で接着したままである細胞の数を示す棒グラフである。
図６Ｒ〜図６Ｓは、膵臓線維芽細胞の事前に形成された間質層を通って遊走した蛍光標識されているＢｘＰＣ−３膵臓ガン細胞（図６Ｒ）、および、力に供された後も肺線維芽細胞層に接着したままであるＨ４６０肺ガン細胞（図６Ｓ）の、対照（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ）値のパーセントとして示される定量化を示す。
図６Ｔは、対照線維芽細胞培養物が、ＱＳＯＸ１の非存在下でもたらされる対照線維芽細胞培養物よりも堅いことを示す原子間力顕微鏡法を示す。線維芽細胞培養物および関連ＥＣＭの機械的性質がＱＳＯＸ１欠乏の結果として変化した。原子間力顕微鏡法を使用して、コンフルエントな対照ＷＩ−３８線維芽細胞またはＱＳＯＸ１欠乏ＷＩ−３８線維芽細胞の堅さを測定した。ＥＣＭにおける変化に対する感度を最適化するために選ばれるチップサイズおよび圧入深さにより測定される場合、対照線維芽細胞培養物についての弾性率の分布はピークが４ｋＰａ〜６ｋＰａの間にあり、しかし、３０ｋＰａにまで達する値の幅広い範囲が認められた。弾性率のこの範囲は、培養された線維芽細胞の以前のＡＦＭ研究と一致している。ＱＳＯＸ１ノックダウン培養物についての分布はピークをより低い堅さ値（２ｋＰａ〜４ｋＰａ）において示し、少数の散らばった測定結果が８ｋＰａ〜５０ｋＰａの間にあった。対照細胞培養物についてではなく、ＱＳＯＸ１ノックダウン細胞培養物について得られる１００ｋＰａを超える弾性率をもたらす実質的な一組の圧入曲線はおそらくは、下に位置するペトリ皿支持体との直接の接触を表している。
図７Ａ〜図７Ｄは、ＱＳＯＸ１が、腫瘍に関連する線維芽細胞においてアップレギュレーションされることを示す。図７Ａは、Ｈ４６０肺ガン細胞から得られる馴化培地（Ｃ．Ｍ．）の非存在下または存在下で２日間培養されたＷＩ−３８細胞の上清におけるＱＳＯＸ１のウエスタンブロットである。図７Ｂは、エクスビボ培養されたガン関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の細胞が、腫瘍成長部からより遠位の組織から採取される線維芽細胞と比較して、より大きいレベルのＱＳＯＸ１を示すことを示す棒グラフである（ＮＦ＝正常な線維芽細胞）。Ｈ４６０腫瘍細胞培養物から得られる馴化培地にさらされるとき、ＮＦは、ＣＡＦによって産生されるような同程度のレベルのＱＳＯＸ１を転写し、分泌するように誘導される。図７Ｃ〜図７Ｄは、抗ＱＳＯＸ１により染色される乳管ガンの組織学的切片を例示する。矢印は、高レベルのＱＳＯＸ１を発現する代表的な腫瘍関連線維芽細胞を示す。矢じりは、ＱＳＯＸ１について陰性である線維芽細胞の細胞を示す。
図８Ａ〜図８Ｋは、ＱＳＯＸ１の阻害により、腫瘍上皮細胞遊走が阻止されることを示す。図８Ａ〜図８Ｆは、対照の非処理ＷＩ−３８線維芽細胞、あるいは、培養培地においてＱＳＯＸ１特異的モノクローナル抗体（抗ＱＳＯＸ１、図８Ｃ〜図８Ｄ）または対照抗体（抗ＣＤ１９、図８Ｅ〜図８Ｆ）のいずれかの存在下で成長させたＷＩ−３８線維芽細胞の事前に形成された間質層を通って遊走した蛍光標識されているＨ４６０ヒト肺ガン細胞を例示する写真である。２つの代表的な領域がそれぞれの場合において示される。図８Ｇは、図８Ａ〜図８Ｆに示されるパネルなどのパネルから得られる遊走細胞数の定量化を例示する棒グラフである。図８Ｈ〜図８Ｋは、ＱＳＯＸ１特異的モノクローナル抗体の非存在下または存在下で成長させたＷＩ−３８細胞から得られるＢＭにおけるラミニンのＩＦ染色を例示する写真である。２つの代表的な領域が示される。
図９Ａ〜図９Ｊは、コンフルエントな線維芽細胞から得られるＱＳＯＸ１の特徴づけを示す。図９Ａ〜図９Ｆは、ゴルジ特異的抗体（ｐ１１５）またはＥＲ特異的抗体（ＧＲＡＳＰ６５）およびＱＳＯＸ１抗体により免疫染色されるＨＵＶＥＣ細胞を示す写真である。ＤＡＰＩ染色（青色）は核を示す。サイズバーは１０μｍを表す。図９Ｇ〜図９Ｊは、ゴルジマーカーｐ１１５（赤色）およびＱＳＯＸ１（緑色）により免疫染色されるコンフルエントなＷＩ−３８線維芽細胞を示す写真である。ＤＡＰＩ染色（青色）は核を示す。サイズバーは１０μｍを表す。 図９Ｋ〜図９Ｌは、コンフルエントな線維芽細胞から得られるＱＳＯＸ１の特徴づけを示す。図９Ｋは、示された濃度のｒＱＳＯＸ１を使用して作製されたような、モデル基質のジチオスレイトール（ＤＴＴ）に対するＱＳＯＸ１活性のための校正曲線を例示するグラフである。ゼロ点は、ＤＴＴを含有するが、酵素を全く含有しない溶液におけるバックグラウンドの酸素消費に対応する。灰色の線が、６個のデータ点に対する最も良い適合である。ピンク色の丸は、コンフルエントなＷＩ−３８線維芽細胞培養物から得られる３つの上清サンプルについて観測されるＤＴＴ添加時の酸素消費速度を示す。図９Ｌは、ウエスタンブロットによって検出される様々な線維芽細胞からのＱＳＯＸ１分泌を例示する写真である（１＝ＷＩ−３８、２＝正常な肺線維芽細胞、３＝ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））。注目すべきことに、ＱＳＯＸ１が、膵臓上皮ＢｘＰＣ細胞株（ｅｐｉ）または内皮ＨＵＶＥＣ細胞（ｅｎｄｏ）のコンフルエントな培養物からは分泌されなかった。
図１０Ａ〜図１０Ｂは、コンフルエントな線維芽細胞から得られるＱＳＯＸ１の特徴づけを示す。分泌されたＱＳＯＸ１を免疫沈殿させたときの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観測される２つのバンドの質量分析フィンガープリンティング。残基６００の右側にある４残基（ＰＥＬＩ）が、短い方のＱＳＯＸ１スプライス変化体に特有である。下流側の１４７個のさらなる残基が、長い方のスプライス変化体に特有である。バンドをトリプシンまたはキモトリプシンのどちらかによりゲル内で消化した。赤色レタリングは、アミノ酸が少なくとも１つのペプチドにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって観測されたことを示す。潜在的なＮ結合型糖鎖付加部位が灰色の背景で示される。右側パネルにおける残基６０１〜７４７の左側にある垂直の黒色棒は、長い方のＱＳＯＸ１スプライス変化体においてのみ見出される配列を示す。トリプシンサンプルおよびキモトリプシンサンプルの両方でのこの領域における赤色のアミノ酸の存在は、ＱＳＯＸ１の上側バンドが長い方のスプライス変化体に由来するにちがいないことを示している。 図１０Ｃ〜図１０Ｄは、コンフルエントな線維芽細胞から得られるＱＳＯＸ１の特徴づけを示す。分泌されたＱＳＯＸ１を免疫沈殿させたときの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観測される２つのバンドの質量分析フィンガープリンティング。残基６００の右側にある４残基（ＰＥＬＩ）が、短い方のＱＳＯＸ１スプライス変化体に特有である。下流側の１４７個のさらなる残基が、長い方のスプライス変化体に特有である。バンドをトリプシンまたはキモトリプシンのどちらかによりゲル内で消化した。赤色レタリングは、アミノ酸が少なくとも１つのペプチドにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって観測されたことを示す。潜在的なＮ結合型糖鎖付加部位が灰色の背景で示される。右側パネルにおける残基６０１〜７４７の左側にある垂直の黒色棒は、長い方のＱＳＯＸ１スプライス変化体においてのみ見出される配列を示す。トリプシンサンプルおよびキモトリプシンサンプルの両方でのこの領域における赤色のアミノ酸の存在は、ＱＳＯＸ１の上側バンドが長い方のスプライス変化体に由来するにちがいないことを示している。
図１１Ａ〜図１１ＥはＱＳＯＸ１のノックダウンを示す。図１１Ａは、総ＲＮＡからのＱＳＯＸ１転写物のＰＣＲ増強によって、また、ウエスタブロットによって示されるように、ｓｉＲＮＡを使用するＷＩ−３８線維芽細胞におけるＱＳＯＸ１のノックダウンの高い有効性を示す写真である。使用された負荷対照がブロットメンブランのクーマシー染色であった。図１１Ｂは、ＱＳＯＸ１ノックダウンがｓｉＲＮＡトランスフェクション後の少なくとも４日間にわたって維持され、また、ＤＴＴ添加時の酸素消費によってモニターされるように、バックグラウンドレベルのスルフヒドリルオキシダーゼ活性を細胞培養上清においてもたらしたことを例示する。これに対応して、ＱＳＯＸ１タンパク質はノックダウン後の培養上清において事実上検出不能であった。図１１Ｃ〜図１１Ｅは、ＱＳＯＸ１ノックダウンが、老化関連β−ガラクトシダーゼ活性についてのＸ−ｇａｌ染色によって明らかにされるように、細胞の老化を促進させないことを例示する写真である。対照の老化細胞が、大きい（３２を超える）継代数からのＷＩ−３８細胞の３週齢培養物から得られた。
図１２Ａ〜図１２Ｑは、ＥＣＭに対するＱＳＯＸ１ノックダウンの影響を示す。図１２Ａは、ＱＳＯＸ１ノックダウンがＢＭにおける増大した反応性チオール含有量をもたらすことを示す棒グラフである。ＷＩ−３８線維芽細胞を、示されたｓｉＲＮＡトランスフェクションに供し（ＤＴＴサンプルおよびＮＥＭサンプルを対照トランスフェクション細胞から調製した）、さらに４日間成長させた。細胞を水酸化アンモニウムにより除き、ＴｈｉｏＧｌｏを加えて、遊離チオールを定量した。ＤＴＴサンプルおよびＮＥＭサンプルを、１００ｍＭのＤＴＴまたは１００ｍＭのＮＥＭを対照プレートに加え、ＤＴＴ／ＮＥＭを洗い流し、その後、ＴｈｉｏＧｌｏにより処理することによって作製した。図１２Ｂ〜図１２Ｑは、ＢＭに取り込まれる量におけるほんの小さな変化を伴うが、ＱＳＯＸ１ノックダウン細胞の細胞培養上清における増大した量のラミニン関連タンパク質を明らかにするウエスタンブロットおよび免疫蛍光である。
図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＥＣＭに対するＱＳＯＸ１ノックダウンの影響を示す。図１３Ａ〜図１３Ｅは、既にトランスフェクション後の２日目において強度における著しい違いを示す、等しい数の細胞を含有する領域のラミニン染色を例示する。図１３Ｆは、ＢＭの総タンパク質含有量が、ＢＭサンプルのクーマシー染色によって示されるように、ｓｉＲＮＡおよび組換えＱＳＯＸ１による様々な処理について感知できるほどには異なっていなかったことを示す写真である。 図１３Ｇ〜図１３Ｎは、ＥＣＭに対するＱＳＯＸ１ノックダウンの影響を示す。図１３Ｇ〜図１３Ｌは、異なる安定性を有する２つの独立したラミニン網目構造がＷＩ−３８のＢＭにおいて共存することを示す写真である。標準的なＩＦ染色手法は、ラミニンを含有する大きい斑点の出現を引き起こし、この場合、これらの斑点はｓｉＱＳＯＸ１処理のサンプルでは消失し、しかし、ｒＱＳＯＸ１の添加によって回復した。図１３Ｍ〜図１３Ｎは、トランスフェクション後１日目に加えられる５０ｎＭのｒＱＳＯＸ１が、正常な細胞数およびラミニン組成をＱＳＯＸ１ノックダウン細胞に戻すために十分であったことを示す棒グラフである。
図１４は、膵臓の線維芽細胞によって産生されるＱＳＯＸ１が腫瘍上皮細胞遊走を促進させることを示す棒グラフである。示された処理に供される膵臓線維芽細胞の事前に形成された間質層を通り抜ける蛍光標識されているＢｘＰＣ−３ヒト膵臓ガン細胞の遊走の定量化。
図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＭＡｂ４９２．１についての阻害定数の決定を示す線グラフである。図１５Ａは、ｒｄＲＮａｓｅの酸化を伴う比色アッセイからの結果に基づく、５０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１に対するＭＡｂ４９２．１の用量応答曲線を例示する。阻害活性が４０５ｎｍにおける吸光度として表され、これは、ＤＴＮＢと反応し、ＨｓＱＳＯＸ１によって酸化されなかった遊離チオールの量を表す。ＩＣ５０が非線形回帰分析によって決定され、ＩＣ５０は６０ｎＭの値をもたらした。図１５Ｂは、（２５０ｎＭから１ｎＭにまで及ぶ）種々のＭＡｂ４９２．１濃度における酸素電極アッセイからの結果に基づく、２５ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１に対するＭＡｂ４９２．１の阻害曲線を例示する。阻害活性が、非阻害速度に対する阻害速度の比率として表される。阻害定数が非線形回帰分析によって決定され、阻害定数は１．０±０．３ｎＭのＫｉ値をもたらした。 図１５Ｃは、ＭＡｂ４９２．１についての阻害定数の決定を示す線グラフである。図１５Ｃは、１０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１が、示された濃度のＤＴＴの存在下で１０分間、２５０ｎＭのＭＡｂ４９２．１を伴って、または伴うことなくインキュベーションされ、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の添加によって反応停止されたことを例示する写真である。２００μＭにおけるＤＴＴは、ＨｓＱＳＯＸ１の酸素消費アッセイにおける初速度を得るための還元性基質の十分に高い濃度をもたらし（ＤＴＴについてのＨｓＱＳＯＸ１のＫＭがおよそ７０μＭである）、しかし、抗体の還元および解体を引き起こしていない。したがって、２００μＭにおけるＤＴＴを、図１５Ｂに記載される実験（下記参照）において使用した。 図１５Ｄは、ＭＡｂ４９２．１についての阻害定数の決定を示す線グラフである。図１５Ｄは、酸素消費アッセイに基づく、ＭＡｂ４９２．１による阻害の基質依存性を示す棒グラフである。１００ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１の初期速度を５０ｎＭのＭＡｂ４９２．１の非存在下および存在下において２つのＤＴＴ濃度、すなわち、３５μＭ（０．５ＫＭ）および２００μＭ（３ＫＭ）について測定した。ＭＡｂ４９２．１の非存在下での初期速度（ｖ０）に対するＭＡｂ４９２．１の存在下での初期速度（ｖｉ）の間における３回の測定の平均比率がそれぞれの濃度について示される。これらの異なる濃度における類似する比率は、この阻害が基質依存的でないことを示している。
図１６Ａ〜図１６Ｄは、ＭＡｂ４９２．１がＨｓＱＳＯＸ１のアミノ末端フラグメントのＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘと結合することを示す線グラフである。図１６Ａは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイに基づく、完全長ＨｓＱＳＯＸ１およびその２つのフラグメントに対するＭＡｂ４９２．１の結合曲線を例示する。低い標的タンパク質濃度において達成される６３０ｎｍでの大きい吸光度は、堅固な結合を示している。図１６Ｂ〜図１６Ｄは、分析的サイズ排除クロマトグラフィーから得られる、完全長ＨｓＱＳＯＸ１およびその２つのフラグメントの遊走プロフィルを例示する。灰色の線はＭＡｂ４９２．１の単独での遊走プロフィルを表す。点線はＨｓＱＳＯＸ１またはそのフラグメントの１つの単独での遊走プロフィルを表す。黒色の線は、ＭＡｂ４９２．１とＨｓＱＳＯＸ１またはそのフラグメントとの混合物の遊走プロフィルを表す。
図１７は、ｒｄＲＮａｓｅの酸化を伴う比色アッセイからの結果に基づく、５０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１に対するｓｃＦｖ４９２．１の用量応答曲線を描く線グラフである。阻害活性が４０５ｎｍにおける吸光度として表され、これは、ＤＴＮＢと反応した遊離チオールの量を表す。ＩＣ５０が非線形回帰分析によって決定され、ＩＣ５０は２５０ｎＭの値をもたらし、これは、ＭＡｂ４９２．１について得られるＩＣ５０値よりも５倍大きかった。
図１８は、ｒｄＲＮａｓｅの酸化を伴う比色アッセイからの結果に基づく、５０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１に対するＭＡｂ４９２．１から導かれるＦａｂの用量応答曲線を描く線グラフである。阻害活性が４０５ｎｍにおける吸光度として表され、これは、ＤＴＮＢと反応した遊離チオールの量を表す。ＩＣ５０が非線形回帰分析によって決定され、ＩＣ５０は１００ｎＭの値をもたらし、これは、全長のＭＡｂ４９２．１について得られるＩＣ５０値よりも２倍大きかった。
図１９Ａは、下記を示す概略的例示である：図１９Ａは、ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ（Ｔｒｘ１（桃色）、Ｔｒｘ２（灰色）、黄色の球でのＣＸＸＣモチーフ）とＦａｂ４９２．１（重鎖（青色）、軽鎖（緑色））との間における複合体の構造を例示する。結合部位の拡大図が表面提示により示される。 図１９Ｂ〜図１９Ｃは、下記を示す概略的例示である：図１９Ｂは、異なる角度での眺めから得られる、Ｆａｂ４９２．１−ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ複合体およびＣＤＲの表面提示を例示する。Ａでのような、Ｔｒｘ１、重鎖および軽鎖の着色。ＣＤＲの表示がＣＤＲそのものの色でなされる。左側において、Ｔｒｘ１は、ＣＤＲのＬ１、Ｌ３およびＨ２との接触を有することが示される。ｙ軸の周りでの１８０°の回転により、ＣＤＲのＬ２、Ｈ１およびＨ３と接触しているＴｒｘ１が示される（中央）。右側において、６つすべてのＣＤＲの表面の上面図。図１９Ｃは、Ｆａｂ４９２．１（左）およびＴｒｘ１（右）のオープンブック描写を例示する。Ｔｒｘ１が、Ｆａｂ４９２．１に対して垂直軸の周りに１８０°回転させられる。Ａでのような、Ｔｒｘ１、ＣＸＸＣモチーフ、重鎖および軽鎖の着色。Ｔｒｘ１との相互作用に関与する軽鎖からの残基が白色である。Ｔｒｘ１との相互作用に関与するＣＤＲのＨ３からの残基が暗赤紫色である。Ｔｒｘ１との相互作用に関与するＣＤＲのＨ２およびＨ１からの残基が紫色である。Ｔｒｘ１からの対応する相互作用残基が、Ｆａｂ４９２．１からの残基と同じ色である。
図２０Ａ〜図２０Ｂは、Ｆａｂ４９２．１−ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘの境界残基で、Ｔｒｘ１からの境界残基、軽鎖からの境界残基（図２０Ａ）および重鎖からの境界残基（図２０Ｂ）を示す概略的例示である。Ｔｒｘ１が白色の表面に示され、特異的な相互作用残基が、黒色の書体により表示されて棒で示される。軽鎖（緑色）および重鎖（青色）が実物大に示され、特異的な相互作用残基が棒で示される。ＣＤＲには表示がなされる。水素結合が黒色の点線により示され、それらの距離が示されている。カチオン−πおよび塩架橋も同様に示される。
図２１Ａ〜図２１Ｏは、対照の非処理ＷＩ−３８線維芽細胞、あるいは、培養培地においてＭＡｂ４９２．１または対照抗体（抗β−アクチン）の存在下で成長させたＷＩ−３８線維芽細胞の事前に形成された間質層を通って遊走した蛍光標識されているＨ４６０ヒト肺ガン細胞を例示する写真である。３つの代表的な領域がそれぞれの場合において示される。
図２２は、ＭＡｂ４９２．１による腫瘍細胞遊走の阻害を示す棒グラフである。ＷＩ−３８線維芽細胞を多孔質膜の上で４日間成長させ、ＷＩ−３８線維芽細胞に、ＥＣＭを種々の濃度のＭＡｂ４９２．１の存在下または非存在下で産生させた。続いて、蛍光標識されたＨ４６０肺ガン細胞を線維芽細胞の上に重層した。２４時間後の各サンプルにおいて線維芽細胞層を突き抜けた標識されているＨ４６０細胞の数が示される。注目すべきことに、この図は、図２１Ｏ〜図２０Ａに示されるパネルの定量化である。
図２３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞から放射される生物発光の画像である。この図は、腫瘍細胞および線維芽細胞を乳房脂肪パッドに同時接種した１週間後における局在化した腫瘍を示す３匹のマウスを示す。
図２４は、ＭＡｂ４９２．１の非存在下および存在下における様々な哺乳動物ＱＳＯＸ１酵素の活性を示す棒グラフである。活性速度を、酸素消費アッセイを使用して評価した。それぞれのＱＳＯＸ１酵素についての測定を種々のＭＡｂ４９２．１濃度の存在下で行い、初期傾斜（速度）を計算した。酸素消耗速度が、ＭＡｂ４９２．１の非存在下（灰色）、２５０ｎＭのＭＡｂ４９２．１の存在下（黒色）および１μＭのＭＡｂ４９２．１の存在下（白色）においてそれぞれのＱＳＯＸ１酵素について示される。留意すべきことに、ＨｓＱＳＯＸ１が、試験されたＭＡｂ４９２．１濃度においてＭＡｂ４９２．１によって阻害された唯一の酵素である。
図２５は、活性部位のＣＧＨＣモチーフと、ＭＡｂ４９２．１の軽鎖およびＣＤＲのＨ３と接触する残基とを含めて、ＭＡｂ４９２．１と結合するＴｒｘ１ドメインの部分を示す、他の哺乳動物ＱＳＯＸ１酵素に対するＨｓＱＳＯＸ１の配列アラインメントである。ＭＡｂ４９２．１との相互作用に関与する残基が太字である。対応するＨｓＱＳＯＸ１（配列番号３）残基と異なるＭｍＱＳＯＸ１（配列番号４３）由来の残基、ＲｎＱＳＯＸ１（配列番号４２）由来の残基およびＣｐＱＳＯＸ１（配列番号４１）由来の残基が赤く着色される。
図２６は、ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ−Ｆａｂ４９２．１複合体の構造とＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造との間における重ね合わせである。ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘが青色であり、同じ非対称ユニットに由来するＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘの２つの鎖が緑色およびマゼンタ色である。レドックス活性部位のシステインが２つの黄色の玉として表示される。右側は、ＣＤＲのＬ３に由来するＴｙｒ９２と、ＭｍＱＳＯＸ１に由来するＡｓｎ１１７との間における予想された衝突の拡大図である。左側は、ＣＤＲのＨ３に由来するＴｙｒ１００と、ＭｍＱＳＯＸ１に由来する残基１３８〜１４１のループとの間における予想された衝突の拡大図である。ＨｓＱＳＯＸ１およびＭｍＱＳＯＸ１の残基の番号付けは比較し易いように、ＭｍＱＳＯＸ１に従っている。
図２７は、ＭＡｂ４９２．１の存在下における種々のＭｍＱＳＯＸ１変異体についての百分率活性を示す棒グラフである。測定が３回行われ、平均化された。野生型ＭｍＱＳＯＸ１酵素は、ＭＡｂ４９２．１による阻害に対して抵抗性であり、これに対して、ＴＬＰＧ変異体およびＡ１１９Ｐ変異体は、ＭＡｂ４９２．１に対するいくらかの感受性を示した。両方の変異を有するＭｍＱＳＯＸ１は、ＨｓＱＳＯＸ１と同じ程度に阻害される。
本発明はそのいくつかの実施形態において、ＱＳＯＸ１阻害剤に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、ラミニン関連疾患を処置するためのＱＳＯＸ１阻害剤の使用に関連する。
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
キエシンスルフヒドリルオキシダーゼ１（ＱＳＯＸ１）は、基質タンパク質におけるチオール基の対から分子状酸素への電子の移動を媒介するために結合型フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を使用する酵素であり、過酸化水素が副生成物として生成される。ＱＳＯＸ１は分泌経路においてＥＲの下流側のオルガネラに主に局在化しており、細胞からの調節された分泌を受ける。
基底膜（ＢＭ）は、体腔または血管と、下側に位置する間質線維芽細胞との境界における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の層である。ＢＭは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンおよび多くの他の寄与する巨大分子から構成される。ＢＭは、細胞接着およびシグナル伝達のための複雑な媒体であり、その組成および性質は、関連する上皮細胞の挙動に大きな影響を与える。
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、基底膜（ＢＭ）でのラミニンの集合におけるＱＳＯＸ１の基本的な役割、および、腫瘍細胞侵入との境界におけるその重要性を発見している。具体的には、本発明者らは、ＱＳＯＸ１が、細胞および特にガン細胞が基底膜を通って遊走することを結果的には可能にする適正なラミニン機能性（例えば、集合ならびに細胞接着および細胞遊走の支援）のために要求されることを例証している。ＱＳＯＸ１がラミニン集合のプロセスの主要な調節因子として見出されたことは、ＱＳＯＸ１を、転移プロセスおよび細胞遊走における非常に重要な標的として示唆している。
さらに本発明を実施に移している間に、本発明者らは、ＱＳＯＸ１に対する阻害抗体を初めて製造することができ、また、ラミニン集合および腫瘍細胞遊走におけるその役割を実証した。したがって、これらの抗体は、基底膜を調節するために使用されるかもしれず、また、腫瘍細胞遊走を阻害するための治療剤として使用されるかもしれない。
本明細書中下記および下記の実施例の節において示されるように、本発明者らは、ＱＳＯＸ１がＢＭの組立てに直接に関与することを発見している（下記の実施例の節の実施例１を参照のこと）。ＱＳＯＸ１によって最も著しく影響されるＢＭ成分がラミニンであり（図１２Ｂ〜図１２Ｑを参照のこと）、ＱＳＯＸ１の存在に対して最も影響を受けやすいラミニンイソ型が、α４鎖を含有するイソ型である（本明細書中下記の表２を参照のこと）。本発明者らは、ＱＳＯＸ１の欠乏が、コンフルエントな線維芽細胞培養物の上清における可溶性ラミニンイソ型の出現を引き起こすことを認めた（図１２Ｂ〜図１２Ｑ、図３Ａ〜図３Ｌおよび図４Ａを参照のこと）。本発明者らはさらに、ＱＳＯＸ１の非存在下で産生されるＢＭは、攻撃的な腫瘍上皮細胞の接着および遊走を支援することができないことを認めた（図８Ａ〜図８Ｋを参照のこと）。
そのうえ、本発明者らは、ヒトＱＳＯＸ１（ＨｓＱＳＯＸ１）と結合し、これを阻害するモノクローナル抗体を作製し、また、この抗体の組換え単鎖可変ドメイン型を構築し、ＱＳＯＸ１における抗体結合部位を特徴づけた（下記の実施例の節の実施例２を参照のこと）。本発明者らは、ｍＡｂ４９２．１による処置が３０ｍｇ／ｋｇの用量において、処置を何ら受けていないマウスと比較して、乳ガン細胞のリンパ節内への浸潤を著しく減少させることをインビボマウスモデルにおいて例証している（本明細書中下記の表６および表７を参照のこと）。
本発明者らはさらに、ＨｓＱＳＯＸ１が他の哺乳動物ＱＳＯＸ１オルソログと同等であることを示している。ＨｓＱＳＯＸ１のＴｒｘ１ドメイン配列と他のＱＳＯＸ１酵素の対応する領域とのアライメントにより、ＣＧＨＣのレドックス活性モチーフの近傍における配列が同一であることが示された（図２５を参照のこと）。しかしながら、抗体の軽鎖およびＣＤＲのＨ３配列が結合するＨｓＱＳＯＸ１の領域（ＨｓＱＳＯＸ１１０６−１５２）には、他のＱＳＯＸ１酵素と比較して、少しの違いがあることが明らかにされた（図２５を参照のこと）。特に、Ｐｒｏ１１６（これは、ＭＡｂ４９２．１の疎水性のＣＤＲ Ｌ３の側鎖の間における溝に十分にはまる）が、他の哺乳動物ＱＳＯＸ１酵素ではアラニンにより置換される。配列の違いを示すもう１つの領域が、ＨｓＱＳＯＸ１に由来するＶ１３５−Ｖ１３８であり、これはＭｍＱＳＯＸ１におけるＴｈｒ１３８−Ｇｌｙ１４１に対応する。これらの発見により、マウスＱＳＯＸ１と結合することができる抗体を作製するための枠組みが提供される。
