CN104411724A - 抑制静止素巯基氧化酶(qsox1)的组合物及其用途 - Google Patents

抑制静止素巯基氧化酶(qsox1)的组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

公开了抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配的方法。所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配。

Description

抑制静止素巯基氧化酶 (QSOX1) 的组合物及其用途
发明领域和背景
本发明，在其某些实施方案中，涉及QSOX1抑制剂，并且，更具体地但并非排他地涉及其治疗层粘连蛋白相关疾病的用途。
静止素巯基氧化酶1 (Quiescin sulfhydryl oxidase 1, QSOX1)是一种酶，其使用结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子以介导电子从底物蛋白质中的硫醇基对转移至分子氧，产生过氧化氢作为副产物。QSOX1与在内质网(ER)的早期蛋白质折叠中起作用的许多其他酶以及在线粒体膜间隙中介导蛋白质折叠和驻留的酶共享二硫化物形成的这一基本催化活性。然而，QSOX1是已知主要定位于分泌途径中的ER的细胞器下游并且已知经历从细胞的经调节分泌的仅有的二硫化物催化剂。QSOX1是多域蛋白，其经历一系列二巯基化物/二硫化物交换步骤，以将电子从底物硫醇传递给其FAD辅因子。该酶的两个主要的氧还活性结构域(一个与含蛋白硫醇的底物相互作用，另一个催化分子氧的还原)在反应周期期间必须改变它们的相对取向。具体地讲，氨基-末端的氧还活性二半胱氨酸基序，硫氧还蛋白-折叠(Trx)结构域(图1A-B)必须经充分地溶剂暴露，以接受来自底物蛋白的电子。然后Trx结构域必须将自身相对于产生二硫化物的ERV-折叠(Erv)结构域的氧还活性二半胱氨酸基序而遮蔽起来，以进一步传递电子(图1A-B)。来自哺乳动物和来自锥虫寄生虫的一组QSOX晶体结构说明了QSOX酶所表现出来的构象变化的性质和鉴定了允许这类重排的柔性接头。
最初发现QSOX1是在乳汁和哺乳动物精囊分泌物中作为二硫键形成的催化剂[Janolino V.G.和Swaisgood H.E. (1975) J. Biol. Chem. 250, 2532-2538]。随后经由将其在培养的肺成纤维细胞中诱导而鉴定QSOX1转录物，当所述细胞达到汇合并进入静息状态时[Coppock D.L.等人(1993) Cell Growth Differ. 4, 483-493]。QSOX1表达已经在胚胎发育期间[Portes K.F.等人(2008) J. Mol. Histol. 39, 217-225]以及在许多成体器官和组织类型中在体内已经观测到。QSOX1水平在具有高分泌能力的器官中特别高，所述器官例如肺、卵巢和子宫内膜[Musard J. F.等人(2001) Biochem. Biophys. Res. Comm. 287, 83-91]，以及胃、细支气管、唾液腺、食道、郎格罕氏胰岛、膀胱、和男女生殖系统的表面上皮层[Tury A.等人(2006) Cell Tissue Res. 323, 91-103]。QSOX1在发育中的脑中也显示出空间和时间上的复杂表达模式[Amiot C. 等人(2004) Brain Res. Mol. Brain Res. 125, 13-21]。静息成纤维细胞所产生的QSOX1显示出被分泌[Coppock D.等人(2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 269, 604-610]，并且不同体液中的巯基氧化酶活性表明QSOX1也从其他细胞类型中分泌[Janolino V.G.和Swaisgood, 出处同上]。
胞外或晚期分泌的二硫化物催化剂的目的仍然是个主要的开放性问题，并且QSOX1的天然底物仍有待鉴定。
最近几个研究人员已经将QSOX1和癌症关联起来。根据Antwi等人[Antwi K.等人(2009) J. Proteome Res. 8, 4722-4731]的教导，增加的QSOX1蛋白水平在人类患者的胰腺导管腺癌(DAP)和相关的微小转移中可见。此外，DAP患者的血清肽组的质谱研究揭示出高水平的肽，所述肽衍生自QSOX1并且明显经蛋白水解[Antwi等人(2009), 出处同上]。Katchman等人教导QSOX1促进由基质金属蛋白酶介导的胰腺肿瘤细胞的侵袭[Katchman等人(2011) Mol Cancer Res；9(12) 1621–31]。此外，在前列腺癌小鼠模型中，Nkx3.1肿瘤抑制物的功能丧失导致QSOX1产生增加[Ouyang X. 等人(2005) Cancer Res. 65, 6773-6779]。QSOX1尤其在前列腺肿瘤发生中的早期事件：前列腺增生和上皮间肿瘤(interepithelial neoplasia)中高度表达[Song H.等人(2009) Oncogene 28, 3307-3319]。
额外背景技术包括PCT申请号WO 2010/077921和WO 2010/071787。
发明概述
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配的方法，所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了抑制经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移的方法，所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的抑制QSOX1活性或表达的试剂给予所述受试者，从而在所述受试者中治疗所述层粘连蛋白相关疾病或病症。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了治疗有效量的抑制QSOX1活性或表达的试剂在制备经鉴定用于在有需要的受试者中治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的药物中的用途。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了分离的抗体，其包含抗原识别域，所述抗原识别域在介导支持细胞迁移的基膜装配中特异性地结合QSOX1和抑制QSOX1活性。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的分离的抗体和药学上可接受的载体。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了分离的多核苷酸，其包含编码互补决定区(CDR)的核酸序列，所述CDR含有具有SEQ ID NOs: 29-34所示的CDR的多肽。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了在受试者中诊断层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，包括：(a) 在适合所述分离的多肽与QSOX1蛋白之间形成免疫复合物的条件下使所述受试者的生物样品与本发明的分离的多肽接触；和(b) 检测所述免疫复合物的形成，其中所述免疫复合物的存在超过预定阈值就表明所述层粘连蛋白相关疾病，从而在所述受试者中诊断所述层粘连蛋白相关疾病或病症。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了试剂盒，用于在包含本发明抗体的生物样品中检测QSOX1水平。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了鉴定QSOX1抑制剂的方法，所述方法包括在测试试剂存在或不存在时培养组织，其中在用所述测试试剂进行培养后功能性基膜的减少就表明所述测试试剂是QSOX1抑制剂。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了分离的多肽，其包含QSOX1的氨基酸序列，所述肽长度小于500个氨基酸。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO: 6所示的QSOX1的氨基酸序列。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中预防或治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的所述药物组合物。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了所述分离的抗体在制备经鉴定用于在有需要的受试者中预防或治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的药物中的用途。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了制品，其包含分离的抗体，所述抗体被包装在包装材料中并且在所述包装材料内或上的印刷中标识为用于治疗层粘连蛋白相关疾病或病症。
依据本发明某些实施方案的一方面，提供了产生抗体的方法，所述抗体包含抗原识别域，所述抗原识别域在介导支持细胞迁移的基膜装配中特异性地结合QSOX1和抑制QSOX1活性，所述方法包括：(a) 用重组QSOX1多肽免疫小鼠；(b) 自步骤(a)的所述小鼠脾细胞产生杂交瘤，包括使所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合；和(c) 选择阳性杂交瘤，从而产生包含抗原识别域的抗体，所述抗原识别域特异性地结合QSOX1。
依据本发明某些实施方案，所述细胞是肿瘤细胞。
依据本发明某些实施方案，所述组织是肿瘤组织。
依据本发明某些实施方案，所述组织包含成纤维细胞。
依据本发明某些实施方案，所述方法在体内进行。
依据本发明某些实施方案，所述层粘连蛋白相关疾病或病症是肿瘤。
依据本发明某些实施方案，所述肿瘤是转移性实体瘤。
依据本发明某些实施方案，所述肿瘤是腺癌。
依据本发明某些实施方案，所述肿瘤选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、脐尿管癌、阴道癌、结肠癌、食道癌、胰腺癌、喉癌、胃癌和髓细胞性白血病。
依据本发明某些实施方案，所述层粘连蛋白相关疾病或病症与纤维化相关。
依据本发明某些实施方案，所述层粘连蛋白包含α4链。
依据本发明某些实施方案，所述层粘连蛋白是层粘连蛋白-411或层粘连蛋白-421。
依据本发明某些实施方案，所述试剂是多肽试剂。
依据本发明某些实施方案，所述多肽试剂选自抗体、抗体片段或肽。
依据本发明某些实施方案，所述多肽试剂针对QSOX1的氨基酸坐标34-266。
依据本发明某些实施方案，所述抗体是MAb492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。
依据本发明某些实施方案，所述抗体片段是scFV492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。
依据本发明某些实施方案，所述试剂是多核苷酸试剂。
依据本发明某些实施方案，所述多核苷酸试剂选自反义、siRNA、小RNA、核酶和脱氧核酶。
依据本发明某些实施方案，所述活性通过胞外基质的免疫荧光(IF)染色测定或检测可溶性层粘连蛋白的蛋白质印迹测定中的至少一种而测定。
依据本发明某些实施方案，所述抗体是抗体片段。
依据本发明某些实施方案，所述抗体选自Fab片段、Fv片段、单链抗体和单域抗体。
依据本发明某些实施方案，所述抗体是单克隆抗体。
依据本发明某些实施方案，所述单克隆抗体是MAb492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。
依据本发明某些实施方案，所述抗体是单链抗体。
依据本发明某些实施方案，所述单链抗体是scFV492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。
依据本发明某些实施方案，所述抗体或抗体片段是人源化的。
依据本发明某些实施方案，所述抗体是嵌合抗体。
依据本发明某些实施方案，所述抗体被固定在固体支持物上。
依据本发明某些实施方案，所述抗体连接在可检测部分。
依据本发明某些实施方案，所述分离的抗体包含SEQ ID NOs: 7和8所示的氨基酸序列。
依据本发明某些实施方案，所述分离的抗体包含SEQ ID NOs: 27和28所示的氨基酸序列。
依据本发明某些实施方案，所述功能性基膜的减少包括所述基膜中的层粘连蛋白装配的减少。
依据本发明某些实施方案，所述层粘连蛋白装配的减少包括所述组织中的可溶性层粘连蛋白的增加。
依据本发明某些实施方案，所述组织包括组织培养物。
依据本发明某些实施方案，所述方法在体内进行。
依据本发明某些实施方案，所述方法进一步包括QSOX1活性或表达水平的降低。
依据本发明某些实施方案，所述QSOX1是人QSOX1。
依据本发明某些实施方案，所述QSOX1是鼠QSOX1。
依据本发明某些实施方案，所述层粘连蛋白相关疾病或病症是肿瘤。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。虽然在本发明的实施方案的实践或测试中可以使用类似于或等效于本文描述的那些方法和材料的方法和材料，但以下将描述示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。另外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的而无意进行必要限制。
附图简述
本文仅通过举例的方式并参照附图来说明本发明的一些实施方案。现在详细地具体参照附图，需要强调的是，所示的详细情况是通过举例的方式，并且用于本发明实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，连同附图一起进行描述使本领域技术人员清楚如何实施本发明的实施方案。
在附图中：
图1A-B是示意图，描绘了HsQSOX1的结构域组织和反应周期。图1A是示意图，显示了HsQSOX1的4个结构域。氨基-末端片段HsQSOX1Trx是由2个Trx-折叠结构域组成。羧基-末端片段HsQSOX1Erv是由2个Erv-折叠结构域组成。已经失去其活性位点半胱氨酸和辅因子结合能力的简并的Erv-样巯基氧化酶模块称为"ψErv"。黄色球表示CXXC基序(氧还活性二硫化物)。3个融合六边形表示黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子，与Erv结构域结合；和图1B说明HsQSOX1所导致的底物氧化和氧还原的反应周期中的步骤。结构域在A中以相同名称和颜色表示，灰线表示Trx2结构域和ψErv结构域之间的接头。融合的黄球表示二硫键。分开的黄球表示还原的半胱氨酸。
图1C-M表示QSOX1在亚汇合的成纤维细胞中定位于高尔基体的并由汇合的成纤维细胞分泌。图1C-J是照片，显示用高尔基体-特异性抗体(p115)或ER-特异性(GRASP65)抗体(红色)和QSOX1(绿色)免疫染色的亚汇合的WI-38成纤维细胞。DAPI染色(蓝色)表示核。比例尺是10 µm；图1K是照片，表示汇合的WI-38细胞提取物(上部)和RT-PCR (底部)的蛋白质印迹，显示在这些细胞中QSOX1表达，而QSOX2不表达；图1L是照片，表示WI-38培养上清液的蛋白质印迹(上部)和细胞的RT-PCR(底部)作为汇合的函数；和图1M是柱状图，表明在加入5 mM DTT后通过氧消耗而测定的细胞培养上清液的巯基氧化酶活性。
图2A-H描绘了活性QSOX1是培养中形成密集的成纤维细胞单层所需的。图2A-D是照片，显示用对照(siCONTROL)或QSOX1-特异性(siQSOX1) siRNA转染后4天，WI-38培养单层的DAPI染色。图2C-D描绘了在siRNA转染后24小时，培养物用补充有50 nM重组QSOX1 (rQSOX1)或无活性突变体(rQSOX1-AA)的siQSOX1处理。比例尺是10 µm；图2E是柱状图，表明图2A-D所示的视野中的细胞数量的定量测定；图2F是QSOX1的结构域组织和结构的示意图，其中氧还活性二硫化物显示为成对黄色球，标记为“CXXC”。黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子用融合的六边形(上)或橙色条(下)指示。锯齿状垂直线代表可变剪接事件，其产生QSOX1的可溶性或膜结合的形式。“TM”代表跨膜区。重组QSOX1跨越所有QSOX1结构域和氧还活性位点。rQSOX1-AA突变体缺乏氨基-末端氧还活性半胱氨酸；和图2G-H是柱状图，显示QSOX1敲减(knockdown)导致细胞从组织培养板上脱落。图2G显示在siRNA转染后1、2和4天时报告的在对照和QSOX1-敲减板上的细胞数量。图2H展示了培养上清液中已发现的脱落和漂浮的、但经锥虫蓝染色表明有活力的细胞数量。
图3A-R是照片，表明QSOX1是将层粘连蛋白并入基膜中所需的。图3A-L说明了使用P1多克隆抗体的层粘连蛋白免疫染色，表明与QSOX1-敲减(siQSOX1, 图3D-F) WI-38培养物相比，对照(siCONTROL, 图3A-C)中有更显著的层粘连蛋白基质。siQSOX1培养物中补充重组QSOX1 (rQSOX1, 图3G-I)，而不是rQSOX1-AA突变体(图3J-L)，siRNA转染后24小时恢复厚厚的层粘连蛋白基质。比例尺是10 µm；和图3M-R说明对照敲减和siQSOX1-处理的细胞单层用层粘连蛋白链-特异性抗体的免疫染色。LAMA2和LAMA4表明分别用识别层粘连蛋白α2和α4链的抗体的染色。比例尺是10 µm。
图4A-C描绘了QSOX1是将层粘连蛋白并入基膜中所需的。图4A是柱状图，描绘了来自例如图3A-L中所示的视野的层粘连蛋白强度的定量测定。图4B是照片，显示在WI-38细胞培养上清液样品中的层粘连蛋白(上图)和QSOX1 (下图)的蛋白质印迹。泳道1-2对应于用对照siRNA处理的细胞的上清液。泳道3-5对应于用QSOX1-特异性siRNA处理的细胞的上清液；和图4C是柱状图，描绘了来自例如图3M-R所示的视野的层粘连蛋白链强度的定量测定。
图5A-F是照片，表明需要QSOX1用于将层粘连蛋白并入基膜中。WI-38表面的SEM图像显示了独特的集簇材料，在以较低放大倍数采集的图像中用箭头指示。该材料，推测是含有α4链的层粘连蛋白，仅出现在用对照siRNA处理的细胞上，而不出现在用siQSOX1处理的细胞上。
图5G是用于图6A-R的迁移测定的示意图。成纤维细胞在上室中生长至汇合，然后加入荧光标记的肿瘤细胞。对于已经渗透成纤维细胞/ECM层、通过有孔的膜迁移并到达上室底部表面的肿瘤细胞，进行细胞计数。
图6A-Q描绘了成纤维细胞所产生的QSOX1促进肿瘤上皮细胞粘附和迁移。图6A-O是照片，表明荧光标记的H460人肺癌细胞，其已经通过经历指定处理的WI-38成纤维细胞的预先形成的基质层而迁移。成纤维细胞的siRNA转染后24小时(如图2A-H、3A-R、4A-C和5A-F)加入重组酶(rQSOX1, 图6G-I，和rQSOX1-AA, 图6J-L)。对于图6M-O，标记的“抗α6”，H460细胞用针对阻断整联蛋白活性的α6整联蛋白亚基的抗体处理，然后铺在转染了对照的成纤维细胞上。每种处理都显示3个代表性的视野；图6P是柱状图，描绘了来自图组例如图6A-O中所示的迁移的细胞数量的定量测定；和图6Q是柱状图，表明在受力后的每种样品中仍然粘附的细胞数量。
图6R-S描绘了荧光标记的BxPC-3胰腺癌细胞的定量测定，所述细胞通过胰腺成纤维细胞的预先形成的基质层而迁移(图6R)，和在受力后仍然粘附在肺成纤维细胞层上的H460肺癌细胞的定量测定(图6S)，显示为对照(siCONTROL)值的百分率。
图6T描绘了原子力显微镜术，显示对照成纤维细胞培养物比QSOX1不存在时产生的那些更僵硬。作为QSOX1耗尽的结果，成纤维细胞培养物和相关ECM的机械性能被改变。原子力显微镜术用于测定汇合的对照或QSOX1-耗尽的WI-38成纤维细胞的硬度。选择测定尖端大小(tip size)和凹陷深度(indentation depth)，以优化对ECM变化的灵敏度，对照成纤维细胞培养物的弹性模量分布峰值介于4-6 kPa，但观测到宽范围值达30 kPa。这样的弹性模量范围与先前培养的成纤维细胞的AFM研究是一致的。QSOX1-敲减培养物的分布在较低硬度值2-4 kPa时显示一个峰，在8 kPa和50 kPa之间具有少数零散的测量。大量的凹陷曲线组产生的弹性模量大于对于QSOX1-敲减而非对照细胞培养物而得到的100 kPa，可能代表与下面的培养皿支持物直接接触。
图7A-D描绘了在肿瘤相关的成纤维细胞中QSOX1被上调。图7A是在来自H460肺癌细胞的条件培养基(C.M.)不存在或存在时培养2天的WI-38细胞上清液中的QSOX1的蛋白质印迹；图7B是柱状图，描绘了离体培养的癌症相关的成纤维细胞(CAF)细胞显示出更高水平的QSOX1，与采集自更远离肿瘤生长物的组织的成纤维细胞(NF=正常成纤维细胞)相比。当暴露给来自H460肿瘤细胞培养物的条件培养基时，诱导NFs以转录和分泌与CAFs所产生的相当水平的QSOX1；和图7C-D显示用抗QSOX1染色的乳腺导管癌的组织切片。箭头指示表达高水平QSOX1的代表性的肿瘤相关的成纤维细胞。箭头指示QSOX1阴性的成纤维细胞。
图8A-K描绘了QSOX1的抑制阻断肿瘤上皮细胞迁移。图8A-F是照片，显示荧光标记的H460人肺癌细胞，其已经通过对照、未经处理的WI-38成纤维细胞或者在培养基中在QSOX1-特异性单克隆抗体(抗QSOX1, 图8C-D)或对照抗体(抗CD19, 图8E-F)存在时生长的WI-38成纤维细胞的预先形成的基质层而迁移。每种情况下显示2个代表性的视野；图8G是柱状图，显示来自图组例如图8A-F中所示的迁移细胞数量的定量测定；和图8H-K是照片，显示来自在QSOX1-特异性单克隆抗体不存在或存在时培养的WI-38细胞的BM中的层粘连蛋白的IF染色。显示2个代表性的视野。
