CN116284372B - 抗i型胶原氨基末端肽的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗I型胶原氨基末端肽(NTX)的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述单克隆抗体中,轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,轻链CDR2的氨基酸序列为LMS,轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。上述抗I型胶原氨基末端肽的单克隆抗体或其抗原结合片段具备抗I型胶原氨基末端肽的高亲和力和高特异性,能够用于制备灵敏、特异的I型胶原氨基末端肽检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种抗I型胶原氨基末端肽(NTX)的单克隆抗体及其应用。
背景技术
骨质疏松症是以骨量减少、骨显微结构损害、骨脆性增加和骨折风险增高为特征的全身性骨骼疾病。骨质疏松一般多见于老年人,尤其是绝经后的妇女,但各个年龄段均可能发病。根据流行病学调查结果,我国有2亿以上的人群存在低骨量问题,女性骨质疏松症患病率达20.7%,男性为14.4%,因骨质疏松导致的骨折呈逐年攀升趋势,严重影响患者的生活质量,并且给社会造成沉重的医疗负担,成为广泛关注的公众健康问题。骨质疏松的发生是一个缓慢、渐进的过程。骨质疏松症患者在早期常无明显症状,后期可出现全身疼痛、脊柱变形、骨折等一系列的症状,其严重后果是发生骨质疏松性骨折,即脆性骨折,致残率和致死率高。更早发现骨代谢的异常,诊断骨质疏松症,有利于及时采取适当的干预措施预防骨质疏松症发生发展,提高患者生活质量,减轻个人、社会经济负担。
人体骨骼系统终身持续进行骨代谢过程,即成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨的过程,二者保持着动态平衡,也称为骨转换(骨吸收和骨形成)的动态平衡。当此平衡受到破坏,骨吸收增多,或者骨形成减少,使骨吸收超过骨形成,则会导致骨质疏松。成骨细胞和破骨细胞合成与分解的产物构成了骨转换标志物(bone turnover markers,BTMs),对这些标志物的检测可及时反映骨平衡状态。虽然骨密度检测目前常用于诊断骨质疏松症,但其对于骨质疏松症早期诊断、骨折风险预测的敏感性仍不尽人意,对于骨质疏松症治疗疗效判断又欠缺即时性,存在一定的限制。骨密度用于检测药物疗效其治疗前后变化有明显统计学差异至少需要6个月以上,通常为1-2年,因此不适合短期的随访监测。而骨转换标志物一方面其水平变化显著早于骨密度的改变,能够更早期发现骨代谢异常,有助于骨质疏松症的早期诊断;另一方面,在开始抗骨质疏松治疗后3-6个月后即可检测出骨吸收标志物水平降低30-70%,治疗后6-12个月可检测到骨形成标志物升高30-50%,比骨密度更加敏感,早在骨密度变化之前即可进行早期疗效判断,及时调整治疗方案,避免延长无效治疗时间。
I型胶原作为骨骼中唯一的胶原物质,占骨骼基质的90%。胶原从合成到成熟经历不同的阶段:氨基酸—前胶原—原胶原—胶原。成骨细胞中含有大量I型前胶原,骨形成时I型前胶原被分泌到细胞外,裂解为I型前胶原羧基末端前肽(PICP)、I型前胶原氨基末端前肽(PINP)和I型胶原三个片段。骨吸收时,破骨细胞参与骨吸收过程中产生I型胶原降解产物,释放进入血液并从尿液排出。其中特异性降解产物I型胶原氨基末端肽(NTX)和I型胶原羧基末端肽(CTX)是由I型胶原降解产生的部分紧密交联的氨基末端和羧基末端肽段结构域,能直观的反映出骨吸收的状态,是很好的骨吸收标志物。NTX在血清中和尿液中均可检出,但血清中的水平受昼夜生理节律、饮食的影响较大,而24小时尿中的NTX可以克服生理节律的影响,受饮食影响也比较小。尿液中的NTX是骨吸收的特异和敏感指标,可用于预测骨吸收趋势及疗效监测。但是,目前国内没有一款获得国家药品监督管理局批准的NTX检测产品,其重要原因就在于缺乏高亲和力高特异性的抗NTX抗体。
本发明将针对I型胶原氨基末端肽(NTX),制备高亲和力高特异性的抗I型胶原NTX抗体,为发展灵敏、特异、准确的I型胶原NTX检测试剂盒奠定基础。
发明内容
为此,本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗I型胶原氨基末端肽(NTX)单克隆抗体,并且经过实验获得的单克隆抗体能够识别I型胶原NTX,具有很好的特异性和亲和力,可以用于制备骨质疏松症早期诊断及治疗效果评价的检测试剂产品。
因此,本发明一个方面涉及一种抗I型胶原氨基末端肽(NTX)的单克隆抗体或其抗原结合片段,包括轻链可变区和重链可变区,轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,其中,
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述轻链CDR2的氨基酸序列为LMS或与序列LMS相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列。
在进一步的方面中,本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述轻链可变区序列为SEQ ID NO.1所示序列,所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
本发明还涉及上述的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体,这些抗体或抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区,因此能够识别和结合I型胶原NTX。
此外,本发明还涉及包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的一种核酸分子,以及包含上述核酸分子的表达载体,所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体,其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。