まとめると、本発明の教示は、ラミニン関連の疾患または状態（例えば、転移性腫瘍など）を処置することにおけるＱＳＯＸ１阻害分子に対する治療的価値を述べている。
したがって、本発明の１つの局面によれば、基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げる方法であって、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げることを含む方法が提供される。
本発明の別の局面によれば、ラミニン含有基底膜を介する細胞遊走を阻害する方法であって、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記ラミニン含有基底膜を介する前記細胞遊走を阻害することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ラミニン」はヒトのラミニンタンパク質を示す。典型的には、ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖（これらは、５つ、４つおよび３つの遺伝的変化体でそれぞれ見出される）を含有する三量体タンパク質である。したがって、ラミニンの用語は、本明細書中で使用される場合、異なる鎖組合せのいずれかを含めて、ヒトラミニンのどのようなタイプをも包含する。これらの異なる鎖および三量体分子は、多種多様な機能をインビボで明らかに反映するそれらの組織分布に関して異なる。本発明の例示的なラミニンには、ＬＡＭＡ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＢ４、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＣ２およびＬＡＭＣ３が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態によれば、上記ラミニンはアルファ４鎖を含む。
本発明の特定の実施形態によれば、上記ラミニンはラミニン−４１１またはラミニン−４２１である。
本明細書中で使用される場合、用語「ラミニン集合」は、基底膜緻密層（すなわち、基底膜の層の１つ）へのラミニンタンパク質の取り込みを示す。典型的には、ラミニンが様々な細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、腫瘍細胞）から分泌され、これらの細胞が、独立した網状組織を形成し、また、エンタクチン、フィブロネクチンおよびパールカンを介してＩＶ型コラーゲンの網状組織と会合する細胞会合細胞外マトリックスに取り込まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「基底膜」または用語「ラミニン含有基底膜」は、上皮および内皮の足場となり、それらを支え、かつ、基底膜緻密層を含む（すなわち、ラミニンを含む）薄い繊維層を示す。
本明細書中で使用される場合、表現「ラミニン集合を阻害するか、または妨げる」は、基底膜におけるラミニン集合を低下させること、取り消すこと、弱めること、最小限に抑えること、抑制すること、または停止させることを示す。１つの実施形態によれば、ラミニン集合を阻害するか、または妨げることは、（本明細書中下記でさらに記載されるような）ＱＳＯＸ１阻害剤の非存在下におけるラミニン集合と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％である。したがって、本発明の１つの実施形態によれば、ラミニンが基底膜に全く取り込まれない。
下記の実施例の節の実施例１において示されるように、基底膜に取り込まれないラミニンを（例えば、インビトロ培養された細胞の培養培地において）可溶性形態で見出すことができる。したがって、ラミニン集合における低下をモニターすることを、例えば、細胞外マトリックスの免疫蛍光（ＩＦ）染色によって、または、可溶性ラミニン（すなわち、基底膜に取り込まれなかったラミニン）のウエスタンブロッティングによってモニターすることができる。
ラミニン集合を阻害するか、または妨げることはまた、過剰な結合組織が修復性プロセスまたは反応性プロセスで器官または組織において非構造化様式で産生される状況において、例えば、線維症などにおいて好都合であるかもしれないことが理解されるであろう。したがって、さらに本発明を実施に移している間において、ＱＳＯＸ１の阻害およびそれに続いて可溶性ラミニンの生成が線維症プロセスについては治療的であるかもしれない。
ラミニンが、細胞の接着、シグナル伝達、遊走、表現型、分化および生存に影響を及ぼす、基底膜緻密層および基底膜の重要な生物学的に活性な部分であることが理解されるであろう。
本明細書中で使用される場合、用語「細胞遊走」は、細胞が、ある場所から別の場所に移動する細胞プロセスを示す。本発明の例示的な細胞遊走は、転移を引き起こす腫瘍細胞遊走を含む。
したがって、本発明の教示による細胞は、例えば、脳細胞、ニューロン、心臓細胞、筋細胞、皮膚細胞、骨細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腸細胞、脾臓細胞、呼吸器細胞、肺細胞、リンパ球または単球を含む場合がある。本発明の細胞は、健康な細胞を含む場合があり、または、別法として、変異した細胞（例えば、腫瘍細胞）を含む場合がある。
本明細書中で使用される場合、表現「細胞遊走を阻害する」は、ラミニン含有基底膜を介する細胞（例えば、腫瘍細胞）の遊走を低下させること、取り消すこと、弱めること、最小限に抑えること、抑制すること、または停止させることを示す。１つの実施形態によれば、細胞遊走を阻害するか、または妨げることは、（本明細書中下記でさらに記載されるような）ＱＳＯＸ１阻害剤の非存在下におけるラミニン含有基底膜を介する細胞遊走と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％である。したがって、本発明の１つの実施形態によれば、細胞遊走が基底膜により完全に阻害される。
本明細書中上記で述べられるように、本発明の方法は、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因（これはまた、本明細書中では「ＱＳＯＸ１阻害剤」として示される）と接触させることによって行われる。
本明細書中で使用される場合、用語「ＱＳＯＸ１」は、ＱＳＣＮ６とも呼ばれるキエシンスルフヒドリルオキシダーゼ１（例えば、ヒト型）に関連する。ＮＣＢＩデータベースにおけるヒトＱＳＯＸ１の長い変化体についてのタンパク質アクセション番号がＮＰ＿００２８１７（配列番号１）であり、ヒトＱＳＯＸ１の短い形態についてのアクセション番号がＮＰ＿００１００４１２８（配列番号２）である。本発明のＱＳＯＸ１タンパク質の阻害剤は、基底膜における誤って集合したラミニン（すなわち、機能不全ラミニン）の上昇を媒介する。
用語「組織」は、１つまたは複数の機能を行うように設計された細胞からなる生物の一部分を示す。例には、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋組織、心臓組織、脳組織、脈管組織、腎臓組織、肺組織、生殖腺組織および造血組織が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態によれば、上記組織は腫瘍組織である。
本発明の別の実施形態によれば、上記組織は線維芽細胞を含む。
ＱＳＯＸ１のダウンレギュレーションを、転写および／または翻訳を妨げる様々な分子［例えば、ＲＮＡサイレンシング作用因（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡ）、リボザイムおよびＤＮＡザイム］を使用してゲノムレベルおよび／または転写物レベルで行うことができ、あるいは、細胞遊走を許す適正な基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１の活性が、本明細書中上記で記載されるように阻害される限り、例えば、アンタゴニスト、当該ポリヌクレオチドを切断する酵素などを使用してタンパク質レベルで行うことができる。具体的には、基底膜組立ての阻害を、本明細書中に記載されるような可溶性ラミニンのレベルおよび局在化を定量することによってアッセイすることができる。
１つの実施形態によれば、ＱＳＯＸ１活性をダウンレギュレーションすることができる作用因はポリペプチド作用因である。
ＱＳＯＸ１活性をダウンレギュレーションすることがある例示的なポリペプチド作用因は、ＱＳＯＸ１と特異的に結合し、かつ、その活性を妨げることによってＱＳＯＸ１活性をダウンレギュレーションすることができる抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ドミナントネガティブ分子または天然の阻害剤を含む。好ましくは、抗体はＱＳＯＸ１の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原表面のどのような抗原決定基をも示す。
エピトープ決定基は通常、様々な分子（例えば、アミノ酸または炭水化物側鎖など）がまとまった化学的に活性な表面上の一団からなり、また、通常、特定の電荷特徴と同様に、特定の三次元構造特徴を有する。
その効率的な阻害のために標的とされることがあるＱＳＯＸ１の例示的な領域がアミノ末端のＴｒｘドメインである（下記の実施例の節における実施例２を参照のこと）。具体的には、ＱＳＯＸ１のＴｒｘ１ドメインにおけるレドックス活性なジスルフィドが効率的な阻害のために標的とされる場合がある。
本発明の別の実施形態によれば、上記ポリペプチド作用因はＱＳＯＸ１（配列番号３および４）のアミノ酸座標３４〜２６６に対して向けられる場合がある。
下記の実施例の節において詳しく記載されるように（本明細書中下記の実施例２を参照のこと）、本発明者らは、ＱＳＯＸ１を特異的に標的とし、これを阻害するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および単鎖抗体（ｓｃＡｂ）を作製している。さらに、本発明者らは、抗体を誘発するために使用される組換えＱＳＯＸ１ポリペプチド（配列番号６）をコードするヒトＱＳＯＸ１３３−５４６の核酸配列（配列番号５）を含むプラスミドを作製した。
したがって、ＱＳＯＸ１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、長さが５００アミノ酸未満である単離されたポリペプチドが提供される。
別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、５０個〜５００個の間のアミノ酸、１００個〜５００個の間のアミノ酸、２００個〜５００個の間のアミノ酸、３００個〜５００個の間のアミノ酸、４００個〜５００個の間のアミノ酸、５０個〜１００個の間のアミノ酸、１００個〜２００個の間のアミノ酸、１００個〜３００個の間のアミノ酸、１００個〜４００個の間のアミノ酸、２００個〜３００個の間のアミノ酸、または、２００個〜４００個の間のアミノ酸を含む場合がある。好ましくは、ポリペプチドは、適正な基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１機能を含む。適正な基底膜組立てという用語は、細胞遊走を支援するそのようなものとして定義される。
本発明の特定の実施形態の１つの局面によれば、ＱＳＯＸ１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、長さが５００アミノ酸未満である単離されたポリペプチドが提供される。
本発明で使用される用語「抗体」は、無傷の分子、ならびにマクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどのその機能的なフラグメントを含む。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、同様にまた、それらのフラグメントを製造する様々な方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８８）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。免疫化のために使用されるＱＳＯＸ１ペプチドは、５０個〜１００個の間のアミノ酸、５０個〜１５０個の間のアミノ酸、５０個〜２００個の間のアミノ酸、５０個〜２３２個の間のアミノ酸、１００個〜２００個の間のアミノ酸、または、１５０個〜２３２個の間のアミノ酸を含む場合がある。
本発明のいくつかの実施形態に従う抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、あるいは、当該フラグメントをコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）における発現によって調製することができる。抗体フラグメントを、完全な抗体の従来的方法によるペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを提供するためのペプシンによる抗体の酵素的切断によって製造することができる。このフラグメントはさらに、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および、所望により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のための遮断基を使用して切断することができる。別法として、ペプシンを使用する酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接もたらされる。これらの方法が、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、それらに含まれる参考文献によって記載されている（そのような特許は本明細書により、それらの全体が参照によって組み込まれる）。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６（１９５９）］もまた参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは、他の酵素的技術、化学的技術または遺伝学的技術などもまた、フラグメントが、無傷の当該抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用される場合がある。
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２（１９７２）］に記載されるように非共有結合性である場合がある。別法として、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、化学試薬によって、例えば、グルタルアルデヒドなどによって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれるＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖型抗原結合性タンパク質（ｓＦｖ）が、オリゴヌクレオチドによってつながれる、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて、この発現ベクターが宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチド（例えば、本明細書中下記の実施例２において教示されるような［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３など）を伴う単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための方法が、例えば、下記によって記載されている：ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７（１９９３）；ならびに米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書により、その全体が参照によって組み込まれる）。
抗体フラグメントの別の形態が、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）を、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子が、例えば、可変領域を抗体産生細胞のＲＮＡから合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ［Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０（１９９１）］を参照のこと。
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化された形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２または他の抗原結合性部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望される特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても見出されない残基を含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、かつ、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は最適にはまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むであろう［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化するための方法がこの技術分野では広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から当該ヒト化抗体に導入されている１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、この場合、移入残基は典型的には移入可変ドメインから選ばれる。ヒト化は本質的には、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法に従って行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、ここで実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満の部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能な場合にはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含めて、この技術分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）、および、Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、これは、遺伝子再構成、組立ておよび抗体レパートリーを含めてすべての点でヒトにおいて見られる抗体産生によく似ている。この取り組みが、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号において、また、下記の科学刊行物において記載されている：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ならびに、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３、６５〜９３（１９９５）。
１つの実施形態によれば、抗体が、本質的には本明細書中下記で記載されるように製造される。具体的には、マウスが最初に、組換えヒトＱＳＯＸ１および完全フロイントアジュバント（例えば、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）の乳濁液により免疫化される。例えば、マウスが３週間の間隔で４回免疫化される場合がある。次に、選択されたマウスからの脾臓細胞が、ポリエチレングリコールを使用して骨髄腫細胞（例えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞）と融合される。その後、ハイブリドーマ細胞が選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）によって選択され、これらの細胞の上清が、ヒトＱＳＯＸ１に対する特異的結合およびその阻害についてスクリーニングされる。その後、大規模での抗体が、例えば、ｍｉｎｉＰＥＲＭバイオリアクター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を血清非含有培地（ＤＣＣＭ）において使用して製造される場合がある。
したがって、本発明の教示によれば、ＱＳＯＸ１と結合し、かつ、細胞遊走を支援する基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１活性を阻害する、抗原認識ドメインを含む単離された抗体が提供される。
本発明の実施形態によれば、上記活性が、細胞外マトリックスの免疫蛍光（ＩＦ）染色アッセイ、または、可溶性ラミニン（すなわち、以下の実施例の部分でさらに記載されるように、基底膜中に組み入れられないもの）に対するウエスタンブロットアッセイのうちの少なくとも１つによってアッセイされる。
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の教示によって使用されてもよい例示的なモノクローナル抗体はＭＡｂ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。したがって、ＣＤＲ１〜３（それぞれ配列番号２９〜３１）は抗体の軽鎖に位置され、ＣＤＲ１〜３（それぞれ配列番号３２〜３４）は抗体の重鎖に位置される。
別の実施形態によれば、本発明の抗体は一本鎖抗体である。本発明の教示によって使用されてもよい例示的な一本鎖抗体はｓｃＦＶ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
別の実施形態によれば、本発明の単離された抗体は、配列番号７および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態によれば、本発明の単離された抗体は、配列番号２７および配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態によれば、本発明の抗体はマウスＱＳＯＸ１酵素と結合する場合がある。
したがって、下記の実施例の節においてさらに詳しく記載されるように、ヒトＱＳＯＸ１およびマウスＱＳＯＸ１は同等であり、少なくとも７０％（例えば、７９％）の配列同一性を含む。ヒトＱＳＯＸ１およびマウスＱＳＯＸ１の配列アラインメントにより、例えば、ヒトＱＳＯＸ１のＰｒｏ１１６がマウスＱＳＯＸ１ではアラニンにより置換されていることが明らかにされた（図２５を参照のこと）。配列の違いを示すもう１つの領域が、ヒトＱＳＯＸ１に由来するＶａｌ１３５−Ｖａｌ１３８であり、これはマウスＱＳＯＸ１におけるＴｈｒ１３８−Ｇｌｙ１４１に対応する（図２５を参照のこと）。これらの発見により、マウスＱＳＯＸ１と結合することができる抗体を作製するための枠組みが提供された。
一つの実施形態によれば、本発明の抗体はモノクローナル抗マウスＱＳＯＸ１抗体である。
別の実施形態によれば、本発明の抗体は一本鎖抗マウスＱＳＯＸ１抗体である。
マウスＱＳＯＸ１を標的とする抗体を作製するために使用されるＭＡｂ４９２．１における可能な変異が本明細書中下記の表８に記載される。
ＱＳＯＸ１をダウンレギュレーションすることができる別の作用因が、ＱＳＯＸ１に結合し、かつ／または、ＱＳＯＸ１を切断する分子である。そのような分子としては、ＱＳＯＸ１アンタゴニスト、ＱＳＯＸ１のドミナントネガティブ分子（例えば、エフェクターと競合するペプチドの一部またはその変異体）、ＱＳＯＸ１の天然の阻害剤、または、ＱＳＯＸ１阻害ペプチドが可能である。
ＱＳＯＸ１の少なくとも触媒作用部分または結合性部分の非機能的アナログもまた、ＱＳＯＸ１をダウンレギュレーションする作用因として使用され得ることが理解されるであろう。
ＱＳＯＸ１をダウンレギュレーションするために本発明のいくつかの実施形態と一緒に使用され得る別の作用因が、ＱＳＯＸ１の活性化および基質結合を妨げる分子である。
述べられるように、ＱＳＯＸ１の発現をダウンレギュレーションすることができる別の作用因が、標的化された様式で発現を沈黙させるために好適である核酸作用因である。そのような作用因の例が下記で示される。
例えば、ＱＳＯＸ１のダウンレギュレーションをＲＮＡサイレンシングによって達成することができる。本明細書中で使用される場合、表現「ＲＮＡサイレンシング」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される一群の調節機構［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、相互抑制および翻訳抑制］を示す。ＲＮＡサイレンシングが、植物、動物およびカビを含めて、多くのタイプの生物において認められている。
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＮＡサイレンシング作用因」は、標的遺伝子の発現の特異的な阻害または「サイレンシング」を行うことができるＲＮＡを示す。特定の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング作用因はｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を転写後のサイレンシング機構により妨げることができる。ＲＮＡサイレンシング作用因には、非コードＲＮＡ分子、例えば、対形成した鎖を含むＲＮＡ二重鎖、同様にまた、そのような小さい非コードＲＮＡを生じさせ得る前駆体ＲＮＡが含まれる。例示的なＲＮＡサイレンシング作用因には、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが含まれる。１つの実施形態において、ＲＮＡサイレンシング作用因はＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング作用因は翻訳抑制を媒介することができる。