图9A-L描绘了来自汇合的成纤维细胞的QSOX1的表征。图9A-F是照片，显示用高尔基体-特异性抗体(p115)或ER-特异性抗体(GRASP65)和QSOX1抗体免疫染色的HUVEC细胞。DAPI染色(蓝色)表示核。比例尺代表10 µm；图9G-J是照片，显示用高尔基体标记p115 (红色)和QSOX1 (绿色)免疫染色的汇合的WI-38成纤维细胞。DAPI染色(蓝色)表示核。比例尺代表10 µm；图9K是图，说明在模型底物二硫苏糖醇(DTT)上，使用指定浓度的rQSOX1，产生QSOX1活性的标定曲线。零点对应于含有DTT而不含酶的溶液中的背景氧消耗。灰色线是6个数据点的最佳拟合。粉红色圆圈表明在来自汇合的WI-38成纤维细胞培养物的3个上清液样品中观察到的DTT加入后的氧消耗率；和图9L是照片，显示经蛋白质印迹检测的自不同成纤维细胞的QSOX1分泌(1=WI-38, 2=正常肺成纤维细胞, 3=人包皮成纤维细胞(HFF))。注意，QSOX1并非分泌自胰腺上皮BxPC细胞系(epi)或内皮HUVEC细胞(endo)的汇合的培养物。图10A-D描绘了来自汇合的成纤维细胞的QSOX1的表征。分泌的QSOX1经免疫沉淀后，通过SDS-PAGE观察到2个条带的质谱指纹图谱。残基600右边的4个残基(PELI)对于较短的QSOX1剪接变体是独特的。下面147个额外残基对于较长的剪接变体是独特的。各条带在凝胶中用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化。红色字母标记表示在至少一个肽中通过LC-MS/MS观察的氨基酸。潜在的N-连接的糖基化位点在灰色背景上。在右图的残基601-747左边的垂直黑条表明仅在较长的QSOX1剪接变体中发现的序列。同时在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样品中在该区的红色氨基酸的存在表示QSOX1上面条带必定衍生自较长的剪接变体。
图11A-E描绘了QSOX1的敲减。图11A是照片，描绘了在WI-38成纤维细胞中使用siRNA，QSOX1敲减的高效力，正如通过自总RNA的QSOX1转录本的PCR扩增和通过蛋白质印迹所示。所用的加载的对照是印迹膜的考马斯染色；图11B表明QSOX1敲减在siRNA转染后维持至少4天，导致了细胞培养上清液中的巯基氧化酶活性的背景水平，正如在加入DTT后通过氧消耗所监测的。相应地，在敲减后QSOX1蛋白在培养上清液中事实上是不可检测的；和图11C-E是照片，显示通过对于衰老-相关的β-半乳糖苷酶活性的X-gal染色而证明，QSOX1敲减不促使细胞衰老。对照衰老的细胞得自来自高(高于32)传代次数的3周龄的WI-38细胞培养物。
图12A-Q描绘了QSOX1敲减对ECM的作用。图12A是柱状图，描绘了QSOX1敲减导致BM中的增加的反应性硫醇含量。WI-38成纤维细胞经历了指定的siRNA转染(自对照感染的细胞而制备DTT样品和NEM样品)和继续再培养4天。细胞用氢氧化铵移出，和加入ThioGlo以定量测定游离硫醇。通过将100 mM DTT或100 mM NEM加入对照板，洗去DTT/NEM，再用ThioGlo处理，产生DTT样品和NEM样品；图12B-Q是蛋白质印迹和免疫荧光，表明在QSOX1-敲减细胞的细胞培养上清液中的增加量的层粘连蛋白-相关蛋白，但仅少量的并入BM的数量变化。
图13A-N描绘了QSOX1敲减对ECM的作用。图13A-E说明含有相等数量的细胞的视野的层粘连蛋白染色，显示在转染后2天在强度上已有明显差异；图13F是照片，显示BM的总蛋白含量对于用siRNA和重组QSOX1的不同处理并非明显不同，如通过BM样品的考马斯染色所指示的；图13G-L是照片，描绘了具有不同稳定性的2个独立的层粘连蛋白网络共存于WI-38 BM中。标准IF染色程序导致含层粘连蛋白的大的punctae的出现，其在siQSOX1-处理的样品中消失，但通过加入rQSOX1又恢复；图13M-N是柱状图，描绘了转染后1天加入50 nM rQSOX1足以恢复QSOX1-敲减细胞的正常细胞数量和层粘连蛋白组成。
图14是柱状图，描绘了胰腺成纤维细胞所产生的QSOX1促进肿瘤上皮细胞迁移。定量测定荧光标记的BxPC-3人胰腺癌细胞通过经历指定处理的胰腺成纤维细胞的预先形成的基质层的迁移。
图15A-D是线图，描绘了对MAb492.1的抑制常数的测定。图15A表明基于涉及rdRNase氧化的比色测定的结果，MAb492.1对50 nM HsQSOX1的剂量反应曲线。抑制活性表示为405 nm处的吸光度，代表与DTNB反应且不被HsQSOX1氧化的游离硫醇的量。IC50通过非线性回归分析而测定并得到60 nM的值；图15B显示了基于在不同的MAb492.1浓度(范围为250 nM至1 nM)下的氧电极测定的结果，MAb492.1对25 nM HsQSOX1的抑制曲线。抑制活性表示为抑制率与非抑制率的比率。抑制常数通过非线性回归分析而测定并得到Ki值为1.0 + 0.3 nM；图15C是照片，说明在指定浓度的DTT存在时，在有或无250 nM MAb492.1时，将10 nM HsQSOX1温育10分钟和通过加入三氯乙酸(TCA)而淬灭。200 µM DTT提供了足够高浓度的还原性底物，以在HsQSOX1的氧消耗测定中得到初始速率(HsQSOX1对于DTT的KM为约70 µM)，但不导致抗体还原和分解，并因此用于图15B所述的实验中(参见以下)；和图15D是柱状图，描绘了基于氧消耗测定，MAb492.1抑制的底物依赖性。对于2种DTT浓度，35 μM (0.5KM)和200 μM (3KM)，在50 nM MAb492.1不存在和存在时，测定100 nM HsQSOX1的起始速率。对于每种浓度，显示了在MAb492.1存在时的起始速率(vi)与在MAb492.1不存在时的起始速率(v0)之间的3次测量的平均比率。在这些不同浓度下的类似比率表明抑制并非底物依赖性的。
图16A-D是线图，描绘了MAb492.1结合HsQSOX1氨基-末端片段HsQSOX1Trx。图16A说明基于ELISA结合测定，MAb492.1对全长HsQSOX1和对其两个片段的结合曲线。在低靶蛋白浓度时达到的630 nm处的高吸光度表示紧密结合；和图16B-D表明得自分析型大小排阻色谱的全长HsQSOX1及其两个片段的迁移图。灰色线仅代表MAb492.1的迁移图。虚线仅代表HsQSOX1或其片段之一的迁移图。黑色线代表MAb492.1和HsQSOX1或其片段的混合物的迁移图。
图17是线图，描绘了scFv492.1对50 nM HsQSOX1的剂量反应曲线，其基于涉及rdRNase氧化的比色测定的结果。抑制活性表示为405nm处的吸光度，代表与DTNB反应的游离硫醇的量。IC50通过非线性回归分析而测定并得到250 nM的值，是MAb492.1所得的IC50值的5倍。
图18是线图，描绘了衍生自MAb492.1的Fab对50 nM HsQSOX1的剂量反应曲线，其基于涉及rdRNase氧化的比色测定的结果。抑制活性表示为405 nm处的吸光度，代表与DTNB反应的游离硫醇的量。IC50通过非线性回归分析而测定并得到100 nM的值，是全长 MAb492.1所得的IC50值的2倍。
图19A-C是示意图，描绘了以下：图19A表明HsQSOX1Trx (Trx1桃红色，Trx2灰色, CXXC基序在黄色球中)和Fab492.1 (重链蓝色, 轻链绿色)之间的复合物的结构。用表面展示呈现结合位点的特写；图19B表明Fab492.1-HsQSOX1Trx复合物和从不同角度的CDR的表面展示。Trx1、重链和轻链的颜色如A中。CDRs的标记是CDRs本身的颜色。在左边，Trx1显示出与CDR L1、L3和H2有接触。围绕y轴旋转180°显示Trx1与CDR L2、H1和H3 (中间)有接触。在右边，所有6个CDRs表面的俯视图；和图19C表明Fab492.1 (左)和Trx1 (右)的清楚明了的呈现。Trx1围绕垂直轴相对于Fab492.1旋转180°。Trx1、CXXC基序、重链和轻链的染色如A中。来自参与与Trx1相互作用的轻链的残基以白色表示。来自参与与Trx1相互作用的CDR H3的残基以莓红色表示。来自参与与Trx1相互作用的CDRs H2和H1的残基以紫红色表示。来自Trx1的相应的相互作用残基与来自Fab492.1的残基用相同颜色表示。
图20A-B是示意图，描绘了Fab492.1–HsQSOX1Trx界面残基，其来自Trx1，来自轻链(图20A)和重链(图20B)。Trx1以白色表面显示，特异性相互作用残基以条状显示，标记为黑色印刷。轻链(绿色)和重链(蓝色)以卡通显示，特异性相互作用残基以条状显示。CDRs被标记。氢键以黑色虚线表示并指明它们的距离。也指明了阳离子– π和盐桥。
图21A-O是照片，显示荧光标记的H460人肺癌细胞，其已通过对照、未经处理的WI-38成纤维细胞或者在培养基中在MAb492.1或对照抗体(抗β肌动蛋白)存在时生长的WI-38成纤维细胞的预先形成的基质层而迁移。每种情况下显示3个代表性的视野。
图22是柱状图，描绘了MAb492.1对肿瘤细胞迁移的抑制。WI-38成纤维细胞在有孔的膜上生长4天并让其在不同浓度的MAb492.1存在或不存在时产生ECM。然后，荧光标记的H460肺癌细胞铺在成纤维细胞上。指明了标记的H460细胞数量，其在24小时后已经渗透每个样品中的成纤维细胞层。注意，该图是图21O-A中所示的图组的定量测定。
图23是MDA-MB-231乳腺癌细胞发射的生物发光的图像。该图显示在将肿瘤细胞和成纤维细胞共同接种到乳腺脂肪垫后1周，3只小鼠显示局部肿瘤。
图24是柱状图，描绘了在MAb492.1不存在和存在时的不同哺乳动物QSOX1酶的活性。使用氧消耗测定来评价活性比率。在不同MAb492.1浓度存在时进行每种QSOX1酶的测定，和计算起始斜率(比率)。在MAb492.1不存在时(灰色)，在250nM MAb492.1存在时(黑色)，和在1 μM MAb492.1存在时(白色)，对于每种QSOX1酶，给出氧耗尽率。注意，HsQSOX1是在所测MAb492.1浓度时受到MAb492.1的抑制的仅有的酶。
图25是HsQSOX1与其它哺乳动物QSOX1酶的序列比对，显示结合MAb492.1的部分Trx1结构域，包括活性位点CGHC基序以及接触MAb492.1轻链和CDR H3的残基。参与与MAb492.1相互作用的残基以粗体显示。不同于相应HsQSOX1 (SEQ ID NO: 3)残基的MmQSOX1 (SEQ ID NO: 43)，RnQSOX1 (SEQ ID NO: 42)和CpQSOX1 (SEQ ID NO: 41)的残基显示为红色。
图26是HsQSOX1Trx-Fab492.1复合物结构和MmQSOX1Trx结构的叠加。HsQSOX1Trx为蓝色，来自相同不对称单位的MmQSOX1Trx的两条链为绿色和洋红色。氧还活性位点半胱氨酸标记为两个黄色球。在右边是来自CDR L3的Tyr92和来自MmQSOX1的Asn117之间的预期冲突的特写镜头。在左边是来自CDR H3的Tyr100和来自MmQSOX1的残基138-141的环之间的预期冲突的特写镜头。HsQSOX1和MmQSOX1残基的编号是根据MmQSOX1，以便比较。
图27是柱状图，描绘了在MAb492.1存在时的不同MmQSOX1突变体的%活性。测量进行3次并将其平均。野生型MmQSOX1酶抵抗MAb492.1抑制，而TLPG和A119P突变体显示出对MAb492.1有些敏感性。具有这两种突变的MmQSOX1被抑制的程度类似于HsQSOX1。
本发明的具体实施方案的描述
本发明，在其某些实施方案中，涉及QSOX1抑制剂，并且，更具体地但并非排他地涉及治疗层粘连蛋白相关疾病的用途。
参考附图和所附说明，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明不一定将其应用限制在以下说明中给出的或通过实施例举例说明的细节上。本发明能够实施其它实施方案或以不同方式被实践或实施。另外，应当理解，本文使用的措辞和术语是用于描述的目的，不应视为限制性的。
静止素巯基氧化酶1 (QSOX1)是一种酶，其使用结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子以介导电子从底物蛋白质中的硫醇基对转移至分子氧，产生过氧化氢作为副产物。QSOX1主要定位于分泌途径中的ER的细胞器下游并且经历从细胞的经调节分泌。
基膜(BM)是在体腔或血管与下面的基质成纤维细胞之间的界面上的胞外基质(ECM)层。BM由层粘连蛋白、胶原IV、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和许多其它起作用的大分子组成。BM是细胞粘附和信号传导的复杂介质，并且其组成和性质深刻地影响相关上皮细胞的行为。
尽管简化本发明以便实施，本发明人已经揭示了QSOX1在基膜(BM)中的层粘连蛋白装配中的基本作用及其在与肿瘤细胞侵袭的界面中的重要性。具体地讲，本发明人已经阐明了QSOX1是合适的层粘连蛋白功能(例如装配和细胞粘附和迁移的支持)所必需的，所述功能继而允许细胞和尤其是癌细胞通过基膜的迁移。对QSOX1作为层粘连蛋白装配点的过程的主要调节物的发现，指明将其作为转移过程和细胞迁移中的关键性靶标。
尽管简化本发明以便实施，但本发明人第一次能够产生针对QSOX1的抑制性抗体和证明它在层粘连蛋白装配和肿瘤细胞迁移中的作用，因此，这些抗体可以用于调节基膜并用作抑制肿瘤细胞迁移的治疗药。
如下文和以下实施例部分所示，本发明人已经揭示了QSOX1直接参与BM装配(参见以下实施例部分的实施例1)。最明显地受到QSOX1影响的BM组分就是层粘连蛋白(参见图12B-Q)，其中对QSOX1存在最敏感的层粘连蛋白同种型是含有α4链的那些(参见下表2)。本发明人观察到QSOX1耗尽导致汇合的成纤维细胞培养物上清液中出现可溶性层粘连蛋白同种型(参见图12B-Q, 图3A-L和图4A)。本发明人进一步观察到在QSOX1不存在时产生的BM不能支持侵袭性肿瘤上皮细胞的粘附和迁移(参见图8A-K)。
此外，本发明人产生了结合和抑制人QSOX1 (HsQSOX1)的单克隆抗体，构建了所述抗体的重组单链可变域形式，并表征了QSOX1上的抗体结合位点(参见以下实施例部分的实施例2)。本发明人已经阐明在体内小鼠模型中，与未接受治疗的小鼠相比，用剂量30 mg/kg的mAb492.1治疗，显著地减少了乳腺癌细胞向淋巴结的浸润(参见下表6和7)。
本发明人进一步证明HsQSOX1相当于其它哺乳动物QSOX1直系同源物。HsQSOX1的Trx1结构域序列与其它QSOX1酶的相应区比对显示，在CGHC氧还活性基序附近的序列是相同的(参见图25)。然而，抗体轻链和CDR H3序列(HsQSOX1106-152)所结合的HsQSOX1区揭示了与其它QSOX1酶的少许不同(参见图25)。具体地讲，Pro 116 (其良好适合MAb492.1的疏水性CDR L3侧链间的缝隙)在其它哺乳动物QSOX1酶中被丙氨酸取代。显示序列差异的另一区是HsQSOX1的V135-V138，对应于MmQSOX1的Thr138-Gly141。这些发现提供了产生能结合小鼠QSOX1的抗体的框架。
总之，本发明的教导描述了QSOX1抑制性分子在治疗层粘连蛋白相关疾病或病症例如转移性肿瘤中的治疗价值。
因此，依据本发明的一方面，提供了抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配的方法，所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配。
依据本发明的另一方面，提供了抑制经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移的方法，所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移。
本文所用的术语“层粘连蛋白”是指蛋白人层粘连蛋白。典型地层粘连蛋白是三聚体蛋白质，其含有α-链、β-链和γ-链(分别在5、4和3个遗传变体中发现)。因此，本文使用的术语层粘连蛋白包括任何类型的人层粘连蛋白，包括任何不同的链组合。不同的链和三聚体分子的组织分布不同，明显反映了体内的不同功能。本发明的示例性的层粘连蛋白包括但不限于LAMA1、LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、LAMB4、LAMC1、LAMC2和LAMC3。
依据本发明的实施方案，所述层粘连蛋白包含α4链。
依据具体的实施方案，所述层粘连蛋白是层粘连蛋白-411或层粘连蛋白421。
本文所用的术语“层粘连蛋白装配”是指层粘连蛋白并入基底层(basal lamina)(即基膜层之一)。典型地，层粘连蛋白自细胞(例如成纤维细胞、上皮细胞、肿瘤细胞)分泌并且并入细胞相关的胞外基质，在此它们形成独立的网络并经由巢蛋白、纤连蛋白和基底膜聚糖而与IV型胶原网络缔合。
本文所用的术语“基膜”或“包含层粘连蛋白的基膜”是指纤维薄层，其锚定和支持上皮和内皮并且包含基底层(即包含层粘连蛋白)。
本文所用的短语“抑制或阻止层粘连蛋白装配”是指减少、逆转、减弱、最小化、抑制或终止基膜中的层粘连蛋白装配。依据一个实施方案，抑制或阻止层粘连蛋白装配达至少约10%，达至少约20%，达至少约30%，达至少约40%，达至少约50%，达至少约60%，达至少约70%，达至少约80%，达至少约90%或达至少约100%，与QSOX1抑制剂不存在时的层粘连蛋白装配相比(如下文进一步描述的那样)。因此，依据本发明的实施方案，没有层粘连蛋白并入基膜中。
如以下实施例部分的实施例1所示，未并入基膜中的层粘连蛋白可以以可溶性形式存在(例如在体外培养的细胞的培养基内)。因此，对层粘连蛋白装配的减少的监测，可以通过例如胞外基质的免疫荧光(IF)染色或通过可溶性层粘连蛋白(即未并入基膜中的那些)的蛋白质印迹而监测。
应理解，抑制或阻止层粘连蛋白装配在以下情况中也可为有利的：其中在修复或反应性过程(例如纤维化)中在器官或组织中以非结构化方式产生过量结缔组织。因此，尽管进一步简化本发明以便实施，对QSOX1的抑制和随后可溶性层粘连蛋白的产生可用于治疗纤维化过程。
应理解，层粘连蛋白是基底层和基膜的重要生物活性部分，影响细胞粘附、信号传导、迁移、表型、分化和生存。
本文所用的术语“细胞迁移”涉及细胞从一个位置移动至另一个的细胞过程。本发明的示例性的细胞迁移包括肿瘤细胞迁移，导致转移。
因此，依据本发明教导的细胞可包含例如，脑细胞、神经元、心肌细胞、肌细胞、皮肤细胞、骨细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、肠道细胞、脾细胞、呼吸道细胞、肺细胞、淋巴细胞或单核细胞。本发明的细胞可包含健康的细胞或者还可以包含突变的细胞(例如肿瘤细胞)。
本文所用的短语“抑制细胞迁移”是指减少、逆转、减弱、最小化、抑制或终止经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞(例如肿瘤细胞)的迁移。依据一个实施方案，抑制或阻止层粘连蛋白装配达至少约10%，达至少约20%，达至少约30%，达至少约40%，达至少约50%，达至少约60%，达至少约70%，达至少约80%，达至少约90%或达至少约100%，与QSOX1抑制剂不存在时经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移相比(如下文进一步描述的)。因此，依据本发明的实施方案，通过基膜的细胞迁移被完全抑制。
如上所述，本发明的方法通过使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂(在本文中也称为“QSOX1抑制剂”)接触而进行。
本文所用的术语“QSOX1”涉及静止素巯基氧化酶1 (例如人)，也称为QSCN6。在NCBI数据库中的人QSOX1的长变体的蛋白质检索号为NP_002817 (SEQ ID NO: 1)，人QSOX1的短形式的检索号为NP_001004128 (SEQ ID NO: 2)。本发明的QSOX1蛋白的抑制剂介导基膜中的错误装配的层粘连蛋白(即功能失调的层粘连蛋白)的升高。
术语“组织”是指由细胞组成的、旨在行使功能的生物体的一部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织和造血组织。
依据本发明的实施方案，所述组织是肿瘤组织。
依据另一实施方案，所述组织包含成纤维细胞。
QSOX1的下调可以在基因组水平和/或转录水平上进行，使用干扰转录和/或翻译[例如RNA沉默剂(例如反义、siRNA、shRNA、小RNA)、核酶和脱氧核酶]的各种分子；或者在蛋白水平上进行，使用例如拮抗剂、切割多肽的酶等，只要在介导合适的基膜装配(其允许细胞迁移)中的QSOX1活性受到抑制，如上所述。具体地讲，可以测定对基膜装配的抑制，即通过定量测定可溶性层粘连蛋白的水平和定位，如本文所述。
依据一个实施方案，能够下调QSOX1活性的试剂是多肽试剂。
可以下调QSOX1活性的示例性的多肽试剂包括抗体、抗体片段、肽、显性阴性分子或天然抑制剂，其能够通过特异性结合QSOX1和干扰其活性而下调QSOX1活性。优选地，所述抗体特异性地结合QSOX1的至少一个表位。本文所用的术语“表位”是指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。
表位决定簇(Epitopic determinant)通常由化学活性表面组群的分子例如氨基酸或碳水化合物侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。
为了有效抑制QSOX1而靶向的示例性的QSOX1区是氨基-末端Trx结构域(参见以下实施例部分的实施例2)。具体地讲，为了有效抑制，可以靶向QSOX1的Trx1结构域中的氧还活性二硫化物。
依据另一实施方案，所述多肽试剂可针对QSOX1的氨基酸坐标34-266 (SEQ ID NOs: 3和4)。