另一方面,本发明涉及一种抗I型胶原NTX的单克隆抗体杂交瘤细胞株,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地,本发明涉及抗I型胶原NTX的单克隆抗体杂交瘤细胞株,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株3A112,保藏号为CGMCC No.45456。
再一方面,本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备骨质疏松症早期诊断及治疗效果评价的检测试剂产品中的应用。进一步地,本发明涉及一种检测I型胶原NTX的试剂盒,所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段,用于识别和结合I型胶原NTX。
生物材料保藏说明
本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株:小鼠杂交瘤细胞株3A112,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏中心登记入册编号为CGMCC No.45456,保藏日期为:2023年2月8日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101。
附图说明
图1是显示抗I型胶原NTX单克隆抗体3A112亚型鉴定结果图,经鉴定抗体亚型为IgG2a。
图2是显示对骨质疏松症患者尿液样本检测结果。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗I型胶原氨基末端肽(NTX)单克隆抗体,该株抗I型胶原NTX单克隆抗体可以识别I型胶原NTX。以I型胶原NTX合成肽-KLH偶联物作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体,采用I型胶原NTX合成肽-BSA偶联物筛选单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选后获得一株表达高亲和力高特异性的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株,命名为3A112。2023年2月8日将该细胞株进行于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45456,保藏日期为2023年2月8日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101。
本发明人对该株小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体进行了测序,单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为110个氨基酸,其序列如下:VMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGK TYLNWLLQRPGQSPKRLIYLMSKLDSGVP DRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTYFPQTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于25-35aa,氨基酸序列为QSLLYSNGKTY(SEQ ID NO.2);CDR2位于53-55aa,氨基酸序列为LMS;CDR3位于92-100aa,氨基酸序列为VQGTYFPQT(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为117个氨基酸,其序列如下:DVQLVESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGSSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWVGYITYSG SLSFNP SLKSRMSITRDTFKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAWMKYNNYGEKWGQGTLVTVS(SEQ ID NO.4),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于26-34aa,氨基酸序列为GSSITSDYA(SEQ ID NO.5);CDR2位于52-58aa,氨基酸序列为ITYSGSL(SEQ ID NO.6);CDR3位于97-107aa,氨基酸序列为AWMKYNNYGEK(SEQ ID NO.7)。经测定,上述单克隆抗体对I型胶原NTX具有高亲和力和高特异性。
众所周知,抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要序列,并且氨基酸序列中1个或2个保守氨基酸替换一般不会改变蛋白质的性质。因此,对轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3和/或重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3进行1个或2个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合I型胶原NTX。保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一化学上相似的氨基酸所替换,例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间的相互替换,脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间的相互替换,极性氨基酸Gln、Asn之间的相互替换,碱性氨基酸Lys、Arg、His之间的相互替换,酸性氨基酸Asp、Glu之间的相互替换,以及羟基氨基酸Ser、Thr之间的相互替换等。