本発明の１つの実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング作用因は標的ＲＮＡ（例えば、ＱＳＯＸ１）に対して特異的であり、標的遺伝子に対する９９％以下の全体的相同性（例えば、標的遺伝子に対する９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満の全体的相同性）を示す遺伝子またはスプライス変化体の交差阻害または交差サイレンシングをもたらさない。
ＲＮＡ干渉は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを示す。植物における対応するプロセスが転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと一般に呼ばれ、これはまた、カビではクエリングと呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられており、多種多様な植物および動物によってそれらの間で一般に共有される。外来遺伝子発現からのそのような保護が、相同的な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染に由来するか、または、宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントのランダムな組み込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して進化してきたかもしれない。
細胞における長いｄｓＲＮＡの存在により、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来する短い干渉性ＲＮＡは、長さが典型的には約２１ヌクレオチド〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体（これはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に呼ばれる）を特徴とする。標的ＲＮＡの切断が、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において生じる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡからのタンパク質発現をダウンレギュレーションするためのｄｓＲＮＡの使用が意図される。
１つの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは３０ｂｐ超である。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐ超のｄｓＲＮＡ）の使用は、二本鎖ＲＮＡのこれらのより長い領域がインターフェロン応答およびＰＫＲ応答の誘導を生じさせるであろうという考えのために非常に限定されている。しかしながら、長いｄｓＲＮＡの使用は下記の点で数多くの利点をもたらすことができる：細胞は、数多くのｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減する最適なサイレンシング配列を選択することができる；長いｄｓＲＮＡは、サイレンシングライブラリーが、ｓｉＲＮＡのために必要であろうと思われるよりも少ない複雑性を有することを可能にするであろう；および、おそらくは最も重要であるが、長いｄｓＲＮＡは、治療剤として使用されたときにはウイルスの回避変異を防止することができるかもしれない。
様々な研究により、長いｄｓＲＮＡが、ストレス応答を誘導することなく、また、著しい標的外影響を引き起こすことなく、遺伝子発現を沈黙させるために使用され得ることが明らかにされる。例えば、Ｓｔｒａｔ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、第３４巻、Ｎｏ．１３、３８０３〜３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ他、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２００４、１３：１１５〜１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．他、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３、１３：３８１〜３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００２、９９：１４４３〜１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２００４、５７３：１２７〜１３４を参照のこと。
特に、本発明はそのいくつかの実施形態によれば、インターフェロン経路が活性化されない細胞（例えば、胚性細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長いｄｓＲＮＡ（３０塩基を超える転写物）の導入を意図する。例えば、Ｂｉｌｌｙ他、ＰＮＡＳ、２００１、第９８巻、１４４２８頁〜１４４３３頁；およびＤｉａｌｌｏ他、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年１０月１日、１３（５）：３８１〜３９２、ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照のこと。
本発明はそのいくつかの実施形態によれば、遺伝子発現をダウンレギュレーションするための、インターフェロン経路およびＰＫＲ経路を誘導しないように特に設計された長いｄｓＲＮＡの導入もまた意図する。例えば、ＳｈｉｎａｇａｗａおよびＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、１７（１１）：１３４０〜１３４５、２００３］は、長い二本鎖ＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターから発現するために、ｐＤＥＣＡＰと名づけられるベクターを開発している。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓ−ＲＮＡ輸出を促進させる５’キャップ構造および３’ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓ−ＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。
インターフェロン経路およびＰＫＲ経路を哺乳動物系において避ける別の方法が、小さい阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、トランスフェクションまたは内因性発現のどちらかを介して導入することによるものである。
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小さい阻害性ＲＮＡ二重鎖（一般には１８塩基対〜３０塩基対の間）を示す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐの二重鎖領域および両末端における対称的な２塩基の３’突出部を有する２１量体として化学合成されているが、２５塩基〜３０塩基の長さの化学合成されたＲＮＡ二重鎖が、同じ場所において２１量体と比較して、効力の１００倍もの増大を有し得ることが近年には記載されている。ＲＮＡｉを誘発することにおいてより長いＲＮＡを使用して得られる観測された増大した効力が、ダイサーに生成物（２１量体）の代わりに基質（２７量体）を提供すること、また、このことにより、ｓｉＲＮＡ二重鎖がＲＩＳＣに進入する速度または効率が改善されることから生じるように理論化される。
３’突出の位置がｓｉＲＮＡの効力に影響すること、および、３’突出をアンチセンス鎖に有する非対称的な二重鎖が、３’突出をセンス鎖に有するものよりも一般に強力であることが見出されている（Ｒｏｓｅ他、２００５）。このことは、アンチセンス転写物を標的とするときには逆の効力パターンが認められるので、非対称的な鎖がＲＩＳＣに入ることに起因すると考えられ得る。
二本鎖の干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖が、ヘアピン構造またはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成するためにつながれる場合がある。したがって、述べられたように、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング作用因はまた、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合がある。
用語「ｓｈＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、相補的配列の第１の領域および第２の領域を含む、ステム−ループ構造を有するＲＮＡ作用因を示し、ただし、この場合、これらの領域の相補性の程度および配向が、塩基対形成がこれらの領域の間で生じるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によってつながれ、ループが、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の間での塩基対形成の欠如から生じる。ループにおけるヌクレオチドの数は、３〜２３の間の数（３および２３を含む）、または、５〜１５の間の数（５および１５を含む）、または、７〜１３の間の数（７および１３を含む）、または、４〜９の間の数（４および９を含む）、または、９〜１１の間の数（９および１１を含む）である。ループにおけるヌクレオチドのいくつかは、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与することができる。ループを形成させるために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．他（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．他（２００２）、ＲＮＡ、８：１４５４）が含まれる。生じた一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ装置と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループ構造またはヘアピン構造を形成することが当業者によって認識されるであろう。
本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適であるＲＮＡサイレンシング作用因の合成を下記のように行うことができる。最初に、ＱＳＯＸ１のｍＲＮＡ配列がＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンから下流に走査される。それぞれのＡＡおよびその３’側の隣接する１９ヌクレオチドの存在が、可能性のあるｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位がオープンリーディングフレームから選択される。これは、非翻訳領域（ＵＴＲ）には調節タンパク質結合部位がより多いからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる場合がある［Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．、２：２３９〜２４５］。だが、非翻訳領域に向けられるｓｉＲＮＡもまた、５’ＵＴＲに向けられるｓｉＲＮＡがＧＡＰＤＨの細胞ｍＲＮＡにおける約９０％の低下を媒介し、かつ、タンパク質レベルを完全になくしたＧＡＰＤＨについて明らかにされるように（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）、効果的である場合があることが理解されるであろう。
次に、可能性のある標的部位が、いずれかの配列アライメントソフトウエアを使用して、例えば、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウエアなどを使用して適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）に対して比較される。他のコード配列に対する有意な相同性を示す推定される標的部位が取り出される。
条件を満たす標的配列が、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択される。好ましい配列が、低いＧ／Ｃ含有量を含む配列である。これらは、Ｇ／Ｃ含有量が５５％よりも大きい配列と比較して、遺伝子サイレンシングを媒介することにおいてより効果的であることが判明しているからである。いくつかの標的部位が好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより良い評価のために、陰性対照が好ましくは、併せて使用される。陰性対照ｓｉＲＮＡは好ましくは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含み、しかし、ゲノムに対する有意な相同性を有していない。したがって、他のいずれの遺伝子に対しても有意な相同性を何ら示さないならば、ｓｉＲＮＡのスクランブル型ヌクレオチド配列が好ましくは使用される。
例えば、ＱＳＯＸ１の好適なｓｉＲＮＡには、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（米国）から商業的に購入されるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング作用因は、ＲＮＡのみを含有するそのような分子に限定される必要はなく、しかし、化学的に改変されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解されるであろう。
ＲＮＡサイレンシング作用因を使用して標的化されることになるｍＲＮＡには、その発現が、望まれていない表現型形質と相関関係にあるｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。標的化されることがある例示的なｍＲＮＡが、短縮型タンパク質をコードするｍＲＮＡ、すなわち、欠失を含むｍＲＮＡである。したがって、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング作用因は、欠失の両側での架橋領域に対して標的化される場合がある。そのようなＲＮＡサイレンシング作用因が細胞に導入されるならば、非変異タンパク質には影響を与えないままにしながら、変異タンパク質のダウンレギュレーションが引き起こされるであろう。
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング作用因はｍｉＲＮＡである場合がある。
用語「ミクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲ」は同義的であり、遺伝子発現を調節する、長さが約１９〜２８ヌクレオチドである非コードの一本鎖ＲＮＡ分子の集まりを示す。様々なｍｉＲＮＡが広範囲の生物（ウイルス．ｆｗｄａｒｗ．ヒト）において見出され、発達、恒常性および疾患原因においてある役割を果たすことが示されている。
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊のどのような対であれ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の対の５’末端および３’末端には変動性が存在するかもしれないことには留意するべきである。この変動性は、切断部位に関するＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの酵素プロセシングにおける変動性に起因する場合がある。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’末端および３’末端における変動性はまた、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する場合がある。ステム鎖のミスマッチにより、異なるヘアピン構造の集団がもたらされる場合がある。ステム構造における変動性はまた、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによる切断の生成物における変動性をもたらす場合がある。
ＱＳＯＸ１をダウンレギュレーションすることができる別の作用因が、ＱＳＯＸ１のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖標的配列および二本鎖標的配列の両方を切断することができる一本鎖のポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ． ＆ Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムのための一般的なモデル（“１０−２３”モデル）が提案されている。“１０−２３”ＤＮＡザイムは１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒作用ドメインを有しており、この触媒作用ドメインには、それぞれが７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドである２つの基質認識ドメインが隣接している。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において有効に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ． ＆ Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、４：１１９〜２１（２００２）を参照のこと］。
一本鎖標的切断部位および二本鎖標的切断部位を認識する合成される操作されたＤＮＡザイムの構築および増幅の様々な例が米国特許第６３２６１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に対して指向した類似する設計のＤＮＡザイムは近年、ウロキナーゼ受容体の発現を阻害し、結腸ガン細胞転移をインビボにおいて首尾よく阻害することが認められた（Ｉｔｏｈ他、２０００２、アブストラクト４０９、Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ、ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂｌガン遺伝子に相補的なＤＮＡザイムが、ガン遺伝子の発現を白血病細胞において阻害すること、また、再発率をＣＭＬおよびＡＬＬの場合における自己骨髄移植において小さくすることにおいて成功した。
ＱＳＯＸ１のダウンレギュレーションはまた、ＱＳＯＸ１をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによって行うことができる。
ＱＳＯＸ１を効率的にダウンレギュレーションするために使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンス取り組みにとって重要である２つの局面を考慮しながら行わなければならない。第１の局面が、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であり、一方、第２の局面が、指定されたｍＲＮＡと、その翻訳を阻害する様式で細胞内において特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
先行技術では、オリゴヌクレオチドを広範囲の様々な細胞タイプに効率的に送達するために使用することができる数多くの送達戦略が教示される［例えば、Ｌｕｆｔ、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、７６：７５〜６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ他、Ｂｌｏｏｄ、９１：８５２〜６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、８：９３５〜４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２３７：５６６〜７１（１９９７）；および、Ａｏｋｉ他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２３１：５４０〜５（１９９７）を参照のこと］。
加えて、最大の予測された結合親和性をそれらの標的ｍＲＮＡについて有するそのような配列を、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造変化のエネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて特定するためのアルゴリズムもまた利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、６５：１〜９（１９９９）参照］。
そのようなアルゴリズムが、細胞におけるアンチセンス取り組みを実行するために首尾よく使用されている。例えば、Ｗａｌｔｏｎ他によって開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）の転写物のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計することを可能にした。同じ研究グループはさらに近年、合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの、細胞培養物における３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対するアンチセンス活性が、動的ＰＣＲ技術によって評価された場合、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド化学およびホスホロチオアートオリゴヌクレオチド化学を用いた２つの細胞タイプにおける３つの異なる標的に対する試験を含めて、ほとんどすべての場合において有効であることが判明したことを報告している。
加えて、特異的なオリゴヌクレオチドを設計し、その効率を、インビトロ系を使用して予測するためのいくつかの取り組みもまた発表された（Ｍａｔｖｅｅｖａ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３７４〜１３７５（１９９８）］。
ＱＳＯＸ１をダウンレギュレーションすることができる別の作用因が、ＱＳＯＸ１をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。様々なリボザイムが、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９：４８６〜９６（１９９８）］。リボザイムを、どのようなＲＮＡであれ、特異的な標的ＲＮＡを切断するために設計することができることにより、リボザイムは基礎的研究および治療的応用の両方において有益なツールになっている。治療領域において、様々なリボザイムが、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、ガンにおける支配的なガン遺伝子、および、遺伝的障害における特異的な体細胞変異を標的とするために利用されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ．、１０：１６３〜７１（１９９８）］。最も注目すべきことに、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルが既に第１相試験にある。より近年には、リボザイムが、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的検証および経路解明のために使用されている。いくつかのリボザイムが臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥが、ヒトの臨床試験において研究されるための最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）、すなわち、血管形成経路における重要な成分の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、同様にまた、他の企業が、抗血管形成治療剤の重要性を動物モデルにおいて明らかにしている。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ、すなわち、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡを選択的に破壊するために設計されたリボザイムが、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを細胞培養アッセイで低下させることにおいて有効であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＲＮＡサイレンシング作用因を細胞透過性ペプチドと機能的に関連させることができる。本明細書中で使用される場合、「細胞透過性ペプチド」は、細胞の原形質膜および／または核膜を越える膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存的（すなわち、非エンドサイトーシス的）転位特性を与える短い（約１２〜３０残基の）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態の膜透過性複合体において使用される細胞透過性ペプチドは好ましくは、少なくとも１つの非機能的なシステイン残基を含み、この場合、この非機能的システイン残基は遊離状態であるか、または、連結のために改変されている二本鎖リボ核酸とのジスルフィド連結を形成するために誘導体化されるかのどちらかである。そのような特性を与える代表的なアミノ酸モチーフが米国特許第６３４８１８５号に列挙されている（その内容は明示的に、参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明のいくつかの実施形態の細胞透過性ペプチドには好ましくは、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓ１、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳおよびＭＡＰが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法（例えば、細胞遊走を阻害する方法）は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで行われる場合がある。