如以下实施例部分(参见以下实施例2)所详述的，本发明人已经产生了单克隆抗体(mAb)和单链抗体(scAb)，其特异性地靶向和抑制QSOX1。此外，本发明人产生了质粒，其包含人QSOX133-546的核酸序列(SEQ ID NO: 5)，该序列编码重组QSOX1多肽(SEQ ID NO: 6)，用于诱导抗体。
因此，提供了分离的多肽，其包含QSOX1的氨基酸序列，所述肽的长度小于500个氨基酸。
依据另一实施方案，本发明的多肽可包含50-500个氨基酸、100-500个氨基酸、200-500个氨基酸、300-500个氨基酸、400-500个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、100-300个氨基酸、100-400个氨基酸、200-300个氨基酸或200-400个氨基酸。优选地，所述多肽包含QSOX1在介导合适的基膜装配中的功能。术语合适的基膜装配定义为能够支持细胞迁移。
依据本发明的具体实施方案，提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO: 6所示的QSOX1的氨基酸序列。
本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子及其功能性片段，例如Fab、F(ab')2和Fv，其能够结合到巨噬细胞。这些功能性抗体片段定义如下：(1) Fab，其是含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶对全抗体的消化以得到完整的轻链和一个重链的一部分而产生；(2) Fab’，其是可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，紧接着还原以得到完整的轻链和部分重链而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3) (Fab’)2，其是可以通过用胃蛋白酶处理全抗体而没有随后还原获得的抗体片段；F(ab’)2是两个Fab’片段通过两个二硫键连在一起的二聚体；(4) Fv，定义为基因工程的片段，其含有轻链的可变区和重链的可变区，表达为两条链；和(5)单链抗体(“SCA”)，基因工程的分子，其含有通过合适的多肽接头连接的轻链的可变区以及重链的可变区，作为基因融合的单链分子。
产生多克隆抗体和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如，Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, 通过引用结合到本文中)。用于免疫的QSOX1肽可包含50-100个氨基酸、50-150个氨基酸、50-200个氨基酸、50-232个氨基酸、100-200个氨基酸或150-232个氨基酸。
可以制备本发明某些实施方案的抗体片段，即通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中表达编码所述片段的DNA。可通过常规方法经胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体而得到抗体片段。例如，可通过用胃蛋白酶酶促切割抗体而产生抗体片段，得到5S片段，称为F(ab')2。还可以进一步切割该片段，使用硫醇还原剂和任选用于巯基的封闭基团，导致二硫键的切割，产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割，直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。这些方法如以下文献所述：例如，Goldenberg, 美国专利号4,036,945和4,331,647，和其中包含的参考文献，所述专利通过引用全部结合到本文中。另见Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]。也可使用切割抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或其它酶促、化学或遗传技术，只要所述片段结合到被完整抗体所识别的抗原。
Fv片段包含VH链和VL链的缔合。该缔合可以是非共价的，如以下文献所述：Inbar等人[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]。或者，可变的链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物例如戊二醛而交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH链和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)如下制备：通过构建包含通过寡核苷酸连接的DNA序列的结构基因，所述序列编码VH和VL结构域。将结构基因插入表达载体，随后将其引入宿主细胞例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成单一多肽链，其中接头肽连接2个V结构域(例如以下实施例2中所述的[Gly4Ser]3)。产生sFvs的方法描述于例如[Whitlow和Filpula, Methods 2: 97-105 (1991)；Bird 等人, Science 242:423-426 (1988)；Pack 等人, Bio/Technology 11:1271-77 (1993)；和美国专利号4,946,778，其通过引用全部结合到本文中。
抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。可以通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单位”)。例如通过使用聚合酶链式反应，自抗体-产生细胞的RNA合成可变区，来制备这样的基因。参见例如Larrick和Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]。
非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab').sub.2或抗体的其他抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自非人类物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基(具有所期望的特异性、亲和力和能力)来替换来自受体的互补决定区(CDR)的残基。在一些情况下，用相应的非人残基来替换人免疫球蛋白的Fv构架残基。人源化抗体还可以包含在受体抗体和在输入CDR或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包括至少一个，并且通常两个可变域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体最佳地还将包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区[Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann 等人, Nature, 332:323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
用于人源化非人抗体的方法是本领域中众所周知的。通常，人源化抗体具有由非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称作输入残基，其通常来自输入可变域。可以基本上按照Winter和同事的方法[Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann 等人, Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen 等人, Science, 239:1534-1536 (1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行人源化。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著地少于完整人可变域已由来自非人类物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所替代。
还可以利用在本领域中已知的各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks 等人, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术还可用于人单克隆抗体的制备(Cole 等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)和Boerner 等人, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如小鼠)(其中已部分或完全灭活内源性免疫球蛋白基因)来制备人抗体。在攻击以后，观察到人抗体的生产，其在所有方面非常类似于在人体中看到的情况，包括基因重排、装配和抗体库。这种方式例如描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及以下科学出版物：Marks等人, Bio/Technology 10,: 779-783 (1992)；Lonberg 等人, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368 812-13 (1994)；Fishwild 等人, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；和Lonberg和Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)。
依据一个实施方案，基本上按照本文以下所述来产生抗体。具体地讲，首先用重组人QSOX1和完全弗氏佐剂(例如得自DifcoLboratories)的乳剂免疫小鼠。例如，小鼠可以在3周间隔中免疫4次。然后，使用聚乙二醇，将所选小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(例如NSO骨髓瘤细胞)融合。然后通过选择培养基(例如HAT培养基)来选择杂交瘤细胞，并筛选与人QSOX1特异性结合并抑制人QSOX1的细胞上清液。然后可以大规模产生抗体，使用例如在无血清培养基(DCCM)中的miniPERM生物反应器(Sarstedt)。
因此本发明的教导提供了分离的抗体，其包含抗原识别域，所述抗原识别域结合QSOX1和在介导支持细胞迁移的基膜装配中抑制QSOX1活性。
依据本发明的实施方案，所述活性通过胞外基质的免疫荧光(IF)染色测定或检测可溶性层粘连蛋白(即未并入基膜中的层粘连蛋白，如以下实施例部分中进一步详述的那样)的蛋白质印迹测定中的至少一种而测定。
依据具体的实施方案，本发明的抗体是单克隆抗体。可用于本发明教导的示例性单克隆抗体是MAb492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。因此，CDRs 1-3 (分别为SEQ ID NOs: 29-31)位于抗体的轻链上，CDRs 1-3 (分别为SEQ ID NOs: 32-34)位于抗体的重链上。
依据另一实施方案，本发明的抗体是单链抗体。可用于本发明教导的示例性单链抗体是scFV492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。
依据另一实施方案，本发明的分离的抗体包含SEQ ID NOs: 7和8所示的氨基酸序列。
依据另一实施方案，本发明的分离的抗体包含SEQ ID NOs: 27和28所示的氨基酸序列。
依据一个实施方案，本发明的抗体可结合小鼠QSOX1酶。
因此，如以下实施例部分中进一步详述的那样，人和鼠QSOX1是可比较的并且包含至少70% (例如79%)的序列同一性。人和小鼠QSOX1的序列比对揭示了例如人QSOX1的Pro 116在鼠QSOX1中被丙氨酸取代(参见图25)。显示序列差异的另一区是来自人QSOX1的Val135-Val138，对应于小鼠QSOX1中的Thr138-Gly141 (参见图25)。这些发现提供了产生能结合小鼠QSOX1的抗体的框架。
依据一个实施方案，本发明的抗体是单克隆抗小鼠QSOX1抗体。
依据另一实施方案，本发明的抗体是单链抗小鼠QSOX1抗体。
用于产生靶向小鼠QSOX1的抗体的MAb492.1中的可能突变描述于下表8。
能够下调QSOX1的另一试剂是结合到和/或切割QSOX1的分子。这样的分子可以是QSOX1拮抗剂、QSOX1的显性阴性分子(例如与效应物竞争的部分肽或其突变)、QSOX1的天然抑制剂或QSOX1抑制性肽。
应理解，QSOX1的至少催化或结合部分的非功能类似物也可用作下调QSOX1的试剂。
可用于本发明某些实施方案以下调QSOX1的另一试剂是阻止QSOX1活化或底物结合的分子。
如所述的，能够下调QSOX1表达的另一试剂是核酸试剂，其合适于以靶向方式使表达沉默。这类试剂的实例列举如下。
例如，通过RNA沉默可以达到QSOX1的下调。本文所用的短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调节机制[例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、抑制、共抑制和翻译阻遏]，其导致相应蛋白质编码基因的表达的抑制或“沉默”。RNA沉默在包括动植物和真菌在内的许多类型的生物体中都已观察到。
本文所用的术语“RNA沉默试剂”是指能够特异性地抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中，所述RNA沉默试剂能够通过转录后沉默机制而阻止mRNA分子的全部加工(例如整个翻译和/或表达)。RNA沉默试剂包括非编码RNA分子，例如包含成对链的RNA双链体、以及前体RNA(从中可以产生小的非编码RNA)。示例性的RNA沉默试剂包括dsRNAs例如siRNAs、miRNAs和shRNAs。在一个实施方案中，RNA沉默试剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默试剂能够介导翻译阻遏。
依据本发明的实施方案，所述RNA沉默试剂对靶RNA (例如QSOX1)具有特异性并且不交叉抑制或沉默这样的基因或剪接变体：其与靶基因具有99%以下的总体同源性，例如与靶基因具有小于98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%的总体同源性。
RNA干扰是指在动物中的由短的干扰RNA (siRNAs)介导的序列-特异性的转录后基因沉默的过程。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默并且在真菌中也称为抑制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，用于阻止外源基因表达并且由多种植物区系和门类所共享。这种针对外源基因表达的防护作用可能是在响应双链RNAs (dsRNAs)的产生时逐渐形成的：所述双链RNA来源于病毒感染或来源于转座子元件通过细胞反应而随机整合到宿主基因组中，其特异性地破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。
在细胞中的长dsRNA的存在刺激核糖核酸酶III酶(称为dicer)的活性。Dicer参与将dsRNA加工成小片dsRNA，称为短的干扰RNAs (siRNAs)。来源于dicer活性的短干扰RNA通常长度为约21至约23个核苷酸并且包含约19个碱基对双链体。RNAi反应的特征还在于内切酶复合物，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部。
因此，本发明某些实施方案考虑了使用dsRNA以下调自mRNA的蛋白表达。
依据一个实施方案，所述dsRNA大于30 bp。长dsRNAs (即大于30 bp的dsRNA)的使用非常有限，因为认为双链RNA的这些较长区将导致干扰素的诱导和PKR反应。然而，使用长dsRNAs可提供许多优势：细胞可选择优化沉默序列，减少对测试大量siRNAs的需求；长dsRNAs将允许沉默文库具有比siRNA所需要的更低的复杂度；并且，也许最重要的是，当用作治疗药时，长dsRNA能阻止病毒逃逸突变。
多项研究表明长dsRNAs可用于沉默基因表达，而不诱导应激反应或导致明显的脱靶效应 - 参见例如[Strat等人, Nucleic Acids Research, 2006, 第34卷, 第13期，3803–3810；Bhargava A 等人 Brain Res. Protoc. 2004；13:115–125；Diallo M., 等人, Oligonucleotides. 2003；13:381–392；Paddison P.J., 等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002；99:1443–1448；Tran N., 等人, FEBS Lett. 2004；573:127–134]。
具体地讲，依据其某些实施方案，本发明考虑了在细胞中引入长dsRNA (超过30个碱基转录本)用于基因沉默，在所述细胞中干扰素途径未失活(例如胚胎细胞和卵母细胞)，参见例如Billy等人, PNAS 2001, 第98卷, 第14428-14433页. 和Diallo等人, Oligonucleotides, 2003年10月1日, 13(5): 381-392. doi:10.1089/154545703322617069。
依据其某些实施方案，本发明也考虑了引入长dsRNA，其经特别设计而不会诱导干扰素和PKR途径，用于下调基因表达。例如，Shinagwa和Ishii [Genes & Dev. 17 (11): 1340-1345, 2003]已经开发出一种载体，称为pDECAP，以便自RNA聚合酶II (Pol II)启动子表达长的双链RNA。因为自pDECAP的转录同时缺乏促进ds-RNA输出到胞质的5'-帽结构和3'-聚(A)尾，来自pDECAP的长ds-RNA不诱导干扰素反应。
在哺乳动物系统中回避干扰素和PKR途径的另一方法是通过经由或转染或内源表达而引入小的抑制性RNAs (siRNAs)。
术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小的抑制性RNA双链体(通常为18-30碱基对)。典型地，siRNAs经化学合成为21聚体，具有中心的19bp双链体区和在末端的对称的2-碱基3'-突出端，尽管最近已经描述了与在相同位置的21聚体相比，经化学合成的25-30个碱基长度的RNA双链体在效力上可能具有多达100倍的增加。使用较长的RNAs所得到的在触发RNAi方面所观察到的效力增加在理论上是由于给Dicer提供了底物(27聚体)而非产物(21聚体)，并且这提高了siRNA双链体进入RISC的速率或效率。
已经发现3'-突出端的位置影响siRNA的效力并且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体通常比在正义链上具有3'-突出端的那些更有效(Rose等人, 2005)。这可能是归因于加载到RISC的不对称的链，因为当靶向反义转录物时观察到相反的功效模式。
双链干扰RNA(例如siRNA)的链可以连接在一起，构成发夹或茎环结构(例如shRNA)。因此，如所述的，本发明某些实施方案的RNA沉默试剂也可以是短发夹RNA (shRNA)。
术语“shRNA”如本文所用，是指RNA试剂，其具有茎环结构，包括互补序列的第一和第二区，所述区的互补程度和取向足以使这些区之间发生碱基配对，第一和第二区通过环区连接，该环是由于环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对所致。环内的核苷酸数量介于并包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11的数量。环内的某些核苷酸可以参与与环内其它核苷酸之间的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T. R. 等人(2002) Science 296: 550)和5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. 等人(2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员将会知道，所得单链寡核苷酸构成茎环或发夹结构，其包含能够与RNAi机器相互作用的双链区。
适用于本发明某些实施方案的RNA沉默剂的合成可以如下进行。首先，扫描AUG起始密码子下游的QSOX1 mRNA序列的AA二核苷酸序列。记录每次AA和3’邻近的19个核苷酸的出现作为潜在的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自可读框，因为非翻译区(UTRs)在调节蛋白结合位点中比较丰富。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。可以理解，虽然针对非翻译区的siRNAs也可能是有效的，但正如对于GAPDH所证明的那样，其中指向5’ UTR的siRNA介导GAPDH mRNA的约90%降低并完全消除蛋白水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。
第二，使用任何序列比对软件，例如可得自NCBI服务器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的BLAST软件，将潜在靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)相比。过滤掉与其他编码序列具有明显同源性的推定的靶位点。