此外,本领域众所周知,抗体或其抗原结合片段中,轻链或重链各CDR之外为骨架区,CDR序列与骨架区序列之间增加少数氨基酸,例如增加1个或2个氨基酸对抗体或其抗原结合片段的立体结构影响较小,因此仍然可以识别和结合相应抗原。因此,本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR1序列除了是SEQ ID NO.2所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列。同样地,本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR2序列除了是序列LMS或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列;本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR3序列除了是SEQ ID NO.3所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列;本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR1序列除了是SEQ ID NO.5所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列,本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR2序列除了是SEQ IDNO.6所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列;本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR3序列除了是SEQ ID NO.7所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列。
还可以通过本领域现有技术,从本发明的单克隆抗体制备各种能够与I型胶原NTX结合的各种抗体片段,即抗原结合片段,例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域,由一条完整的轻链与重链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成,轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区,轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备,例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后,抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段(结晶片段)。在胃蛋白酶的作用下,抗体IgG被降解为一个F(ab')2片段和一个pFc'片段,F(ab')2片段进一步被还原形成两个Fab'片段。上述抗原结合片段可以应用于制备检测I型胶原NTX的产品。
还可以通过本领域现有技术,从本发明的单克隆抗体制备单链抗体(scFv)。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体,其只有一条链,是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的,并且可以通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。单链抗体分子量小、穿透力强并且抗原性弱等优点,可以应用于制备I型胶原NTX检测产品。
本领域技术人员能够基于上述的抗I型胶原NTX单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子,也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中,构建得到表达载体,该载体能够表达出抗I型胶原NTX单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体,并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段,如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别I型胶原NTX,因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术,本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。
由于骨代谢标志物的变化是引起骨代谢相关疾病的原因,而骨密度改变是相应的结果,所以体液中NTX的水平变化显著早于骨密度的变化,使用本发明抗I型胶原NTX单克隆抗体或其抗原结合片段检测体液中NTX的水平能够更早发现骨代谢的异常,实现骨质疏松症早期诊断。同样在药物治疗过程中,骨密度发生显著变化至少需要6个月以上,通常为1-2年,而NTX的水平变化在抗骨质疏松治疗开始3-6个月后即可检测,因此使用本发明抗I型胶原NTX单克隆抗体或其抗原结合片段检测体液中NTX的水平可进行早期疗效判断,以便及时调整治疗方案。
如上所述,本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合I型胶原NTX,因此可以用于制备用于检测I型胶原NTX的试剂盒,所述试剂盒可以是任何利用了本发明抗体或其抗原结合片段与I型胶原NTX结合反应的试剂盒,例如但不限于胶体金免疫层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定、化学发光、免疫比浊类型的试剂盒。对于特定类型的试剂盒中,除本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段之外的其他成分的确定是本领域技术人员众所周知的。
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果,以下结合具体实施例进行说明。
实施例1:I型胶原NTX抗原肽的合成制备
I型胶原分子是由3条多肽链相互盘绕、旋转而形成的螺旋状结构,其中2条多肽链为α1(I),1条多肽链为α2(I)链。当骨吸收时,破骨细胞参与骨吸收过程中产生特异性降解产物I型胶原NTX和I型胶原CTX。I型胶原CTX肽链结构均为αl(I)型,为所有组织中的I型胶原所共有。I型胶原NTX含有2条α1(I)的N端肽序列和1条α2(I)的N端肽序列,其中α2(I)的N端肽序列仅存在于骨I型胶原中,所以利用针对α2(I)的N端肽序列的抗体对I型胶原NTX检测具有极高的特异性。