細胞遊走を調節することができることを、新規な治療様式として使用することができる。
したがって、本発明の別の実施形態によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置の必要のある対象において処置する方法であって、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態」は、ラミニン機能が疾患の発症または進行に関連する疾患または状態を示す。
用語「処置する」は、疾患、障害もしくは状態の発達を阻害すること、もしくは停止させること、および／または、疾患、障害もしくは状態の軽減、寛解もしくは退行を生じさせること、あるいは、疾患、障害もしくは医学的状態を、当該疾患、障害もしくは状態について危険性があるかもしれないが、当該疾患、障害もしくは状態を有すると未だ診断されていない対象において生じさせないことを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害もしくは状態の発達を評価するために使用され得ること、また、同様に、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害もしくは状態の軽減、寛解もしくは退行を評価するために使用されるかもしれないことを理解するであろう。
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを示し、この場合、ヒトには、壊死関連の障害または状態に罹患しているか、あるいは、壊死関連の障害または状態に対する素因を有する男女の若年者および高齢者の両方が含まれる。
一つの実施形態によれば、上記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は腫瘍である。
腫瘍の例には、ガン腫、芽細胞腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されない。ガン性疾患の具体的な例には、下記のものが挙げられるが、それらに限定されない：骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺混合腫瘍、結腸腺腫など；腺ガン、例えば、小細胞肺ガン、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、肉腫、脂肪肉腫、粘液様、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング腫瘍；他のものには、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳房、皮膚、前立腺および卵巣が含まれる。
一つの実施形態によれば、上記腫瘍は転移性固形腫瘍である。
一つの実施形態によれば、上記腫瘍は腺ガンである。
別の実施形態によれば、本発明の教示によって処置されてもよい腫瘍は、前立腺ガン、肺ガン、乳ガン、子宮頸ガン、尿膜管ガン、膣ガン、結腸ガン、食道ガン、膵臓ガン、咽頭ガン、胃ガンおよび骨髄性白血病からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
一つの実施形態によれば、上記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は線維症に関連する。
用語「線維症」は、器官または組織における過剰な結合組織の形成または存在を示す。線維症はまた、例えば、刺激（例えば、組織の傷害または炎症など）に対する修復応答または置換応答として生じる場合がある。
線維症を伴う障害の例には、肝線維症、肺線維症、腎線維症、膵線維症、強皮症、結合組織疾患、瘢痕化、皮膚線維症、心臓線維症、臓器移植、血管狭窄、再狭窄、動脈線維症、関節線維化、乳房線維症、筋線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、胸膜線維症およびＣＯＰＤが含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は、細菌疾患、ウイルス疾患または寄生虫疾患である。
本発明の教示によって処置されることがある例示的な寄生虫疾患には、アフリカトリパノソーマ症が含まれる。
本発明の教示によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置するために、対象には、本明細書中上記でさらに詳述されるように、ＱＳＯＸ１の活性または発現をダウンレギュレーションする作用因が投与される。
本明細書中上記で記載されるダウンレギュレーション作用因のそれぞれを個体にそれ自体で投与することができ、または、生理学的に許容され得るキャリアもまた含む医薬組成物の一部として個体に投与することができる。医薬組成物の目的は、有効成分の生物への投与を容易にすることである。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができるＱＳＯＸ１ダウンレギュレーション作用因を示す。
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、例えば右または左の心室腔内、もしくは総冠動脈内への心臓内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の取り組みには、下記のことが含まれる：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内在性輸送経路の１つを利用するための試みにおける作用因の分子的操作（例えば、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを、自身ではＢＢＢを越えることができない作用因との組合せで含むキメラ融合タンパク質の製造）；作用因の脂質溶解性を増大させるために設計される薬理学的戦略（例えば、水溶性作用因を脂質キャリアまたはコレステロールキャリアにコンジュゲート化すること）；および、ＢＢＢの一体性を（頸動脈内へのマンニトール溶液の注入または生物学的活性剤（例えば、アンギオテンシンペプチドなど）の使用から生じる）高浸透圧破壊によって一時的に破壊すること。
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
鼻吸入による投与の場合、本発明のいくつかの実施形態による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
本発明のいくつかの実施形態に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、障害（例えばラミニン関連疾患またはラミニン関連状態）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（ＱＳＯＸ１ダウンレギュレーション作用因）の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に本明細書に与えられた詳細な開示に照らして十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
ラミニン関連疾患のための動物モデルには、例えば、肝線維症のためのマウス動物モデル［例えば、Ｈｉｒｏｍｉｔｓｕ ＨａｙａｓｈｉおよびＴａｋａｏ Ｓａｋａｉ１、Ａｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ−ＧＩ（２０１１）、３００（５）：Ｇ７２９〜Ｇ７３８による総説論文を参照のこと］および転移性乳ガンのためのマウス動物モデル［Ａｎｎａ ＦａｎｔｏｚｚｉおよびＧｅｒｈａｒｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）、８：２１２］が含まれる。
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
投薬量および投薬間隔を、生物学的効果（最小有効濃度（ＭＥＣ））を誘発または抑制するために十分な量で活性成分を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
本発明のいくつかの実施形態の抗マウスＱＳＯＸ１抗体は、処置のための抗体の治療有効量、毒性および効力を求めるために前臨床試験のために使用されることがあることが理解されるであろう。
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル（例えばブリスターパック）を含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の医薬組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
本発明の単離されたポリペプチド（例えば、抗体）はＱＳＯＸ１と特異的に結合することができるので、また、ＱＳＯＸ１のレベルが、ラミニンに関連する医学的状態（例えば、腫瘍）において上昇するので、そのようなポリペプチドは、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態の診断において使用することができることが理解されるであろう。
したがって、本発明の１つの局面によれば、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を対象において診断する方法であって、（ａ）前記対象の生物学的サンプルを、本発明の単離されたポリペプチドとＱＳＯＸ１タンパク質との間における免疫複合体形成のために好適な条件のもとで本発明の単離されたポリペプチドと接触させること；および（ｂ）前記免疫複合体の形成を検出し、ただし、所定の閾値（すなわち、健康な個人から得られる生物学的サンプルにおけるそのレベル）を超える前記免疫複合体の存在により、前記ラミニン関連疾患が示されることを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、表現「診断する」は、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を分類すること、疾患の重篤度を決定すること、疾患の進行をモニターすること、疾患の結果および／または回復の見通しを予測することを示す。
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、対象から単離される組織または流体のサンプルを示し、これらには、細胞（例えば、線維芽細胞、ニューロン細胞、樹状細胞、上皮細胞など）、組織、器官、様々な腫瘍（例えば、腫瘍生検サンプル）、ならびに、流体、例えば、血液、血清、血漿、リンパ、胆汁液、尿、唾液、痰、滑液、精液、涙、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、腹水、膿、馴化培地など、ならびに、同様に、インビボ細胞培養成分のサンプルが含まれるが、これらに限定されない。「対象の生物学的サンプル」はまた、場合により、当該対象から物理的に取り出されていないサンプルを含む場合がある。
１つの実施形態によれば、本発明の方法は、腫瘍、例えば、転移性固形腫瘍（例えば、前立腺ガン、膵臓ガン、乳ガンなど）などの診断を可能にする。
本発明に従うラミニン関連疾患の診断が、対象の生物学的サンプルを、本発明の単離されたポリペプチド（例えば、抗体）とＱＳＯＸ１タンパク質との間における免疫複合体形成のために好適な条件のもとで本発明の単離されたポリペプチドと接触させることによって行われる。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫複合体」は、抗体（例えば、本発明の単離されたポリペプチド）とその特異的な抗原（ＱＳＯＸ１タンパク質）との間で形成される複合体を示す。
本発明の免疫複合体は、使用される単離されたポリペプチドおよびＱＳＯＸ１タンパク質に依存して変化する場合がある様々な温度、塩濃度およびｐＨ値において形成させることができ、当業者は、それぞれの免疫複合体の形成のために好適な条件を調節することができる。
本発明のこの局面の方法によれば、免疫複合体形成の検出により、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態の診断が示される。様々な方法を、本発明の免疫複合体を検出するために使用することができ、当業者は、どの方法が、それぞれの免疫複合体のために、および／または、診断のために使用される生物学的サンプルのタイプのために好適であるかを決定することができる。
例えば、免疫複合体を、従来の免疫組織化学分析または免疫蛍光分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ分析、ウエスタンブロット分析およびＲＩＡ分析によって、または、分子量に基づく取り組みによって検出することができる。
本発明のいくつかの実施形態の単離されたポリペプチド（例えば、抗体）は、免疫複合体の検出を可能にするために、検出可能な部分に結合させられる場合があることが理解されるであろう。
様々なタイプの検出可能な部分またはレポーター部分が本発明の抗体にコンジュゲート化される場合がある。これらには、放射性同位体（例えば、［１２５］ヨウ素など）、リン光性化学物質、化学発光性化学物質、蛍光性化学物質（蛍光団）、酵素、蛍光性ポリペプチド、親和性タグ、および、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出可能である分子（造影剤）が含まれるが、これらに限定されない。
好適な蛍光団の例には、フィコエリトリン（ＰＥ）、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−クロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッドおよびＰＥ−Ｃｙ５などが含まれるが、これらに限定されない。蛍光団選択、蛍光団を様々なタイプの分子に連結する方法に関するさらなる指針については、下記を参照のこと：Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９２−１９９４”、第５版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；米国特許第６０３７１３７号（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎ Ｉｎｃ．）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ニューヨーク（１９９５）；Ｋａｙ Ｍ．他、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：２９３；Ｓｔｕｂｂｓ他、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：９３７；Ｇａｋａｍｓｋｙ Ｄ．他、“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ”、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、第２版、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃ．およびＨｏｒｔｏｎ Ｒ．（編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、英国（２００１）；米国特許第６３５０４６６号（Ｔａｒｇｅｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．）。蛍光性の検出可能な部分にコンジュゲート化されたときの抗体を検出するために使用することができる蛍光検出法には、例えば、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光共焦点顕微鏡法、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が含まれる。
数多くのタイプの酵素が本発明の抗体に結合させられる場合があり［例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）］、また、酵素コンジュゲート化抗体の検出を、ＥＬＩＳＡ（例えば、溶液において）、酵素結合免疫組織化学的アッセイ（例えば、固定処理された組織において）、酵素結合化学発光アッセイ（例えば、電気泳動分離されたタンパク質混合物において）またはこの技術分野で知られている他の方法を使用して行うことができる［例えば、Ｋｈａｔｋｈａｔａｙ ＭＩ．およびＤｅｓａｉ Ｍ．、１９９９、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、２０：１５１〜８３；Ｗｉｓｄｏｍ ＧＢ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３２：４３３〜４０；Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｅ．他、１９８３、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４：２０９〜３２７；Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ Ｍ．、１９８０、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８：１９７〜２０８；Ｓｃｈｕｕｒｓ ＡＨ．およびｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ ＢＫ．、１９８０、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１：２２９〜４９を参照のこと］。
親和性タグ（または結合対のメンバー）は、対応する抗体によって特定可能な抗原［例えば、抗ＤＩＧ抗体によって特定されるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）］、または、タグに対する大きい親和性を有する分子［例えば、ストレプトアビジンおよびビオチン］が可能である。親和性タグと結合する抗体または分子は蛍光標識することができ、または、上記で記載されるような酵素にコンジュゲート化することができる。
様々な方法がこの技術分野では広範囲に実施されており、ストレプトアビジン分子またはビオチン分子を本発明の抗体に結合するために用いられる場合がある。例えば、ビオチン分子が、下記の実施例の節において、また、Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２において記載されるようなビオチンタンパク質リガーゼ（例えば、ＢｉｒＡ）の認識配列を介して本発明の抗体に結合させられる場合がある。別法として、ストレプトアビジン分子が、本質的には下記において記載されるように、抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖなど）に結合させられる場合がある：Ｃｌｏｕｔｉｅｒ ＳＭ．他、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３７：１０６７〜１０７７；Ｄｕｂｅｌ Ｓ．他、１９９５、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７８：２０１；Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ．他、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ＳＭ．他、１９９５、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６：９３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ＳＭ．他、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９：２０３；Ｐｅａｒｃｅ ＬＡ．他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｌ、４２：１１７９〜１１８８。
ストレプトアビジンにコンジュゲート化される様々な機能的部分（例えば、蛍光団など）が、免疫蛍光フローサイトメトリー試薬の本質的にすべての主要な供給者から市販されている（例えば、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
本発明のいくつかの実施形態によれば、様々なビオチンコンジュゲート化抗体が、多価組成物（例えば、当該抗体の二量体形態または四量体形態）を形成させるためにストレプトアビジン分子に結合させられる。
表１は、本発明の抗体にコンジュゲート化することができる特定可能な部分の限定されない例を提供する。
さらに、免疫複合体を単離するために、単離されたペプチド（例えば、抗体）が固体支持体に固定化される場合がある。本明細書中で使用される場合、表現「固体支持体」は、目的とする試薬（例えば、本発明のこの局面の単離されたポリペプチド）が付着することができる非水性マトリックスを示す。固体支持体の例には、一部または全体がガラス（例えば、細孔制御ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンから形成される固体支持体が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、状況に依存して、固体支持体はアッセイプレートのウエルを含むことができる；他の状況では、固体支持体は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語にはまた、分離している粒子の不連続な固相、例えば、米国特許第４２７５１４９号に記載のものが含まれる。
免疫複合体形成を検出するための本明細書中上記で記載される作用因は、好ましくは適切な使用説明書、ならびに、ラミニン関連疾患の診断および／または評価を行うことにおける使用のためのＦＤＡ承認を示す表示と一緒に診断キット／製品に含まれる場合がある。
そのようなキットは、例えば、上記の診断剤の少なくとも１つ（例えば、抗体）を含む少なくとも１つの容器と、別の容器に詰められた画像化試薬（例えば、酵素、二次抗体、緩衝液、発色性基質、蛍光発生物質）とを含むことができる。キットはまた、キットの貯蔵寿命を改善するための適切な緩衝液および保存剤を含む場合がある。
本発明の別の局面によれば、生物学的サンプルにおいてＱＳＯＸ１のレベルを検出するためのキットが提供される。
下記の実施例の節において詳しく記載されるように（例えば、本明細書中下記の実施例１を参照のこと）、本発明者らは、ＱＳＯＸ１の阻害／欠乏が基底膜におけるラミニン集合の欠陥を引き起こすことを示している。
したがって、本発明の別の局面によれば、ＱＳＯＸ１阻害剤を特定する方法であって、組織を試験作用因の存在下または非存在下で培養することを含み、前記試験作用因との前記培養の後での機能的基底膜における減少により、前記試験作用因が前記ＱＳＯＸ１阻害剤であることが示される方法が提供される。
一つの実施形態によれば、機能的基底膜における上記減少は、上記基底膜でのラミニン集合における低下を含む。
本明細書中で使用される場合、表現「機能的基底膜における減少」は、少なくとも約１０％の減少、少なくとも約２０％の減少、少なくとも約３０％の減少、少なくとも約４０％の減少、少なくとも約５０％の減少、少なくとも約６０％の減少、少なくとも約７０％の減少、少なくとも約８０％の減少、少なくとも約９０％の減少、または、少なくとも約１００％の減少を示す。したがって、好ましくは、ラミニンが基底膜に全く取り込まれない。
別の実施形態によれば、ラミニン集合における上記低下は、上記組織での可溶性ラミニンにおける増大を含む。
別の実施形態によれば、上記組織は組織培養物を含む。
別の実施形態によれば、上記方法はインビボで行われる。
別の実施形態によれば、上記方法はさらに、ＱＳＯＸ１の活性レベルまたは発現レベルにおける低下を含む。ＱＳＯＸ１の活性レベルまたは発現レベルにおける低下は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％である場合がある。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
実施例１
ジスルフィド触媒ＱＳＯＸ１は重要な基底膜成分の取り込みによって腫瘍細胞遊走を促進させる
材料および実験手順
細胞株および維持
ＷＩ−３８肺線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、供給者によって推奨されるように、１５％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質が補充された最少必須培地（ＭＥＭ）において維持した。ＨＦＦ細胞および膵臓線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質が補充されたＭＥＭにおいて維持した。ＢｘＰＣ−３上皮細胞およびＨ４６０上皮細胞を、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質が補充されたＤＭＥＭにおいて維持した。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＱＳＯＸ１特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびスクランブル型ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを製造者の説明書（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に従って線維芽細胞にトランスフェクションした。簡単に記載すると、細胞をおよそ７５％のコンフルエンスで播種し、血清非含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地において５０ｎＭのｓｉＲＮＡおよびＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１トランスフェクション緩衝液と６時間インキュベーションした。インキュベーション後、トランスフェクション混合物を吸引し、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭを細胞に加えた。
免疫蛍光