选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包含低G/C含量的那些，因为它们已被证明在介导基因沉默中比G/C含量高于55%的那些更有效。优选地沿着用于评价的靶基因长度，选择若干靶位点。为了更好地评价所选siRNAs，优选同时使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与siRNAs相同的核苷酸组成，但缺乏与基因组的明显同源性。因此，优选使用siRNA的错义核苷酸序列，只要它不表现出与任何其他基因的任何明显同源性。
例如，合适的QSOX1 siRNA可以是来自Dharmacon, USA的市售的siRNA。
可以理解，本发明某些实施方案的RNA沉默试剂不必限制在仅含RNA的那些分子，而是进一步包括经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
使用RNA沉默剂而靶向的mRNA包括但不限于其表达与不想要的表型性状相关的那些。可以靶向的示例性的mRNA是编码截短的蛋白质(即包含缺失)的那些。因此，本发明某些实施方案的RNA沉默试剂可以靶向缺失两侧任一侧的桥连区。将这样的RNA沉默剂引入细胞将会导致突变蛋白的下调，而非突变蛋白却不受影响。
依据另一实施方案，所述RNA沉默试剂可以是miRNA。
术语“小RNA”、“miRNA”和“miR”是同义词，是指长度约19-28个核苷酸的非编码的单链RNA分子的集合，其调节基因表达。miRNAs已在宽范围的生物体(病毒.fwdarw.人)中发现和已被证明在发育、体内稳态和疾病病因学中起作用。
应当注意，在任何成对的miRNA和miRNA*的5’和3’末端中都可能存在变异性。这种变异性可能是因为在Drosha和Dicer对于裂解位点的酶促加工中的变异性所致。在miRNA和miRNA*的5’和3’末端的变异性也可能是因为pri-miRNA和pre-miRNA的茎结构中的错配所致。茎链的错配可能导致不同发夹结构的群体。茎结构中的变异性也可导致Drosha和Dicer所切割的产物中的变异性。
能够下调QSOX1的另一试剂是脱氧核酶分子，其能够特异性地切割QSOX1的mRNA转录本或DNA序列。脱氧核酶是单链多核苷酸，其能够切割单链和双链靶序列两者(Breaker, R.R.和Joyce, G. Chemistry and Biology 1995；2:655；Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997；943:4262)。已经提出了脱氧核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，侧接2个底物-识别结构域，每个结构域分别有7-9个脱氧核糖核苷酸。这类脱氧核酶在嘌呤:嘧啶连接处可以有效地切割其底物RNA (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；有关脱氧核酶的综述参见Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)]。
识别单链和双链靶切割位点的合成的、工程的脱氧核酶的构建和扩增的实例已经公开于美国专利号6,326,174 (授予Joyce等人)。近期已经观察到针对人尿激酶受体的类似设计的脱氧核酶抑制尿激酶受体表达，并且在体内成功地抑制了结肠癌细胞转移(Itoh等人, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org)。在另一应用中，与bcr-ab1癌基因互补的脱氧核酶已经成功地抑制了在白血病细胞中的癌基因表达，和在CML和ALL的病例中在自体骨髓移植中降低了复发率。
通过使用与编码QSOX1的mRNA转录本能够特异性地杂交的反义多核苷酸，也可实现QSOX1的下调。
当考虑对反义方法而言重要的两方面时，必须进行可用于有效下调QSOX1的反义分子的设计。第一方面是将寡核苷酸递送到合适细胞的细胞质中，而第二方面是设计寡核苷酸，所述寡核苷酸以抑制其翻译的方式特异性地结合细胞内的经设计的mRNA。
现有技术教导了许多递送策略，其可用于将寡核苷酸有效地递送到多种多样的细胞类型中[参见例如，Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998)；Kronenwett 等人，Blood 91: 852-62 (1998)；Rajur 等人，Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997)；Lavigne 等人，Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997)和Aoki 等人(1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)]。
另外，根据用于解释靶mRNA和寡核苷酸两者中的结构改变的能量学的热力循环，用于鉴定对其靶mRNA具有最高的预测结合亲和力的那些序列的算法也是可用的[参见例如，Walton等人，Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)]。
这样的算法已经成功地用于在细胞中实施反义方法。例如，由Walton等人开发的算法使科学家们能够成功地设计反义寡核苷酸，用于兔β-珠蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNFα)转录本。同一研究小组新近已经报告，通过动力PCR技术评价，在细胞培养中针对3个模型靶mRNAs (人乳酸脱氢酶A和B和大鼠gp130)的合理选择的寡核苷酸的反义活性，证明了在几乎所有情况中都是有效的，包括在两种细胞类型中，用磷酸二酯和硫代磷酸寡核苷酸化学针对3个不同靶的测试。
另外，也发表了使用体外系统的用于设计和预测特定寡核苷酸效率的若干方法(Matveeva等人, Nature Biotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)]。
能够下调QSOX1的另一试剂是能够特异性地切割编码QSOX1的mRNA转录本的核酶分子。通过切割编码目标蛋白的mRNA，核酶被越来越多地用于基因表达的序列-特异性抑制[Welch等人, Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。设计核酶以切割任何特异性靶RNA的可能性使其成为基础研究和治疗应用的有价值的工具。在治疗领域，核酶已被用于在感染性疾病中靶向病毒RNAs，在癌症中靶向显性癌基因，在遗传障碍中靶向特定体细胞突变[Welch等人, Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]。最显著的是，用于HIV患者的若干核酶基因治疗方案已经处于1期试验。新近，核酶已被用于转基因动物研究、基因靶证实和途径的阐明。若干核酶处于不同临床试验期。ANGIOZYME是进行人体临床试验研究的首个经化学合成的核酶。ANGIOZYME特异性地抑制VEGF-r (血管内皮生长因子受体)的形成，VEGF-r是血管生成途径中的一种关键组分。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., 以及其它公司已经证明抗血管生成治疗药在动物模型中的重要性。已经发现HEPTAZYME，经设计用于选择性地破坏丙肝病毒(HCV) RNA的一种核酶，在细胞培养测定中能有效减少丙肝病毒RNA (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - WEB主页)。
在某些实施方案中，本文提供的RNA沉默试剂与细胞渗透肽可能是功能上相关的。本文所用的“细胞渗透肽”是包含短的(约12-30个残基)氨基酸序列或功能性基序的肽，其赋予膜-渗透性复合物跨越细胞质膜和/或核膜的运输相关的能量独立的(即非-内吞的)转位性质。用于本发明某些实施方案的膜-渗透性复合物的细胞渗透肽优选地包含至少一个无功能的半胱氨酸残基，其是游离或衍生的，以与双链核糖核酸形成二硫键(所述双链核糖核酸已经修饰用于形成这样的键)。赋予这类性质的代表性氨基酸基序在美国专利号6,348,185中已列举，其内容通过引用明确结合到本文中。本发明某些实施方案的细胞渗透肽优选地包括但不限于penetratin、transportan、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。
本发明的方法(例如抑制细胞迁移)可以在体外、在体内或离体进行。
调节细胞迁移的能力可用作新的治疗形式。
因此，依据本发明的另一方面，提供了在有需要的受试者中治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的抑制QSOX1活性或表达的试剂。
本文所用的术语“层粘连蛋白相关疾病或病症”是指这样的疾病或病症：其中层粘连蛋白功能与疾病的发作或发展相关。
术语“治疗”是指抑制或阻止疾病、障碍或病症的发展和/或导致疾病、障碍或病症的减少、缓解或消退或在可能处于疾病障碍或病症的风险中、但尚未诊断具有疾病、障碍或病症的受试者中防止疾病、障碍或医学病症出现。本领域技术人员将会理解，不同方法和测定可用于评估疾病、障碍或病症的发展，同样地，不同方法和测定可用于评估疾病、障碍或病症的减少、缓解或消退。
本文所用的术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，最优选人类，包括两种性别的年轻人和老人，其患有或易于患有坏死相关障碍或病症。
依据一个实施方案，所述层粘连蛋白相关疾病或病症是肿瘤。
肿瘤的实例包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤。癌性疾病的具体实例包括但不限于：骨髓增生性疾病，例如实体瘤良性脑膜瘤，唾液腺混合瘤，结肠腺瘤；腺癌，例如小细胞肺癌，肾癌，子宫癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，结肠癌，肉瘤，脂肪肉瘤，粘液样肉瘤，滑膜肉瘤，横纹肌肉瘤(肺泡)，骨骼外黏液样软骨肉瘤，尤文氏瘤；其他包括睾丸和卵巢无性细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肾母细胞瘤，神经母细胞瘤，恶性黑色素瘤，间皮瘤，乳腺癌，皮肤癌，前列腺癌和卵巢癌。
依据一个实施方案，所述肿瘤是转移性实体瘤。
依据一个实施方案，所述肿瘤是腺癌。
依据另一实施方案，可依据本发明的教导而治疗的肿瘤，包括但不限于：前列腺癌，肺癌，乳腺癌，宫颈癌，脐尿管癌，阴道癌，结肠癌，食道癌，胰腺癌，喉癌，胃癌和髓细胞性白血病。
依据一个实施方案，所述层粘连蛋白相关疾病或病症与纤维化相关。
术语“纤维化”是指器官或组织中的过量结缔组织的形成或存在。它可能是因针对刺激物(例如组织损伤或炎症)的修复术或置换术反应而发生。
涉及纤维化的障碍的实例包括但不限于：肝纤维化，肺纤维化，肾纤维化，胰纤维化，硬皮病，结缔组织病，疤痕形成，皮肤纤维化，心脏纤维化，器官移植，血管狭窄，再狭窄，动脉纤维化，关节纤维化，乳腺纤维化，肌肉纤维化，腹膜后纤维化，甲状腺纤维化，淋巴结纤维化，膀胱纤维化，胸膜纤维化和COPD。
依据一个实施方案，所述层粘连蛋白相关疾病或病症是细菌性疾病、病毒性疾病或寄生虫性疾病。
可通过本发明的教导而治疗的示例性寄生虫性疾病包括非洲锥虫病。
依据本发明的教导，为了治疗所述层粘连蛋白相关疾病或病症，给予所述受试者如上详述的下调QSOX1活性或表达的试剂。
可将如上所述的每种下调试剂本身给予个体或将其作为药物组合物的部分而给予个体，所述药物组合物还包含生理上可接受的载体。药物组合物的目的是便于将活性成分给予生物体。
本文所用的“药物组合物”是指制剂，其包含本文描述的一种或多种活性成分和其他化学组分例如生理上合适的载体和赋形剂。药物组合物的目的是便于将化合物给予生物体。
本文的术语“活性成分”是指对生物效应负责的下调QSOX1的试剂。
在下文中，可以互换使用的短语”生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指这样的载体或稀释剂，其并不引起对生物体的显著刺激并且并不废除所给予化合物的生物活性和性能。这些短语包括佐剂。
本文的术语“赋形剂”是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性组分的给予。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和给予药物的技术可以参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版本，其通过引用结合到本文中。
适宜的给药途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜途径，尤其是经鼻、肠道或胃肠道外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内注射，例如，注入右或左心室腔、注入总冠状动脉，静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
用于将药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方式包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内灌注)；对试剂的分子操作(例如，生产嵌合融合蛋白，其包含对于内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽与本身不能穿越BBB的试剂组合)，以试图开发BBB的内源性转运途径之一；药理学策略，其设计成用来增加试剂的脂溶性(例如，水溶性剂与脂质或胆固醇载体缀合)；以及通过高渗性破坏(源于甘露醇溶液输注进入颈动脉或使用生物活性剂如血管紧张肽)而短暂地破坏BBB的完整性。
或者，可以以局部而不是全身方式来给予药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域。
可以通过本领域中众所周知的过程来制造本发明某些实施方案的药物组合物，例如，通过常规混合、溶解、造粒、制作锭剂、磨细、乳化、封装、包埋或冷冻干燥过程。
因此，依据本发明某些实施方案使用的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可以药用的制剂)，以常规方式加以配制。合适的制剂取决于所选的给药途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中如Hank溶液、林格氏液、或生理盐缓冲液。对于经粘膜给予，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给予，可以通过将活性化合物和本领域中众所周知的药用载体混合来容易地配制药物组合物。这类载体能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等，用于由患者口服摄取。可以在添加适宜的助剂(如果需要的话)以后，利用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并处理颗粒混合物，以获得片剂或锭剂核心来制备用于口服的药理学制剂。适宜的赋形剂尤其是填充剂例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
提供有适当的包衣的锭剂核心。为此目的，可以使用浓缩糖液，其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、涂剂溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料加入片剂或锭剂包衣，用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合的胶囊剂(push-fit capsule)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软质密封胶囊剂。推入配合的胶囊剂可以包含活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)，以及，可选地，稳定剂的混合物。在软胶囊剂中，可以将活性成分溶解或悬浮于适宜的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于口服给予的所有剂型应具有适用于所选给药途径的剂量。
对于颊部给予，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入的给予，以来自加压包装或使用适宜的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)的喷雾器的气溶胶喷雾剂形式，来方便地递送依据本发明某些实施方案使用的活性成分。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。用于分药器的例如明胶的胶囊剂和药筒可以配制成包含化合物和适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以配制本文所述的药物组合物，用于胃肠外给予，例如，通过推注或连续输注。可以以单位剂型来提供用于注射的剂型，例如，以安瓿或以多剂量容器形式，任选具有添加的防腐剂。组合物可以是处于油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可以包含配制剂如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠道外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液剂。另外，可以将活性组分的混悬剂制备成适当的油基或水基注射混悬剂。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可以包含增加混悬剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。可选地，混悬剂还可以包含适宜的稳定剂或增加活性组分可溶性的药剂，以允许制备高度浓缩溶液剂。
或者，活性成分可以呈粉末形式，在使用以前，用于用适宜溶媒(例如，无菌、无热原水性溶液)进行配制。
还可以将本发明某些实施方案的药物组合物配制成直肠组合物如栓剂或滞留型灌肠剂，使用，例如，常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。
适用于本发明某些实施方案背景中的药物组合物包括这样的组合物，其中以达到预期目的的有效量包含活性成分。更具体地，治疗有效量是指活性成分(下调QSOX1的试剂)的量可有效地预防、缓解或改善障碍(例如，层粘连蛋白相关疾病或病症)的症状或延长接受治疗的受试者的生存期。
确定治疗有效量是在本领域技术人员的能力内，尤其是考虑到本文提供的详细公开内容。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初由体外和细胞培养测定来估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以实现所期望的浓度或滴度。这类信息可以用来更准确地确定在人体内的有用剂量。
层粘连蛋白相关疾病的动物模型包括，例如，肝脏纤维化的鼠动物模型[参见例如以下综述文章：Hiromitsu Hayashi和Takao Sakai1, Amer Journal Physiol - GI (2011) 300(5): G729-G738]和转移性乳腺癌的鼠动物模型[Anna Fantozzi和Gerhard Christofori, Breast Cancer Research (2006) 8:212]。
可以通过在体外、在细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定本文描述的活性成分的毒性和疗效。由这些体外和细胞培养测定和动物研究得到的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。剂量可能会有所不同，这取决于所采用的剂型和所使用的给药途径。确切的配方、给药途径和剂量可以由单个医生考虑到患者的病情来选择。(参见例如Fingl, 等人, 1975, 载于" The Pharmacological Basis of Therapeutics ", 第1章第1页)。
可以单独地调节剂量和间隔以便以足够的量提供活性成分，其足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。对于每种制剂，MEC将有所不同，但可以由体外数据估计。为实现MEC所必要的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测测定可以用来确定血浆浓度。
取决于待治疗病症的严重性和响应性，剂量可以是单次或多次给予，其中治疗过程持续数天至数周或直到实现治愈或实现疾病状态的减弱。
应理解，本发明某些实施方案的抗小鼠QSOX1抗体可用于临床前试验，以确定所述抗体用于治疗的治疗有效量、毒性和功效。
待给予的组合物的量当然将取决于接受治疗的受试者、病患的严重性、给予方式、处方医师的判断等。
如果需要的话，可以以包装或分药器装置来提供本发明某些实施方案的组合物，如FDA批准的药盒，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以，例如，包括金属或塑料箔，如泡眼包装。包装或分药器装置可以伴随有给药说明书。包装或分药器还可以容纳与由管理药品的制造、使用或出售的政府机构规定形式的容器相关的通告，该通告反映了机构批准该组合物或人用或兽用给予的形式。这类通告，例如，可以是由美国食品和药物管理局认可的处方药的标记或批准的产品插页的标记。还可以制备包含配制在相容的药用载体中的本发明制剂的组合物，放置在适当容器中，并标示用于指定病症的治疗，如上文进一步详述的那样。