因此,本发明设计合成I型胶原NTX的α2(I)链的N端肽序列,序列为CQYDGKGVGLGPGPMGL,并分别偶联钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA),其中KLH偶联的多肽用于免疫小鼠制备单克隆抗体,BSA偶联的多肽用于抗体的筛选。此外,合成BSA偶联的I型胶原NTX的α1(I)链的N端肽,序列为QLSYGYDEKSTGGISVP,用于鉴定单克隆抗体的识别特异性。多肽的合成及偶联委托上海德翅生物科技有限公司完成。
实施例2:抗I型胶原NTX高特异单克隆抗体的制备
取KLH偶联I型胶原NTX的α2(I)链N端肽作为免疫原,采用8周龄BALB/c雌性小鼠,抗原加等量弗氏完全佐剂背部及腹腔注射小鼠,免疫剂量为50μg/只;第四周和第八周进行第2次和第3次相同剂量免疫,用福氏不完全佐剂,3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞,培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血作为阳性对照血清,同时颈脱位处死小鼠,用75%酒精消毒体表3-5min,取其脾脏,制备脾细胞悬浮液。
取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5:1的比例,在无血清的DMEM培养基中混匀,1500rpm离心5分钟,充分吸取上清,轻轻振荡离心管底部,振散细胞,在45-60秒内加入1mL预热过的50% PEG融合细胞,边加边轻轻摇匀,加完后静置90秒,加入无血清的DMEM培养基终止融合,37℃静置10min,1500rpm离心5分钟,沉淀用HAT培养基悬浮,分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中,37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后,用HAT培养基换液一次,第10天用HAT培养基换液,等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时,同样采用间接ELISA法筛选阳性克隆。
用碳酸盐包被缓冲液稀释BSA偶联I型胶原NTXα2(I)的N端肽和BSA偶联I型胶原NTXα1(I)的N端肽,浓度分别为2.5μg/ml,每孔包被100μl,4℃过夜;用洗液洗板2次,200μl/孔;加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时;用洗液洗板5次,200μl/孔。每孔加入200μl样品稀释液后,分别加入10μl细胞培养上清,室温孵育30min,弃液。用1×洗液洗板,每孔200μL,重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上,用力拍打以去除多余的洗液。加入100μl/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体,室温孵育20min。洗板5次。加新鲜配制的底物溶液,100μl/孔,室温避光孵育10分钟。加入2M H2SO4终止液50μL/孔,终止反应。设定酶标仪检测波长450nm,测定每孔OD值,终止后10分钟内读值。
经过筛选共获得11个仅特异性识别I型胶原NTXα2(I)的N端肽,而不识别I型胶原NTXα1(I)的N端肽的阳性克隆,检测值OD450nm均高于2.0。
实施例3:抗I型胶原NTX高亲和力抗体的筛选
为了筛选获得对α2(I)的N端肽具有最高亲和力的单克隆抗体,取11株杂交瘤细胞株,用含10%胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集细胞,用10mL生理盐水重悬细胞,每只小鼠腹腔注射0.5mL(细胞密度大约为1×107个/mL)。2周后,收集腹水。以Thermo公司Melon Gel Monoclonal IgG PurificationKit试剂盒进行抗体纯化,用PBS将纯化后的11株单克隆抗体进行系列梯度稀释,浓度为10μg/ml、2μg/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、640pg/ml。用BSA偶联I型胶原NTXα2(I)的N端肽包被酶联板,浓度为2.5μg/ml,每孔包被100μl,4℃过夜;用洗液洗板2次,200μl/孔;加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时;用洗液洗板5次,200μl/孔。每孔加入100μl稀释后单克隆抗体,室温孵育30min,弃液。用1×洗液洗板,每孔200μL,重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上,用力拍打以去除多余的洗液。加入100μl/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体,室温孵育20min。洗板5次。加新鲜配制的底物溶液,100μl/孔,室温避光孵育10分钟。加入2M H2SO4终止液50μL/孔,终止反应。设定酶标仪检测波长450nm,测定每孔OD值,终止后10分钟内读值。结果如表1所示,克隆株3A112单克隆抗体的效价为640pg/ml,显著高于其他克隆株,因此确定克隆株3A112单克隆抗体为性能最优的单克隆抗体。
表1抗I型胶原NTX高亲和力单克隆抗体的筛选
实施例4:抗I型胶原NTX单克隆抗体3A112亚型鉴定
采用Pierce Papid Isotyping Kit-Mouse试剂盒抗体亚型鉴定,首先用样本稀释液将抗体稀释为50ng/mL,然后每孔加入150μl稀释好的抗体,5-10min后观察记录结果。结果显示抗I型胶原NTX单克隆抗体3A112为小鼠IgG2a亚型,如图1所示。
实施例5:抗I型胶原NTX单克隆抗体3A112可变区序列测定
培养小鼠杂交瘤细胞株3A112,Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA,Thermo Fisher公司High Capacity cDNA Rever Transcription Kit试剂盒逆转录cDNA后,根据《重组抗体》(科学出版社,沈倍奋主编,2005年出版)中鼠单抗引物序列,设计并由北京擎科生物科技有限公司合成该抗体的重轻链引物,PCR扩增(扩增程序为:95℃预热1min,进行30个循环(95℃30秒,58℃30秒,72℃45秒),最后72℃延伸5min),连接PMD18-T载体,大肠杆菌HB109表达,挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。