細胞を、所望されるコンフルエンスにまで２４ウエルプレートにおいてガラスカバースリップ上で成長させた。細胞内染色のために、細胞を、ＲＴで３０分間、３．７％ホルムアルデヒドにより固定処理し、続いて、透過処理を０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００において２分間行い、その後、０．１％のＴｗｅｅｎを含有するリン酸塩緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ−Ｔ）において３回すすぎ洗浄した。その後、細胞をＰＢＳ−Ｔにおける５％ＢＳＡと１時間インキュベーションし、続いて、ＰＢＳでの５％ＢＳＡにおける一次抗体（製造者によって別途指定される場合は除き、２０μｇ／ｍｌ）とＲＴで１時間、または、４℃で一晩インキュベーションし、その後、ＰＢＳにおいて洗浄し、ＰＢＳ−Ｔでの５％ＢＳＡにおける蛍光標識されている二次抗体とＲＴで１時間インキュベーションした。さらに３回洗浄した後、カバースリップを、細胞面を下側にしてガラススライド上の５μＬ液滴のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の上に置き、遮光して一晩乾燥させた。サンプルをＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ画像化システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）で観察した。ＥＣＭタンパク質を標識するために、細胞およびその関連マトリックスをＰＢＳ−Ｔにおける５％ＢＳＡとインキュベーションし、一次抗体により標識した。その後、サンプルを３．７％ホルムアルデヒドにより固定処理し、二次抗体により処理した。
ＥＣＭの精製およびＴｈｉｏＧｌｏ染色
細胞培養物を２４ウエル皿において成長させ、結果の節（本明細書中下記）および図の説明（本明細書中上記）に記載されるようにトランスフェクションした。細胞を２０ｍＭのＮＨ４ＯＨによる１分間の処理によってはぎ取り、続いて、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）による６回の洗浄を行った。最後の洗浄の後で、陽性対照および陰性対照のＥＣＭサンプルを、３７℃で１時間、１００ｍＭのＤＴＴ（１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにおいて）または１００ｍＭのＮＥＭ（５％アセトニトリルにおける２５０ｍＭストック液から加えられる）によりそれぞれ処理した。その後、サンプルを、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにより４回洗浄し、その後、６μＭのＴｈｉｏＧｌｏ試薬とＲＴで３０分間（遮光して）インキュベーションした。反応を、２μｌの２Ｎ ＨＣｌを加えることによって停止させ、放射を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した（ｅｘ：３７９ｎｍ、ｅｍ：５１３ｎｍ）。
酸素消費アッセイ
クラーク型酸素電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して、溶存酸素濃度における変化をスルフヒドリルオキシダーゼ活性の尺度としてモニターした。精製ＱＳＯＸ１を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、６５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいてアッセイした。反応を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を電極反応チャンバーにおいて５ｍＭの濃度に注入することによって開始させた。細胞培養上清におけるスルフヒドリルオキシダーゼ活性を、５ｍＭのＤＴＴを上清溶液に注入した後で同様にアッセイした。
質量分析法による分析
ゲルフラグメントを５０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおいて３７℃でプロテア−ゼにより処理した。ペプチド混合物を、８０％ＣＨ３ＣＮ、１％ＣＦ３ＣＯＯＨを用いてゲルから抽出し、有機溶媒を真空遠心分離器において蒸発させた。得られたペプチド混合物を、質量分析法による分析に先立って８０％ギ酸において再構成し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水により直ちに１：１０に希釈した。タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ／Ｎａｎｏ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ｄｉｏｎｅｘ）を使用して、社内で作製され、かつ、３μｍのＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ Ｃ１８ＡＱ媒質（Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ、ドイツ国）が充填された１５ｃｍの逆相の噴霧用フューズドシリカ・キャピラリーカラム（内径、７５μｍ）を使用して行った。ＬＣシステムを、陽イオンモードで運転され、かつ、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えるＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と併せて使用した。ペプチドを５％アセトニトリルから６５％アセトニトリルへの５０分の勾配により分離した（緩衝液Ａ：５％アセトニトリル、０．１％ギ酸、０．００５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：９０％アセトニトリル、０．２％ギ酸、０．００５％ＴＦＡ）。サーベイＭＳ走査を、６００００の値に設定される分解能によりＯｒｂｉｔｒａｐにおいて取得した。１走査あたり６個までの最も大きい強度のイオンをフラグメント化し、線形トラップにおいて分析した。ペプチドの分析のために、サーベイ走査をＦＴモードで記録し、続いて、６個の最も大きい強度のイオンのデータ依存的衝突誘起解離（ＣＩＤ）を線形イオントラップ（ＬＴＱ）において行った。生データファイルをＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに対してＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ロンドン、英国）により検索した。
侵入アッセイ
線維芽細胞を、８．０μｍの細孔サイズの膜挿入物を有する２４ウエルのＢＤ ＢｉｏＣｏａｔプレートの上部チャンバーに播種した。結果の節（本明細書中下記）および図の説明（本明細書中上記）に記載されるように細胞をトランスフェクションし、かつ、ｒＱＳＯＸ１を補充し、その後、細胞を４日間成長させて、コンフルエンスに到達させた。４日目に、５×１０４個の上皮細胞（製造者の説明書に従って細胞追跡色素ＣＳＦＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により事前に標識されたもの）を線維芽細胞の上に重層した。内側チャンバーを血清非含有ＭＥＭで満たし、外側チャンバーを、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭで満たした。上皮細胞を、３７℃で２４時間、膜を越えて遊走させた。非侵入細胞を膜の上部面から手でかき取り、捨て、下部面の侵入細胞を３．７％ホルムアルデヒドにおいて固定処理し、画像化し、定量化した。
細胞接着アッセイ
線維芽細胞を２４ウエルプレートにおいて成長させ、その後、結果の節および図の説明文に記載されるようにトランスフェクションし、かつ、ｒＱＳＯＸ１を補充した。トランスフェクション後４日目に、線維芽細胞をＰＢＳにおける５％ＢＳＡと１時間インキュベーションし、一組のサンプルにα６抗体を補充した。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後、１０５個の上皮細胞（細胞追跡色素ＣＳＦＥにより事前に標識されたもの）を線維芽細胞の上に重層し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、プレートをプラスチックにより密封し、上下逆さにして５０×ｇで５分間遠心分離して、細胞を除いた。遠心分離後、プレートに付着したままであった細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーによって計数した。
老化染色
細胞を結果の節および図の説明文に記載されるようにトランスフェクションした。ＳＡ−β−Ｇａｌ染色に先立って、細胞を、ＲＴで１５分間、０．５％グルタルアルデヒドにより固定処理し、続いて、ＰＢＳ／ＭｇＣｌ２（ｐＨ６．０）により３回洗浄した。その後、新鮮なＸ−ｇａｌ溶液を加え、細胞を遮光して３７℃で３時間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、直ちに画像化した。
走査型電子顕微鏡法
ＷＩ−３８細胞を、直径が１３ｍｍのガラスカバースリップの上で成長させた。細胞を、ＲＴで１時間、０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１％スクロースにおける３％パラホルムアルデヒドおよび２％グルタルアルデヒドにより固定処理した。１％スクロースを含有する０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液により３回（それぞれ５分）すすいだ後、細胞を、室温で１時間、０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１％スクロースにおける１％ＯｓＯ４により処理した。その後、サンプルを０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液により５回、水により５回洗浄し、１％タンニン酸と５分間インキュベーションし、再び、水により５回洗浄した。サンプルを１％酢酸ウラニルにおいて３０分間インキュベーションし、再び、水により５回洗浄した。脱水するため、サンプルを、２５％、５０％、７０％、９６％および１００％のエタノールにおいて順次、それぞれ５分間インキュベーションした。サンプルを、ＦＥＧ−ＳＥＭ ＬＥＯ Ｓｕｐｒａ５５電子顕微鏡を使用して画像化した。
ＮＦ／ＣＡＦ単離
ＮＦおよびＣＡＦを、手術により切除された肺腫瘍から得た（ＣＡＦ）か、または、同じ試料の健全な領域から得た（ＮＦ）。施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって要求されるように、署名入りの同意を患者から得た。組織を切り刻み、４型コラゲナーゼを含有するＤＭＥＭにおいて絶えず振とうしながら３７℃で一晩インキュベーションした。その後、細胞をろ過し、２０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、抗生物質および６０μＭのβ−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭにおいて７〜１４日間にわたって置床し、その後、１０％のＦＢＳを含有する培地に移した。線維芽細胞の同一性を、典型的な形態学、陽性のビメンチン染色および陰性のサイトケラチン染色によって確認した。細胞を小分けで凍結し、それぞれの実験の７日前に解凍した。解凍後、線維芽細胞を７０％のコンフルエンスにまで成長させ、その後、培地を対照培地またはＨ４６０馴化培地のどちらかにより置き換えた。細胞の採取およびＲＮＡ分析を４８時間で行った。
馴化培地
コンフルエントな肺上皮細胞（Ｈ４６０）および膵臓上皮細胞（ＢｘＰＣ−３）を培養プレートにおいて成長させた。馴化培地を５日後に集め、遠心分離して、破片を除いた。
リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析
総ＲＮＡを、ＮｕｃｌｏｅＳｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、ドイツ国）を使用して抽出した。１マイクログラムのＲＮＡを、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびランダムヘキサマープラマーを用いて逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ７３００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して行った。プライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを使用して設計し、発現レベルを同じサンプルにおけるＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現レベルによって正規化した。
組織学的免疫染色
乳ガン患者に由来するホルマリン固定組織を脱水し、パラフィンに包埋し、４μｍで切片化した。スライドを６０℃に１時間加温し、キシレンにおけるワックス除去に供し、脱水した。内因性ペルオキシダーゼの阻止を３％Ｈ２Ｏ２／メタノールにおいて１０分間行った。ＴＢＳにおいてすすいだ後、切片を、室温で１時間、ＱＳＯＸ１に対する精製抗体（１：５０）とインキュベーションした。検出を、Ｓｕｐｅｒ Ｐｉｃｔｕｒｅ ＰＯＬＹ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。簡単に記載すると、切片を、室温で３０分間、ＰＯＬＹ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅとインキュベーションした。抗体結合を基質色素原ＡＥＣにより可視化した。切片をヘマトキシリンにより対比染色し、カバースリップに水性封入液（Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ、Ｄａｋｏ）と一緒に載せた。染色された切片を光学顕微鏡で調べ、分析した。
マイクロアレイ分析
ラミニン転写物の定量化のために、ＷＩ−３８細胞を、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ、ｓｉＱＳＯＸ１、または、ｓｉＱＳＯＸ１＋ｒＱＳＯＸ１のいずれかにより処理し、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ＲＮＡの質を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００プラットホーム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して評価した。その後、サンプルを処理し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐシステムを製造者の説明書に従って使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のヒト２．０マイクロアレイに対してハイブリダイゼーションさせた。
原子間力顕微鏡法
ＡＦＭ測定を、コロイド状チップ（１μｍの半径のホウケイ酸塩）および０．０３Ｎ／ｍのカンチレバー（Ｎｏｖａｓｃａｎ）を使用して、Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ４コントローラーとともにＢｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｃｏｐｅで行った。力−距離曲線を、サンプル上の走査を行うことなく、０．５Ｈｚで行った。弾性率を、新しい曲線に対するヘルツモデル適合を使用して計算した。数十の力曲線を３つの対照サンプルおよび２つのＱＳＯＸ１ノックダウンサンプルのそれぞれについて取得した。
結果
活性なＱＳＯＸ１が休止線維芽細胞から分泌される
培養された上皮細胞において一時的に発現されるＱＳＯＸ１が、ゴルジ装置に局在化することが以前に示された［Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ Ｓ．他（２００７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４０４、４０３〜４１１］。ニューロンおよび神経内分泌腺における内因性ＱＳＯＸ１もまた、ゴルジ局在化することが以前に示唆された［Ｔｕｒｙ Ａ．他（２００４）、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１８３、３５３〜３６３］。本発明者らはポリクローナル抗体を惹起させ、内皮細胞および上皮細胞におけるゴルジへの内因性ＱＳＯＸ１の局在化を明らかにした（図９Ａ〜図９Ｊ）。サブコンフルエントな線維芽細胞において、ＱＳＯＸ１がまた、ゴルジに見出された（図１Ｃ〜図１Ｊ）。しかしながら、コンフルエンスに達したとき、線維芽細胞における細胞内染色パターンは変化し、分泌小胞へのＱＳＯＸ１の移動に対応するようであった（図９Ａ〜図９Ｊ）。
ＱＳＯＸ１のレベルが、ＷＩ−３８線維芽細胞がコンフルエントになり、休止状態に入るにつれて、ＷＩ−３８線維芽細胞の成長培地において増大することが以前に示された（Ｃｏｐｐｏｃｋ他、２０００、上掲）。ＷＩ−３８細胞は、ＱＳＯＸ１が多く存在するが、そのパラログであるＱＳＯＸ２は多く存在しない組織である肺に由来した。本発明者らは、排他的なＱＳＯＸ１転写、および、コンフルエントな線維芽細胞の培養培地へのタンパク質分泌を確認した（図１Ｋ）。分泌されたＱＳＯＸ１のレベルが時間とともに増大し（図１Ｌ）、これは、酸素消費アッセイによって測定されるように、スルフヒドリルオキシダーゼ活性における増大と相関していた（図１Ｍ）。コンフルエントな細胞の培養培地におけるＱＳＯＸ１活性は４０μＭ〜５０μＭの野生型組換えＱＳＯＸ１（ｒＱＳＯＸ１）と同程度であった（図９Ｋ）。ＱＳＯＸ１の分泌は、様々な起源に由来するコンフルエントな線維芽細胞の一般的な現象であることが示された。特に、膵臓および肺から得られるガン関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、正常な肺線維芽細胞、ならびに、ヒト包皮線維芽細胞が、ＱＳＯＸ１を成長培地に分泌した（図９Ｌ）。対照的に、試験された上皮細胞および内皮細胞は、ＱＳＯＸ１を細胞内に発現するが、コンフルエンスに達した数日後においてさえ、この酵素を分泌しなかった（データは示されず）。
線維芽細胞成長培地に分泌されたＱＳＯＸ１のウエスタンブロットはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる二重のバンドをおよそ８０ｋＤ〜９０ｋＤにおいて一貫して示した（図１Ｌ）。ＱＳＯＸ１転写物のこれら２つの知られているスプライス変化体は、計算された分子量が、オリゴ糖修飾を含めておよそ７６ｋＤである可溶性タンパク質と、予測されたカルボキシ末端の膜貫通部分を含有するおよそ９２ｋＤのタンパク質とをコードする。ウエスタンブロットによって認められるこれら２つのＱＳＯＸ１種の源を求めるために、本発明者らはＱＳＯＸ１を培養上清から免疫沈殿させ、これら２つのバンドを液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に供した（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。下側バンドから回収されるペプチドは、両方のスプライス変化体に共通である領域にのみ由来した。しかしながら、上側バンドから回収されるいくつかのペプチドは、長い方のスプライス変化体に特有な領域に由来した。長い方のスプライス変化体の細胞質テール領域または膜貫通領域にわたるペプチドは一つも観測されなかった。これらの観測結果についての１つの可能な説明が、長い方のスプライス変化体はその膜貫通領域を伴って生合成され、可溶性の外部ドメインが、分泌経路において、または、細胞表面において翻訳後切断のときに取り除かれるということであった。
細胞外ＱＳＯＸ１が線維芽細胞接着に要求される
ＱＳＯＸ１を、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して線維芽細胞から欠乏させた。ＱＳＯＸ１特異的ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションはＱＳＯＸ１のｍＲＮＡおよび分泌された酵素を検出可能レベル未満に低下させ、バックグランド速度への細胞外スルフヒドリルオキシダーゼ活性における対応する低下を引き起こした（図１１Ａ）。ＱＳＯＸ１のｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされた線維芽細胞の免疫蛍光染色は、非常に少ない細胞（およそ５％）が細胞内タンパク質の検出可能なレベルを保持することを示した。ＱＳＯＸ１の欠乏がトランスフェクション後の少なくとも４日間にわたって維持された（図１１Ｂ）。
線維芽細胞からのＱＳＯＸ１欠乏の最も明白な影響が細胞数における低下であった（図２Ａ〜図２Ｅ）。トランスフェクション後４日において、ＱＳＯＸ１欠乏細胞のカウント数が対照細胞のおよそ５０％であった。５０ｎＭのｒＱＳＯＸ１をトランスフェクション後２４時間でＱＳＯＸ１欠乏細胞の培養培地に加えることにより、細胞数の完全な回復がもたらされた。対照的に、５０ｎＭの触媒不活性なｒＱＳＯＸ１（ｒＱＳＯＸ１−ＡＡ）（アミノ末端のレドックス活性なシステイン（Ｃ７０およびＣ７３）がアラニンによって置換されたもの）（図２Ｆ）の添加は、影響が何らなかった。過酸化水素、すなわち、ＱＳＯＸ１媒介によるジスルフィド形成の副生成物が、正常な細胞増殖のために要求されるという可能性が、カタラーゼ（過酸化水素を酸素および水に不均化する酵素）による対照細胞の処理によって除外された。すなわち、検出可能な影響が認められなかった（データは示されず）。これらのデータにより、触媒活性な細胞外ＱＳＯＸ１の重要性、および、培養における線維芽細胞増殖のためのジスルフィド結合の形成が立証される。
いくつかの状況が線維芽細胞におけるＱＳＯＸ１欠乏後の低下した細胞数を引き起こし得るかもしれない。特に、細胞外ＱＳＯＸ１活性は細胞増殖を促進させる場合があり、あるいは、ＱＳＯＸ１の不足が、アポトーシス、休止または老化を誘導する場合がある。アネキシンＶ染色は、アポトーシスがＱＳＯＸ１ノックダウン細胞においてわずかであることを示した（データは示されず）。ＱＳＯＸ１ノックダウンは、老化関連のβ−ガラクトシダーゼ活性についてのＸ−ｇａｌ染色によれば、細胞が老化することを引き起こさなかった（図１１Ｃ〜図１１Ｅ）。さらに、ｓｉＲＮＡ処理後４日目におけるヨウ化プロピジウムによる染色は、ＱＳＯＸ１欠乏が細胞周期からの離脱を引き起こさないことを示唆した（データは示されず）。本発明者らは、細胞数における有意な違いがトランスフェクション後４８時間までのＱＳＯＸ１欠乏培養物と対照培養物との間に無いことに注目した。しかしながら、３日目から始まって、細胞数が分かれ始め、剥離細胞がＱＳＯＸ１欠乏サンプルの培養培地に現れ始めた（図２Ｇ〜図２Ｈ）。ｒＱＳＯＸ１をトランスフェクション後１日目に線維芽細胞培養物に加えることにより、上記で記されるように、細胞数の回復がもたらされることに加えて、それ以降での細胞剥離が妨げられた。ＱＳＯＸ１の欠乏は、「有糸分裂シェークオフ」技術において利用される有糸分裂細胞の低下した接着を悪化させる場合があり、その結果、単層からの細胞の喪失を、意図的な撹拌がない場合でさえもたらし得る。
ＱＳＯＸ１欠乏が基底膜におけるラミニン集合欠陥を引き起こす
本発明者らは次に、細胞剥離を細胞外ＱＳＯＸ１の非存在下でもたらす分子的欠陥を特定しようとした。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が接着受容体のための主要な標的である。様々なＥＣＭ成分についての転写物がＱＳＯＸ１のｍＲＮＡと一緒にコンフルエントな線維芽細胞において増大することが以前に指摘された（Ｃｏｐｐｏｃｋ他、１９９３、上掲）。本発明者らは、ＱＳＯＸ１がコラーゲンまたは他のＥＣＭ成分におけるジスルフィド結合の形成のために要求されるならば、ＱＳＯＸ１の欠乏はＥＣＭにおける過剰な対形成していないシステインを生じさせることがあると推論した。実際、ＱＳＯＸ１欠乏の線維芽細胞から単離される細胞外マトリックスは、チオール特異的蛍光団のＴｈｉｏＧｌｏ１による標識化によって示されるように、反応性チオールのレベルを増大させた（図１２Ａ）。チオールレベルは大部分が、ｒＱＳＯＸ１−ＡＡの添加によってではなく、ｒＱＳＯＸ１をｓｉＲＮＡトランスフェクション後の培養培地に加えることによって回復した。これらのデータは、ＱＳＯＸ１が細胞外マトリックスのタンパク質の内部におけるジスルフィド形成を触媒するということを初めて示すものとなっている。
ＷＩ−３８線維芽細胞によって産生されるＥＣＭ成分は、基底膜（ＢＭ）、すなわち、上皮および内皮の下側に位置する薄い線維層を構成する成分である。本発明者らは本明細書中下記では、培養されたＷＩ−３８細胞によって産生されるＥＣＭをＢＭとして示しており、だが、このマトリックスは、身体表面および腔に対してその生理学的状況から取り出される。ＢＭの主要な構成要素には、コラーゲンＩＶおよびラミニン（これらは重合して、線維網目構造を形成する）、ならびに、パールカン、エンタクチンおよびアグリン（これらは、コラーゲンＩＶおよびラミニンの足場を架橋する）が含まれる。これらのＢＭ構成要素のどれかがＱＳＯＸ１の細胞外活性によって影響を受けるかを明らかにするために、免疫蛍光（ＩＦ）染色およびウエスタンブロッティングを使用して、ＱＳＯＸ１特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４日後の線維芽細胞に由来する細胞および培養培地をそれぞれ分析した。この様式で、本発明者らは、ＢＭの形態学および組成における変化、同様にまた、ＢＭに取り込むことができないことに起因する様々なタンパク質の可溶性型のレベルにおける変化をモニターした。有意な変化が、ＱＳＯＸ１欠乏のとき、ウエスタンブロットまたはＩＦによってコラーゲンＩＶからは何ら検出されなかった（図１２Ｂ〜図１２Ｑ）。しかしながら、ラミニン取り込みにおける大きな欠陥がＱＳＯＸ１の非存在下で認められた。ＱＳＯＸ１欠乏後４日で、可溶性ラミニンを培養培地においてウエスタンブロットによって検出することができ、細胞外ラミニンＩＦ染色における７４％の低下が、対照細胞と比較して測定された（図３Ａ〜図３Ｌおよび図４Ａ）。ＱＳＯＸ１欠乏後でのラミニンにおける変化が、ｒＱＳＯＸ１−ＡＡの添加によってではなく、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の培養培地へのｒＱＳＯＸ１の外因的な添加によって完全に取り消された。このことは、スルフヒドリルオキシダーゼ活性がＢＭへのラミニン取り込みに要求されることを示している。ラミニンの総量における低下が、ＱＳＯＸ１ノックダウンのときの総細胞数における低下を考慮して予想され得るかもしれないが、本発明者らは、低下したラミニンレベルを、等しい数の細胞が画像化されたときでさえ見出した（図１３Ａ）。加えて、細胞剥離がトランスフェクション後３日目から始まり、これに対して、マトリックスにおける低下したラミニンが、既に４８時間で検出することができ（図１３Ａ）、また、細胞外タンパク質の総含有量が全般的に見て、対照細胞とＱＳＯＸ１欠乏細胞との間で等しかった（図１３Ｆ）。最後に、そして、最も重要なことであるが、可溶性ラミニンが、ＱＳＯＸ１の非存在下でのみ、培養培地において検出された（図４Ｂ）。このことは、量におけるわずかな変化というよりは、むしろ、組立てにおける欠陥を示している。