应理解，因为本发明的分离的多肽(例如抗体)能够特异性地结合QSOX1，和因为QSOX1水平在层粘连蛋白相关的医学病症(例如肿瘤)中会升高，所以这样的多肽可用于诊断层粘连蛋白相关疾病或病症。
因此，依据本发明的一方面，提供了在受试者中诊断层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，包括：(a) 在适合所述分离的多肽与QSOX1蛋白之间形成免疫复合物的条件下使所述受试者的生物样品与本发明的分离的多肽接触；和(b) 检测所述免疫复合物的形成，其中所述免疫复合物的存在超过预定阈值(即得自健康个体的生物样品中的所述免疫复合物的水平)就表明所述层粘连蛋白相关疾病。
本文所用的短语“诊断”是指对层粘连蛋白相关疾病或病症进行分类，确定疾病的严重程度，监测疾病进程，预测疾病的结果和/或恢复前景。
本文所用的“生物样品”是指分离自受试者的组织或液体的样品，包括但不限于，细胞(例如成纤维细胞、神经元细胞、树突细胞、上皮细胞等)、组织、器官、多种肿瘤(例如肿瘤活检样品)和液体例如血液、血清、血浆、淋巴液、胆汁、尿、唾液、痰、滑液，精液、泪、脑脊液，支气管肺泡灌洗液(bronchioalveolar large fluid)、腹水、脓汁、条件培养基，并且也指体内细胞培养成分的样品。“受试者的生物样品”也可任选地包括已经从受试者中物理取出的样品。
依据一个实施方案，本发明的方法能够诊断肿瘤，例如转移性实体瘤(例如前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等)。
依据本发明对层粘连蛋白相关疾病的诊断通过以下来进行：在适合所述分离的多肽(例如抗体)与QSOX1蛋白之间形成免疫复合物的条件下使所述受试者的生物样品与本发明的分离的多肽接触。
本文所用的术语“免疫复合物”是指抗体(例如本发明的分离的多肽)与其特异性抗原(QSOX1蛋白)之间形成的复合物。
本发明的免疫复合物可以在各种温度、盐浓度和pH值中形成，其可因所用的分离的多肽和QSOX1蛋白而变，并且本领域技术人员能够调节适合于各种免疫复合物形成的条件。
依据本发明该方面的方法，检测到免疫复合物形成就表明诊断出所述层粘连蛋白相关疾病或病症。多种方法可用于检测本发明的免疫复合物，本领域技术人员能够确定哪种方法适合于每一种免疫复合物和/或用于诊断的生物样品类型。
例如，可通过常规免疫组织化学或免疫荧光、FACS、ELISA、蛋白质印迹和RIA分析，或通过基于分子量的方法而检测免疫复合物。
应理解，可将本发明某些实施方案的分离的多肽(例如抗体)连接到可检测部分上，以便能够检测免疫复合物。
可将多种类型的可检测部分或报告部分缀合到本发明的抗体上。这些包括但不限于：放射性同位素(例如[125]碘)、磷光化学品、化学发光化学品、荧光化学品(荧光团)、酶、荧光多肽、亲和标签和分子(造影剂)(可通过正电子发射断层照相(PET)或磁共振成像(MRI)检测)。
适宜的荧光团的实例包括但不限于藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-铬、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、得克萨斯红、PE-Cy5等。关于荧光团选择的另外指导，将荧光团连接于各种类型的分子的方法，参见Richard P. Haugland, “Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992–1994”, 第5版, Molecular Probes, Inc. (1994)；美国专利号 6,037,137 (授予Oncoimmunin Inc.)；Hermanson, “Bioconjugate Techniques”, Academic Press New York, N.Y. (1995)；Kay M. 等人, 1995. Biochemistry 34:293；Stubbs 等人, 1996. Biochemistry 35:937；Gakamsky D. 等人, “Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence Resonance Energy Transfer,”载于“Receptor: A Practical Approach,” 第2版, Stanford C.和Horton R. (编著), Oxford University Press, UK. (2001)；美国专利号 6,350,466 (授予Targesome, Inc.)]。当缀合到荧光可检测部分时，可以用来检测抗体的荧光检测方法包括，例如，荧光激活流式细胞术(FACS)、免疫荧光共聚焦显微术、荧光原位杂交(FISH)和荧光共振能量转移(FRET)。
可以将多种类型的酶连接在本发明的抗体上[例如，辣根过氧化物酶(HPR)、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP)]并可以使用ELISA (例如在溶液中)、酶联免疫组织化学测定(例如在固定组织中)、酶联化学发光测定(例如在电泳分离的蛋白混合物中)或本领域中已知的其他方法来检测酶-缀合的抗体[参见例如Khatkhatay MI.和Desai M., 1999. J Immunoassay 20:151-83；Wisdom GB., 1994. Methods Mol Biol. 32:433-40；Ishikawa E. 等人, 1983. J Immunoassay 4:209-327；Oellerich M., 1980. J Clin Chem Clin Biochem. 18:197-208；Schuurs AH.和van Weemen BK., 1980. J Immunoassay 1:229-49)。
亲和标签(或结合对的成员)可以是通过相应抗体可识别的抗原[例如，地高辛(DIG)，其被抗DIG抗体识别)或对于标签具有高亲和力的分子[例如，链霉抗生物素和生物素]。结合亲和标签的抗体或分子可以是荧光标记的或缀合至上文所述的酶。
在本领域中广泛实践的各种方法可以用来将链霉抗生物素或生物素分子连接于本发明的抗体。例如，可以通过生物素蛋白连接酶(例如，BirA)的识别序列将生物素分子连接于本发明的抗体，如在以下实施例部分和在Denkberg, G. 等人, 2000. Eur. J. Immunol. 30:3522-3532中所描述的。或者，可以将链霉抗生物素分子连接于抗体片段，如单链Fv，基本上如在以下所描述：Cloutier SM. 等人, 2000. Molecular Immunology 37:1067-1077；Dubel S. 等人, 1995. J Immunol Methods 178:201；Huston JS. 等人, 1991. Methods in Enzymology 203:46；Kipriyanov SM. 等人, 1995. Hum Antibodies Hybridomas 6:93；Kipriyanov SM. 等人, 1996. Protein Engineering 9:203；Pearce LA. 等人, 1997. Biochem Molec Biol Intl 42:1179-1188)。
缀合至链霉抗生物素的功能部分，如荧光团，可商业上获自免疫荧光流式细胞术试剂的基本上所有主要供应商(例如，Pharmingen或Becton-Dickinson)。
依据本发明某些实施方案，将生物素缀合的抗体结合至链霉抗生物素分子以形成多价组分(例如，抗体的二聚体或四聚体形式)。
表1提供可以缀合到本发明抗体的可鉴定部分的非限制性实例。
表 1
可鉴定部分 氨基酸序列 (GenBank 检索号 ) 核酸序列 (GenBank 检索号 )
绿色荧光蛋白 AAL33912 AF435427
碱性磷酸酶 AAK73766 AY042185
过氧化物酶 CAA00083 A00740
组氨酸标签 GenBank检索号AAK09208的氨基酸 264-269 GenBank检索号AF329457的核苷酸790-807
Myc标签 GenBank检索号AAK09208的氨基酸 273-283 GenBank检索号 AF329457的核苷酸817-849
生物素连接酶(lygase)标签 LHHILDAQ K MVWNHR
橙色荧光蛋白 AAL33917 AF435432
β半乳糖苷酶 ACH42114 EU626139
链霉抗生物素 AAM49066 AF283893
此外，为了分离免疫复合物，可将分离的肽(例如抗体)固定在固体支持物上。本文所用的短语“固体支持物”是指目的试剂(例如本发明的该方面的分离的多肽)可以附着于其上的非水性基质。固体支持物的实例包括但不限于部分或完全由以下形成的固体支持物：玻璃(例如可控孔的玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮。在某些实施方案中，取决于背景，固体支持物可包括测定板的孔；在其它实施方案中固体支持物是纯化柱(例如亲和色谱柱)。该术语也包括不连续固相的离散颗粒，例如美国专利号4,275,149中描述的那些。
上文所述的用于检测免疫复合物形成的试剂可以包括在诊断试剂盒/制品中，优选伴随合适的使用说明书和表明FDA批准用于诊断和/或评价层粘连蛋白相关疾病的标签。
这样的试剂盒可包括例如包含至少一种上述的诊断试剂(例如抗体)的至少一个容器和包装在另一容器中的成像试剂(例如酶、第二抗体、缓冲液、显色底物、荧光材料)。所述试剂盒也可以包括合适的缓冲液和防腐剂，用于改善试剂盒的贮存期。
依据本发明的另一方面，提供了用于在生物样品中检测QSOX1水平的试剂盒。
如以下实施例部分中详述的(参见以下实施例1)，本发明人已经证明了对QSOX1的抑制/耗尽导致基膜中的层粘连蛋白装配缺陷。
因此，依据本发明的另一方面，提供了鉴定QSOX1抑制剂的方法，所述方法包括在测试试剂存在或不存在时培养组织，其中在用所述测试试剂进行培养后功能性基膜的减少就表明所述测试试剂是QSOX1抑制剂。
依据本发明的实施方案，功能性基膜的减少包括基膜中的层粘连蛋白装配的减少。
本文所用的短语“功能性基膜的减少”是指减少达至少约10%，达至少约20%，达至少约30%，达至少约40%，达至少约50%，达至少约60%，达至少约70%，达至少约80%，达至少约90%或达至少约100%。因此，优选无层粘连蛋白并入基膜中。
依据另一实施方案，所述层粘连蛋白装配的减少包括组织中的可溶性层粘连蛋白的增加。
依据另一实施方案，所述组织包括组织培养物。
依据另一实施方案，所述方法在体内进行。
依据另一实施方案，所述方法进一步包括QSOX1活性或表达水平的减少。QSOX1活性或表达水平的减少可以达至少约10%，达至少约20%，达至少约30%，达至少约40%，达至少约50%，达至少约60%，达至少约70%，达至少约80%，达至少约90%或达至少约100%。
本文所用的术语“约”是指±10%。
术语“包含”、“含有”、“包括”、“含”“具有”和它们的同根词是指“包括但不限于”。
术语“由...组成”是指“包括且限于”。
术语“基本上由...组成”是指组合物、方法或结构可包括额外成分、步骤和/或部分，但仅当额外成分、步骤和/或部分并不会实质性改变要求保护的组合物、方法或结构的基本的和新的特征。
本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文中另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，可以以范围形式呈现本发明的多种实施方案。应当理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简要起见，并且不应当解释为对本发明范围的僵硬的限制。因此，应当认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围，以及在该范围内独立的数值。例如，范围描述，如从1至6应当认为具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及该范围内的独立数值，例如，1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度这都适用。
每当在本文中指明了数值范围，就意味着包括在所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“范围在第一个指明的数字和第二个指明的数字之间/在第一个指明的数字和第二个指明的数字之间的范围”以及“范围从第一个指明的数字‘至’第二个指明的数字/从第一个指明的数字‘至’第二个指明的数字的范围”在本文中可交替使用，并且意味着包括第一个和第二个指明的数字以及所有在其间的分数和整数。
本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或由这些从业者根据已知的方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和规程。
应当理解，为了清楚而在单独的实施方案的背景中描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方案中组合而提供。相反，为了简要而在单个实施方案的背景中描述的本发明的各种特征，也可以分别地或以任何适宜的子组合或适合于本发明描述的任何其他实施方案提供。除非实施方案在没有那些要素的情况下是无效的，否则在各种实施方案的背景中描述的某些特征不认为是所述实施方案的必要特征。
在以下实施例中可以找到上文描述的和在所附权利要求书部分要求保护的本发明各种实施方案和方面的实验性支持。
实施例
现在参考以下实施例，其与上文的描述一起以非限制的方式说明了本发明。
通常，在本文中使用的命名法和在本发明中利用的实验室规程包括分子的、生物化学的、微生物学的和重组DNA技术。在文献中充分地解释了这样的技术。参见例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 等人(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"第I-III卷，Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel 等人, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson 等人, " Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren 等人(编著) " Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", 第1-4卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；以下文献中阐述的方法：美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", 第I-III卷，Cellis, J. E., ed. (1994)；"Current Protocols in Immunology" 第I-III卷，Coligan J. E., ed. (1994)；Stites 等人(编著), "Basic and Clinical Immunology" (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (编著), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman和Co., New York (1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中有大量描述，参见 例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)；“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.,和Higgins S. J., 编著. (1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D.,和Higgins S. J., 编著. (1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes " IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology" 第1-317卷， Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak 等人, " Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；所有这些都通过引用结合到本文中，如同完全在本文中阐述的那样。贯穿该文件，提供了其他通用参考文献。认为本领域熟知其中的程序并且提供了这些程序以方便读者。其中包括的所有信息通过引用结合到本文中。
实施例 1
二硫化物催化剂 QSOX1 通过并入关键基膜组分促进肿瘤细胞迁移
材料和实验程序
细胞系和维持
按照供应商的建议，将WI-38肺成纤维细胞(Coriell)维持在补充有15% FBS、L-谷氨酰胺和抗生素的极限必需培养基(MEM)中。将HFF细胞和胰腺成纤维细胞维持在补充有10% FBS、L-谷氨酰胺和抗生素的MEM中。将BxPC-3和H460上皮细胞维持在补充有10% FBS、L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM中。
siRNA转染
按照制造商的说明书(Dharmacon)，将QSOX1特异性的和错义siRNA寡核苷酸转染到成纤维细胞。简而言之，将约75%汇合的细胞接种并与50 nM siRNA和Dharmafect1转染缓冲液在无血清Opti-MEM培养基中孵育6小时。孵育后，吸出转染混合物并将含有10% FBS的MEM加入细胞中。
免疫荧光
将细胞在24-孔板中在玻璃盖玻片上培养至所需的汇合。对于胞内染色，在室温下将细胞用3.7%甲醛固定30分钟，然后在0.1% Triton X-100中透化2分钟，再在含有0.1 % Tween的磷酸缓冲盐水(PBS) (PBS-T)中漂洗3次。然后将细胞与5% BSA的PBS-T孵育1小时，接着与第一抗体(20μg/ml，除非制造商另有说明)的5% BSA的PBS在室温下孵育1小时或在4℃孵育过夜，在PBS中洗涤，再与荧光标记的第二抗体的5% BSA的PBS-T在室温下孵育1小时。再洗涤3次后，将细胞朝下的盖玻片放置在载玻片上的5μl ProLong Gold antifade 试剂液滴(Invitrogen)上，让其在避光处干燥过夜。在DeltaVision成像系统(Applied Precision)上观测样品。对于ECM蛋白标记，将细胞和其相关基质与5% BSA的PBS-T一起孵育并用第一抗体标记。然后将样品用3.7%甲醛固定并用第二抗体处理。
ECM纯化和ThioGlo染色
如结果部分(下文)和附图描述(上文)中所述，将细胞培养物在24孔板中培养和转染。通过用20 mM NH4OH处理1分钟，接着用1 mM EDTA/PBS (pH 7.4)洗涤6次，剥离细胞。最后一次洗涤后，在37 ℃将阳性和阴性对照ECM样品分别用100 mM DTT (在1 mM EDTA/PBS中)或100 mM NEM (自250 mM储液的5%乙腈加入)处理1小时。然后将样品用1 mM EDTA/PBS洗涤4次，再与6 µM ThioGlo试剂在室温下孵育30分钟(避光)。反应通过加入2μl 2 N HCl而终止，然后用ELISA板读板器测定发射(激发: 379 nm, 发射: 513 nm)。
氧消耗测定
Clarke-型氧电极(Hansatech Instruments Ltd.)用于监测溶解氧浓度的变化，作为巯基氧化酶活性的度量。在50 mM磷酸钾缓冲液、pH 7.5、65 mM NaCl、1 mM EDTA中测定纯化的QSOX1。通过在电极反应室中注射二硫苏糖醇(DTT)至浓度5 mM而开始反应。类似地，在将5 mM DTT注射到上清液溶液中之后，测定细胞培养上清液中的巯基氧化酶活性。
质谱分析
凝胶片段在37℃在50 mM碳酸氢铵中用蛋白酶处理。用80% CH3CN、1% CF3COOH从凝胶中提取肽混合物，在真空离心机中蒸发有机溶剂。所得肽混合物在80%甲酸中重配并立即用Milli-Q水稀释1:10，然后质谱分析。进行串联质谱(LC-MS/MS)，使用15 cm反相喷雾熔融硅石毛细管柱(内径75 µm)，所述柱是内部制作并装填了3 µm ReproSil-Pur C18AQ介质(Ammerbuch-Entringen, Germany)，使用UltiMate3000 Capillary/Nano LC系统(LC Packings, Dionex)。LC系统与以阳离子模式操作并配有纳米电喷雾离子源的LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific)结合使用。用50 min的5至65%乙腈梯度(缓冲液A: 5 %乙腈, 0.1%甲酸, 0.005% TFA；缓冲液B: 90%乙腈, 0.2 %甲酸, 0.005% TFA)分离肽。在分辨率设置为60000的值的Orbitrap中获取全面MS扫描。在线性阱中每次扫描至多6个最强离子被分裂和分析。对于肽的分析，以FT方式记录全面扫描，接着通过线性离子阱(LTQ)中的6个最强离子的数据依赖性碰撞-诱导解离(CID)。用MASCOT (Matrix Science, London, UK)针对Swissprot数据库，搜索原始数据文件。
侵袭测定