经序列分析后发现,轻链可变区氨基酸序列为110个氨基酸,其序列如下:VMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLMSKLDSGVP DRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTYFPQTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于25-35aa,氨基酸序列为QSLLYSNGKTY(SEQ ID NO.2);CDR2位于53-55aa,氨基酸序列为LMS;CDR3位于92-100aa,氨基酸序列为VQGTYFPQT(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为117个氨基酸,其序列如下:DVQLVESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGSSITS DYAWNWIRQFPGNKLEWVGYITYSGSLSFNPSLKSRMSITRDTFKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAWMKYNNYGEKWGQGTLVTVS(SEQ ID NO.4),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于26-34aa,氨基酸序列为GSSITSDYA(SEQ ID NO.5);CDR2位于52-58aa,氨基酸序列为ITYSGSL(SEQ ID NO.6);CDR3位于97-107aa,氨基酸序列为AWMKYNNYGEK(SEQ ID NO.7)。
实施例6:对临床尿液样本的检测
采用双抗体夹心法酶联免疫技术,使用本发明高亲和力高特异性单克隆抗体3A112检测临床确诊的10例骨质疏松症患者和10例健康对照的尿液样本中I型胶原NTX。用单克隆抗体3A112包被酶联板,浓度为2.0μg/ml,每孔包被100μl,4℃过夜;用洗液洗板2次,200μl/孔;加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时;用洗液洗板5次,200μl/孔。每孔加入50μl尿液样本和50μl 500倍稀释的HRP标记的3A112抗体,室温孵育60min,弃液。用1×洗液洗板,每孔200μL,重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上,用力拍打以去除多余的洗液。加新鲜配制的底物溶液,100μl/孔,室温避光孵育10分钟。加入2M H2SO4终止液50μL/孔,终止反应。设定酶标仪检测波长450nm,测定每孔OD值,终止后10分钟内读值。结果如表2和图2所示,10例骨质疏松症患者的检测OD值显著高于10例健康对照,表明单克隆抗体3A112具有高亲和力和高特异性,可以用于骨质疏松症患者I型胶原NTX的检测。
表2对尿液样本中I型胶原NTX的检测
骨质疏松症患者 | OD值 | 健康对照 | OD值 |
S1 | 1.031 | N1 | 0.251 |
S2 | 0.757 | N2 | 0.165 |
S3 | 0.362 | N3 | 0.053 |
S4 | 1.495 | N4 | 0.094 |
S5 | 0.552 | N5 | 0.091 |
S6 | 0.569 | N6 | 0.164 |
S7 | 0.365 | N7 | 0.175 |
S8 | 0.433 | N8 | 0.062 |
S9 | 1.735 | N9 | 0.219 |
S10 | 0.604 | N10 | 0.386 |
Claims (10)
1.一种抗I型胶原氨基末端肽的单克隆抗体或其抗原结合片段,包括轻链可变区和重链可变区,轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,其特征在于,
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列;
所述轻链CDR2的氨基酸序列为LMS;
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列;
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列;
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列;
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述轻链可变区序列为SEQ ID NO.1所示序列,所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体,其特征在于,其由保藏号为CGMCC No.45456的小鼠杂交瘤细胞株3A112分泌。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体。
5.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸包含编码权利要求1至4任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
6.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组体,其特征在于,所述重组体包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8.一种分泌抗I型胶原氨基末端肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株3A112,保藏号为CGMCC No.45456。
9.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备骨质疏松症早期诊断及治疗效果评价的检测试剂产品中的应用。
10.一种检测I型胶原氨基末端肽的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
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