基底膜内へのラミニンの集合における細胞外ＱＳＯＸ１の役割をさらに細かく分析するために、本発明者らは、ＱＳＯＸ１欠乏細胞へのｒＱＳＯＸ１添加の濃度および時間依存性を評価した（図１３Ｍ）。本発明者らは、トランスフェクション後２４時間で加えられる５０ｎＭのｒＱＳＯＸ１により、ｓｉＲＮＡによるＱＳＯＸ１欠乏によって引き起こされる細胞外欠陥（例えば、低下した細胞接着およびＢＭへの不十分なラミニン取り込みなど）が修復されることを見出した。より高いｒＱＳＯＸ１濃度（すなわち、１２５ｎＭ）では、細胞数またはラミニン集合を、対照細胞のレベルまたは５０ｎＭのｒＱＳＯＸ１で処理されたＱＳＯＸ１ノックダウン細胞のレベルを超えて増大させなかった。このことは、ＱＳＯＸ１活性が５０ｎＭ超では制限的でなかったことを示している。対照的に、２５ｎＭのｒＱＳＯＸ１は、ＱＳＯＸ１欠乏の影響を完全に取り消すためには不十分であった。５０ｎＭのｒＱＳＯＸ１が、トランスフェクション後２４時間でなく、トランスフェクション後７２時間で加えられたとき、ＱＳＯＸ１欠乏の影響は取り消されなかった（示されず）。外因的な酵素添加のこの時間依存性は、ＱＳＯＸ１およびラミニンの分泌が時間的に相関するにちがいないこと、または、ラミニンのＢＭ取り込みのための好機が失われていることを示唆する。
ラミニン集合の攪乱はまた、ラミニン結合タンパク質に影響を及ぼすであろうことが予想される。基底膜は、パールカン、エンタクチン、アグリン、ネトリンおよびフィブロネクチンを含めて様々なラミニン相互作用タンパク質に富む。これらのタンパク質はコラーゲンＩＶの網状組織とも相互作用し、また、細胞表面受容体とも相互作用する。本発明者らは、可溶性のパールカン、エンタクチン、アグリンおよびフィブロネクチンを、対照細胞の培地の場合よりも大きな度合いでＱＳＯＸ１欠乏線維芽細胞の培養培地において認めた（図１２Ｃ〜図１２Ｅ）。しかしながら、これらのタンパク質のそれぞれにおける最大でも小さい変化が、ＱＳＯＸ１欠乏細胞のＢＭにおいてＩＦによって検出された（図１２Ｇ〜図１２Ｉ、図１２Ｋ〜図１２Ｍ）。これらのデータは、ＱＳＯＸ１の非存在下でのラミニン網状組織における欠陥、および、ラミニン相互作用タンパク質に対する、結果として生じる影響と一致しており、しかし、コラーゲンＩＶまたは細胞表面タンパク質との相互作用が、それらのＢＭ取り込みを大きな程度に保つために十分であることを示唆する。
ＱＳＯＸ１が特定のラミニンイソ型に影響を及ぼす
ラミニンが、α、βおよびγとして知られている３つの鎖からなる十字形状のヘテロ三量体として細胞から分泌される。５つのαサブユニットイソ型、４つのβイソ型および３つのγイソ型がヒトでは知られており、１６通りの異なる鎖組合せが種々の組織および発達段階において発現され、今日までに発見されている。最新の命名法によれば、これらのラミニンタイプはそれらの鎖組成によって指定され、例えば、ラミニン−１１１は、α１鎖、β１鎖およびγ１鎖を含有する。上記のラミニンにおける変化を検出するために使用される抗体が、ラミニン三量体の高度に保存された抗原決定基であるフラグメントＰ１に対してポリクローナルであった。したがって、Ｐ１抗体は多数のラミニンイソ型を認識する。それにもかかわらず、Ｐ１についてのＩＦ染色では、コンフルエントなＷＩ−３８細胞によって産生されるＢＭにおける多数の異なったラミニンマトリックスの共存が暗示された。本発明者らは、繊細なラミニンマトリックスが対照サンプルおよびＱＳＯＸ１ノックダウンサンプルの両方において認められることに注目した。しかしながら、標準的なＩＦ染色手順のもとでは大きい無定形のパッチとして現れたが（図１３Ｇ〜図１３Ｈ、図１３Ｋ〜図１３Ｌ）、さらなるラミニン集団が対照細胞においてのみ見出された。同じ固定処理および染色プロトコルのもとでのこれら２つのラミニン集団の異なる出現は、２つの質的に異なるタイプのラミニンが存在し、これらの一方のみがＱＳＯＸ１の存在に対して敏感であることを示していた。染色プロトコルのその後の精緻化（上記の「材料および方法の節」を参照のこと）により、ＱＳＯＸ１依存的なラミニン網状組織の網目様外観が、図３Ａ〜図３Ｌにおける画像などの画像をもたらすように保たれた。
ＷＩ−３８線維芽細胞において発現されるラミニンイソ型に関する情報が対照細胞およびＱＳＯＸ１欠乏細胞のＲＮＡマイクロアレイ分析から得られた。本発明者らは、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−２２１およびラミニン−２１１が潜在的にはこれらの細胞において最も豊富に発現されること、また、α１鎖およびα２鎖についての転写物におけるわずかな増大を除いては、ＱＳＯＸ１欠乏はラミニン鎖のｍＲＮＡレベルを有意に変化させなかいことを見出した（表２（下記））。特異的抗体によるＩＦ染色では、ＱＳＯＸ１欠乏のときのＢＭでのラミニンのα４鎖における大きな低下が明らかにされ、これに対して、α２鎖は変化していなかった（図３Ｍ〜図３Ｒおよび図４Ｃ）。したがって、ラミニン−２２１またはラミニン−２１１ではなく、ラミニン−４１１またはラミニン−４２１の取り込みが、細胞外ＱＳＯＸ１によって影響されるまさにその事象である。さらに、ラミニン−４１１またはラミニン−４２１は、上記で記載されるように、標準的なＩＦ染色手順を使用して認められる大きいラミニンパッチに対応する可能性が高い。α２鎖ラミニンに富むＢＭの領域は同様に、α４鎖ラミニンに富む傾向があり、しかし、α４含有マトリックスは、α２含有ラミニンに乏しい領域の中に広がっていた（図３Ｍ〜図３Ｒ）。
ｒＱＳＯＸ１による補充を伴って、または伴うことなく、対照ｓｉＲＮＡまたはＱＳＯＸ１特異的ｓｉＲＮＡにより処理されるＷＩ−３８線維芽細胞におけるｍＲＮＡ転写物レベルを、マイクロアレイ分析を使用して求めた。様々なサンプル対の間における倍数変化、および、対照ＷＩ−３８細胞における正規化されたレベル（選択された一組の参照ｍＲＮＡに対して正規化されたレベル）が示された。
ＱＳＯＸ１依存性ラミニンマトリックスの超微細構造に対する洞察が、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して得られた。ＳＥＭにより、クラスター化したフィリグリー様物質が、対照ＷＩ−３８細胞の細胞外環境に多く存在することが明らかにされた（図５Ａ〜図５Ｆ）。この外観を有する物質が、ＱＳＯＸ１ノックダウン細胞との関連では検出されなかった。まとめると、ＳＥＭおよびＩＦを使用して行われた観測により、ＱＳＯＸ１が、特有の超微細構造を呈示する特定のラミニンイソ型のみの適切なＢＭ組立てのために要求されることが示唆された。さらに、染色プロトコルに対する感受性により、ＱＳＯＸ１依存的ラミニン網目は自然界では、ＱＳＯＸ１活性と無関係にＢＭに堆積するそのようなラミニン網状組織よりも強くは細胞表面または他のＢＭ成分に付着しないことが示唆される。
ＱＳＯＸが腫瘍上皮細胞遊走に要求される
様々なラミニンイソ型が腫瘍上皮細胞遊走を転移時において促進させ、支援する。ＱＳＯＸ１およびラミニンα４鎖（これはＬＡＭＡ４遺伝子によってコードされる）の両方についての転写物が、正常な乳房線維芽細胞と比較して、浸襲性乳房ガン腫を取り囲む線維芽細胞において著しく増大することが以前に見出された［Ｆｉｎａｋ Ｇ．他（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１４、５１８〜５２７］。今回のデータは、α４含有ラミニンの集合におけるＱＳＯＸ１についての特異的な要求を明らかにしており、ガン関連間質におけるＬＡＭＡ４／ＱＳＯＸ１同時誘導の機構的結果を示唆する。ＱＳＯＸ１の細胞外活性が腫瘍細胞と周囲の間質との相互作用に影響を及ぼすかどうかを調べるために、本発明者らは器官型侵入アッセイを利用した。このアッセイでは、Ｈ４６０転移性肺上皮細胞（蛍光性の細胞質色素により事前に標識されたもの）が、ＷＩ−３８肺線維芽細胞およびその関連ＢＭの事前に形成された層を通って遊走する能力がモニターされた（図５Ｇ）。上皮細胞遊走が、ＱＳＯＸ１が線維芽細胞層形成期間中に欠乏させられたときにはおよそ６０％弱まった（図６Ａ〜図６Ｏ）。ＱＳＯＸ１欠乏線維芽細胞に外因性ｒＱＳＯＸ１が補充されたとき、腫瘍細胞遊走が回復した。しかしながら、ｒＱＳＯＸ１−ＡＡの添加は遊走を支援しなかった。類似する結果が、膵臓の線維芽細胞および上皮細胞を使用して得られた。このことは、ＱＳＯＸ１欠乏時の遊走阻害の一般性を示している（図１４）。類似する結果が、対にされた膵臓の線維芽細胞および上皮細胞について得られた（図６Ｒ〜図６Ｓ）。このことは、遊走促進（ｐｒｏ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）ＥＣＭの構築におけるＱＳＯＸ１触媒活性の一般性を示している。ＱＳＯＸ１欠乏線維芽細胞単層は対照よりも弾力的であり（図６Ｔ）、このことは、より大きい浸透性を示唆したにもかかわらず、それらは遊走を支援することができないことは、インテグリン媒介接着、すなわち、腫瘍転移のための必要条件におけるラミニンの知られている役割と一致している。
ＱＳＯＸ１が腫瘍上皮細胞に直接に作用して、それらの遊走を促進させるという可能性を除外するために、遊走アッセイを線維芽細胞層の非存在下で行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆の多孔質膜を通るＨ４６０の遊走を培養培地におけるｒＱＳＯＸ１の存在下または非存在下で定量化した。ｒＱＳＯＸ１の添加は検出可能な影響を何ら有しておらず、このことから、ＱＳＯＸ１は腫瘍細胞遊走を直接に促進させていないことが明らかにされた。加えて、ＱＳＯＸ１を欠く線維芽細胞層における腫瘍細胞の不良な遊走が上皮細胞の低下した生存性に起因するという可能性を除外するために、Ｈ４６０細胞をガラスカバースリップ上のＷＩ−３８線維芽細胞に重層した。細胞生存性トレーサーの取り込みにおける差が、対照対ＱＳＯＸ１欠乏線維芽細胞におけるＨ４６０細胞の間で何ら検出されなかった（データは示されず）。まとめると、これらのデータは、ＱＳＯＸ１の細胞外活性が実際に、線維芽細胞により分泌されるＢＭを通る腫瘍上皮細胞の遊走を、間質層に対するその影響を介して促進させるという結論を裏付けている。
上皮細胞が遊走期間中のＢＭへの確固たる接着のためにＱＳＯＸ１を要求する
線維芽細胞接着における欠陥が、上記で記載されるようなＱＳＯＸ１欠損の単一培養物における攪乱されたラミニン集合と相関した。ＱＳＯＸ１欠乏線維芽細胞層を通って遊走する上皮細胞の損なわれた能力もまた、接着欠陥に起因するかどうかを調べるために、本発明者らは、遠心分離を使用して上皮細胞接着を評価した。上皮細胞を、事前に形成された線維芽細胞層の上に置き、接着力を、制御された力を加えることによって比較した。５分間にわたる５０ｇの加速度に供されたとき、Ｈ４６０上皮細胞が対照細胞から（４．５％の剥離）よりも容易にＱＳＯＸ１欠乏ＷＩ−３８線維芽細胞から剥離した（４４．９％の剥離）。ｒＱＳＯＸ１をＱＳＯＸ１欠乏線維芽細胞の成長培地に加えた場合、その後でその上に重層された上皮細胞の接着が回復し、これに対して、ｒＱＳＯＸ１−ＡＡを加えた場合、上皮細胞の接着は回復しなかった。本発明者らは、ＱＳＯＸ１の細胞外触媒活性が、腫瘍細胞が有効に接着する間質層の形成を促進させ、腫瘍細胞遊走の促進がその結果として生じると結論する。
様々なラミニンが、α鎖およびβ鎖のヘテロ二量体であって、細胞−細胞および細胞−マトリックスの接着の基本的な媒介因子として働く、細胞表面の様々なインテグリンによって認識される。インテグリンα６β１が上皮細胞表面におけるラミニンのための主要な受容体であり、だが、α６β４およびα３β１もまた、ラミニンと結合することが以前に示された。ＱＳＯＸ１ノックダウンが実際に細胞接着および細胞遊走をラミニン欠損のために低下させるならば、本発明者らは、ラミニン受容体の直接の阻止が同程度の影響を有すると予想するであろう。α６阻止抗体により１時間にわたって前処理された転移性上皮細胞は、ＱＳＯＸ１ノックダウン時に観測されるのと同様な程度に、線維芽細胞およびそれらの関連ＢＭの層を通る低下した遊走を示した（図６Ｐ）。線維芽細胞分泌マットリックスに対する、抗α６処理された上皮細胞の低下した接着もまた、遠心分離細胞接着アッセイにおいて明らかにされた（図６Ｑ）。これらのデータは、ＱＳＯＸ１ノックダウン時に観測される接着および遊走の欠陥の根底にある少なくなったラミニン−インテグリン相互作用と一致している。
腫瘍上皮細胞と線維芽細胞との間でのクロストークがＱＳＯＸ１分泌を誘導し、遊走を促進させる
インビボでは、器官および血管を取り囲むＢＭに埋め込まれる線維芽細胞は、様々なシグナルを、分泌された因子を介して上皮および内皮と交換する。今回のデータは、ＱＳＯＸ１の分泌が、細胞接着、基底膜組立ておよび細胞遊走（これらのすべてが腫瘍細胞の増殖および転移を支援し得る）を促進させることを示す。上皮細胞は、ＱＳＯＸ１を分泌することが知られていないので、本発明者らは次に、腫瘍細胞が隣接の線維芽細胞を動員して、ＱＳＯＸ１の発現および分泌を誘導するかどうかを調べた。この目的のために、サブコンフルエントなＷＩ−３８細胞（これは典型的には、より低いレベルのＱＳＯＸ１を発現し、ＱＳＯＸ１を検出可能なほどに分泌しない）を、Ｈ４６０肺ガン細胞株に由来する馴化培地とともに２日間培養した。馴化培地への暴露により、線維芽細胞からのＱＳＯＸ１の分泌が高まった（図７Ａ）。この発見は、膵臓起源の線維芽細胞および上皮腫瘍細胞を用いて再現された（図７Ａ）。加えて、腫瘍細胞馴化培地との線維芽細胞のインキュベーションは、その結果としてのマトリックス横断の上皮細胞遊走を通常の培地とのインキュベーションよりも大きく促進させた（データは示されず）。
ガン患者由来の線維芽細胞のエクスビボ分析
上記の研究において、本発明者らは、細胞外ＱＳＯＸ１の役割を解明するために、ＱＳＯＸ１の発現を培養細胞においてノックダウンさせ、その後、培養培地に組換え酵素を与えた。これらの攪乱を介して、本発明者らは、ＱＳＯＸ１がＢＭにおけるラミニン集合に寄与し、また、細胞接着および細胞遊走に寄与することを発見した。腫瘍の進行および転移発達におけるＱＳＯＸ１の役割をさらに探るために、本発明者らは、エクスビボ実験系、すなわち、肺ガン患者から得られる初代線維芽細胞に向かった。外植された線維芽細胞をガン関連組織（ＣＡＦ、ガン関連線維芽細胞）から、または、隣接する健康な組織（ＮＦ、正常な線維芽細胞）から精製し、上記の「材料および実験手順」節に記載されるように維持した。１名の患者から得られる細胞のＲＮＡマイクロアレイ分析では、ＣＡＦサンプルにおけるＱＳＯＸ１転写がＮＦサンプルの場合よりも大きく、両方の細胞タイプが、増大するＱＳＯＸ１転写レベルによって腫瘍由来の馴化培地とのインキュベーションに応答することが示された（データは示されず）。さらに３名の患者についてのリアルタイムＰＣＲ分析では、ＣＡＦが一貫して、ＮＦよりも大きいレベルのＱＳＯＸ１を発現することが示された（図７Ｂ）。これらのエクスビボ線維芽細胞のウエスタンブロット分析では、ＱＳＯＸ１の分泌が転写と相関することが示された；ＣＡＦはＮＦよりも多くのＱＳＯＸ１を分泌し、ＮＦは、腫瘍の馴化培地とのインキュベーションの後での高まった分泌を示した。
乳ガン患者から取り出された腫瘍切片の免疫組織化学的染色により、エクスビボ線維芽細胞から得られる結論が確認された。最も顕著なＱＳＯＸ１染色が腫瘍の上皮細胞において明白であったが、腫瘍に隣接する線維芽細胞は、成長部からより離れた線維芽細胞よりも強いＱＳＯＸ１染色を示した（図７Ｃ〜図７Ｄ）。
細胞外ＱＳＯＸ１の阻害によるＢＭ組立ておよび腫瘍細胞遊走の制御
今回の発見は、ＱＳＯＸ１の阻害が、ＢＭ組成を制御し、それにより、腫瘍の微小環境を制御するための強力な戦略となるかもしれないことを示唆する。したがって、本発明者らは、ＱＳＯＸ１に対する様々な阻害性モノクローナル抗体を開発した（本明細書中下記の実施例２を参照のこと）。これらの抗体が、細胞がコンフルエンスに近づくにつれてＷＩ−３８線維芽細胞の成長培地に与えられたとき、より少ない細胞数が、非処理の細胞または対照抗体により処理された細胞と比較して、４日後の培養単層において認められた（図８Ａ〜図８Ｋ）。さらに、ラミニンα４鎖の劇的に減少した染色が、（下記の実施例２において記載されるように）ＱＳＯＸ１モノクローナル抗体の存在下で成長させた細胞によって産生されるＢＭにおいて認められた。最後に、上記で記載されるような、ＱＳＯＸ１のｓｉＲＮＡにより処理された細胞に対して行われるタイプの器官型侵入アッセイでは、線維芽細胞層を通る腫瘍上皮細胞遊走における大きな低下が、線維芽細胞層がＱＳＯＸ１阻害剤の存在下で生成されたときに示された。まとめると、これらの結果は、ＱＳＯＸ１酵素を発現し、分泌する細胞によって産生されるＱＳＯＸ１の阻害を使用して、ＢＭの組成および機能性を調節することができることを示す。
実施例２
ジスルフィド触媒ＱＳＯＸ１を標的とする阻害性抗体は、ジチオール／ジスルフィド中継における最初の工程を阻止することによって細胞外マトリックス形成を攪乱する
材料および実験手順
プラスミド構築
抗体産生を誘発するために使用される組換えＨｓＱＳＯＸ１は以前に記載された［Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８］。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質産生のためにコドン最適化されたｓｃＦｖおよびＨｓＱＳＯＸ１の合成遺伝子（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）をｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローン化した。アミノ末端およびカルボキシ末端のＨｓＱＳＯＸ１フラグメントの構築は以前に記載された［Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８、および、Ａｌｏｎ他（２０１０）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８４、１５２１〜１５２５］。
ＨｓＱＳＯＸ１ ３３−５４６
ヒト腎臓ｍＲＮＡに由来するＨｓＱＳＯＸ１イソ型ｂのｃＤＮＡクローン（ＩＤ４４４７６６６）をベクターｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ６においてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。所望される構築物を、シグナル配列を取り除き、かつ、ＮｄｅＩ制限部位を取り込むＮ’端側フォワードプライマー（配列番号３９）と、ＢａｍＨＩ部位が続く停止コドンを取り込むＣ’端側リバースプライマー（配列番号４０）とを用いるＰＣＲによって増幅した。
ＰＣＲ生成物およびｐＥＴ１５ｂ発現ベクターをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより制限した。ベクターをさらに子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）により処理して、５’側の隣接するリン酸を除き、かつ、ベクターの再連結を防止した。Ｈｉｓ６タグおよびトロンビン切断部位を、タンパク質に直接つながれるＨｉｓ６タグにより置き換えた。この改変を、ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩによる制限、続いてＣＩＰによって行った。ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩの制限部位と適合可能な付着末端部位をもたらす隣接ヌクレオチドを伴うＨｉｓ６をコードするオリゴヌクレオチドを煮沸し、アニーリングさせた。これらのオリゴヌクレオチドは制限されるのではなく、むしろ、酵素による制限を模倣するために設計されたので、リン酸基をアニーリング後に酵素により付加し、その後、プライマーをベクターに連結した。
最終的な発現ベクターは、配列番号６に示される配列をコードした。
組換えＨｓＱＳＯＸ１の発現および精製
マウスに注入されるＨｓＱＳＯＸ１を以前に記載されるように発現させ、精製した［Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８］。他の目的のために使用されるＨｓＱＳＯＸ１を同様に発現させ、精製し、そのアミノ末端のＨｉｓ６タグのみをＮｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製の後で切断した。溶出された酵素を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールに交換した。トロンビン（１０ユニット／ｍｇタンパク質）を加え、切断反応のために室温で一晩インキュベーションした。ＰＭＳＦを１ｍＭに加えてトロンビンを阻害し、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムに再び加えた。さらなる精製を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡにおいてサイズ排除クロマトグラフィーによって行った。
アミノ末端およびカルボキシ末端のＨｓＱＳＯＸ１フラグメントの発現および精製を以前の記載のように行った［Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８、および、Ａｌｏｎ他（２０１０）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８４、１５２１〜１５２５］。
マウス抗ＨｓＱＳＯＸ１モノクローナル抗体の作製
ハイブリドーマを以前に記載されるようなＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法によって作製した［Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．（１９７４）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７］。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（１２週齢）を、３週間間隔で４回、組換えＨｓＱＳＯＸ１および完全フロイントアジュバント（ＤｉｆｃｏＬｂｏｒａｏｒｉｅｓ）の乳濁液により免疫化した。選択されたマウスからの脾臓細胞を、以前に記載されるようにポリエチレングリコールを使用してＮＳＯ骨髄腫細胞と融合した［Ｇａｌｆｒｅ Ｇ．他（１９７７）、Ｎａｔｕｒｅ、２６６、５５０〜５５２］。ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地によって選択した。細胞の上清をＨｓＱＳＯＸ１の結合および阻害についてスクリーニングした（下記を参照のこと）。ＭＡｂ４９２．１を、ｍｉｎｉＰＥＲＭバイオリアクター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を血清非含有培地（ＤＣＣＭ）において用いて大規模で産生させた。
モノクローナル抗体の精製
血清を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に対して１００００のＭＷカットオフメンブラン（Ｔｈｅｒｍｏ）により透析し、プロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。抗体を１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３）によりカラムから溶出し、１０％の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）により直ちに中和した。
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μＬの５μｇ／ｍｌの組換えＨｓＱＳＯＸ１により、または、対照として、０．１％ｔｗｅｅｎを含有するリン酸塩緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）における５％ＢＳＡにより３７℃で１時間にわたって被覆した。ウエルを、ＲＴで１時間、ＰＢＳ−Ｔにおける５％ＢＳＡにより遮断処理した。種々のマウス抗ＨｓＱＳＯＸ１クローンおよびマウス抗ＨｓＱＳＯＸ１サブクローンを、ＲＴで１時間、ウエルに加えた。ウエルを３００μＬのＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄した。５％ＢＳＡにおける、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲート化されたポリクローナルのヤギ抗マウス抗体を１：２５００の希釈で加え、ＲＴで３０分間インキュベーションした。ウエルを３００μＬのＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄した。吸光度を、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を加えた後直ちにマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）で６３０ｎｍにおいて読み取った。
ＨｓＱＳＯＸ１阻害アッセイ
１００μＬの体積の反応を９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）で行った。還元および変性されたＲＮａｅｓＡ（Ｓｉｇｍａ）をモデル基質として使用し、下記のように調製した。１０ｍｇのＲＮａｓｅを、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）、６Ｍ ＧｕＨＣｌおよび１００ｍＭ ＤＴＴの１ｍｌに溶解し、３７℃で１時間インキュベーションした。タンパク質をＤＤＷにより平衡化されるＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩し、そのチオール含有量を４１２ｎｍにおいてＤＴＮＢ吸光度によって求めた。５０ｎＭの組換えＨｓＱＳＯＸ１および様々な濃度のモノクローナル抗体クローンをＲＴで３０分間インキュベーションした。反応を２００μＭのＲＮａｓｅチオールの添加によって開始させ、１ｍＭのＤＴＮＢにより２５分後に停止させた。吸光度をマイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおいて測定した。
可変領域の配列決定