将成纤维细胞接种在具有8.0 µm孔径的膜插入物的24孔BD BioCoat板的上室。转染细胞并补充rQSOX1，如结果部分(下文)和附图描述(上文)中所述，并让细胞生长4天以达到汇合。在第4天，按照制造商的说明书，将5 x 104 上皮细胞(按照制造商的说明书，用cell-tracker dye CSFE (Molecular Probes)预标记)，铺在成纤维细胞上。内室填充无血清MEM，外室填充含有10% FBS的MEM。让上皮细胞在37℃跨膜迁移24小时。将非侵袭细胞经手工从膜的上面刮除并弃去，将下面的侵袭细胞固定在3.7%甲醛中，成像并定量测定。
细胞粘附测定
将成纤维细胞培养在24-孔板中并进行转染和补充rQSOX1，如结果部分和附图描述中所述。在转染后4天，将成纤维细胞与5% BSA的PBS孵育1小时，并且1组样品补充α6-抗体。用PBS-T洗涤后，将105上皮细胞(用cell-tracker dye CSFE预标记)铺在成纤维细胞上并在37℃孵育1小时。然后用塑料将各板密封并在50 x g倒置离心5分钟以除去细胞。离心后，将仍然附着在板上的细胞经胰蛋白酶消化，重悬于PBS中，并通过流式细胞术计数。
衰老染色
如结果部分和附图描述中所述，转染细胞。在SA-β-Gal染色之前，将细胞用0.5%戊二醛在室温下固定15分钟，接着用PBS/MgCl2 (pH 6.0)洗涤3次。再加入新鲜X-gal溶液，并将细胞在37 ℃避光处孵育3小时。细胞再用PBS洗涤3次并立即成像。
扫描电镜术
将WI-38细胞培养在直径13 mm的盖玻片上。将细胞用3%低聚甲醛和2%戊二醛的0.1 M甲次砷酸盐缓冲液、pH 7.2、5 mM CaCl2、1%蔗糖在室温下固定1小时。用含有1%蔗糖的0.1 M甲次砷酸盐缓冲液漂洗3次(每次5分钟)后，细胞用1% OsO4的0.1 M甲次砷酸盐缓冲液、pH 7.2、5 mM CaCl2、1 %蔗糖在室温下处理1小时。再将样品用0.1M甲次砷酸盐缓冲液洗涤5次，用水洗涤5次，与1%鞣酸孵育5分钟，再用水洗涤5次。将样品在1%乙酸双氧铀中孵育30分钟并再用水洗涤5次。对于脱水，将样品依次在25%、50%、70%、96%、和100%乙醇中各自孵育5分钟。使用FEG-SEM LEO Supra 55电镜，对样品成像。
NF/CAF分离
NF和CAF得自手术切除的肺肿瘤(CAF)或得自同一标本的健康区(NF)。按照机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)的要求，从患者获得已签署的同意书。将组织切碎并在37 ℃在恒定摇动下在含有4型胶原酶的DMEM中孵育过夜。然后将细胞过滤并铺在含有20 % FBS、1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素和60 µM β-巯基乙醇的DMEM中孵育7-14天，然后移入含有10% FBS的培养基中。通过典型形态学、阳性波形蛋白染色和阴性细胞角蛋白染色证实成纤维细胞的身份。将细胞以等分试样冷冻，并在每次实验前7天融化。融化后，将成纤维细胞培养至70%汇合，然后将培养基更换为或对照培养基或H460条件培养基。在48小时进行细胞收获和RNA分析。
条件培养基
将汇合的肺(H460)和胰腺(BxPC-3)上皮细胞在培养板上培养。5天后收集条件培养基并离心以除去碎片。
实时逆转录 -PCR 分析
使用NucleoSpin试剂盒(Macherey Nagel, Germany)提取总RNA。用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和随机六聚体引物将1微克RNA逆转录。在ABI 7300仪器(Applied Biosystems)上使用SYBR Green PCR Master Mix，进行定量实时PCR。使用Primer Express软件设计引物，并通过相同样品中的GAPDH管家基因将表达水平标准化。
组织免疫染色
将来自乳腺癌患者的福尔马林固定的组织脱水，包埋在石蜡中，并切为4 µm的切片。将玻片升温至60 ℃达1小时，在二甲苯中脱蜡并脱水。在3% H2O2/甲醇中进行内源过氧化物酶阻断达10分钟。在TBS中漂洗后，将切片在室温下与针对QSOX1的纯化抗体(1:50)孵育1小时。用Super Picture POLY HRP 缀合物(Invitrogen)进行检测。简而言之，将切片在室温下与POLY HRP缀合物孵育30分钟。用底物发色团AEC使抗体结合可视化。用苏木精对切片复染色并用水性封片液(Glycergel, Dako)加上盖玻片。用光学显微镜检查染色的切片并分析。
微阵列分析
对于层粘连蛋白转录本定量测定，WI-38细胞用siCONTROL、siQSOX1或siQSOX1+rQSOX1处理，并使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA。使用Bioanalyzer 2100平台(Agilent)评价RNA品质。按照制造商的说明书，样品再经处理并使用Affymetrix GeneChip系统，杂交到Affymetrix人2.0 微阵列。
原子力显微镜术
使用胶态(1 µm半径硼硅酸盐)头和0.03 N/m悬臂(Novascan)，在具有Nanoscope 4 controller的Bruker Bioscope上进行AFM测量。在0.5 Hz进行力 - 距离曲线，不扫描样品。使用Herzian模型拟合到新进的曲线，计算弹性模量。对于3个对照样品和2个QSOX1敲减样品的每一个，获取几十条力曲线。
结果
活性 QSOX1 分泌自静息成纤维细胞
先前已经证明，在培养的上皮细胞中瞬时表达的QSOX1定位于高尔基体[Chakravarthi S.等人(2007)。Biochem. J. 404, 403-411]。先前也已指出，神经元和神经内分泌腺中的内源QSOX1定位于高尔基体[Tury A. 等人(2004) J. Endocrinol. 183, 353-363]。本发明人产生了多克隆抗体并证明内源QSOX1定位于内皮细胞和上皮细胞中的高尔基体(图9A-J)。在亚汇合的成纤维细胞中，也发现QSOX1在高尔基体内(图1C-J)。然而，达到汇合后，成纤维细胞中的胞内染色模式发生变化，显示对应于QSOX1向分泌小泡的移动(图9A-J)。
先前已证明QSOX1水平在WI-38成纤维细胞的生长培养基中增加，当所述细胞汇合并进入静息时(Coppock等人, 2000, 出处同上)。WI-38细胞源自肺，肺是富含QSOX1而非其横向同源物QSOX2的组织。本发明人证明了独有的QSOX1转录和蛋白分泌至汇合成纤维细胞的培养基(图1K)。经氧消耗测定而测定，分泌的QSOX1水平随时间增加(图1L)，与巯基氧化酶活性增加相关(图1M)。汇合的细胞培养基中的QSOX1活性相当于40-50 nM野生型重组QSOX1 (rQSOX1) (图9K)。QSOX1分泌显示出是不同来源的汇合成纤维细胞的通常现象。具体地讲，来自胰腺和肺的癌症相关的成纤维细胞(CAF)、正常肺成纤维细胞和人包皮成纤维细胞向生长培养基中分泌QSOX1 (图9L)。相比之下，所测的上皮细胞和内皮细胞，尽管在胞内表达QSOX1，但是甚至在达到汇合后数日都不分泌该酶(数据未显示)。
分泌到成纤维细胞生长培养基中的QSOX1的蛋白质印迹始终显示出SDS-PAGE的双重条带，在约80-90 kD (图1L)。QSOX1转录本的两种已知的剪接变体编码计算分子量约76 kD的可溶性蛋白(包括寡糖修饰)和含有预测的羧基端跨膜片段的约92 kD的蛋白。为了确定经蛋白质印迹所见的两种QSOX1的来源，本发明人从培养上清液中将QSOX1免疫沉淀下来并对这两个条带进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS) (图10A-D)。从下条带回收的肽仅源自这两种剪接变体所共有的区域。然而，从上条带回收的某些肽却来自较长剪接变体的独特区域。未观察到覆盖较长剪接变体的胞质尾或跨膜区的肽。对于这些观察结果，一种可能的解释是生物合成了具有其跨膜区的较长剪接变体，而在分泌途径中或在细胞表面上在翻译后切割而脱去了可溶性胞外域。
胞外 QSOX1 是成纤维细胞粘附所需的
使用小干扰RNA (siRNA)，从成纤维细胞中耗尽QSOX1。用QSOX1-特异性siRNA转染降低了QSOX1 mRNA并分泌低于可检测水平的酶，并且导致胞外巯基氧化酶活性与背景的比率的相应降低(图11A)。转染了QSOX1 siRNA的成纤维细胞的免疫荧光染色显示出极少细胞(约5%)保留了可检测水平的胞内蛋白。QSOX1的耗尽在转染后维持了至少4天(图11B)。
成纤维细胞中的QSOX1耗尽的最明显效应是细胞数量减少(图2A-E)。转染后4天，QSOX1耗尽的细胞计数是对照细胞的约50%。在转染后24小时将50 nM rQSOX1加入到QSOX1耗尽的细胞的培养基中完全恢复了细胞数量。相比之下，加入50 nM催化上无活性的rQSOX1 (rQSOX1-AA)则没有作用，所述rQSOX1中的氨基-末端氧还活性半胱氨酸(C70和C73)被丙氨酸取代(图2F)。通过用催化酶处理对照细胞，排除了正常细胞增殖需要过氧化氢(是QSOX1-介导的二硫化物形成的副产物)的可能性，所述催化酶是将过氧化氢歧化为氧和水的酶，没有可检测的作用(数据未显示)。这些数据确定了具有催化活性的胞外QSOX1和二硫键形成对于培养中的成纤维细胞增殖的重要性。
若干情况可导致在成纤维细胞中的QSOX1耗尽后细胞数量减少。具体地讲，胞外QSOX1活性可以促进细胞增殖，或者QSOX1的缺乏可以诱导细胞凋亡、静息或衰老。膜联蛋白V染色表明，细胞凋亡在QSOX1-敲减细胞中不明显(数据未显示)。根据衰老-相关的β-半乳糖苷酶活性的X-gal染色(图11C-E)，QSOX1敲减不导致细胞衰老。此外，在siRNA处理后4天的碘化丙啶染色表明QSOX1耗尽不导致从细胞周期退出(数据未显示)。发明人注意到在转染后长达48小时，QSOX1耗尽的培养物和对照培养物之间的细胞数量并无明显差异。然而，从第三天起，细胞数量开始偏离，分离的细胞开始出现在QSOX1耗尽的样品的培养基中(图2G-H)。转染后1天将rQSOX1加入到成纤维细胞培养物中，除了如上所述恢复细胞数量之外，还阻止细胞的随后分离。QSOX1耗尽可以加剧有丝分裂细胞粘附的减少，这用于“有丝分裂摇落(mitotic shake-off)”技术，导致细胞从单层上脱去，而不用有意搅动。
QSOX1耗尽导致基膜中的层粘连蛋白装配缺陷
发明人接下来寻求鉴定在胞外QSOX1不存在时导致细胞分离的分子缺陷。胞外基质(ECM)蛋白是粘附受体的主要靶标。先前注意到在汇合的成纤维细胞中各种ECM组分的转录本连同QSOX1 mRNA一起增加(Coppock等人, 1993, 出处同上)。本发明人推论，如果QSOX1是胶原或其它ECM组分中的二硫键形成所必需的，那么QSOX1的耗尽就可导致ECM中过量的非配对半胱氨酸。的确，分离自QSOX1耗尽的成纤维细胞的胞外基质具有增加的反应性硫醇水平，正如通过用硫醇-特异性荧光团ThioGlo1标记所示的那样(图12A)。在siRNA转染后，通过将rQSOX1加入培养基，硫醇水平大部分得以恢复，但加入rQSOX1-AA却不行。这些数据提供了第一指示：QSOX1催化了胞外基质的蛋白内的二硫化物形成。
WI-38成纤维细胞所产生的ECM组分是构成基膜(BM)的那些组分，所述基膜是上皮和内皮下的薄纤维层。发明人在下文中将培养的WI-38细胞所产生的ECM称为BM，虽然将所述基质从其体表和体腔的生理环境中移出。BM的主要成分包括胶原IV和层粘连蛋白(其聚合形成纤维网状物)，以及基底膜聚糖、巢蛋白和集聚蛋白(其将胶原IV和层粘连蛋白支架桥连)。为了确定任何这些BM成分是否受到QSOX1胞外活性的影响，分别用免疫荧光(IF)染色和蛋白质印迹来分析在QSOX1特异性siRNA转染后4天的源自成纤维细胞的细胞和培养基。以此方式，本发明人监测了BM形态学和组成的变化，以及因未能并入BM的蛋白可溶性形式的水平变化。在QSOX1耗尽后，通过蛋白质印迹或IF未检测到胶原IV的显著变化(图12B-Q)。然而，在QSOX1不存在时观察到了层粘连蛋白并入的主要缺陷。QSOX1耗尽后4天，通过蛋白质印迹在培养基中可检测到可溶性层粘连蛋白，并且与对照细胞相比，胞外层粘连蛋白IF染色经测定有74%的减少(图3A-L和4A)。在siRNA转染后，通过外源加入rQSOX1到培养基中，而不是加入rQSOX1-AA，完全恢复了QSOX1耗尽后的层粘连蛋白的变化，表明巯基氧化酶活性是层粘连蛋白并入BM中所必需的。尽管在QSOX1敲减后因为总细胞数量的减少可以预期层粘连蛋白总量的减少，但是发明人发现甚至当相等细胞数量成像时层粘连蛋白水平仍降低(图13A)。另外，细胞分离开始于转染后第3天，而基质中层粘连蛋白的减少在48小时已经可以检测到(图13A)，和胞外蛋白的总含量在对照和QSOX1-耗尽的细胞之间大体相同(图13F)。最终和最重要的是，仅在QSOX1不存在时在培养基中检测到可溶性层粘连蛋白(图4B)，表明是装配中的缺陷，而不仅是数量上的变化。
为了进一步剖析胞外QSOX1在层粘连蛋白装配到基膜中的作用，发明人评价了rQSOX1加入到QSOX1-耗尽的细胞中的浓度和时间依赖性(图13M)。发明人发现在转染后24小时加入50 nM rQSOX1修复了胞外缺陷，例如通过使用siRNA耗尽QSOX1所导致的减少的细胞粘附和缺陷的层粘连蛋白向BM中的并入。较高的rQSOX1浓度(即125 nM)不会使细胞数量或层粘连蛋白装配增加到高于对照细胞或用50 nM rQSOX1处理的QSOX1敲减细胞的水平，表明QSOX1活性不限于高于50 nM时。相比之下，25 nM rQSOX1不足以完全逆转QSOX1耗尽的影响。当在转染后72小时、而非24小时时加入50 nM rQSOX1时，QSOX1耗尽的影响不能被逆转(未显示)。外源酶加入的时间依赖性表明QSOX1和层粘连蛋白的分泌必须在时间相关，否则层粘连蛋白的BM并入的机会窗口就会丧失。
预期层粘连蛋白装配的扰乱也会影响层粘连蛋白结合蛋白。基膜富含层粘连蛋白-相互作用蛋白，包括基底膜聚糖、巢蛋白、集聚蛋白、导蛋白和纤连蛋白。这些蛋白也与胶原IV网络和与细胞表面受体相互作用。发明人观察到可溶性基底膜聚糖、巢蛋白、集聚蛋白和纤连蛋白在QSOX1耗尽的成纤维细胞的培养基中的程度大于在对照细胞的培养基中的程度(图12C-E)。然而，通过IF在QSOX1-耗尽的细胞的BM中检测至多在每种这些蛋白中的微小减少(图12G-I, 12K-M)。这些数据与QSOX1不存在时的层粘连蛋白网络中的缺陷是一致的并且随后影响层粘连蛋白-相互作用蛋白，但是表明与胶原IV或细胞表面蛋白的相互作用在很大程度上足以保持它们的BM并入。
QSOX1影响特定的层粘连蛋白同种型
层粘连蛋白以十字形异三聚体的形式从细胞中分泌，其由3条链组成，称为α、β、和γ。在人体中已知5种α亚基同种型、4种β同种型和3种γ同种型，并且迄今为止已经发现在不同组织和发育时期表达的16种不同的链组合。依据现有的命名法，这些层粘连蛋白类型按其链组成而命名，例如层粘连蛋白-111含有α1、β1和γ1链。用于检测上述层粘连蛋白变化的抗体是针对片段P1的多克隆抗体，片段P1是层粘连蛋白三聚体的高度保守的抗原决定簇。P1抗体因此识别多种层粘连蛋白同种型。对于P1的IF染色仍然表明汇合的WI-38细胞所产生的BM中的多种不同的层粘连蛋白基质的共存在。本发明人注意到在对照和QSOX1敲减样品中都观察到精细的层粘连蛋白基质。然而，仅在对照细胞中发现额外的层粘连蛋白群体，其在标准IF染色程序下出现大的无定形斑块(图13G-H、13K-L))。两种层粘连蛋白群体在相同固定和染色方案下的不同表现表明两种在定性上不同类型的层粘连蛋白的存在，其中仅有一种对QSOX1的存在敏感。随后对染色方案的细化(参见以上的“材料与方法部分”)保留了QSOX1-依赖性层粘连蛋白网络的网状外观，以得到图像例如图3A-L中的那些。
有关WI-38成纤维细胞中表达的层粘连蛋白同种型的信息得自对对照和QSOX1-耗尽的细胞的RNA微阵列分析。发明人发现层粘连蛋白-411、-421、-221和-211在这些细胞中可能最大量表达，并且，除了α1和α2链的转录本的少许增加之外，QSOX1耗尽并不显著改变层粘连蛋白链mRNA水平(下表2)。用特异性抗体的IF染色揭示出在QSOX1耗尽后在BM中的层粘连蛋白的α4链中的极大减少，而α2链却不变(图3M-R和4C)。因此，层粘连蛋白-411或层粘连蛋白-421、而非层粘连蛋白-221或层粘连蛋白-211的并入，是受到胞外QSOX1所影响的精确事件。此外，层粘连蛋白-411或-421同样也对应于使用如上所述的标准IF染色程序所观察到的大的层粘连蛋白斑块。富含α2-链层粘连蛋白的BM区倾向于也富含α4-链层粘连蛋白，但含有α4的基质延伸到含α2层粘连蛋白不足的区域中(图3M-R)。
表 2: 层粘连蛋白同种型的表达水平
基因 siQ vs. siC siQ+r vs. siC siQ+r vs. siQ Level in siC
LAMA1 1.6 1.5 -1.1 6.7
LAMA2 1.5 2.5 1.7 7.8
LAMA3 ND ND ND ND
LAMA4 -1.0 -1.2 -1.2 10.3
LAMA5 ND ND ND ND
LAMB1 1.1 -1.0 -1.1 10.8
LAMB2 -1.3 -1.3 -1.1 8.1
LAMB3 ND ND ND ND
LAMB4 ND ND ND ND
LAMC1 1.1 1.0 -1.0 10.7
LAMC2 ND ND ND ND
LAMC3 ND ND ND ND
使用微阵列分析测定在补充或不补充rQSOX1时用对照siRNA或QSOX1-特异性siRNA处理的WI-38成纤维细胞中的mRNA转录水平。给出了不同样品对之间的倍数变化和对照WI-38细胞中的标准化(相对于所选组的参考mRNA)水平。
使用扫描电镜(SEM)得到对QSOX1-依赖性层粘连蛋白基质的超微结构的了解。SEM揭示了对照WI-38细胞的胞外环境中的聚集的丝状材料的丰度(图5A-F)。没有检测到具有这种外观的材料与QSOX1敲减细胞的关联。总之，使用SEM和IF所得到的观察结果表明QSOX1是仅具有特征性超微结构的特定层粘连蛋白同种型的适当BM装配所必需的。此外，对染色方案的灵敏度表明，与不依赖于QSOX1活性的BM中沉积的那些层粘连蛋白网络相比，QSOX1-依赖性层粘连蛋白网是天然更少稳定地附着在细胞表面或附着在其它BM组分上。
QSOX是肿瘤上皮细胞迁移所需的
层粘连蛋白同种型在转移期间促进和支持肿瘤上皮细胞迁移。先前已发现QSOX1转录本和由LAMA4基因编码的层粘连蛋白α4链的转录本在侵袭性乳腺癌周围的成纤维细胞(与正常乳腺成纤维细胞相比)中显著增加[Finak G.等人(2008) Nature Med. 14, 518-527]。证明QSOX1是含α4层粘连蛋白装配中的特定需要的现有数据表明LAMA4/QSOX1共诱导在癌症相关基质中的机械学结果。为了测试QSOX1胞外活性是否影响肿瘤细胞与周围基质的相互作用，发明人利用器官型侵袭测定(organotypic invasion assay)。该测定监测H460转移性肺上皮细胞(用荧光细胞质染料预先标记)通过WI-38肺成纤维细胞和它们所缔合的BM的预先形成的层而迁移的能力(图5G)。当在成纤维细胞层形成期间QSOX1被耗尽时，上皮细胞迁移被减弱约60% (图6A-O)。当QSOX1-耗尽的成纤维细胞中补充了外源rQSOX1时，肿瘤细胞迁移被重建。然而，加入rQSOX1-AA并不支持迁移。使用胰腺成纤维细胞和上皮细胞获得类似结果，表明在QSOX1耗尽后迁移抑制的普遍性(图14)。对于成对的胰腺成纤维细胞和上皮细胞获得类似结果(图6R-S)，表明QSOX1催化的活性在迁移前的(pro-migratory)ECM的构建中的普遍性。尽管QSOX1-耗尽的成纤维细胞单层比对照更具弹性(图6T)，表明更大的渗透性，但它们不能支持迁移，这与层粘连蛋白在整联蛋白-介导的粘附(肿瘤转移的必要条件)中的已知作用是一致的。
为了排除QSOX1直接作用于肿瘤上皮细胞而促使其迁移的可能性，在成纤维细胞层不存在时进行迁移测定。在培养基中存在或不存在rQSOX1时，定量测定H460通过Matrigel-包被的有孔膜的迁移。加入rQSOX1没有可检测的作用，证明QSOX1不直接促进肿瘤细胞迁移。另外，为了排除在缺乏QSOX1的成纤维细胞层上的肿瘤细胞不良迁移是因为上皮细胞活性减少的可能性，将H460细胞铺在盖玻片上的WI-38成纤维细胞上。在对照上和在QSOX1-耗尽的成纤维细胞上的H460细胞之间，未检测出细胞活力示踪物的摄取上的差异(数据未显示)。总之，这些数据支持以下结论：QSOX1胞外活性确实通过其对基质层的影响而促进肿瘤上皮细胞通过成纤维细胞-分泌的BM的迁移。
在迁移期间，上皮细胞需要 QSOX1 而稳定粘附于 BM
如上所述，在QSOX1-缺陷性单培养物中，成纤维细胞粘附中的缺陷与受干扰的层粘连蛋白装配相关。为了测试上皮细胞通过QSOX1-耗尽的成纤维细胞层而迁移的能力受损是否也是因为粘附缺陷，发明人使用离心分离，评价了上皮细胞粘附。将上皮细胞放在预先形成的成纤维细胞层上，通过施加控制力而比较粘附强度。在经过50g加速5分钟后，H460上皮细胞从QSOX1-耗尽的WI-38成纤维细胞上分离(44.9%分离)比从对照细胞上分离更容易(4.5%分离)。加入rQSOX1到QSOX1-耗尽的成纤维细胞生长培养物上恢复随后铺于其上的上皮细胞的粘附，而加入rQSOX1-AA却不能。发明人得出结论，QSOX1的胞外催化活性促进基质层形成，肿瘤细胞有效地粘附于所述基质层上，从而促进肿瘤细胞迁移。
层粘连蛋白被细胞表面整联蛋白识别，后者是α链和β链的异二聚体，起到细胞-细胞和细胞-基质粘附的基本介质的作用。整联蛋白α6β1是上皮细胞上的层粘连蛋白的主要受体，尽管先前也已证明α6β4和α3β1与层粘连蛋白结合。如果QSOX1敲减的确因层粘连蛋白缺陷而减少了细胞粘附和迁移，发明人将会预期层粘连蛋白受体的直接封闭具有相当的效果。转移性上皮细胞用α6封闭抗体预处理1小时，显示了通过成纤维细胞层及其关联BM的迁移的减少程度类似于在QSOX1敲减后所观察到的那样(图6P)。在离心细胞粘附测定中也证明了抗α6处理的上皮细胞对成纤维细胞-分泌的基质的粘附减少(图6Q)。这些数据与较少层粘连蛋白-整联蛋白相互作用是一致的，其基础是在QSOX1敲减后观察到的粘附和迁移缺陷。
肿瘤上皮细胞和成纤维细胞之间的通讯 (Cross-talk) 诱导 QSOX1 分泌和促进迁移