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用しておよそ１１×１０６個の抗ＨｓＱＳＯＸ１ハイブリドーマ細胞から抽出した。５００ｎｇの総ＲＮＡを、ポリｄＴプライマーおよび２０ユニットのモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使用することによって第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。軽鎖の可変領域を、以前に記載されるような縮重プライマーを使用して増幅し［Ｂｅｎｈａｒ Ｉ．およびＲｅｉｔｅｒ，Ｙ．（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１０章、ユニット１０．１９Ｂ］、重鎖の可変領域を、以前に記載されるような、マウスｓｃＦｖレパートリークローニングのための最適化プライマーを使用して増幅した［Ｚｈｏｕ Ｈ．他（１９９４）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２、８８８〜８８９］。およそ３００ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＨｉＹｉｅｌｄ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡフラグメント抽出キット（ＲＢＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてゲル抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。挿入物を、Ｔ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを使用して配列決定し、ＩＭＧＴデータベースによって分析した。配列をタンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって確認した［Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８］。
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
１００μＬの２０μＭ ＨｓＱＳＯＸ１、そのフラグメントまたはＭＡｂ４９２．１を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡにより平衡化されるスーパーデックス２００カラム（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に１ｍｌ／分の流速で負荷した。ＨｓＱＳＯＸ１またはそのフラグメントと、ＭＡｂ４９２．１との複合体（２００μＬ）を、ＲＴでの３０分間の共インキュベーションの後で注入した。
ｓｃＦｖの発現、精製およびリフォールディング
ｓｃＦｖ４９２．１を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補充されるＬＢ培地で成長させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ株において産生させた。形質転換された細胞を３７℃で成長させ、誘導を、細胞が５９５ｎｍにおいて０．５の光学密度に達したとき、０．５ｍＭの濃度へのＩＰＴＧの添加によって行った。誘導後、細胞を２５℃で一晩成長させた。細胞を４０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離によって採取した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤が補充される２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールに懸濁した。細胞溶解物を４００００×ｇで１時間遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に溶解し、３０秒間、３回、超音波処理し、再び１０分間遠心分離した。上清を捨て、超音波処理および遠心分離の手順を３回繰り返した（ただし、最後は、ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いなかった）。ペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）、６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールに４℃で一晩溶解した。溶解されたｓｃＦｖを変性条件（６Ｍ ＧｕＨＣｌ）においてＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ｐＨ６．９とｐＨ３．８との間でのｐＨ勾配を使用して溶出した。リフォールディングを以前の記載のように行った［Ｋｏｕｈｅｉ，Ｔ．他（１９９８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１９、１１９〜１２９］。
阻害定数の決定
クラーク型酸素電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、溶存酸素濃度における変化をＨｓＱＳＯＸ１活性の尺度としてモニターした。２５ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１および様々な濃度（１〜２５０ｎＭ）の精製ＭＡｂ４９２．１を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、６５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいてアッセイした。反応を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を電極反応チャンバーにおいて２００μＭの濃度に注入することによって開始させた。測定を種々のＭＡｂ４９２．１濃度について行い、初期傾きを計算した。ＤＴＴおよびＭＡｂ４９２．１の存在に起因する酸素濃度におけるバックグラウンド低下を３回測定し、平均化し、初期傾きから差し引いて、様々なＭＡｂ４９２．１濃度におけるＨｓＱＳＯＸ１活性の速度を得た。阻害剤の存在下および非存在下におけるＨｓＱＳＯＸ１の初速度の比率を阻害剤濃度の関数としてプロットした。得られた曲線を、強固に結合する阻害剤についてのＫｉを得るために、以前に記載されるような下記の式に対して適合させた［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｊ．Ｆ．（１９６９）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｃｔａ、１８５、２６９〜２８６；Ｂｉｅｔｈ Ｊ．Ｇ．（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４８、５９〜８４］：
式中、ｖ０はＭＡｂ４９２．１の非存在下における反応の速度であり、ｖｉは種々のＭＡｂ４９２．１濃度の存在下における速度であり、［Ｅ０］は総酵素濃度（２５ｎＭ）であり、［Ｉ０］は総ＭＡｂ４９２．１濃度であり、Ｋｉが、決定されることになる阻害定数である。
ｓｃＦｖ４９２．１の阻害定数を、古典的競合阻害のための下記の式を使用して、ｒｄＲＮａｓｅの酸化に基づく比色アッセイによって得られるＩＣ５０値から計算した：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［Ｓ］０／Ｋｍ）。
式中、［Ｓ］０は初期基質濃度であり、ＫｍはｒｄＲＮａｓｅについてのＨｓＱＳＯＸ１のミカエリス定数であり、この場合には３２０±３５μｍである。
ＭＡｂ４９２．１Ｆａｂ−ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ複合体の精製および結晶化
ＰＢＳにおいて１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮された精製ＭＡｂ４９２．１を、活性化パパインを１：２０のパパイン：ＭＡｂ４９２．１の比率で使用して３７℃で消化した。パパイン（Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ、２０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、２０ｍＭシステインにより活性化した。消化を、ロイペプチンを阻害剤として使用して４時間後に停止させ、消化された抗体をＰＢＳ（ｐＨ８）に対して透析した。ＭＡｂ４９２．１のＦａｂフラグメント（Ｆａｂ４９２．１）をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、続いて、プロテインＧ精製を行った。精製Ｆａｂ４９２．１を２倍過剰のＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘと４℃で１時間インキュベーションし、複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して１１ｍｇ／ｍｌの濃度で単離した。結晶を、１９％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（４ｋＤ）、０．４Ｍ二塩基性リン酸アンモニウムを含有するウエル溶液の上方における２９３Ｋでの懸滴蒸気拡散によって成長させた。結晶を、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ（４ｋＤ）、２５％のグリセロール、０．３５Ｍ二塩基性リン酸アンモニウムを含有する溶液に移し、急速冷凍した。
データ収集
回折データを、ＲａｘｉｓＩＶ＋＋イメージプレートシステムおよびＯｓｍｉｃミラーを備えるＲＵ−Ｈ３Ｒ発生装置（Ｒｉｇａｋｕ）で１００Ｋにおいて収集した。データを、ａ＝ｂ＝２０９．３１１Å、ｃ＝５５．２６５Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の単位格子定数を有する空間群Ｐ６１の結晶から２．７Åの分解能になるまで収集した。データを、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを使用して処理し、スケール化した。
構造解
構造を、Ｐｈａｓｅｒを使用する分子置換（ＭＲ）によって決定した。最初に、ＨｓＱＳＯＸＴｒｘの構造を検索のために使用し、回転および並進の好適な解を見出した。その後、７５％の配列同一性を有するＦａｂ構造の定常領域（ＰＤＢコード、３ＯＫＤ）を検索モデルとして使用し、最終的には、同じＦａｂモデルからのＣＤＲループを有しない可変領域を検索した。精密化を、ＣＮＳを使用して行い、モデル再構築を、Ｃｏｏｔを使用して行った。構造の検証を、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹを使用して行い（それに従えば、ラマチャンドラン異常値が全く存在しなかった）、構造モデルをその分解能範囲において上位９５％で評価した。
細胞侵入アッセイ
ＷＴ−３８線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、８．０μｍの細孔サイズの膜挿入物を有する２４ウエルのＢＤ ＢｉｏＣｏａｔプレートの上部チャンバーに播種し、種々のＭＡｂ４９２．１濃度または抗βアクチン（対照抗体）の存在下でコンフルエンスに到達させるために４日間にわたって成長させた。４日目に、５×１０４個のＨ４６０ヒト肺ガン上皮細胞（製造者の説明書に従って細胞追跡色素ＣＳＦＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により事前に標識されたもの）を線維芽細胞の上に重層した。内側チャンバーを血清非含有の最少必須培地（ＭＥＭ）で満たし、外側チャンバーを、１０％のウシ胎児血清を含有するＭＥＭで満たした。標識されたＨ４６０細胞を、３７℃で２４時間、膜を越えて遊走させた。非侵入細胞を膜の上部面から手でかき取り、捨て、下部面の侵入細胞を３．７％ホルムアルデヒドにおいて固定処理し、画像化し、定量化した。
異種移植実験におけるインビボでのＨｓＱＳＯＸ１阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ乳ガン腫瘍細胞を以前に記載されるように成長させた［Ｇｏｌｄｓｈａｉｄ，Ｌ．他（２０１０）、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：Ｒ２９］。ＧＦＰ−ｈＴｅｒｔ−ＷＩ−３８肺線維芽細胞を、１５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸Ｎａおよび抗生物質が補充されるＭＥＭ培地において成長させた。
２６匹のメスのＣＤ−１ヌードマウス（６週齢）を６つの群に分け（本明細書中下記の表６を参照のこと）、施設内動物管理使用の指示に従って収容し、取り扱った。実験手順がＷｅｉｚｍａｎ科学研究所（レホヴォト、イスラエル国）の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
実験を開始するために、３つの群のマウスには、１０７個の採取された線維芽細胞および１０６個の採取された腫瘍細胞の、５０μＬのＰＢＳに懸濁された混合物を左側下部の乳房脂肪パッドに注入した。２つの他の群には、腫瘍細胞のみを同様に注入した。注入後４日で、ＭＡｂ４９２．１による処置を開始した。ＭＡｂ４９２．１の様々な投薬量（本明細書中下記の表６を参照のこと）を２００μＬのＰＢＳにおいて調製し、週に２回、静脈内（ＩＶ）に投与した。細胞注入の１週間後、マウスを、ルシフェリン生物発光を使用して、局在化した腫瘍の形成を確認するために、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳＲ１００／ＸＦＯ−１２、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、アラメダ、カリフォルニア、米国）で画像化した。画像化の前に、マウスには、１．５ｍｇのＤ−ルシフェリンの腹腔内（ＩＰ）注射が施され、８５：１５のケタミン：キシラジンの５０μＬの混合物の注入によって麻酔が施された。細胞注入の５週間後、マウスを記載されるように麻酔し、膝窩リンパ節および腋窩リンパ節における転移を特定するために蛍光顕微鏡下で画像化した。動物を実験開始後５週間でペントバルビタールにより屠殺した。
ＭＡｂ４９２．１特異性アッセイ
哺乳動物ＱＳＯＸ１酵素のＭｍＱＳＯＸ１（野生型および３つの変異体）、ＣｐＱＳＯＸ１およびＲｎＱＳＯＸ１を、（上記で記載されるような）ＨｓＱＳＯＸ１の場合のようにクローン化し、発現させ、精製した。５０ｎＭにおけるこれらの酵素の活性を、（上記で記載されるような）酸素消費アッセイおよび基質としての２００μＭのＤＴＴを使用して評価した。２５０ｎＭまたは１μＭのＭＡｂ４９２．１の存在下における活性も同様に測定し、ＭＡｂ４９２．１の非存在下における活性と比較した。
ＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘの精製および結晶化
ＭｍＱＳＯＸ１ＴｒｘをＨｓＱＳＯＸ１の場合のようにクローン化し、発現させた。精製を、下記の点を除いて、ＨｓＱＳＯＸ１の精製と同様に行った：Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを、結合については２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールにおいて行い、溶出については２５０ｍＭイミダゾールにおいて行った。溶出された酵素をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに直ちに負荷し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌにおいて精製した。結晶を、７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧモノメチルエーテル（２ｋＤ）、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、５％ＤＭＳＯを含有するウエル溶液の上方における２９３Ｋでの懸滴蒸気拡散によって成長させた。液滴におけるタンパク質濃度が１３ｍｇ／ｍｌであり、液滴には、０．４ｍｇのタンパク質あたり１ユニットのトロンビンが補充された。結晶を、１５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧモノメチルエーテル（２ｋＤ）、２５％グリセロール、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）を含有する溶液に移し、急速冷凍した。
ＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘのデータ収集および構造解
回折データを、ＲａｘｉｓＩＶ＋＋イメージプレートシステムおよびＯｓｍｉｃミラーを備えるＲＵ−Ｈ３Ｒ発生装置（Ｒｉｇａｋｕ）において１００Ｋで収集した。データを、ａ＝４２．４８Å、ｂ＝１１６．３８Å、ｃ＝５０．０２Å、α＝γ＝９０°、β＝１０３．１°の単位格子定数を有する空間群Ｐ２１の結晶から２．０５Åの分解能になるまで収集した。データを、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを使用して処理し、スケール化した。ＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造を、ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造を検索モデルとして使用してＭＲによって決定した。精密化を、ＣＮＳを使用して行い、モデル再構築を、Ｃｏｏｔを使用して行った。構造の検証を、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹを使用して行い（それに従えば、ラマチャンドラン異常値が全く存在しなかった）、構造モデルをその分解能範囲において上位７０％で評価した。
結果
ＨｓＱＳＯＸ１と結合し、これを阻害する抗体クローンの選択
細菌において産生される組換えヒトＱＳＯＸ１（以降、ＨｓＱＳＯＸ１として示される）［Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８］を、マウスにおける抗体産生を誘発させるために使用し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの上清を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用してＨｓＱＳＯＸ１の結合についてスクリーニングした。スクリーニングされたおよそ５００個のクローンのうち、上位５個の結合体をサブクローニングのために選んだ。これらのサブクローンのそれぞれをＥＬＩＳＡによって結合について試験した。およそ３０個のサブクローンを阻害アッセイのために選んだ。
阻害を、インビトロ・スルフヒドリルオキシダーゼ活性アッセイを使用して試験した。抗体の減少を避けるために、穏和な還元性基質、すなわち、還元および変性させたＲＮａｓｅＡ（ｒｄＲＮａｓｅ）を最初に選んだ。ｒｄＲＮａｓｅを高濃度の様々な精製抗体サブクローンの存在下におけるＨｓＱＳＯＸ１による酸化に供し、所定期間の後に残っているチオール基を５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）との反応によって定量した。高いＤＴＮＢ反応性は反応終了時の溶液における高濃度のチオール基の存在を示した。このことは、ＨｓＱＳＯＸ１の阻害を示していると解釈された。１つの特定のクローンに由来する抗体サブクローンが、良好なＨｓＱＳＯＸ１阻害をこのアッセイにおいて示した。ＩｇＧ１イソ型であると分類される１つのサブクローン、すなわち、ＭＡｂ４９２．１をさらなる研究のために選択した。
阻害定数の決定
ＨｓＱＳＯＸ１の阻害をＭＡｂ４９２．１の様々な濃度で調べた。ＤＴＮＢアッセイが２５０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１とともに最初に用いられたとき、２４０±３０ｎＭのＩＣ５０が認められた。この値は、アッセイにおける酵素濃度に密接に対応するので、アッセイの条件のもとでのＭＡｂ４９２．１によるＨｓＱＳＯＸ１のほぼ化学量論的な結合および有効な阻害を示唆した。ＨｓＱＳＯＸ１濃度が５０ｎＭに下げられたとき、６０±１０ｎＭのＩＣ５０が認められた（図１５Ａ）。再度ではあるが、この値は酵素濃度とほぼ等しく、このことは堅固な結合および有効な阻害をさらに裏づけている。より低い酵素濃度および抗体濃度を、溶存酸素がＨｓＱＳＯＸ１によって過酸化水素に還元されるときの溶存酸素の低下速度をモニターする酸素消費アッセイを使用して詳しく調べた。このアッセイは、単に活性の程度だけでなく、初期速度の直接的な決定を可能にする。強い還元剤、すなわち、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）がこの実験における電子供与体として使用されたにもかかわらず、抗体の一体性を保つＤＴＴ濃度が選ばれた（図１５Ｃ）。反応速度を、２５ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１および様々な濃度のＭＡｂ４９２．１を使用する実験から計算した。結果を、強固に結合する阻害剤についてのモデルに対して適合させることにより、１．０±０．３ｎＭの見かけの阻害定数が得られた（図１５Ｂ）。ＭＡｂ４９２．１はアミノ末端のＴｒｘ１ドメイン（図１Ａ）においてＨｓＱＳＯＸ１と結合し、レドックス活性なジシステインモチーフの活性部位への基質の接近を妨げる。このことは、ＭＡｂ４９２．１が競合的阻害剤であることを示している。競合的阻害剤の存在下における反応速度は典型的には、基質濃度とともに変化し、したがって、見かけのＫｉは実際のＫｉを必ずしも表していない。それにもかかわらず、ＭＡｂ４９２．１による阻害は基質濃度に無関係であった（図１５Ｄ）。このことは、ＭＡｂ４９２．１−ＨＱＳＯＸ１複合体の解離が実験の時間枠に対して遅く、基質によって誘導されないことを暗示している。これらの条件のもとでは、見かけの阻害定数が実際の阻害定数になる。
ＨｓＱＳＯＸ１における抗体結合部位の決定
トリＱＳＯＸの限定されたタンパク質分解が２つの安定なフラグメントをもたらすことが以前に認められた。類似する観察が哺乳動物のＱＳＯＸ１酵素についてなされ、ヒトＱＳＯＸ１の２つのフラグメント、すなわち、ＨｓＱＳＯＸ１ＴｒｘおよびＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖの構造（図１Ａ〜図１Ｂ）が、Ｘ線結晶学を使用して以前に決定されている［Ａｌｏｎ Ａ．他（２０１０）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８４、１５２１〜１５２５；Ａｌｏｎ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ、４８８、４１４〜４１８］。ＭＡｂ４９２．１のための結合部位がＨｓＱＳＯＸ１ＴｒｘまたはＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖに存在するかどうかを明らかにするために、本発明者らはこれら２つのフラグメントのそれぞれを細菌において産生させ、２つの相補的な結合アッセイを行った。第１のアッセイにおいて、ＨｓＱＳＯＸ１ＴｒｘまたはＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖに対するＭＡｂ４９２．１の結合をＥＬＩＳＡによって完全長ＨｓＱＳＯＸ１に対する結合と比較した。ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ（これはＴｒｘ１ドメインおよびＴｒｘ２ドメインを含有する）は、完全長ＨｓＱＳＯＸ１が結合したのと同じ程度にＭＡｂ４９２．１と結合した（図１６Ａ）。他方で、ＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖは、試験されたどの濃度においても、ＭＡｂ４９２．１と結合しなかった。第２の結合アッセイでは、サイズ排除クロマトグラフィーが使用された。ＨｓＱＳＯＸ１、ＨｓＱＳＯＸ１ＴｒｘおよびＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖの遊走プロフィルをＭＡｂ４９２．１の存在下および非存在下において測定した。ＨｓＱＳＯＸ１およびＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘの両方の遊走プロフィルがＭＡｂ４９２．１とのインキュベーションの後では変化し、しかし、ＨｓＱＳＯＸ１Ｅｒｖの遊走は影響を受けず（図１６Ｂ〜図１６Ｄ）、このことから、ＭＡｂ４９２．１がＨｓＱＳＯＸ１のアミノ末端部分に結合するという結論が確認された。
ＭＡｂ４９２．１抗体クローンの配列決定および単鎖可変フラグメントの構築
ＭＡｂ４９２．１の配列をハイブリドーマクローンからの逆転写およびＰＣＲによって決定した。軽鎖の可変領域が比較的小さい一組の縮重プライマーにより増幅された。対照的に、重鎖の可変領域は、同程度のプライマーミックスを使用して増幅することができず、このことは、以前に認められた、重鎖を増幅することが比較的困難であったことと一致していた。したがって、ＭＡｂ４９２．１の重鎖を、マウスｓｃＦｖレパートリークローニングのための最適化プライマーを使用して増幅した。それぞれの増幅フラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローン化し、配列決定した。これらの配列（下記の表３を参照のこと）を、以前に記載されるように［Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．他（２００４）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３、５９３〜５９７］、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベースに付随するツールを使用して分析し、これらの配列は、生産的に再構成された配列であることが確認された。可変領域は、９４％を超える同一性を、マウスにおいて産生される抗体の可変領域についてのデータベース登録物に対して示した。これらの配列はまた、精製ＭＡｂ４９２．１のタンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって確認された（下記の表３を参照のこと）。
ＭＡｂ４９２．１の軽鎖配列および重鎖配列を上記の「材料および実験手順」節で記載されるように得た。ＤＴＴによる処理の後でのＭＡｂ４９２．１はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２つのバンドを呈示し、上側バンドが重鎖に対応し、下側バンドが軽鎖に対応した。バンドをトリプシンまたはキモトリプシンおよびＡｓｐＮによりゲル内で消化した。表は、トリプシンによる切断またはキモトリプシンおよびＡｓｐＮによる切断の後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって少なくとも１回は検出される代表的なペプチドを呈示する。
ＭＡｂ４９２．１から特定された可変領域を使用して、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を構築した。このｓｃＦｖは、アミノ末端における重鎖可変ドメイン、カルボキシ末端における軽鎖可変ドメイン、および、それらをつなぐ［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３のリンカーから構成された。このｓｃＦｖをコードする配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化し、トロンビンにより切断可能なＨｉｓ６タグをアミノ末端に有する発現ベクターにクローン化した。精製されたｓｃＦｖ（これはｓｃＦｖ４９２．１として示される）を細菌における産生の後で封入体から得て、機能的な材料を得るためにリフォールディングした。リフォールディングされたｓｃＦｖ４９２．１をｒｄＲＮａｓｅの酸化に基づく比色アッセイにおいて試験し、このｓｃＦｖ４９２．１は、５０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１を２５０±３０ｎＭのＩＣ５０により阻害することが示された（図１７）。ｓｃＦｖ４９２．１は競合阻害剤であるので、１３０±２０ｎＭの阻害定数をこのＩＣ５０値から直接計算することができた。ｓｃＦｖ４９２．１はおそらくは、ＭＡｂ４９２．１と同じ部位においてＨｓＱＳＯＸ１と結合し、これにより、基質の酸化を妨げ、しかし、５倍の過剰が、ＨｓＱＳＯＸ１を同じ実験条件のもとで阻害するために必要とされるので、強固な結合阻害剤であると見なすことができない。
ＨｓＱＳＯＸ１における抗体結合部位の決定
ＭＡｂ４９２．１に由来するＦａｂフラグメントをＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘとの共結晶化のために調製した。Ｆａｂをパパイン消化によって精製ＭＡｂ４９２．１から生じさせた。ＦａｂがＨｓＱＳＯＸ１と結合し、これを阻害する能力を、ｒｄＲＮａｓｅの酸化に基づく比色アッセイにより試験した。Ｆａｂ４９２．１は、５０ｎＭのＨｓＱＳＯＸ１を１００±２０ｎＭのＩＣ５０により阻害することが見出され（図１８）、これは、完全長ＭＡｂ４９２．１について見出されるＩＣ５０値の２倍であった。ＭＡｂ４９２．１のアビディティーはＦａｂフラグメントのアビディティーの２倍であった。このことは、Ｆａｂ４９２．１が、強固な結合挙動を維持することを示している。
ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ−Ｆａｂ４９２．１複合体の構造を２．７Åの分解能になるまで決定した（下記の表４を参照のこと）。結晶構造により、Ｆａｂ４９２．１がアミノ末端ドメインのＴｒｘ１（図１９Ａ）を認識することが明らかにされた。具体的には、Ｆａｂ４９２．１は活性部位と結合し、これにより、ＣＸＸＣモチーフと、このモチーフを取り囲む広い表面区域とを覆う。境界面積が、９４８．７Å２であると計算された。６つすべてのＣＤＲが結合に関与する（図１９Ｂ）。重鎖が、３つすべてのＣＤＲを使用してＣＸＸＣモチーフを覆うことを含めて相互作用のほとんどに関わっている（図２０Ｂおよび下記の表５）。軽鎖はＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ−Ｆａｂ４９２．１境界の４０％（４０７．６Å２）に関わっており、ベータシートをＴｒｘ１ドメインのｃ末端ヘリックスとつなぐループにおいて活性部位から離れている広い表面区域と結合する（図１９Ｃ）。この領域は、活性部位を含有する、重鎖が結合する表面を伴う連続した表面をもたらす。軽鎖は疎水性相互作用および水素結合のネットワークによりＴｒｘ１と結合し（図２０Ａおよび下記の表５）、これにより、活性部位に対する重鎖の配向をおそらくは安定化させると思われる。Ｆａｂ４９２．１と複合体化しているＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造は、複合体化していないＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造からのずれをほとんど示さなかった。このことは、ＭＡｂ４９２．１はＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造を乱すのではなく、単に活性部位への基質の接近を遮断することを示している。
括弧内の値は最高分解能最外殻についてである。
ａＲｓｙｍ＝ΣｈｋｌΣｉ｜Ｉｉ（ｈｋｌ）−＜Ｉ（ｈｋｌ）＞｜／ΣｈｋｌΣｉＩｉ（ｈｋｌ）、式中、Ｉｉ（ｈｋｌ）は実測による強度であり、＜Ｉ（ｈｋｌ）＞はｉ個の実測値についての平均強度である。
ｂＲｗｏｒｋ、Ｒｆｒｅｅ＝Σ｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／Σ｜Ｆｏｂｓ｜、式中、ＦｏｂｓおよびＦｃａｌｃはそれぞれ、実測による構造因子および計算による構造因子である。一組の反射（６．８％）が精密化から除外され、また、Ｒｆｒｅｅを計算するために使用された。
間質を通過する腫瘍細胞遊走についての共培養アッセイにおけるＨｓＱＳＯＸ１阻害
ＭＡｂ４９２．１を、腫瘍細胞侵入を支援するＥＣＭ層の線維芽細胞による産生を阻害するその能力について試験した。器官型侵入アッセイを、最初にＷＩ−３８線維芽細胞がコンフルエンスになり、ＥＣＭを種々のＭＡｂ４９２．１濃度の存在下において４日間にわたって蓄積することを可能にすることによって行った。対照のために、βアクチンについての抗体を加えた。その後、蛍光標識されているＨ４６０肺腫瘍細胞を線維芽細胞の上に置床した。２４時間後、それぞれのサンプルにおいて線維芽細胞層および関連ＥＣＭを突き抜けた細胞を計数した（図２１Ａ〜図２１Ｏおよび図２２）。２５０ｎＭおよび５００ｎＭのＭＡｂ４９２．１により処理されるサンプルは、非処理のサンプルよりも少ない腫瘍細胞侵入を示し、このことから、ＭＡｂ４９２．１は細胞培養において腫瘍細胞遊走を遮断することができることが明らかにされた。５０ｎＭのＭＡｂ４９２．１により処理されるサンプルは腫瘍細胞侵入において差を示さず、このことは、アッセイにおけるＨｓＱＳＯＸ１濃度が、決定された阻害定数に基づいて約５０ｎＭ以下であったことを示している。
転移の防止または軽減のための異種移植実験におけるインビボでのＨｓＱＳＯＸ１阻害
インビボでのＨｓＱＳＯＸ１阻害がＢＭ組成を調節することができ、かつ、腫瘍細胞遊走を防止することができること、遅らせることができること、または除くことができることを明らかにするために、腫瘍細胞および腫瘍関連線維芽細胞の両方を取り込む動物モデルが必要であった。ＭＡｂ４９２．１は、ＨｓＱＳＯＸ１に対する大きい特異性を示し（データは示されず）、これにより、ＱＳＯＸ１が動物の線維芽細胞から分泌されるときにおけるＱＳＯＸ１阻害をインビボで研究する選択肢がなくなった。この障害を克服するために、ある種からの生細胞を別の種に移植することを伴う異種移植アッセイをヌードマウス（胸腺の非存在または欠陥に起因する抑制された免疫系を有するマウス）に対して行った。種々の組成の細胞注入液および種々の処置（これらは本明細書中下記の表６にまとめられる）を、３匹〜５匹のメスのヌードマウスをそれぞれが含む６つの群に施した。
ヒト線維芽細胞と一緒でのヒト乳ガン細胞の混合物を３つの群のマウスの乳房脂肪パッドに注入した。２つの群は、転移成長が、分泌されたＨｓＱＳＯＸ１によって支援され、腫瘍そのものに局在化する細胞内ＨｓＱＳＯＸ１によって支援されないことを確認するために乳ガン細胞のみを受けた。最後の群には、健康な動物に対するＭＡｂ４９２．１の影響を調べるために、どのようなヒト細胞も移植されなかった。使用されたヒト不死化線維芽細胞がＧＦＰ−ｈＴＥＲＴ−ＷＩ−３８線維芽細胞であった。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）およびルシフェラーゼを含有するＭＡＤ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞が腫瘍細胞として使用された。ルシフェラーゼ（これはルシフェリンに作用して、光を生じさせる）の発現により、腫瘍細胞遊走を実験の経過期間中において生物発光画像化によってモニターすることが可能になる。重要なことに、生物発光画像化は組織における大きいシグナル対ノイズ比を有しており、放射されたシグナルを生きている動物において非浸襲的に検出することができる。１週間後に乳房脂肪パッドに局在化する腫瘍の形成が、ルシフェリンの生物発光を使用して確認された（図２３）。細胞接種後４日で、数群のマウス（本明細書中下記の表６を参照のこと）が、ＭＡｂ４９２．１の処置を異なる投薬量で受け始めた。細胞注入後５週間で、腋窩リンパ節および膝窩リンパ節への転移進行をガン性細胞から放射される蛍光によって評価した（本明細書中下記の表６を参照のこと）。
残存する動物は２つの大きな傾向を示した。第１に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ガン細胞をヒト線維芽細胞と一緒に受けた動物は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のみを受ける動物が発達させたよりも多い転移を生じさせる、より大きい腫瘍を発達させた。この観測結果は、腫瘍関連線維芽細胞から分泌される間質成分がガンの進行のために必須であるという既に立証された考えを強固にした。観測された第２の影響が、線維芽細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の両方を受けた動物の中で、より大きいＭＡｂ４９２．１投薬量（すなわち、３０ｍｇ／ｋｇ）により処置された動物は、処置を何ら受けなかったか、または、より低い投薬量を受けた動物と比較して、ガン性細胞によるリンパ節浸潤がより少なかった（本明細書中下記の表７を参照のこと）。ＭＡｂ４９２．１の投薬量および投薬様式はさらに最適化される場合がある。
重要なことに、ＭＡｂ４９２．１注射を受けたが、細胞を全く受けなかった３匹の動物は、異常な挙動を実験期間中に何ら示さず、また、炎症の徴候が剖検において何ら認められなかった。予想されたように、ＭＡｂ４９２．１は観察可能な副作用を何ら有しなかった。
ＨｓＱＳＯＸ１に対するＭＡｂ４９２．１の特異性
ＭＡｂ４９２．１の阻害活性を、その特異性を調べるために他の哺乳動物ＱＳＯＸ１酵素に対して試験した。組換えハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＱＳＯＸ１（ＭｍＱＳＯＸ１）は、組換えＨｓＱＳＯＸ１に対する７９％の配列同一性を有する。酸素消費アッセイは、ＭＡｂ４９２．１が、マイクロモル濃度でさえ、ＭｍＱＳＯＸ１に対する影響を何ら有しないことを示した（図２４）。ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のＱＳＯＸ１（ＲｎＱＳＯＸ１）およびモルモット（Ｃａｖｉｓ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）由来のＱＳＯＸ１（ＣｐＱＳＯＸ１）はともに、ＨｓＱＳＯＸ１に対する７９％の配列同一性を有しており、それらの活性もまた、ＭＡｂ４９２．１によって影響されなかった（図２４）。ＨｓＱＳＯＸ１のＴｒｘ１ドメイン配列と他のＱＳＯＸ１酵素の対応する領域とのアライメントにより、ＣＧＨＣのレドックス活性モチーフの近傍における配列が同一であることが示される（図２５を参照のこと）。しかしながら、抗体の軽鎖およびＣＤＲのＨ３配列が結合するＨｓＱＳＯＸ１の領域（ＨｓＱＳＯＸ１１０６−１５２）では、他のＱＳＯＸ１酵素と比較して、少しの違いが明らかにされる（図２５）。特に、Ｐｒｏ１１６（これは、ＭＡｂ４９２．１の疎水性のＣＤＲ Ｌ３の側鎖の間における溝に十分にはまる）が、他の哺乳動物ＱＳＯＸ１酵素ではアラニンにより置換される。配列の違いを示すもう１つの領域が、ＨｓＱＳＯＸ１に由来するＶ１３５−Ｖ１３８であり、これはＭｍＱＳＯＸ１におけるＴｈｒ１３８−Ｇｌｙ１４１に対応する。
アミノ酸配列におけるこれらの違いがどのようにＱＳＯＸ１オルソログの構造に影響を及ぼすかを明らかにするために、ＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘを結晶化し、その構造を解明した。２つのＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘ分子が非対称ユニットに存在した。ＨｓＱＳＯＸ１Ｔｒｘ−Ｆａｂ４９２．１複合体の構造をＰｒｏ１１６の近傍においてＭｍＱＳＯＸ１Ｔｒｘの構造（図２６）と比較することにより、Ｐｒｏ１１６に取って代わるアラニン残基は、ＭｍＱＳＯＸ１とＦａｂ４９２．１との間での仮想的な複合体における疎水性の溝を、Ｐｒｏ１１６が満たすのと同様には満たすことができないことが示される。加えて、アラニンによるプロリンの置換は、（ＨｓＱＳＯＸ１に由来するＡｓｎ１１４に対応する）ＭｍＱＳＯＸ１に由来するＡｓｎ１１７の近くでの骨格の位置およびＡｓｎ１１７の回転異性体に影響を及ぼす。したがって、衝突が、ＭｍＱＳＯＸ１のＡｓｎ１１７と、ＣＤＲのＬ３に由来するＴｙｒ９２との間で予想される（図２６、右）。加えて、ＭｍＱＳＯＸ１分子の一方に由来するＴｈｒ１３８−Ｇｌｙ１４１のループが、ＨｓＱＳＯＸ１に由来する対応するＶ１３５−Ｖ１３８のループよりも、ＣＤＲのＨ３に由来するＴｙｒ１００に近づく（図２６、左）。
ＨｓＱＳＯＸ１を別個の位置で模倣する３つのＭｍＱＳＯＸ１変異体を上記の観察結果に基づいて構築した。ＭＡｂ４９２．１による阻害を、ＭＡｂ４９２．１−ＭｍＱＳＯＸ１複合体形成を妨げる残基を特定するためにこれらの変異体について試験した。第１の変異体（ＭｍＱＳＯＸ１ Ａ１１９Ｐ）の活性は約４０％の活性をＭＡｂ４９２．１の存在下で示した（図２７）。第２の変異体、すなわち、ＭｍＱＳＯＸ１ ＴＬＰＧ（１３８−１４１）ＶＦＰＶ（これは以降、ＴＬＰＧ変異体と名づけられる）は、約５０％の活性をＭＡｂ４９２．１の存在下で示し、第３の変異体（これは、述べられた両方の変異を含む）は、ＨｓＱＳＯＸ１と同じ程度にＭＡｂ４９２．１によって阻害された。これらの結果から、ほんの少数の残基（変異させられた４個まで）により、ＭｍＱＳＯＸ１と比較して、ＨｓＱＳＯＸ１に対するＭＡｂ４９２．１の特異性が決定されることが確認される。
これらの観察結果に基づいて、ＭｍＱＳＯＸ１および潜在的には他の哺乳動物ＱＳＯＸ１オルソログを阻害するＭＡｂ４９２．１変化体の作製が、抗体のＣＤＲまたは周囲領域の少数の変異に基づいて可能である。ＭｍＱＳＯＸ１を阻害する抗体をもたらし得るＭＡｂ４９２．１における変異についての示唆（が下記の表８に列挙される）。これらの変異の組合せもまた用いられるかもしれない。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。

Claims (56)

  1. 基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げる方法であって、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記基底膜におけるラミニン集合を阻害するか、または妨げることを含む方法。
  2. ラミニン含有基底膜を介する細胞遊走を阻害する方法であって、組織を、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因と接触させ、それにより、前記ラミニン含有基底膜を介する前記細胞遊走を阻害することを含む方法。
  3. 前記細胞は腫瘍細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記組織は腫瘍組織である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記組織は線維芽細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記方法はインビボで行われる、請求項１または２に記載の方法。
  7. ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置の必要のある対象において処置する方法であって、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因の治療有効量を前記対象に投与し、それにより、前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を前記対象において処置することを含む方法。
  8. ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を処置の必要のある対象において処置するために特定される医薬を製造するための、ＱＳＯＸ１の活性または発現を阻害する作用因の治療有効量の使用。
  9. 前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は腫瘍である、請求項７に記載の方法、または請求項８に記載の使用。
  10. 前記腫瘍は転移性固形腫瘍である、請求項９に記載の方法または使用。
  11. 前記腫瘍は腺ガンである、請求項９に記載の方法または使用。
  12. 前記腫瘍は、前立腺ガン、肺ガン、乳ガン、子宮頸ガン、尿膜管ガン、膣ガン、結腸ガン、食道ガン、膵臓ガン、咽頭ガン、胃ガンおよび骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項９に記載の方法または使用。
  13. 前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態は線維症に関連する、請求項７に記載の方法、または請求項８に記載の使用。
  14. 前記ラミニンはアルファ４鎖を含む、請求項１，２もしくは７に記載の方法、または請求項８に記載の使用。
  15. 前記ラミニンはラミニン−４１１またはラミニン−４２１である、請求項１，２もしくは７に記載の方法、または請求項８に記載の使用。
  16. 前記作用因はポリペプチド作用因である、請求項７に記載の方法、または請求項８に記載の使用。
  17. 前記ポリペプチド作用因は、抗体、抗体フラグメントまたはペプチドからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法または使用。
  18. 前記ポリペプチド作用因は前記ＱＳＯＸ１のアミノ酸座標３４〜２６６に対して向けられる、請求項１６に記載の方法または使用。
  19. 前記抗体はＭＡｂ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１７に記載の方法または使用。
  20. 前記抗体フラグメントはｓｃＦＶ４９２．１であり、配列番号２９〜３４である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１７に記載の方法または使用。
  21. 前記作用因はポリヌクレオチド作用因である、請求項７に記載の方法、または請求項８に記載の使用。
  22. 前記ポリヌクレオチド作用因は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイムおよびＤＮＡザイムからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法または使用。
  23. ＱＳＯＸ１と特異的に結合し、かつ、細胞遊走を支援する基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１活性を阻害する、抗原認識ドメインを含む単離された抗体。
  24. 前記活性が、細胞外マトリックスの免疫蛍光（ＩＦ）染色アッセイ、または、可溶性ラミニンについて検出するウエスタンブロットアッセイのうちの少なくとも１つによってアッセイされる、請求項２３に記載の単離された抗体。
  25. 前記抗体は抗体フラグメントである、請求項２３に記載の単離された抗体。
  26. 前記抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項２３に記載の単離された抗体。
  27. 前記ＱＳＯＸ１はヒトＱＳＯＸ１である、請求項２３に記載の単離された抗体。
  28. 前記ＱＳＯＸ１はマウスＱＳＯＸ１である、請求項２３に記載の単離された抗体。
  29. 前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の単離された抗体。
  30. 前記モノクローナル抗体はＭＡｂ４９２．１であり、かつＣＤＲ配列番号２９〜３４を含む、請求項２９に記載の単離された抗体。
  31. 前記抗体は一本鎖抗体である、請求項２３に記載の単離された抗体。
  32. 前記一本鎖抗体はｓｃＦＶ４９２．１であり、ＣＤＲ配列番号２９〜３４を含む、請求項３１に記載の単離された抗体。
  33. 前記抗体または抗体フラグメントはヒト化される、請求項２３に記載の単離された抗体。
  34. 前記抗体はキメラ抗体である、請求項２３に記載の単離された抗体。
  35. 前記抗体は固体支持体に固定化される、請求項２３に記載の単離された抗体。
  36. 前記抗体は検出可能成分に結合される、請求項２３に記載の単離された抗体。
  37. 配列番号７および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の単離された抗体。
  38. 配列番号２７および配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の単離された抗体。
  39. 有効成分として請求項２３〜２７，２９〜３４または３７〜３８に記載の単離された抗体を含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
  40. ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を妨げるか処置する必要のある対象において前記疾患または状態を妨げるか、または処置するための方法であって、前記対象に請求項３９に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
  41. ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を妨げるか処置する必要のある対象において前記疾患または状態を妨げるか、または処置するために特定される医薬を製造するための、請求項２３〜２７，２９〜３４または３７〜３８のいずれかに記載の単離された抗体の使用。
  42. 前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態が腫瘍である、請求項４０に記載の方法または請求項４１に記載の使用。
  43. 請求項２３〜２７，２９〜３４または３７〜３８のいずれかに記載の単離された抗体を包装材に詰めた状態で含み、かつ、ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態の処置において使用するために前記包装材の内部または表面において印刷で特定される製品。
  44. 請求項２３〜３４または３７〜３８のいずれかに記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  45. 配列番号２９〜３４に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＣＤＲ含有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
  46. ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を対象において診断する方法であって、
    （ａ）前記対象の生物学的サンプルを、請求項３５または３６に記載の単離されたポリペプチドとＱＳＯＸ１タンパク質との間における免疫複合体形成のために好適な条件のもとで請求項３５または３６に記載の単離されたポリペプチドと接触させること；および
    （ｂ）前記免疫複合体の形成を検出し、ただし、所定の閾値を超える前記免疫複合体の存在により、前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態が示され、それにより、前記ラミニン関連疾患またはラミニン関連状態を前記対象において診断すること
    を含む方法。
  47. 請求項２３〜３８のいずれかに記載の抗体を含む生物学的サンプルにおいてＱＳＯＸ１のレベルを検出するためのキット。
  48. ＱＳＯＸ１阻害剤を特定する方法であって、組織を試験作用因の存在下または非存在下で培養することを含み、前記試験作用因との前記培養の後での機能的基底膜における減少により、前記試験作用因が前記ＱＳＯＸ１阻害剤であることが示される方法。
  49. 機能的基底膜における前記減少は、前記基底膜でのラミニン集合における低下を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. ラミニン集合における前記低下は、前記組織での可溶性ラミニンにおける増大を含む、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記組織は組織培養物を含む、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記方法はインビボで実施される、請求項４８に記載の方法。
  53. ＱＳＯＸ１の活性レベルまたは発現レベルにおける低下をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  54. ＱＳＯＸ１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、長さが５００アミノ酸未満である単離されたポリペプチド。
  55. 配列番号６に示されるＱＳＯＸ１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  56. ＱＳＯＸ１と特異的に結合し、かつ、細胞遊走を支援する基底膜組立てを媒介することにおけるＱＳＯＸ１活性を阻害する、抗原認識ドメインを含む抗体を製造する方法であって、
    （ａ）マウスを組換えＱＳＯＸ１ポリペプチドにより免疫化する工程；
    （ｂ）ハイブリドーマを工程（ａ）の前記マウスの脾臓細胞から作製する工程であって、前記脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合することを含む工程；および
    （ｃ）陽性のハイブリドーマを選択し、それにより、前記ＱＳＯＸ１と特異的に結合する前記抗原認識ドメインを含む前記抗体を製造する工程
    を含む方法。
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