在体内，在器官和血管周围的BM中嵌入的成纤维细胞通过分泌因子而与上皮和内皮交换信号。现有数据表明QSOX1分泌促进细胞粘附、基膜装配和细胞迁移，所有这些都可支持肿瘤细胞增殖和转移。因为上皮细胞已知不分泌QSOX1，发明人下一步测试了肿瘤细胞是否募集临近的成纤维细胞以诱导QSOX1表达和分泌。为此，用源自H460肺癌细胞系的条件培养基将亚汇合的WI-38细胞(其典型地表达较低水平的QSOX1并且不可检测地分泌它)培养2天。暴露给条件培养基增加了QSOX1自成纤维细胞中的分泌(图7A)。用成纤维细胞和来自胰腺来源的上皮肿瘤细胞重现了这一发现(图7A)。另外，用肿瘤细胞-条件培养基诱导成纤维细胞，促进随后的跨越基质的上皮细胞迁移，其程度大于用正常培养基孵育的程度(数据未显示)。
来自癌症患者的成纤维细胞的离体分析
在上述研究中，发明人在培养的细胞中敲减QSOX1表达，然后将重组酶提供给培养基，以阐明胞外QSOX1的作用。通过这些干扰，发明人发现QSOX1有助于BM中的层粘连蛋白装配和有助于细胞粘附和迁移。为了进一步研究QSOX1在肿瘤进程和转移发展中的作用，发明人开始离体实验系统：来自肺癌患者的原代成纤维细胞。如以上“材料和实验程序”部分中所述，从癌症相关组织(CAF,癌症相关的成纤维细胞)或邻近的健康组织(NF, 正常成纤维细胞)中纯化并维持移植的成纤维细胞。对来自一个患者的细胞的RNA微阵列分析表明CAF样品中的QSOX1转录大于在NF样品中的QSOX1转录，并且这两种细胞类型通过增加QSOX1转录水平而响应用肿瘤衍生的条件培养基的孵育(数据未显示)。3个更多患者的实时PCR分析表明CAF比NF始终表达更高水平的QSOX1(图7B)。这些离体成纤维细胞的蛋白质印迹分析表明QSOX1分泌与转录有关；CAF比NF分泌更多QSOX1，和NF在用肿瘤条件培养基孵育后显示出增强的分泌。
对从乳腺癌患者中切取的肿瘤切片的免疫组织化学染色证实了来自离体成纤维细胞的结论。尽管最突出的QSOX1染色在肿瘤的上皮细胞中很明显，但邻近肿瘤的成纤维细胞比远离生长物的成纤维细胞显示出更强烈的QSOX1染色(图7C-D)。
胞外 QSOX1 的抑制对 BM 装配和肿瘤细胞迁移的控制
现有发现表明QSOX1的抑制可能是控制BM组成并因此控制肿瘤微环境的强有力的策略。本发明人因此开发了针对QSOX1的抑制性单克隆抗体(参见以下实施例2)。与未经处理的细胞或用对照抗体处理的细胞相比，当将这些抗体提供给WI-38成纤维细胞(当它们接近汇合时)的生长培养基时，4天后在培养单层中观察到较少的细胞数量(图8A-K)。此外，在当QSOX1单克隆抗体存在时培养的细胞所产生的BM中观察到层粘连蛋白α4链的极大减少的染色(如以下实施例2所述)。最终，在用QSOX1 siRNA处理的细胞上进行器官型侵袭测定，如上所述，显示了通过成纤维细胞层的肿瘤上皮细胞迁移的重大减少，当成纤维细胞层是在QSOX1抑制剂存在时产生的。综合这些结果表明，由表达和分泌所述酶的细胞所产生的QSOX1的抑制可用于调节BM的组成和功能。
实施例 2
靶向二硫化物催化剂 QSOX1 的抑制性抗体通过阻断二巯基化物 / 二硫化物接替 (Relay) 的第一步而干扰胞外基质形成
材料和实验程序
质粒构建
先前已经描述了用于诱导抗体产生的重组HsQSOX1 [Alon等人(2012) Nature 488, 414-418]。将经密码子优化用于在大肠杆菌中产生蛋白质的ScFv和HsQSOX1合成基因(Genescript)在pET-15b 载体(Novagen)的NdeI和BamHI位点之间克隆。先前已经描述了氨基-末端和羧基-末端的HsQSOX1片段构建[Alon等人(2012) Nature 488, 414-418和Alon 等人(2010) FEBS Lett. 584, 1521-1525]。
HsQSOX133-546
来自人肾mRNA的HsQSOX1同种型b cDNA克隆(ID 4447666)得自Invitrogen，在载体pCMV·SPORT6中。通过PCR，用缺乏信号序列并加入NdeI限制位点的N’-末端正向引物(SEQ ID NO: 39)，以及加入终止密码子接着是BamHI位点的C’-末端反向引物(SEQ ID NO: 40)，扩增所需的构建体。
PCR产物和pET15b表达载体用NdeI和BamHI限制性切割。载体用小牛肠道碱性磷酸酶(CIP)进一步处理以除去5’侧翼磷酸酯并阻止载体的重新连接。His6标签和凝血酶切割位点用直接连接蛋白的His6标签替代。该修饰是通过用NcoI和NdeI限制，接着通过CIP而达到。将编码带侧翼核苷酸的His6的寡核苷酸煮沸并退火，所述侧翼核苷酸产生与NcoI和NdeI限制位点相容的交错末端位点。因为这些寡核苷酸不受限制，而是设计用于酶促限制，所以在退火后经酶促加上磷酸基团，再将引物连接到载体。
最终的表达载体编码SEQ ID NO: 6所示的序列。
重组 HsQSOX1 的表达和纯化
如前所述，表达并纯化注射给小鼠的HsQSOX1 [Alon等人(2012) Nature 488, 414-418]。同样也表达和纯化用于其它目的的HsQSOX1，仅其氨基-末端His6标签在Ni-NTA柱(GE Healthcare)上纯化后被切割。洗脱的酶被交换到20 mM磷酸钠缓冲液、pH 7.4、100 mM NaCl、20 mM 咪唑中，使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)。加入凝血酶(10单位/mg蛋白)并在室温下孵育过夜，用于切割反应。加入PMSF至1 mM以抑制凝血酶，将所述蛋白重新加入Ni-NTA柱。在20 mM磷酸钠缓冲液、pH 7.5、200 mM NaCl、0.5 mM EDTA中通过大小排阻色谱进行进一步纯化。
如前所述地进行氨基-末端和羧基-末端的HsQSOX1片段表达和纯化[Alon等人(2012) Nature 488, 414-418和Alon 等人(2010) FEBS Lett. 584, 1521-1525]。
小鼠抗 HsQSOX1 单克隆抗体的产生
通过先前所述的Kohler-Milstein方法[Kohler G.和Milstein C. (1974) Nature 256, 495-497]产生杂交瘤。5只BALB/c 小鼠(12周龄)用重组HsQSOX1和完全弗氏佐剂(DifcoLboratories)乳剂免疫4次，间隔3周。如前所述[Galfre G.等人(1977) Nature 266, 550-552]，使用聚乙二醇将所选小鼠的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞融合。通过HAT培养基选择杂交瘤细胞。针对HsQSOX1结合和抑制而筛选细胞上清液(参见以下)。用miniPERM生物反应器(Sarstedt)在无血清培养基(DCCM)中大规模产生MAb492.1。
单克隆抗体纯化
将血清通过10,000 MW截止的膜(Thermo)针对20 mM磷酸钠缓冲液(pH 7)而透析，并上样到蛋白G柱(GE Healthcare)。用100 mM甘氨酸缓冲液(pH 3)从柱上洗脱下抗体，并立即用10% 1 M Tris缓冲液(pH 8)中和。
ELISA结合测定
在37℃，用100 µL 5 µg/ml重组HsQSOX1，或含有0.1% tween (PBS-T)的5% BSA的磷酸缓冲盐水(PBS)作为对照，包被96孔板(Nunc)达1小时。各孔用5% BSA的PBS-T在室温下封闭1小时。在室温下将不同的小鼠抗HsQSOX1克隆和亚克隆加入到各孔达1小时。各孔用300 µL PBS-T洗涤3次。将在5% BSA中的缀合到辣根过氧化物酶(HRP)的多克隆山羊抗小鼠抗体以1:2500稀释度加入并在室温下孵育30分钟。各孔用300 µL PBS-T洗涤3次。在加入100 µL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Millipore)后立即在微量板读板器(TECAN)中在630 nm处读取吸光度。
HsQSOX1抑制测定
100 µL体积的反应在96孔板(Nunc)中进行。还原和变性的RNaseA (Sigma)用作模型底物并制备如下。将10 mg RNase溶于1 ml 20 mM磷酸缓冲液、pH 6.5、6 M GuHCl和100 mM DTT，在37℃孵育1小时。在用DDW平衡的PD-10柱(GE Healthcare)上对蛋白脱盐，并通过在412 nm处的DTNB吸光度测定其硫醇含量。将50 nM重组HsQSOX1和不同浓度的单克隆抗体克隆在室温下孵育30分钟。加入200 µM RNase硫醇开始反应，25分钟后用1 mM DTNB淬灭。在微量培养板读板器中在405 nm处测定吸光度。
可变区测序
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)从约11 x 106抗HsQSOX1杂交瘤细胞中提取总RNA。通过使用polydT引物和20单位的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶将500 ng总RNA逆转录为第一链cDNA。如前所述[Benhar I.和Reiter, Y. (2002) Curr. Protoc. Immunol., 第10章，单元10.19B]，使用简并引物扩增轻链可变区，并且使用如前所述[Zhou H. 等人(1994) Nuc. Acids Res. 22, 888-889]用于小鼠scFv库克隆的优化引物来扩增重链可变区。约300 bp的PCR产物用HiYield Gel/PCR DNA片段提取试剂盒(RBCBioscience)进行凝胶提取，并克隆到pGEM-T easy载体(Promega)。使用T7和SP6引物对该插入序列进行测序并通过IMGT数据库分析。通过串联质谱(LC-MS/MS)证实序列[Alon等人(2012) Nature 488, 414-418]。
分析型大小排阻色谱
将100 µL 20 µM HsQSOX1、其片段或MAb492.1上样到用20 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、200 mM NaCl和1 mM EDTA以1ml/min流速平衡的superdex 200柱(GE HealthCare)上。在室温下30分钟共孵育后，注射HsQSOX1或其片段与MAb492.1的复合物(200 µL)。
ScFv表达、纯化和重新折叠
在补充有100 µg/ml氨苄青霉素和30 µg/ml氯霉素的LB培养基中生长的BL21 (DE3) plysS大肠杆菌菌株中产生ScFv492.1。将转化细胞培养在37℃，当细胞在595 nm处达到光密度0.5时，通过加入IPTG至浓度为0.5 mM而进行诱导。诱导后，将细胞在25℃培养过夜。在4000 rpm离心30分钟收获细胞。将细胞沉淀物悬浮于补充有蛋白酶抑制剂的20 mM磷酸钠缓冲液、pH 7.4、500 mM NaCl、和20 mM咪唑中。将细胞裂解物在40,000 x g离心1小时。将沉淀物溶于50 mM Tris缓冲液、pH 8、100 mM NaCl、1 mM EDTA、和0.5 % triton X-100，超声处理3次达30秒钟，再次离心10分钟。弃去上清液，并将超声处理和离心程序重复3次，最后一次不用triton X-100。将沉淀物溶于50 mM Tris缓冲液、pH 7.8、6 M GuHCl、10 mM β-巯基乙醇，在4℃过夜。溶解的scFv在Ni-NTA柱上在变性条件(6 M GuHCl)中纯化，并使用介于pH 6.9和pH 3.8的pH梯度来洗脱。如前所述[Kouhei, T.等人(1998) J. Immunol. Methods 219, 119-129]进行重新折叠。
抑制常数测定
Clarke-型氧电极(Hansatech Instruments)用于监测溶解氧浓度的变化，作为HsQSOX1活性的度量。在50 mM磷酸钾缓冲液、pH 7.5、65 mM NaCl、1 mM EDTA中测定25 nM HsQSOX1和不同浓度的(1-250 nM)纯化MAb492.1。通过在电极反应室中注射二硫苏糖醇(DTT)至浓度200 µM而开始反应。对于不同的MAb492.1浓度进行测量，并计算起始斜率。对于因DTT和MAb492.1的存在所致的氧浓度的背景减少测量3次，将其平均化，并从起始斜率中减去，得到在不同MAb492.1浓度中的HsQSOX1活性速率。将在有和没有抑制剂的存在时HsQSOX1的起始率的比率随抑制剂浓度变化而作图。按照先前所述[Morrison J.F. (1969) Biophys. Biochem. Acta 185, 269-286；Bieth J. G. (1995) Methods in Enzymology 248, 59-84]，将所得曲线拟合到以下等式，获得紧密结合抑制剂的Ki：
其中v0是MAb492.1不存在时的反应速率，vi是不同的MAb492.1浓度存在时的速率，[E0]是总酶浓度(25 nM)，[I0]是总MAb492.1浓度，Ki是所测的抑制常数。
根据基于rdRNase氧化的比色测定而获得的IC50值，使用传统竞争抑制的等式：Ki=IC50/(1+[S]0/Km)，计算scFv492.1的抑制常数。
其中[S]0是起始底物浓度，Km是HsQSOX1对于rdRNase的米氏常数，为320+35 μM。
MAb492.1 Fab - HsQSOX1Trx复合物的纯化和结晶
以1:20木瓜蛋白酶:MAb492.1比率使用活化的木瓜蛋白酶，将浓缩至在PBS中的1.5 mg/ml的纯化MAb492.1在37℃消化。将木瓜蛋白酶(Sigma)溶于PBS、20 mM EDTA中并用20 mM半胱氨酸活化。4小时后使用亮抑酶肽作为抑制剂终止消化作用，并将消化的抗体针对PBS (pH 8)透析。MAb492.1的Fab片段(Fab492.1)经大小排阻色谱，接着经蛋白G纯化而纯化。将纯化Fab492.1与2倍过量的HsQSOX1Trx在4℃孵育1小时，使用大小排阻色谱分离所得复合物，浓度11 mg/ml。在293 K，在含有19% w/v聚乙二醇(PEG) 4 kD、0.4 M磷酸氢二铵的孔溶液中，晶体通过悬滴蒸汽扩散而生长。将晶体移至含有20% w/v PEG 4 kD、25%甘油、0.35 M磷酸氢二铵的溶液中，并快速冷冻。
数据采集
在100 K，在装备有RaxisIV++图像板系统和锇镜的RU-H3R发生器(Rigaku)上采集衍射数据。从空间群P61的晶体，采集数据至2.7 Å分辨率，其晶胞大小为a=b=209.311 Å, c=55.265 Å, α= β= 90°, γ= 120°。使用DENZO和SCALEPACK处理数据和按比例缩放。
结构方案
使用相位器，通过分子置换(MR)测定结构。首先，HsQSOXTrx的结构用于搜索，并找到了合适的旋转和平移方案。然后，具有75%序列同一性的Fab结构恒定区(PDB code 3OKD)用作搜索模型，最终，搜索来自相同Fab模型的无CDR环的可变区。使用CNS进行精修，使用Coot进行模型重建。使用MOLPROBITY，按照无Ramachandran异常值的那些，进行结构验证，并在分辨率范围的上部95%评价结构模型。
细胞侵袭测定
将WI-38成纤维细胞(Coriell)接种到具有8.0 µm孔径的膜插入物的24-孔BD BioCoat板的上室并在不同的MAb492.1浓度或抗β肌动蛋白(对照抗体)存在时让其生长4天以达到汇合。在第4天，按照制造商的说明书，将5 x 104 H460人肺癌上皮细胞(按照制造商的说明书，用cell-tracker dye CSFE (Molecular Probes)预标记)，铺在成纤维细胞上。内室填充无血清MEM，外室填充含有10%胎牛血清的MEM。让标记的H460细胞在37℃跨膜迁移24小时。将非侵袭细胞经手工从膜的上面刮除并弃去，将下面的侵袭细胞固定在3.7%甲醛中，成像并定量测定。
在异种移植实验中，在体内的 HsQSOX1 抑制
如前所述[Goldshaid, L.等人(2010) Breast Cancer Research 12:R29]，培养MDA-MB-231-RFP 乳腺癌肿瘤细胞。将GFP-hTert-WI-38肺成纤维细胞培养在补充有15% FCS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和抗生素的MEM培养基中。
根据机构实验动物护理和使用说明，将26只6周龄的雌性CD-1裸鼠，分为6组(参见下表6)，饲养并处理。实验程序得到魏茨曼科学研究所的机构动物护理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at the Weizmann Institute of Science)(Rehovot, Israel)的批准。
为了开始实验，给3组小鼠在左底部乳腺脂肪垫中注射悬浮于50 µL PBS中的107收获的成纤维细胞和106收获的肿瘤细胞的混合物。给其它2组类似地注射单独肿瘤细胞。注射后4天，开始用MAb492.1处理。将不同剂量的MAb492.1 (参见下表6)在200 µL PBS中制备并且经静脉内(IV)给予，每周2次。注射细胞后1周，将小鼠在In Vivo Optical成像系统(IVISR100/XFO-12, Xenogen Corp., Alameda, CA, USA)中成像，使用荧光素生物发光，以证实定位肿瘤的形成。成像前，给小鼠经腹膜内(IP)注射1.5 mg D-荧光素并通过注射50 µL 85:15氯胺酮:赛拉嗪的混合物而麻醉。注射细胞后5周，如上所述麻醉小鼠并在荧光显微镜下成像以鉴定膝后窝和腋下淋巴结的转移。在实验开始后5周，用戊巴比妥处死动物。
MAb492.1特异性测定
将哺乳动物QSOX1酶MmQSOX1(野生型和3种突变体)、CpQSOX1和RnQSOX1克隆，表达和纯化，正如对于HsQSOX1的那样(如上所述)。使用氧消耗测定(如上所述)并使用200 µM DTT作为底物，评价50 nM的这些酶的活性。也测定250 nM或1 µM MAb492.1存在时的活性，并与MAb492.1不存在时的活性进行比较。
MmQSOX1Trx纯化和结晶
按照用于HsQSOX1的那样，将MmQSOX1Trx克隆和表达。类似于HsQSOX1纯化而进行纯化，不同之处在于Ni-NTA色谱在20 mM Tris缓冲液、pH 8.5、500 mM NaCl、20 mM咪唑中进行，用于结合，和250 mM咪唑用于洗脱。将洗脱的酶立即上样到大小排阻色谱柱中并在10 mM Tris缓冲液、pH 8.5、100 mM NaCl中纯化。在293 K，在含有7% w/v PEG一甲基-乙醚2 kD、0.1 M乙酸钠pH 4.6、5% DMSO的孔溶液中，晶体通过悬滴蒸汽扩散而生长。悬滴中的蛋白浓度为13 mg/ml，并且其中补充有1单位凝血酶/ 0.4 mg蛋白。将晶体移至含有15% w/v PEG一甲基-乙醚2 kD、25 %甘油、0.1 M乙酸钠pH 4.6的溶液中，并快速冷冻。
MmQSOX1Trx数据采集和结构溶液
在100 K，在装备有RaxisIV++图像板系统和锇镜的RU-H3R发生器(Rigaku)上采集衍射数据。从空间群P21的晶体，采集数据至2.05 Å分辨率，其晶胞大小a= 42.48Å, b=116.38 Å, c= 50.02Å, α= γ = 90°, β= 103.1°。使用DENZO和SCALEPACK处理数据和按比例缩放。通过MR，使用HsQSOX1Trx结构作为搜索模型，测定MmQSOX1Trx的结构。使用CNS进行精修，使用Coot进行模型重建。使用MOLPROBITY，按照无Ramachandran异常值的那些，进行结构验证，并在其分辨率范围的上部70%评价结构模型。
结果
结合并抑制 HsQSOX1 的抗体克隆的选择
细菌中产生的重组人QSOX1 (下文称为HsQSOX1) [Alon等人(2012) Nature 488, 414-418]用于在小鼠中诱导抗体的产生，并产生杂交瘤。使用标准ELISA测定，针对HsQSOX1结合而筛选杂交瘤上清液。从筛选的约500个克隆中，选择5个最高结合物用于亚克隆。通过ELISA测试每个亚克隆的结合。选择约30个亚克隆用于抑制测定。
使用体外巯基氧化酶活性测定，测试抑制。为了避免抗体还原，首先选择温和的还原底物，还原和变性的RNase A (rdRNase)。在高浓度的不同纯化抗体亚克隆存在时，rdRNase经历HsQSOX1的氧化，过一段时间后通过与5,5'-二硫基二-(2-硝基苯甲酸) (DTNB)反应而定量测定残余的硫醇基。反应结束时，高DTNB反应性表明溶液中存在着高浓度硫醇基，其用于指示HsQSOX1抑制。在该测定中，源自一个特定克隆的抗体亚克隆显示出良好的HsQSOX1抑制。选择一个亚克隆，MAb492.1(归类为IgG1同种型)，用于进一步研究。
抑制常数的测定
在不同浓度的MAb492.1下测试HsQSOX1抑制。当首次使用用250 nM HsQSOX1的DTNB测定时，观察到IC50为240+30 nM。因为测定中该数值密切对应于与酶浓度，表明在测定条件下MAb492.1对HsQSOX1的近化学计量的结合和有效抑制。当HsQSOX1浓度减低至50 nM时，观察到IC50为60 ± 10 nM (图15A)。再次，该值约等于酶浓度，进一步支持紧密结合和有效抑制。使用氧消耗测定，研究了较低酶和抗体浓度，所述测定监测当溶解氧被HsQSOX1还原为过氧化氢时，溶解氧的降低率。该测定允许直接测定初始速率而不仅是活性程度。尽管强还原剂二硫苏糖醇(DTT)用作该实验中的电子供体，选择DTT浓度，以保持抗体的完整性(图15C)。使用25 nM HsQSOX1和不同浓度的MAb492.1，根据实验计算反应速率。将结果拟合到用于紧密结合抑制剂的模型，得到表观抑制常数为1.0 ± 0.3 nM (图15B)。MAb492.1在氨基-末端Trx1结构域结合HsQSOX1(图1A)，并阻止底物靠近氧还活性的二-半胱氨酸基序的活性位点，表明MAb492.1是竞争抑制剂。在竞争抑制剂存在时的反应速率典型地随底物浓度而变化，因此表观Ki不一定代表实际Ki。然而，MAb492.1抑制不依赖底物浓度(图15D)，暗示MAb492.1-HsQSOX1复合物的解离相对于实验的时间范围而言是缓慢的，并且不受底物诱导。在这些条件下，表观抑制常数变为实际抑制常数。
在 HsQSOX1 上的抗体结合位点的测定
先前观察到禽类QSOX的有限蛋白水解产生两个稳定片段。对于哺乳动物QSOX1酶进行了类似观察，并且先前使用X射线晶体学，已经测定了人QSOX1、HsQSOX1Trx和HsQSOX1Erv (图1A-B)的两个片段的结构[Alon A.等人(2010) FEBS Lett. 584, 1521-1525；Alon 等人(2012) Nature 488, 414-418]。为了测定HsQSOX1Trx或HsQSOX1Erv中的MAb492.1残基的结合位点，发明人在细菌中产生了这两个片段的每一种并且进行了两次互补结合测定。在第一测定中，通过ELISA，将MAb492.1与HsQSOX1Trx或HsQSOX1Erv的结合同与全长HsQSOX1的结合进行比较。含有Trx1和Trx2结构域的HsQSOX1Trx，结合MAb492.1的程度等同于全长HsQSOX1 (图16A)。另一方面，HsQSOX1Erv在任何测试浓度时都不结合MAb492.1。第二结合测定使用大小排阻色谱。在有和没有MAb492.1的存在时测定HsQSOX1、HsQSOX1Trx和HsQSOX1Erv的迁移概况。在与MAb492.1一起孵育后，HsQSOX1和HsQSOX1Trx的迁移概况均偏移，但HsQSOX1Erv的迁移不受影响(图16B-D)，证明了这一结论：MAb492.1结合到HsQSOX1的氨基-末端部分。
MAb492.1抗体克隆的测序和单链可变片段的构建
通过逆转录和PCR，自杂交瘤克隆，测定MAb492.1的序列。用相对小的简并引物组扩增轻链可变区。相比之下，使用相当的引物混合物却不能扩增重链可变区，这与先前所观察到的扩增重链的相对困难是一致的。因此，采用对小鼠scFv库克隆的优化引物扩增MAb492.1重链。将每个扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。如前所述[Lefranc M. P. 等人(2004) Nuc. Acids Res. 33, 593-597]，使用ImMunoGeneTics (IMGT)数据库相关工具来分析这些序列(参见下表3)，并证实其是生产性重排的序列。所述可变区显示出与小鼠所产生的抗体可变区的数据库条目超过94%的同一性。也通过纯化MAb492.1的串联质谱(LC-MS/MS) (参见下表3)证实了这些序列。
表 3: MAb492.1 可变区氨基酸序列
按照以上“材料和实验程序”中所述，得到MAb492.1的轻链序列和重链序列。用DTT处理后的MAb492.1在SDS-PAGE中显示2个条带，上条带对应于重链，下条带对应于轻链。各条带在凝胶中用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶和AspN消化。图表显示在用胰蛋白酶或用胰凝乳蛋白酶和AspN切割后的经LC-MS/MS至少1次检测的代表性肽。
自MAb492.1鉴定的可变区用于构建单链抗体片段(scFv)。scFv由氨基端的重链可变域、羧基端的轻链可变域和连接它们的[Gly4Ser]3接头组成。编码scFv的序列经优化用于在大肠杆菌中表达，并将该序列克隆到在氨基端具有凝血酶-可切割的His6-标签的表达载体中。纯化的scFv，称为scFv492.1，是得自细菌中产生的包涵体，并经重新折叠而获得功能性材料。基于rdRNase氧化，在比色测定中测试重新折叠的scFv492.1并显示出抑制50 nM HsQSOX1的IC50为250±30 nM (图17)。从该IC50值可以直接求出130+20 nM的抑制常数，因为scFv492.1是竞争抑制剂。scFv492.1很可能与MAb492.1在同一位点结合HsQSOX1，阻止底物氧化，但不能认为是紧密结合抑制剂，因为在相同实验条件下需要5倍过量以抑制HsQSOX1。
在 HsQSOX1 上的抗体结合位点的测定
制备源自MAb492.1的Fab片段，用于与HsQSOX1Trx共结晶。自纯化的MAb492.1，经木瓜蛋白酶消化而产生Fab。基于rdRNase氧化，通过比色测定来测试Fab结合和抑制HsQSOX1的能力。发现Fab492.1抑制50 nM HsQSOX1的IC50为100± 20 nM (图18)，是对于全长MAb492.1的IC50值的2倍。MAb492.1的亲合力是Fab片段的亲合力的2倍，表明Fab492.1维持紧密结合行为。
HsQSOX1Trx–Fab492.1复合物的结构测定至2.7Å分辨率(下表4)。晶体结构表明Fab492.1识别氨基末端结构域，Trx1 (图19A)。具体地讲，Fab492.1结合到活性位点，遮蔽了CXXC基序和围绕它的大的表面积。界面区计算为948.7 Å2。所有6个CDR都参与了结合(图19B)。重链负责大部分相互作用(图20B和下表5)，包括CXXC基序的掩蔽，使用所有3个CDR。负责40% HsQSOX1Trx – Fab492.1界面(407.6 Å2)的轻链，在连接与Trx1结构域的c-末端螺旋的β片层的环上，结合远离活性位点的大的表面积(图19C)。该区与含有活性位点的重链所结合的表面产生连续表面。轻链通过疏水性相互作用和氢键网络而结合Trx1 (图20A和下表5)，推测相对于活性位点而稳定重链定向。与Fab492.1复合的HsQSOX1Trx结构显示出与未复合的HsQSOX1Trx结构的极少偏差，表明MAb492.1并不破坏HsQSOX1Trx结构，而仅仅是阻断底物进入活性位点。
表 4: 数据采集和精修统计
括号内的值对于最高分辨率壳
a Rsym = Σ hkl Σ i |Ii (hkl) - <I(hkl)>|/Σ hkl Σ i Ii (hkl)，其中Ii (hkl)是所观测的强度，<I(hkl)>是i次观测的平均强度。
b Rwork, Rfree = Σ||F obs| - |F calc||/Σ|F obs|，其中F obs和F calc分别是所观测的和计算的结构因子。一组反射(6.8%)从精修中排除并用于计算Rfree 。
表 5: Fab492.1 – HsQSOX1Trx 相互作用
在共培养中抑制 HsQSOX1 以测定通过基膜的肿瘤细胞迁移
测试MAb492.1抑制ECM层的成纤维细胞产生的能力，所述ECM层支持肿瘤细胞侵袭。通过在不同的MAb492.1浓度存在时首先允许WI-38成纤维细胞达到汇合并累积ECM超过4天，进行器官型侵袭测定。对于对照，加入β肌动蛋白的抗体。然后，将荧光标记的H460肺肿瘤细胞放在成纤维细胞上。24小时后，对于在每个样品中的渗透成纤维细胞层和相关ECM的细胞进行计数(图21A-O和22)。与未经处理的样品相比，用250 nM和500 nM MAb492.1处理的样品显示出较少的肿瘤细胞侵袭，证明MAb492.1在细胞培养中可以阻断肿瘤细胞迁移。用50 nM MAb492.1处理的样品在肿瘤细胞侵袭上没有显示出差异，表明基于所计算的抑制常数，测定中的HsQSOX1浓度为约50 nM以下。
在异种移植实验中，在体内抑制 HsQSOX1 用于防止或减少转移
为了证明在体内的HsQSOX1抑制可以调节BM组成并可防止、减缓或消除肿瘤细胞迁移，需要同时包括肿瘤细胞和肿瘤相关的成纤维细胞的动物模型。MAb492.1显示出针对HsQSOX1的大的特异性(数据未显示)，消除了当QSOX1从动物成纤维细胞中分泌时，研究在体内抑制QSOX1的选项。为了克服该障碍，在裸鼠(因缺乏胸腺或胸腺缺陷所致的具有受到抑制的免疫系统的小鼠)上进行了异种移植测定，所述测定涉及将活细胞从某一物种向另一物种移植。将不同组成的细胞注射和不同的治疗(概述于下表6)给予6组小鼠，每组各包含3-5只雌性裸鼠。
将人乳腺癌细胞以及人成纤维细胞的化合物注射到3组小鼠的乳腺脂肪垫。2组仅接受乳腺癌细胞，以证实由分泌的HsQSOX1、而非定位于肿瘤本身的胞内HsQSOX1支持转移性生长。最后一组不移植任何人体细胞，以测试MAb492.1对健康动物的作用。所用的人的永生化成纤维细胞是GFP-hTERT-WI-38成纤维细胞。含有红色荧光蛋白(RFP)和萤光素酶的MDA-MB-231乳腺癌细胞用作肿瘤细胞。作用于荧光素而发光的萤光素酶的表达，允许通过实验进程期间的生物发光成像而监测肿瘤细胞迁移。重要的是，生物发光成像在组织中具有大的信噪比，并且可以非侵袭性地在活体动物中检测所产生的信号。1周后，使用荧光素生物发光来证实定位于乳腺脂肪垫的肿瘤形成(图23)。细胞接种后4天，多组小鼠(参见下表6)开始接受不同剂量的MAb492.1治疗。注射细胞后5周，通过癌细胞发射的荧光，评价向腋下和膝后窝淋巴结的转移进程(参见下表6)。
其它动物表现出两种主要趋势。首先，与仅接受MDA-MB-231细胞的动物相比，接受MDA-MB-231癌细胞以及人成纤维细胞的动物出现较大肿瘤，产生较多的转移。这一观察结果强化了已经建立的概念：分泌自肿瘤相关的成纤维细胞的基质成分是癌症进展的基础。所观察的第二作用是，在同时接受成纤维细胞和MDA-MB-231细胞的动物中，与未经治疗的或经较低剂量治疗的动物相比，用较高MAb492.1剂量(即30 mg/kg)治疗的那些具有较少的癌细胞淋巴结浸润(参见下表7)。还可以进一步优化MAb492.1的剂量和给药方案。
重要的是，接受MAb492.1注射、而未接受细胞的3只动物在实验期间显示出无异常行为，并且在尸检中也未见炎症指征。正如预期的，MAb492.1没有可见的副作用。
表 6: 异种移植实验
表 7: 异种移植实验概述
针对 HsQSOX1 的 MAb492.1 特异性
在其它哺乳动物QSOX1酶上测试MAb492.1的抑制活性，以检查其特异性。重组小鼠(Mus musculus) QSOX1，MmQSOX1，与重组HsQSOX1具有79%序列同一性。氧消耗测定显示MAb492.1对MmQSOX1无作用，甚至在微摩尔浓度时(图24)。来自褐鼠(Rattus norvegicus)的QSOX1即RnQSOX1，和来自豚鼠(Cavia porcellus)的QSOX1即CpQSOX1，两者与HsQSOX1都具有79%序列同一性，并且它们的活性也不受MAb492.1的影响(图24)。HsQSOX1的Trx1结构域序列与其它QSOX1酶的相应区的比对显示，在CGHC氧还活性基序附近的序列是相同的(图25)。然而，抗体轻链和CDR H3序列(HsQSOX1106-152)所结合的HsQSOX1区揭示了与其它QSOX1酶相比的少许不同(图25)。具体地讲，Pro 116 (其良好适合MAb492.1的疏水性CDR L3侧链间的缝隙)在其它哺乳动物QSOX1酶中被丙氨酸置换。显示序列差异的另一区是HsQSOX1的V135-V138，对应于MmQSOX1的Thr138-Gly141。
为了确定氨基酸序列中的这些差异如何影响QSOX1直系同源物的结构，将MmQSOX1Trx结晶，并解析其结构。2个MmQSOX1Trx分子存在于不对称单元中。在Pro116附近的HsQSOX1Trx-Fab492.1复合物结构与MmQSOX1Trx结构的比较(图26)显示，置换Pro116的丙氨酸残基不能够填充MmQSOX1和Fab492.1之间的推定复合物的疏水性缝隙，而Pro116却能够。另外，丙氨酸置换脯氨酸，影响附近的主链位置和MmQSOX1的Asn117 (对应于HsQSOX1的Asn114)的旋转异构体。因此，在MmQSOX1 Asn117和CDR L3的Tyr92之间预计有冲突(图26, 右)。另外，与来自HsQSOX1的相应的V135-V138环相比，来自MmQSOX1分子之一的Thr138-Gly141环更接近CDR H3的Tyr100 (图26, 左)。
根据以上观察结果，构建了在独特位置中模拟HsQSOX1的3种MmQSOX1突变体。在这些突变体上测试了MAb492.1抑制，以鉴定干扰MAb492.1-MmQSOX1复合物形成的残基。在MAb492.1存在时，第一突变体, MmQSOX1 A119P的活性显示出约40%活性(图27)。在MAb492.1存在时，第二突变体, MmQSOX1 TLPG (138-141)VFPV (以下称为TLPG突变体)显示出约50%活性，而第三突变体(其同时包含上述2个突变)受到MAb492.1的抑制，其程度等同于HsQSOX1。这些结果证实与MmQSOX1相比，仅少数几个残基(至多4个突变残基)决定了MAb492.1针对HsQSOX1的特异性。
根据这些观察结果，基于抗体CDRs或周围区的少量突变，抑制MmQSOX1和可能其它哺乳动物QSOX1直系同源物的MAb492.1变体的产生是可能的。提示MAb492.1中的突变可以产生抑制MmQSOX1的抗体(列举于下表8)。也可利用这些突变的组合。
表 8: MAb492.1 中的可能突变，以产生靶向 MmQSOX1 的抗体
CDR 可能的突变
H3 Tyr100Asn
H3 Tyr100Asp
H3 Tyr100Gly
H3 Tyr100Ser
H3 Ala101Gly
L3 Tyr92Asn
L3 Tyr92Asp
L3 Ser93Gly
L3 Ser93Ala
虽然已结合其具体实施方案描述了本发明，显然，本领域技术人员了解许多替换、修改和变化。因此，它意图包括落在所附权利要求的精神和广阔范围内的所有这类替换、修改和变化。
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用全部结合到本说明书，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请明确地并且单独地指出通过引用结合在此一样。另外，在本申请中任何参考文献的引用或标识不应解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在使用部分标题的程度上，它们不应该解释为进行必要限制。

Claims (56)

1. 抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配的方法，所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制或阻止基膜中的层粘连蛋白装配。
2. 抑制经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移的方法，所述方法包括使组织与抑制QSOX1活性或表达的试剂接触，从而抑制经由包含层粘连蛋白的基膜的细胞迁移。
3. 权利要求2的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
4. 权利要求1或2的方法，其中所述组织是肿瘤组织。
5. 权利要求1或2的方法，其中所述组织包含成纤维细胞。
6. 权利要求1或2的方法，其中所述方法在体内进行。
7. 在有需要的受试者中治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的抑制QSOX1活性或表达的试剂给予所述受试者，从而在所述受试者中治疗所述层粘连蛋白相关疾病或病症。
8. 治疗有效量的抑制QSOX1活性或表达的试剂在制备经鉴定用于在有需要的受试者中治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的药物中的用途。
9. 权利要求7的方法，或权利要求8的用途，其中所述层粘连蛋白相关疾病或病症是肿瘤。
10. 权利要求9的方法或用途，其中所述肿瘤是转移性实体瘤。
11. 权利要求9的方法或用途，其中所述肿瘤是腺癌。
12. 权利要求9的方法或用途，其中所述肿瘤选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、脐尿管癌、阴道癌、结肠癌、食道癌、胰腺癌、喉癌、胃癌和髓细胞性白血病。
13. 权利要求7的方法，或权利要求8的用途，其中所述层粘连蛋白相关疾病或病症与纤维化相关。
14. 权利要求1、2或7的方法，或权利要求8的用途，其中所述层粘连蛋白包含α4链。
15. 权利要求1、2或7的方法，或权利要求8的用途，其中所述层粘连蛋白是层粘连蛋白-411或层粘连蛋白-421。
16. 权利要求7的方法，或权利要求8的用途，其中所述试剂是多肽试剂。
17. 权利要求16的方法或用途，其中所述多肽试剂选自抗体、抗体片段或肽。
18. 权利要求16的方法或用途，其中所述多肽试剂针对所述QSOX1的氨基酸坐标34-266。
19. 权利要求17的方法或用途，其中所述抗体是MAb492.1并且包含互补决定区(CDRs) SEQ ID NOs: 29-34。
20. 权利要求17的方法或用途，其中所述抗体片段是scFV492.1并且包含CDRs SEQ ID NOs: 29-34。
21. 权利要求7的方法，或权利要求8的用途，其中所述试剂是多核苷酸试剂。
22. 权利要求21的方法或用途，其中所述多核苷酸试剂选自反义、siRNA、小RNA、核酶和脱氧核酶。
23. 分离的抗体，其包含抗原识别域，所述抗原识别域在介导支持细胞迁移的基膜装配中特异性地结合QSOX1和抑制QSOX1活性。
24. 权利要求23的分离的抗体，其中所述活性通过胞外基质的免疫荧光(IF)染色测定或检测可溶性层粘连蛋白的蛋白质印迹测定中的至少一种而测定。
25. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
26. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体选自Fab片段、Fv片段、单链抗体和单域抗体。
27. 权利要求23的分离的抗体，其中所述QSOX1是人QSOX1。
28. 权利要求23的分离的抗体，其中所述QSOX1是鼠QSOX1。
29. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
30. 权利要求29的分离的抗体，其中所述单克隆抗体是MAb492.1并且包含CDRs SEQ ID NOs: 29-34。
31. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
32. 权利要求31的分离的抗体，其中所述单链抗体是scFV492.1并且包含CDRs SEQ ID NOs: 29-34。
33. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体或抗体片段是人源化的。
34. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
35. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体被固定在固体支持物上。
36. 权利要求23的分离的抗体，其中所述抗体连接到可检测部分。
37. 权利要求23的分离的抗体，包含SEQ ID NOs: 7和8所示的氨基酸序列。
38. 权利要求23的分离的抗体，包含SEQ ID NOs: 27和28所示的氨基酸序列。
39. 药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求23-27、29-34或37-38中任一项的分离的抗体和药学上可接受的载体。
40. 在有需要的受试者中预防或治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求39的药物组合物。
41. 权利要求23-27、29-34或37-38中任一项的分离的抗体在制备经鉴定用于在有需要的受试者中治疗层粘连蛋白相关疾病或病症的药物中的用途。
42. 权利要求40的方法，或权利要求41的用途，其中所述层粘连蛋白相关疾病或病症是肿瘤。
43. 制品，其包含权利要求23-27、29-34或37-38中任一项的分离的抗体，所述抗体被包装在包装材料中并且在所述包装材料内或上的印刷中标识为用于治疗层粘连蛋白相关疾病或病症。
44. 分离的多核苷酸，其编码权利要求23-34或37-38中任一项的抗体。
45. 分离的多核苷酸，其包含编码互补决定区(CDR)的核酸序列，所述CDR含有具有SEQ ID NOs: 29-34所示的CDR的多肽。
46. 在受试者中诊断层粘连蛋白相关疾病或病症的方法，包括：
(a) 在适合所述分离的多肽与QSOX1蛋白之间形成免疫复合物的条件下使所述受试者的生物样品与权利要求35或36的分离的多肽接触；和
(b) 检测所述免疫复合物的形成，其中所述免疫复合物的存在超过预定阈值就表明所述层粘连蛋白相关疾病，
从而在所述受试者中诊断所述层粘连蛋白相关疾病或病症。
47. 试剂盒，用于在包含权利要求23-38中任一项的抗体的生物样品中检测QSOX1水平。
48. 鉴定QSOX1抑制剂的方法，所述方法包括在测试试剂存在或不存在时培养组织，其中在用所述测试试剂进行所述培养后功能性基膜的减少就表明所述测试试剂是所述QSOX1抑制剂。
49. 权利要求48的方法，其中所述功能性基膜的减少包括所述基膜中的层粘连蛋白装配的减少。
50. 权利要求48的方法，其中所述层粘连蛋白装配的减少包括所述组织中的可溶性层粘连蛋白的增加。
51. 权利要求48的方法，其中所述组织包括组织培养物。
52. 权利要求48的方法，其中所述方法在体内进行。
53. 权利要求48的方法，进一步包括QSOX1活性或表达水平的降低。
54. 分离的多肽，其包含QSOX1的氨基酸序列，所述肽长度小于500个氨基酸。
55. 分离的多肽，其包含SEQ ID NO: 6所示的QSOX1的氨基酸序列。
56. 产生抗体的方法，所述抗体包含抗原识别域，所述抗原识别域在介导支持细胞迁移的基膜装配中特异性地结合QSOX1和抑制QSOX1活性，所述方法包括：
(a) 用重组QSOX1多肽免疫小鼠；
(b) 自步骤(a)的所述小鼠脾细胞产生杂交瘤，包括使所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合；和
(c) 选择阳性杂交瘤，
从而产生包含所述抗原识别域的所述抗体，所述抗原识别域特异性地结合所述QSOX1。
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